BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO
_ TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÀN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIÊỄN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHAO SAT SU BIEU HIEN HE PROTEIN CUA MOT SO
GIONG LUA KHANG RAY O BONG BANG SONG CUU LONG BANG PHUONG PHAP DIEN DI HAI CHIEU
CAN BO HUONG DAN SINH VIEN THUC HIEN
TS TRAN NHAN DUNG NGUYEN PHUONG DIEM
MSSV: 2064705 LOP: CNSHTT K32
Can Tho, Thang 11/2010
Trang 2
PHAN KY DUYET
CAN BO HUONG DAN SINH VIEN THUC HIEN
(ky tén) (ky tén)
TS Trần Nhân Dũng Nguyễn Phương Diễm
DUYET CUA HOI DONG BAO VỆ LUẬN VĂN
Can Ti ho, ngay tháng nam 2010 CHU TICH HOI DONG
(ky tén)
TS TRUONG TRONG NGON
Trang 3
Lời cảm tạ
Mười hai năm học tập phan dau để bước vào cánh cửa đại học, bốn năm miệt mài rèn luyện để có được chút thành tích đầu tay trong những năm nghiên cứu khoa học đầu đời Để có được thành cơng ngày hơm nay, ngồi sự cố găng của bản thân, khơng thể thiếu tình yêu và sự động viên từ mẹ và gia đình, sự khoan dung và lòng nhiệt tình từ q thầy cơ, sự chan hòa và thân ái của tình cảm bạn bè
Con xin dâng lên Mẹ và gia đình những tình cảm và lòng biết ơn sâu sắc nhất
Con xin gửi lời tri ân đến thầy Trần Nhân Dũng, thấy đã ân cần dìu dắt em từng bước đi đấu tiên của cuộc đời nghiên cứu khoa học, hết lòng hướng dẫn, động viên và quan tâm em trong suốt khóa luận tốt nghiệp
Mãi không quên ơn cô cô vấn Ngô Thị Phương Dung, thây Trần Nguyên Tuấn cùng quý Thầy Cô Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công nghệ sinh học đã hết lòng thương yêu, tạo
điều kiện để chúng em toàn tâm toàn ý học tập và nghiên cứu
Em xin gửi lời cảm ơn và sự kinh trọng đến chị Nguyễn Thị Xuân Dung, người đã chỉ dạy cho em những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian làm luận văn, luôn ở bên em, động viên và giúp đỡ để em không nản lòng Anh Trần Văn Bé Năm, anh Nguyên Vũ Linh, anh Phạm Văn Một đã hết lòng hỗ trợ em thực hiện thật tốt luận văn
Luôn ghỉ nhớ những tình cảm, lời dạy và những kiến thức quỷ báu từ quý Thây Cô đã truyền đạt cho em trong suốt q trình học tập
Lịng thâm cảm ơn toàn thể các bạn lớp Công nghệ sinh học Tiên tiễn khóa 32 (DA0666T1) vì tỉnh thân tương thân tương ải, các bạn đã ở bên, động viên tơi trong những lúc khó khăn Thân gửi đến các bạn lời chúc sức khỏe và sự thành công trên con đường phía
trước
NGUYEN PHUONG DIEM
Trang 5TÓM LƯỢC
Lúa là cây lương thực quan trọng và có nhiễu sâu bệnh hại, nghiêm trọng nhất là dich ray néu (Nilaparvata lugens Stal) 5 giong hia cé cap khang ray tit 0,7-1,0
được chọn làm thí nghiệm để đị tìm marker protein có liên quan đến khả Hãng
kháng rấy nâu Sau khi ly trích protein bằng dung dịch SDS có bồ sung
TCA/Acetone và chạy điện di hai chiêu, chất lượng và nông độ protein cho kết quả trên gel hai chiêu khác biệt rất rõ rệt, trơng quan về di truyền giữa các giống đễu trên 60% Qua phân tích gel hai chiếu nhận thấy có i† nhất 4-6 điểm protein đêu năm trong vùng pH từ 4-7,5 xuất hiện ở tất cả các giống (44.2 kDa, pI 5.2; 28.9
kDa, pI 6.6; 23.8 kDa, pI 6.8; 18.4 kDa, pI 5.1) rất có thể là những protein liên
quan mật thiết đến tính kháng rây
Từ khóa: điện di hai chiếu, ly trích, marker protein, rầy nâu
Trang 6MỤC LỤC
KÝ TÊN HỘI ĐÒNG - St 1E 2 1113111151111 111111 111111155111 E111E.Te CÁM TTẠ G1 TT TH TT TT Hà Tà Trà rà TOM LUƯỢC .- - 5333 E11 1911 TT TT TT TT Tà TT Tà TT ng i MỤC LLỤC .-. SE 11 3 111112171 111111211111 1111.TETET1TEETEEET.TxTrkrD ii DANH SACH BANG 0.ccccecccccccccscssscsssssesessssssessesessesvsvesvesessesvssssvsvssvsssevssvavsssesesseavaseess V DANH SÁCH HÌNH - %1 EE1E 1 EEE1EE12101111711171111117117.171 11111 0 vi CAC TU VIET TAT oie ccccccccccccccscssescssescsesessesessssesssesvesesnssestssesssseavssessnasananeas vii CHUONG 1 GIOT THIEU cccssssssssssssscnsssossssasesssscsssssasosssnsesosssssscsscssssonsssossessenes 1 CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIIỆU -5 5-5 s52 essesessssesssssessssesesse 2 2.1 Giới thiệu chung về cây lúa -L- 2h EY St grrkrkrrrree 2 2.2 RẦy nÂâu - - L- -L 11E1 S11 KH 1TR Sự SH TT TT Tà TT TT Tà TT TT TH TH grkp 2
2.2.1 Phân ÏOạI - c c c ghe 2
2.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh học . ¿2 1t SE vEEEEEErErkrkrkrrrerrrrerrree 2 2.2.3 Tác hại của rầy nâu - tt T1 SE T391 3 E1 TT TT TT nhryt 3 2.2.4 Các loại hình sinh học của rầy nâu trên thế giới ¿5+ cv exsvzsrrrse 4
2.3 Giống lúa kháng rầy nÂâu - tk 1t 3E ST HT ng nh rưưyp 5
2.3.1 Sự biểu hiện tính kháng rầy nâu của các giống lúa - 5: + 5xx 2xx £srx2 5 2.3.2 Sự biểu hiện của các protein liên quan đến tính kháng rầy nâu 7 2.4 Phân tích protein kháng rầy bằng phương pháp SDS PAGE
Va Gién di hai CHICU .cccccccssseecccseecuseeccceuseecevsesesessus cesses cessuuasessesecsssuesevsssuuens 9
Trang 7
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN s so ssesescssseses 11 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện + - S133 3 ng re 11 3.2 Phương tiện và thiết bị, hóa chất - - vn ng nh rrryt 11
3.3 Các giống lúa kháng rầy ¿L1 TT TT HH TT HT ng ngưng 11
3.4 Các bước tiến hành thí nghiệm 0 0.ccccccesescecsssessessesssscsensscsssssseevevevaes 12
3.4.1 Thí nghiệm l1: Hiệu chỉnh quy trình ly trích DrOf€in -. ««ssss + sss+s+ss+s 12 3.4.2 Thí nghiệm 2: Kiểm tra chất lượng protein trích được và ghi nhận
sự khác biệt (nếu có) của hệ protein giữa các giống bằng SDS-PAGE 14
3.4.3 Thí nghiệm 3: Tiến hành điện di hai chiỀu . ¿2 2S S2 32x seez 14 CHƯƠNG 4 KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN -° s5 <sseescsesesesssessesseses 16
4.1 Hiệu chỉnh quy trình ly (rích DTO{n . -o co o9 +5 953686666 6565886966565 16
4.2 Thí nghiệm 2: Phố điện di protein trích được từ các giống
115800 (600011777 17 4.3 Thí nghiệm 3: Kết quả điện di hai chiều s-s-=sese sescseseseseseses 18
So sánh hai giống đối chứng 5 tà E1 1E SH TT TT HT 19
MTL638 vs đối chứng âm và đối chứng dương - - sẻ sEvE‡EsEeErErsreesreei 20 MTL643 vs đối chứng âm và đối chứng đương 5 - + sxssEvEeEsvsrrrrrsreesrees 21 MTL649 vs đối chứng âm và đối chứng dương 5s +tsxssEvEeEsvsrrrrrereesrees 23 MTL651 vs đối chứng âm và đối chứng dương . ¿s2 vs ve rksrees 24 MTL657 vs đối chứng âm và đối chứng dương ¿+ s2 vs vvrvrxrerksrers 26 CHƯƠNG 5 KET LUẬN VÀ ĐÈ NGHỊ, .- 5 5-5 cscscsesssessesesesesssesss 32
ch n ca ae 32
»; na 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO 2 S33 E1cEE171E1EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErkrrkekeii 34 PHỤ LLỤC -. - 5S 1111 1 E11 1 E11 11 1111111111131 1111111111 1111 111111711111
Phụ lục 1: Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford Phu luc 2: Dién di SDS PAGE
Trang 8Phụ lục 3: Trích ly mẫu
Phụ lục 4: Điện di chiều thứ nhất IEF
Phụ lục 5: Điện di chiều thứ hai SDS PAGE cho 2D
Phụ lục 6: Phương pháp tính trọng lượng phân tử trên gel SDS PAGE Phụ lục 7: Cấp kháng rầy của các giống lúa
Phụ lục 8: Nguồn gốc các giống lúa đã dùng
Phụ lục 9: Hình gel điện di sản phẩm PCR của các giống lúa với cặp môi
RM190 liên kết gen Bph3
Phụ lục 10: Tổng hợp gel hai chiều các giống lúa kháng rầy
Trang 9
DANH SACH BANG
Bang 1 Nồng độ protein thu được qua các phương pháp ly trích khác nhau 16 Bảng 2 So sánh độ tương đồng (%) giữa các giống so với đối chứng âm và
đối chứng dương trên gel điện di hai chiỀu 2- 2= ©2+eeecSeerrerxrere 27
Trang 10DANH SÁCH HÌNH
Hình 1 Vịng đời của rầy nâu .¿- ¿E113 333333 k SE E11 TT TT Tàn Henu 3 Hình 2 Phổ điện đi SDS PAGE kiểm tran nồng độ protein qua các phương pháp
ly trích khác nhau 2 n9 993309 11v ng ng gen 16
Hình 3 Phổ điện đi SDS PAGE hệ protein của các giống lúa kháng rây 18
Hình 4 So sánh hai giống đối chứng âm và đương : 5: St S*ttEEskekerrsesees 19
Hình 5 So sánh MTL638 với đối chứng âm - - ¿5+ E22 E*x*E£E£EEEEE 32k: 20 Hình 6 So sánh MTL638 với đối chứng dương - 5 sẻ sE‡E‡E+EvEzEeEererererees 21 Hình 7 So sánh MTL643 với đối chứng âm - ¿523 +E+E2E*E£E+E+EEEEEzzrkrxrerkri 21 Hình 8 So sánh MTL643 với đối chứng đương - - 5 sx+sEvESEsverrrrrersrersrees 22 Hình 9 So sánh MTL649 với đối chứng âm - - 5 2s E3 E333 Sư vo 23
Hình 10 So sánh MTL649 với đối chứng dương ¿5-6 SE vEzEvEsErreserees 24
Hình 11 So sánh MTL651 với đối chứng âm . ¿- ¿6 + Sẻ *E*+šE‡E‡ESEvEzEsEsrsrzrerees 24 Hình 12 So sánh MTL651 với đối chứng đương . 5: 2 + + + vE2Ek££xzse xe: 25 Hình 13 So sánh MTL657 với đối chứng âm - - - 2+ 232v £vE vs eererkes 26 Hình 14 So sánh MTL657 với đối chứng dương + 3xx vxsvrkeererkei 26
Hình 15 Giản đồ phả hệ các giống lúa thông qua điện di hai chiểu -. - 27
Hình 16 Vùng protein Rubisco của giỗng MTL638 và MTL651 (trái sang phải) 29
Trang 11
2D 2DGE BPH Biotype CTAB DNA DBSCL NT PCR SDS SDS PAGE Rubisco TCA
CAC TU VIET TAT
Two-dimensional electrophoresis Two-dimensional gel electrophoresis Brown plant hopper
Loai hinh sinh hoc
Cetyl trimethyl ammonium bromide Deoxyribonucleic acid
Đồng bằng sông Cửu Long Nghiệm thức
Polymerase chain reaction
Sodium dodecyl sulfate
Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase
Tricloroacetic acid
Trang 13CHUONG I GIỚI THIỆU
Ray nâu, Nilaparvata lugens Stal., là một trong những loài côn trùng hại lúa
nghiêm trọng ở châu Á, nhất là tại Việt Nam Rầy nâu gây hại chủ yếu ở phần thân lúa,
chúng chích hút chất đinh dưỡng trong các mạch gỗ của thân, làm cho cây lúa giảm khả năng quang hợp, thiếu chất, thân khô héo, lúa bị gay hai trên diện rộng gọi là hiện tượng cháy rầy (hopper burn) Ngoài ra, việc chích hút của rầy còn lan truyền các loại virus gây bệnh vàng lùn, lùn xoăn lá có tính lây lan cao, khả năng phịng trừ khó Vì thường tồn tại với mật số đông nên tác hại của rầy nâu là vô cùng nghiêm trọng Sử dụng thuốc hóa học là phương pháp truyền thống để ngăn chặn rầy nâu nhưng đắt tiền và
gây ảnh hưởng xấu đến môi trường Cách đơn giản và hiệu quả nhất trong công tác quản
lý dịch hại rầy nâu hiện nay là trồng xen canh các giống lúa kháng rầy (Zhe, 2009) Để phát triển các giỗng kháng rầy, các nhà khoa học trên thế giới đã sưu tập được khoảng
trên dưới 20 gen kháng từ nhiều nguồn khác nhau Những nghiên cứu trong thời gian
gần đây chủ yếu tập trung nhiều vào việc fìm hiểu cơ chế tương tác giữa giống lúa kháng rầy và các biotype rây nâu, tập quán chich hut va sinh ly hoc cia ray (Bo, 2009), tác động gây hại của ray nau trên các giống lúa (Sogawa, 1982) Sự hiểu biết về
sự biến đổi bên trong cây lúa trước tác hại của rầy nâu hỗ trợ nhiều trong việc ứng
dụng các gen kháng rây vào cơng tác phịng trừ rầy nâu Hiện nay, sự am hiểu về cơ chế kháng rầy ở mức độ phân tử còn nhiều hạn chế Những thông tin về sự biểu hiện hệ protein ở một số giỗng lúa kháng rầy vẫn còn rất khiêm tốn Trong phạm vi cho phép, để tài “Khảo sát sự biểu hiện hệ protein của một số giống lúa kháng rầy Ở ĐBSCL bằng kỹ thuật điện di hai chiều” sử đụng hai phương pháp điện di protein SDS PAGE và 2-D (điện di hai chiều) để khảo sát sự hiện diện của các protein kháng rây, do marker protein lién quan dén tinh khang ray và xem mức độ biêu hiện cũng như sự đa dạng của chúng giữa các giống lúa kháng rầy có cấp kháng cao
Mục tiêu của đề tài
e_ Xây dựng quy trình ly trích protein phù hợp để thực hiện điện di hai chiều e Khảo sát sự biểu hiện hệ protein và dị tìm các marker có thể liên quan đến tính
khang ray trong từng giống lúa
Trang 14CHUONG II LUOC KHAO TAI LIEU
2.1 Giới thiệu chung về cây lúa
Cây lúa thuộc họ Hoda thao (Gramineae), chi Oryzae Trong chi Oryzae cé nhiéu loài, sống một năm hoặc nhiều năm Người ta cho rằng tô tiên của chi lúa Øzyzae là một loài cây hoang dại trên siêu lục địa Gondwana cách đây ít nhất 130 triệu năm và phát tán rộng khắp các châu lục trong q trình trơi dạt lục địa Trong đó chỉ có hai loại lúa trồng 1a Oryza sativa, phd bién 6 chau A, và Oryza giaberrima có hạt nhỏ, năng suất thấp, chỉ
trồng trên diện tích nhỏ ở Tây Phi Tô tiên của lúa châu Á Ó szfivz là một loại lúa hoang
phố biến (Oryza rufipogon) dường như có nguồn gốc tại khu vực xung quanh chân núi Himalaya, với Ó safiva thứ inđica ở phía An D6 va O sativa tha japonica 6 phia Trung Quốc Hiện nay đây là giỗng lúa chính được gieo trồng làm cây lương thực trên khắp thế giới Lúa có 2n=24 nhiễm sắc thể, với tông số DNA có quy mơ ước khoảng 430 megabp 2.2 Rầy nâu
2.2.1 Phân loại:
Tên tiếng Anh: Rice planthopper Tén khoa hoc: Nilaparvata lugens Stal Ho: Delphacidae
Bộ: Homoptera (cánh đều)
2.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh học:
e_ Đặc điểm nhận biết
- Rầy trưởng thành có màu nâu Con đực nhỏ hơn con cái Trưởng thành có 2 dạng cánh
ngắn và cánh dài
- Trứng hình bầu dục giống quả chuối, nằm trong nõn bẹ, gân lá
- Rây non mới nở có màu vàng trăng, ở tuôi 2 — 3 trở lên có màu nâu vàng, bị ngang
Trang 15
1.1.Ray truong thanh canh dai 1.2 Trimg xếp hình nải chuối 1.3 Rầy non tuôi ] màu trắng, các tuổi sau có màu vàng nâu 1.4 Rây trưởng thành cánh ngắn
Hình 1 Vịng đời của rây nầu
N guỗn - hiip:7/www.nonsnshiep.vn/nonegnghiepvn/7Upload/Imase/2008/6/19/ray.ipg
Cả rầy non và trưởng thành đều chích hút dịch cây Chúng tập trung ở gốc và thân lúa làm cho cây còi cọc, sinh trưởng kém, lúa vàng Mật độ cao gây cháy ray thanh dam, vat Khi d6 ray trưởng thành cánh dài phát triển mạnh để di chuyên, phân tán
e_ Điều kiện phái sinh và phát triển
Nhiệt độ 20 — 30°C và âm độ bão hoà là điều kiện thuận lợi cho rầy nâu sinh sống
và phát triển Thông thường, nếu trước thời gian nào đó có nhiệt độ và âm độ khơng khí cao, lượng mưa nhiều, sau đó trời hửng nắng thì rầy nâu dễ phát sinh thành dịch Giai đoạn lúa tré - chín thường bị rầy hại nặng
Hàng năm ray phat sinh 7 - 8 lứa, trong đó có 4 lứa quan trọng: lứa rầy 2-3 phá hại vào tháng 4 - 5 (đối với vụ chiêm xuân, đặc biệt vùng chiêm trũng) và lira 5 - 6 phát sinh vào tháng 7 - 9
2.2.3 Tác hại của rầy nâu
e Tác hại trực tiếp:
Ray cám và rây trưởng thành chích hút nhựa cây lúa gây ra hiện tượng cháy rầy khi mật số
cao Ray nau gia tăng mật số nhanh, (bột phát) gây hai nặng cho cây lúa khi thực hiện canh tác
lúa liên tục trong năm, dùng giống nhiễm rây, gieo sạ mật độ dày, bón dư thừa phân đạm hoặc dùng thuốc trừ sâu không đúng cách
Trang 16e Tac hai gian tiếp
Là môi trường truyền virus gây bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá, lúa cỏ cho cy hia Phan ray nau chứa nhiêu đường hấp dẫn nhiều nắm hoại sinh như bồ hóng, làm gốc lúa đen, giảm độ quang
hợp của cây
e Đặc điểm truyền bệnh
Ray nâu chích hút nhựa cây lúa gây bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá rồi mang mầm bệnh virus
nay trong cơ thê đề truyền sang cho cây lúa khỏe mạnh khi chúng đến chích hút cây lúa đó Cây lúa càng non càng dễ bị nhiễm bệnh, về sau có thể khơng trỗ bông được, năng suất giảm
nghiêm trọng hoặc mắt trăng Cây lúa già bị nhiễm bệnh thì năng suất giảm ít hơn 2.2.4.Các loại hình sinh học của rầy nâu trên thế giới
Các giống lúa phản ứng không giống nhau đối với tác hại của rầy nâu Một phân do sự
cách biệt địa lý sinh thái đã hình thành nên các quân thể rầy nâu có độc tính khác nhau (Nguyễn Văn Đĩnh và Trần Thị Liên, 2006) Qua việc nghiên cứu tính thay đôi của côn trùng,
Ikeda va Vaughan (2006) cho rằng hiện nay có 4 biotype: - _ Biotype 1 phân bố rộng ở Đông và Đông Nam A;
- _ Biotype 2 có nguồn gốc ở Philipin phát sinh sau khi sử dụng rộng rãi các giống có gen Bph 1,
- Biotype 3 phát sinh tại các phịng thí nghiệm ở Nhật Bản và Philipin - Biotype 4 chi thay 6 ving Nam A
Những loại hình sinh học của rầy nâu vùng Nam Á không được biết rõ hồn tồn,
có một lồi khác khơng tên đã được phát hiện vào năm 1977, chiếm ưu thế về số lượng
(Jennings et al., 1979) Gần đây những giống lúa ở Philipin với sự kháng đơn gene với
biotype 1 nhu IR26, IR156 dugc phat triển tiếp tục ở những khu vực có sự dẫn nước
quanh năm, khoảng 2 đến 3 năm trước khi một biotype mới đã vượt qua tính kháng này, nhưng ở mặt nào đó, số thế hệ côn trùng sẽ ảnh hưởng tới sự phụ thuộc khác nhau
vào sự khác biệt xuất hiện trong quân thể, đó là tỉ lệ đột biến của cơn trùng, kích thước
quân thể và những giống chủ (Jennings et al., 1979) 2.3 Giống lúa khang ray nâu
Trang 17
Đặc tính tự nhiên của giống kháng rầy nâu là hàm lượng asparagine trong lá thấp, mỏ hạt đỏ và vòi nhụy cái tím với cơ chế không ưa, tức là tạo ra sự không hấp dẫn côn trùng (Trần Dinh Long, 1997) Các loài hoang dại có quan hệ voi chi Oryza cé thé cung cấp nguồn gene quý để cải tiến giống lúa Người ta đã chuyển những tính trạng quý tìm được ở lúa hoang dại vào lúa trồng bằng nhiều phương pháp như lai hữu tính, cơng nghệ nhiễm sắc thê, công nghệ nuôi cấy tế bào, dung hợp tế bào trần, công nghệ gen
Nguồn gen kháng rầy nâu được Pathak và cộng sự tìm ra từ năm 1967 tại viện lúa quốc tế (IRRI, và chương trình cải tiễn giống lúa kháng rầy nâu của IRRI đã được bắt đầu từ năm 1968 Trong 17 gen kháng rầy nâu được phân lập trên thế giới hiện nay, có 8
gen lặn và 9 gen trội Gen liên kết được công bố là bph-2 với Bph-1, và bph-3 với Bph-4
Có 7 gen được tìm thấy trên các quân thể lúa hoang đang được khai thác ở Châu Á và ở Việt Nam (Bùi Chí Bửu, 2004)
2.3.1 Sự biểu hiện tinh khang ray nâu của các giống lúa
Cơ chế về sự biểu hiện của các gene kháng rầy cịn khá ít ỏi, hiện nay người ta vẫn đang tiến hành những nghiên cứu cụ thê hơn để nắm bắt rõ cơ chế phân tử của tính kháng rầy nâu, qua đó đề ra phương án phòng trừ phù hợp Một số nghiên cứu từng được thực hiện đã đưa ra một số kết quả đáng tin cậy về cơ chế kháng rầy nâu bên cạnh các nhân tố di truyền Các cơ chế này có thể được nhóm lại như sau:
Cơ chế dinh dưỡng
Bằng phương pháp nuôi trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, người ta đã xác định được tác động của các hợp chất đường và acid amin trong môi trường dinh dưỡng lên sự phát triển và biểu hiện của rầy nâu Rây nâu chích hút làm giảm lượng đường dự trữ ở các
giống lúa mẫn cảm với rây (Loka Reddy et al., 2004) Khi nghiên cứu thành phần dinh dưỡng của một giống lúa kháng rầy Hàn Quốc, Jung và Im (2005) thấy rằng tại phần mô libe của giống kháng này có hàm lượng đường tương tự với giống lúa nhiễm, tuy nhiên
lượng đường bị rầy chích hút ở giống kháng ít hơn so với giống nhiễm Điều này chứng tỏ rằng mùi vị của lúa cũng là một yếu tố mang kháng rây, thành phần thứ yếu này đã gây cản trở quá trình tiêu hóa cũng như quá trình tiêu thụ thức ăn của rầy
Từ những năm 1970, amino acid asparagine được xem là nhân tố kích thích quá
Trang 18dưỡng nhân tạo, nếu thiếu một trong ba loại amino acid có chứa lưu huynh nhu cysteine, histindine và methionine thì sẽ làm chậm thời gian sinh trường của 4u trùng rầy và giảm sức sống Hơn nữa, nếu thiếu cả ba loại amino acid trên thì sẽ gây chết rầy trong thời kì đầu tăng trưởng (Koyama, 1985)
Mùi hương và các hóa chất thứ cấp
Saxena và Okech (1985) bằng phương pháp hóa hơi đã chiết xuất các chất tạo mùi từ các giống chuẩn nhiễm như TNI1 và một số giống kháng (Mudgo, ASD7, Rathu Heenati, Babawee, Ptb33, ARC6650) Sau một loạt các thí nghiệm đã cho thấy những chất bay hơi thu được từ các giống lúa kháng đã làm giảm sự đẻ trứng của rầy cái và giảm sức tiêu thụ thức ăn của cả đàn rây, tăng tỉ lệ chết của rầy trưởng thành và ấu trùng rây Những hợp chất hóa học thứ cấp do giống lúa kháng tiết ra đóng vai trị quan trọng trong
cơ chế kháng Ví dụ, khi cho nhiễm rây nâu lên giống lúa kháng Trung Quốc thứ B5 (có
gene kháng bphl4, bph1l5), gene Y342 mã hóa cho protein P450 được kích hoạt P450 là một loại protein trong cơ thể cơn trùng có khả năng tạo thành các loại hormone và
pheromone, nhưng vai trị chính yếu của P450 là khả năng phân giải các loại thuốc diệt
côn trùng và các chất hút được từ cây trồng (Yang et al., 2006); tuy nhiên, vẫn chưa có bằng chứng cụ thể rằng các chất hóa học có tác hại đến rầy nâu do giống kháng B5 tiết ra có sẵn hay phải được rầy nâu kích hoạt Oxalic acid do giống kháng Mudgo (mang gen bph]) tiết ra có tác dụng ngăn chặn sự chích hút của rầy nâu; tuy nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu cụ thế xem hàm lượng oxalic acid trong giống kháng Mudgo cao hơn những giống nhiễm như TN1 (Yoshihara et al., 7980) Nghiên cứu của Stevenson et al (1996) va các nghiên cứu khác trên giống kháng Ratthu Heenati cho rằng các chất hóa học thứ cấp do giống kháng tiết ra có tác dụng làm giảm sức hấp dẫn của cây lúa đối với côn trùng hơn là gây độc chúng
Bè mặt cây lúa có tác dụng giảm sự tác động của rầy nâu
Trước đây, các nghiên cứu về tương tác giữa bề mặt cây lúa và sự xâm hai cua ray nâu còn giới hạn (nghiên cứu của Woodhead va Padgham , 1988) Woodhead va Padgham
(1988) đã chiết xuất chất sáp trên bề mặt lớp cuticle của giống IR22 (chuẩn nhiễm), IR46
(mang gene bph1) va IR62 (bph3), sau d6 ho thay rang thanh phân sáp này có tác động
Trang 19ngăn ngừa sự phá hoại của rầy nâu Một nghiên cứu khác chứng tỏ bề mặt của cây lúa có tác động ngăn chặn sự chích hút của rầy nâu được tiến hành bởi Zhang và cộng sự vào năm 2004 Họ so sánh mức độ chích hút của rầy nâu trên hai giỗng B5 (chuẩn kháng) và MH63 (chuẩn nhiễm), thấy rằng ở giống B5, rây thích chích hút ở phần thân trên (nơi ít
có sáp), cịn giống MH63 rầy luôn bám vào phần thân dưới
2.3.2 Sự biểu hiện của các protein liên quan đến tính kháng rầy nâu
Tính kháng cơn trùng ở thực vật là tính trạng đa gen chịu ảnh hưởng của tác động
môi trường, thường biểu hiện khá phức tạp, tương tự sự biểu hiện của gen kháng rầy, dựa
theo nguyên tắc các gen và môi trường tương tác với nhau do đó mức độ kháng còn tùy thuộc điều kiện ngoại cảnh và gen điêu khiến Một số nghiên cứu gần đây ngoài việc nhận diện gen kháng rây, đã chú trọng nhiều hơn đến việc nghiên cứu chức năng của từng gen kháng, mức độ biểu hiện của chúng ở thời điểm cây con cho đến khi thành cây trưởng thành Bo et al (2009) đã lập bản đô và nhân gen kháng Bph14, tạo dịng thành cơng cây lúa mang gen kháng Bph14 phục vụ nghiên cứu Bph14 mã hóa cho một protein xoắn, có trình tự giàu leucine và có điểm gắn nucleotide (CC-NB-LRR protein) Nghiên cứu cho
thay trình tự giàu leucine chuyên biệt này có thể có chức năng nhận diện sự xâm nhập của
rầy nâu và sau đó khởi động phản ứng tự bảo vệ ở thực vật Gen Bph74 chủ yếu biểu hiện ở các bó mạch thân, nơi rầy nâu thường chích hút Khi bị rầy nâu xâm hại, sự biểu hiện
của gen này khởi động chu trình dẫn truyền acid salicylic, kích thích các tế bào mạch gỗ tạo thành mô sẹo và sản xuất chất ức chế trypsin, qua đó làm rây chán ăn, giảm sức sống
và kém phat trién
Một trong những gen kháng rầy đã từng được dùng rộng rãi trong công tác chọn giống là gen trội Bph3 Gen Bph3 được cho rằng giúp cây lúa tạo ra phản ứng làm rầy chán ăn Giống Rathu Heenati không có bắt kì thành phần hóa học nào giúp xua đuổi ray, và cũng chỉ có mùi vị giống như những giống lúa nhiễm rây khác Tuy nhiên, sự kháng
rầy của giống này sẽ xảy ra khi ray bắt đầu chích hút thân và lá lúa (Jairin, 2007) Trong
nghiên cứu của Jairin (2007) cho thấy chỉ có một số ít rầy có thê sống sót trên cây lúa giống Rathu Heenati ở giai đoạn tăng trưởng Những con rây sống sót đều nhẹ cân, phát
triển chậm và ít sinh sản Mặt khác, giống Rathu Heenati dễ bị rầy xâm nhiễm ở giai đoạn
trô hoa và ra hạt
Trang 20Chen et al (2004) da thuc hién nghién ctru về mật độ gây hại của rầy nâu trên các giống lúa đã được đánh giá cấp kháng rây, dùng phương pháp điện di hai chiều để xác định marker protein quy định tính kháng rây nâu Kết quả cho thấy một protein (được tác giả đặt là P40) có pI 6.3, trọng lượng phân tử 40 kDa tăng hoặc giảm đáng kế sau khi
giống chuẩn nhiễm được gây nhiễm rây trong vịng 48 giờ, và khơng thay đôi ở giống
chuẩn kháng Từ các biểu hiện sinh lý của các giống lúa sau khi được gây nhiễm rây, kết luận bước đầu cho thấy protein có kí hiệu P40 có thể có liên quan đến sự tương tác giữa rầy nâu và lúa Tuy nhiên, những nghiên cứu sâu hơn vẫn chưa được công bố
Theo Alagar et al (2009) đã nghiên cứu sự biểu hiện của một số enzyme và protein có liên quan đến chức năng bảo vệ ở thực vật được kích hoạt trong điều kiện bị ray nau chích hút ở các giống lúa kháng cao đến kháng vừa (trong đó có giédng PTB33) Nghién cứu cho thấy sự hoạt động mạnh của các enzyme peroxidase, polyphenol oxidase, phenylalanine ammonia lyase, phenol tổng và beta-1,3-glucanase sau 1 ngày bị nhiễm rầy Hoạt động của enzyme chitinase được thê hiện mạnh sau 3 ngày nhiễm rây và kéo dài hơn 1 tuân so với đối chứng âm TNI1 Nghiên cứu cho rằng các enzyme và protein này có
thê đóng góp vào cơ chế kháng rầy nâu ở lúa, đặc biệt khi bị rây chích hút (Alagar, 2009)
Nhiêu nghiên cứu được công bố cho rằng phản ứng kháng với côn trùng gây hại
của thực vật bao gdm su can bang vé ham lượng các amino acid của dịch dinh dưỡng vận
chuyên trong mô libe (Doughlas, 1993) Sự đa dạng của các amino acid trong dịch dinh
dưỡng chính là nói về hàm lượng nitơ cần thiết đối với cơ thể côn trùng, trong trường hợp
rầy nâu là asparagine và glutamine (Yamaya, 2002) Chính vì vậy mà việc bón phân đạm
khơng đúng cách chính là làm giảm sức kháng đối với rầy nâu của lúa và khiến rây có
thời gian thay đơi độc tính
Dé tim hiéu cơ chế biểu hiện về mặt điêu hòa gen trong cơ thê cây lúa giúp kháng lại ray nau, nhiéu nghién ctru da duoc thuc hién, Wang et al (2008) ding microarray va tìm ra 160 gen hoạt động đột ngột thay đổi mức biểu hiện khi có sự xâm nhập của ray nau Wei et al sir dung phương pháp phân tích hệ protein để phân tích phản ứng kháng của lúa khi bị rầy nâu chích hút Nhìn chung, các nghiên cứu đều cho rằng sự biểu hiện của các protein này đều nằm trong một chuỗi những phản ứng khác nhau, trong đó có q
trình tổng hợp nên các chất sây mùi hấp dẫn côn trùng và phản ứng khi cây có biểu hiện
Trang 21bị thương tốn (oxidative stress response), ít nhất thì hai q trình này có mức biếu hiện tăng một cách rất đáng kể khi bị ray nâu xâm nhập (Jena, 2010) Tuy nhiên, nghiên cứu về mặt biểu hiện protein cũng như thông tin về những loại protein cụ thể nào có liên quan đến phản ứng kháng rây nâu ở lúa hiện vẫn còn rất ít ỏi (Jena, 2010)
2.4 Phân tích protein kháng ray bằng phương pháp SDS PAGE và điện di hai chiều
Hệ protein cung cấp đầy đủ thông tin về sự hoạt động của tế bào sống hơn so với hệ gen Trong khi hệ gen luôn ôn định và giống nhau ở moi té bao sinh dưỡng của một sinh vật, thì hệ protein biến đỗi liên tục, phản ánh sự thay đối trong môi trường của tế bào, đồng thời phản ánh được những biến đôi bên trong và bên ngoài của tế bào Một bộ gen được giải mã hoàn chỉnh có thể khơng cung cấp đủ thơng tin về tồn bộ chức năng của tế
bào nhưng với phân tích hệ protein có thê đáp ứng được điều đó (Wei, 2008)
Tế bào thực vật thường có hàm lượng protease và các phức hợp trao đôi chất sẽ
gây cán trở rất nhiều cho quá trình ly trích, phân tách và định danh protein Phương pháp
ly trích protein tốt sẽ giúp ích rất nhiều cho cơng tác phân tích sự biêu hiện hệ protein thực vật (Wei, 2008)
Phương pháp SDS PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel
electrophoresis)
Các protein có thê được điện di trong điều kiện biến tính hay khơng biến tính
Phương pháp SDS PAGE là phương pháp thông dụng nhất để điện di protein trong điều kiện biến tính Được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực hóa sinh, sinh học phân tử để phân tích hỗn hợp protein theo trọng lượng phân tử của chúng thông qua điện di trên gel polyacrylamide
Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo sự phân tách tốt người ta dùng phương pháp điện di không liên tục (discontinuous electrophoresis) hay điện di 2 lớp
- Lớp gel tập trung (Stacking gel): nằm ở trên, giúp tập trung protein lại tạo thành một băng, lớp gel tập trung này có kích thước lỗ rất lớn (4% acrylamide) cho phép protein di
chuyên nhanh và tập trung lại đưới tác động của điện trường
Trang 22- Lop gel phan tich (Separating gel): nam ở dưới, giúp các protein từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu phân tách nhau theo trọng lượng phân tử Thông thường lớp gel này có thành phan polyacrylamide chiếm từ 10-15% tùy thuộc vào trọng lượng protein can nghiên cứu Theo nguyên tắc protein có trọng lượng phân tử càng cao thì phần trăm nồng độ gel càng nhỏ và ngược lại
Phương pháp điện di hai chiều
Phương pháp điện di hai chiều (2DGE) giúp chúng ta phân tách được hỗn hợp các protein nhờ vào sự khác nhau về điểm đăng điện của ching (pI) khi điện di chiều thứ
nhất, và khi điện di chiều thứ hai, các protein này lại tiếp tục được tách ra lần nữa nhờ vào sự khác nhau về khối lượng phân tử
Có nhiều phương pháp để phân tách protein ngoài phương pháp điện di hai chiều,
nhưng 2DGE vẫn cho kết quả phân tách protein với độ phân giải tốt nhất
Phương pháp này có ưu điểm lớn là từ một lượng mẫu rất nhỏ, chúng ta có thê kiểm tra sự biểu hiện của hàng ngàn protein cùng một lúc Sau khi các protein được phân
tách trên bản gel, có thê được chụp lại và phân tích bằng máy tính Khi tìm ra các điểm
protein thích hợp và định lượng được chúng, ta có thê so sánh hai hay nhiều mẫu protein
khác nhau hoặc có thê tạo một cơ sở dữ liệu vê các điêm protemn đó
Trang 23CHƯƠNG III PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN 3.1 Địa điễm và thời gian thực hiện
Từ tháng 6 đến tháng 11 năm 2010 tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử và phịng Cơng nghệ Enzyme của Viện Nghiên cứu và Phát triên Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học
Cần Thơ
3.2 Phương tiện và thiết bị, húa chất
Một số dụng cụ như: ống nghiệm, bình tam giác, ống nhỏ giọt, beaker, ống đong, phéu, bình định mức, prpet, buret, chày, cối
Một số thiết bị như: Máy ly tâm lạnh (Eppendort, Đức), máy do quang phé (Pharmacia
LKB - Ultrospec, Denmark), thiết bị điện di hai chiều (Bio- Rad, USA), thiết bị điện di
dimg Protean IT (Bio-Rad, USA)
Acrylamide 30% (BioRad), Tris-HCl (Merck), Amonium persulphat (APS) (Sigma), SDS (Sodium dodecyl sulfate) (Merck), N,N,N’,N’-tetramethyl-ethylenediamine
(TEMED) (Merck), Glycine (Merck), Coomassie R-250 (Merck)
Methanol (Trung Quéc), Acid acetic (Trung Quéc), Tricloroacetic acid (Merck) , Acid phosphoric (Merck), Protein chuan (Fermentas), acetone (Trung Quốc)
2D-clean up kit (Bio-rad), IPG strip 7cm, pH 3-10 (Bio-Rad) 3.3 Các giống lúa khang ray
5 giống lúa kháng rây có cấp kháng từ 0.7 đến 1.3 do Viện nghiên cứu phát triển ĐBSCL
lai tạo được chọn làm đối tượng nghiên cứu Hai giống IR 50404 và PTB33 được dùng
làm đối chứng âm, dương
Gidng Cap khang
Trang 24
PTB33 Đối chứng dương
IR50404 Đối chứng âm
(Nguồn: Viện NC & PT ĐBSCL) 3.4 Các bước tiến hành thí nghiệm
Sau khi ủ cho lên mầm, các giống được đem trồng trong từng chậu, với cùng điều kiện chăm sóc như nhau tại nhà lưới Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học Sau 20 ngày tuôi, thu hoạch lúa và mang đi trích protein theo quy trình trích protein thực vật của Phịng sinh hóa và cơng nghệ enzyme, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh
học
Đề tài bao gồm 3 thí nghiệm
3.4.1 TN 1: Hiệu chỉnh quy trình ly trích protein
Thực hiện ly trích protein bằng phương pháp SDS có bố sung TCA/Acetone, chia làm hai nghiệm thức lớn: tủa ammoniumsulphate và tủa acetone 100% lạnh
Trang 25
Thân non va lá cây lúa 3 tuần tuôi
i
Nghién min trong ni-to long
J1 Rua với 10% (TCA)/acetone màu lạnh
mercaptoethanol, ly tâm, rửa với acetone lạnh có 0.07% B-mercaptoethanol dén khi mau mat
Tricloroacetic có acid 0.07% B- 11 Dung dịch trích 1 (125mmol/l Tris-HCl, pH 6.8; 4mol/l urea, 4% SDS; 5% B- mercaptoethanol) +11 i
Dung dich trich 2 (0.175M_ Tris-HCl, pH 8.8; 5% SDS; 15% Glycerol; 0.4% B- mercaptoethanol) 41L
Vortex, ly tâm, thu dung dịch phía trên
11 11 11 Tham tích 24 giờ, thu dịch trích protein Tủa bằng ammonium sulphate
Tua bang acetone 100% lanh 11 11
Ly tâm thu phần tủa, rửa tủa trong dung dich acetone 80% lanh dén khi mat mau
xanh diệp lục, làm khô tủa
11
Hòa tủa với dung dịch đệm (Tris-HCI 7.5, 50mM), ly tam 5000v/p (Š phút) thu dịch
trích protein
Trang 26
Sau khi rửa trong dung dich TCA/acetone đến khi mẫu mất màu, chia làm 6
nghiệm thức (NT) như sau:
NT 1: dung dịch trích 1, ly tâm và thâm tích
NT 2: dung dịch trích 1, tủa bằng amonium sulphate
NT 3: dung dịch trích 1, tủa bằng acetone 100% lạnh
NT 4: dung dịch trích 2, ly tâm và thâm tích
NT 5: dung dịch trích 2, tủa bằng amonium sulphate NT 6: dung dịch trích 2, tủa bằng acetone 100% lạnh
Đề tủa vừa khơ thì hịa tủa với dung dịch đệm (Tris-HCI 7.5, 50mM), ly tâm 5000v/p thu dịch trích protein
v_ Đo nơng độ protein bằng phương pháp Bradford (1976) ( phụ lục 1)
Y Chay điện di SDS-PAGE (Leammili, 1970) (phụ lục 2) để kiểm tra chất lượng
protein trích được
Sau khi kiểm tra trên gel SDS PAGE, ghi nhận những giống có sự khác biệt rõ tệt
(khác biệt ở nhiều băng) để quan sát trong Thí nghiệm 2 (điện di hai chiêu)
3.4.2 TN 2: Kiém tra chất lượng protein trích được và ghỉ nhận sự khác biệt (nếu có) của hệ protein giữa các giống bằng SDS-PAGE
Đồ gel điện di polyacrylamide nồng độ 10% để kiêm tra sự khác biệt các băng protein giữa các giống khác nhau, qua đó kết luận sơ bộ mức độ biểu hiện protein trong từng giống, độ đậm nhạt, có hay khơng có những băng đặc trưng
3.4.3 TN 3: Tiến hành điện di hai chiều
- Điện di chiều thứ nhat IEF (Isoelectric Focusing) (phu luc 3 va 4)
+ Su dung cac thanh dién di (IPG Strip, Bio-Rad) cé gradient pH từ 3-10
+ Tién hanh dién di
Trang 27
- Dién di chiéu thir hai SDS-PAGE
+ Gel phan tich 10% acrylamide dé chay SDS-PAGE cho dién di hai chiéu va khong can gel tap trung
v Chụp hình gel và phân tích kết quả bằng phan mém PDQuest
Trang 28CHUONG 4 KET QUA VA THAO LUAN
4.1 Thí nghiệm 1: Hiệu chỉnh quy trình ly trích protein lá lúa
Bảng 1: Nông độ protein thu được qua các phương pháp ly trích khác nhau
Nghiệm thức Hàm lượng protein thu hôi (mg) Hiệu suất thu hôi (%)
1 1,032 0,0516 2 0,203 0,010184 3 0,093 0,00469 4 1,4 0,0704 5 0,0107 0,00536 6 0,299 0,01495
Kết quả đo OD kiểm tra nồng độ protein cho thay nồng độ protein ở nghiệm thức 6
là cao nhất, kế đến là nghiệm thức 2 Tuy nhiên, để biết được chất lượng protein thu
được có tương ứng với nồng độ hay không cần thêm bước kiểm tra trên gel SDS PAGE
1 : thang chuan (kDa) ; 2 : NT1 °3:NT2;4:NT3;5:NT4;6:NT5;7: NT6
Hình 2 : Pho dién di SDS kiém tra nông độ protein
Tuy pheba githig Eib33rquàncđónhbœúg paapily ttich &hdeotbiawao, nhung thé
tích dung dịch protein thấp, chưa tới 200 pl, khong da dé chay dién di hai chiéu Mat
Trang 29
khác, protein thu được bằng phương pháp này rất dễ bị ảnh hưởng nếu nồng độ acetone trong dung dịch tủa còn quá cao Bên cạnh đó, nồng độ protein và kết quả kiểm tra trên
hinh gel cho thay NT 3.4 cho kết quả trên gel đẹp nhất, các band rõ và có độ phân giải
khá tốt, nồng độ protein tương đối cao (563.8 g/ml) , thé tich dung dịch protein thu được cao (2.5 ml), có thê cơ cạn lại để làm tăng nồng độ Theo Ragnar Flengsrud (2009) thì việc ly trích protein thực vật rất khó khăn do hàm lượng protein trong thực vật thấp
hơn trong động vật và vi sinh vật rất nhiều Bên cạnh đó, đối tượng ly trích là lá tươi nên
sự hiện diện của các protease, phenoloxidase, oxidase và các hợp chất tạo màu làm giam
hiệu suất của q trình ly trích protein rat nhiéu (Méchin et al., 2007)
Bằng phương pháp ly trích protein cải tiến, hiệu suất hàm lượng protein thô thu được (giống Ptb33) vào khoảng 0.0704% (tính bằng cơng thức : hàm lượng protein thu được sau khi ly trích trên khối lượng lúa đầu vào), cao hơn gấp 4 lần so với phương pháp ly trích thơng thường của Lâm Phan Tùng Anh (2009) Theo Wei (2008), việc nghiên
mẫu trong nitơ lỏng cho thật mịn giúp tế bào thực vật tiếp xúc tốt với dung dịch trích và
do đó hiệu suất protein thu được cao hơn, mặt khác, dùng dung dịch TCA/acetone lạnh
để rửa mẫu giúp hòa tan bớt các thành phần gây nhiễm protein như sắc tố, các hợp chất
có chứa phenol, ngồi ra cịn giúp bất hoạt các protease gây biến tính protein (Wei, 2008)
Vậy quy trình ly trích protein từ lá lúa có hiệu chỉnh là phương pháp TCA/acetone có bơ sung dung dịch trích theo phương pháp SDS, ly tâm rồi thâm tích
2 Thí nghiệm 2: Phố điện di hệ protein của các giống lúa kháng ray bang phương pháp SDS PAGE
Trang 30
0: thang chuẩn (kDa); 1: MTL638; 2: MTL643; 3: MTL649; 4: MTL651; 6: MTL657;
7: PTB33 (đối chứng đương); 8: IR50404 (đối chứng âm)
Hình 3 : Phố điện di SDS PAGE hệ protein của các giống lúa kháng rầy
Nhìn chung, hệ protein của các giống lúa biểu hiện tương đối đồng đều về nồng độ
và trọng lượng phân tử, nơng độ protein trích được cao và có độ tỉnh sạch khá tốt do các
băng thê hiện đậm và rõ nét Nhận thấy các protein tập trung chủ yếu ở các vùng có trọng
lượng phân từ từ 57-30 kDa và 18,4-14,4 kDa, đây có thể là vùng dễ tìm thấy sự xuất
hiện của các protein khác biệt, hai giống ở giếng 1 và giếng 2 protein phân bố đều hơn các giống còn lại Ngoài ra, tại băng có trọng lượng phân tử từ 50-56 kDa, các protein còn tập trung thành một khối lớn chứng tỏ còn nhiều protein và hàm lượng của chúng tại vùng này rất cao, chưa thể phân tách rõ rệt Đây cũng là nhược điểm của phương pháp điện di SDS PAGE Tuy nhiên, với kết quả điện di bước đầu cho thấy nồng độ và chất lượng
protein trích được là khá tốt, thích hợp đề tiếp tục điện di hai chiều
3 Thí nghiệm 3: Kết quả điện di hai chiều protein của các giống lúa kháng rầy
So với kết qua dién di SDS PAGE, sau khi dién di hai chiéu, protein cua cac gidng lua
biểu hiện sự khác biệt rất rõ rệt, đặc biệt là ở vùng có khối lượng phân tử 57-30 kDa và
Trang 31
18,4-14,4 kDa, điều này phù hợp với kết quả điện di SDS PAGE Tông số điểm thê hiện
trên gel dao động từ 60 đến 90 điểm với độ phân giải khá cao, các điểm phân bố đều toàn bộ gel, vùng nên của gel sáng đẹp, cho thấy đây là kết quả điện di hai chiều tốt (Pedersen, 2002) Số lượng điểm protein thê hiện trên gel hai chiều đa dạng hơn gấp đôi so với kết
quá điện di hai chiều protein lá lúa của Lâm Phan Tùng Anh (2009) và Trần Song Nguyên
Khôi (2009) (60-90 so với 30-50 điểm), nhất là các protein ở vùng có trọng lượng phân tử lớn (66,2-110 kDa, 40-56 kDa), đây có thê là do công dụng của bước rửa mẫu trong TCA giúp làm bất hoạt các protease (Wei, 2008), giúp giảm hàm lượng protein hao hụt trong q trình ly trích, nhất là các protein có trọng lượng phân tử cao đễ bị biến tính thành các protein nhỏ, và một số hiệu chỉnh trong quá trình làm lạnh dịch protein cũng giúp hạn chế sự biến tính protein bởi nhiệt Điều này chứng tỏ quy trình ly trích protein hiệu chỉnh là quy trình phù hợp để trích protein lá thực vật trong điện di hai chiều Nhìn chung, các protein phân tách trên gel hai chiều khá đồng đều ở tất cả các giống, tập trung chủ yếu ở vùng có trọng lượng phân tử từ 66,2 đến 11,4 kDa, pI từ 4 đến § Đặc biệt, các protein phân tách chưa rõ trên gel SDS PAGE khi chạy hai chiều cho ra nhiều điểm khác biệt rất rõ ràng cả về trọng lượng phân tử và pI (vùng từ 66,2-14,4 kDa va thậm chí nhỏ hơn) Băng protein đậm có trọng lượng 50-56 kDa trên gel SDS PAGE khi thê hiện trên gel 2D là dãy protein hiện diện ở tất cả các giống (kế cả đối chứng âm) (vùng nét đứt)
e So sánh hai giống đối chứng pH
v
an
116
Mw
Chuyên ngành Công nghệ sinh hoc 19 Viện NC & PT Công nghệ sinh học
Trang 32: fs Mr 28,9, + Mie, AI & š pI#2 : à ` rr ` : ầ " HP kè “ ` 800 r 23,8, Í a t a“ pl 6,8 Mr 16,4, > © pl 5,1 Ni: i z Mx,pl 5B m m ® y
» Match symbols (matched:64 unnatched:2)
A ° 4 A K e wv
Đôi chứng âm Đơi chứng dương Hình 4: So sánh hai giống đối chứng âm và dương
Ngoại trừ những protein đặc trưng của cây lúa được biêu hiện thì nhìn chung, bản gel của hai giống đối chứng có khá nhiều điểm khác biệt Gel của giống đối chứng âm có tất cả 80 điểm, gel giống đối chứng dương có 72 điểm, hai giống có tỉ lệ tương đồng là 61,79 % (tính từ tỉ lệ các điểm không bắt cặp với nhau trên hai gel trên tông số điểm trên gel đối chứng dương) Mức độ biểu hiện protein ở các điểm giống nhau là khá đồng đều, trong đó các điểm khác biệt trên gel đối chứng âm so với đối chứng dương tập trung chủ yếu ở vùng pH từ 8-10 (vùng ba zơ), còn trên đối chứng dương so với đối chứng âm là vùng pH 3-5,2 (vùng axit) Tuy nhiên, kết quả so sánh tông thể cho thấy ít nhất có 4 điểm khác biệt giữa hai giống đối chứng, đây cũng là 4 điểm khác biệt chủ yếu ở tất cả các giống kháng khác so với đối chứng âm, bao gồm các
điểm có khối lượng phân tử và pI lần lượt là 44.2 kDa, pI 5.2; 28.9 kDa, pI 6.6; 23.8
kDa, pI 6.8; 16.4 kDa, pI 5.1
e Giống MTLó638
Trang 33
: aT
16.0, 9.00) Ƒ hid 116.0, 3.00)
Đối chứng âm MTL638
Hình 5: So sánh MTL638 với đối chứng âm
Tông quan cho thây các điệm protein của giông đôi chứng âm dày đặc và tập trung
hơn giỗng MTL638 Gel đối chứng âm có 67 điểm, giống MTL638 có 60 điểm, tỉ lệ
tương đồng 62,72% , các điểm khác biệt giữa hai giống nằm rải rác ở vùng pH từ 5- 7,5 Ngồi ra, cịn một dai cac protein có cùng pI vào khoảng 8-9 xuất hiện rất rõ trên bề mặt gel (vòng tròn nét chấm), đặc biệt là những protein có trọng lượng phân tử
thấp, nhỏ hơn 14,4 kDa fer 6.0, 3.00} 6.0, 3.00) a ig ¡ EM BA tela Joa, 7.30) ; II S1 Đối chứng dương _MTL638
Hình 6: So sanh MTL638 voi doi chứng dương ¬ Nhìn chung bản gel của MTL638 và đôi chứng dương khác nhau khá rõ rệt Sô điêm
trên gel của đôi chứng dương là 72, của MTL638 là 75, tỉ lệ tương đồng là 71,59% Ngoài
một số điểm trùng nhau, giỗng MTL638 cịn có thêm một số điểm khác biệt trên vùng pH
Trang 344 (Mw 27,3, pI 3,7) và pH 6-7,5 (vùng khoanh tròn) và các điểm (Mw 64,3, pI 6,9; Mw 16,9, pI 7,3) e« Giống MTLó643 ees 3.00) Mw le 26,5, OL ili 3, = ¥ eee ~ Đối chứng âm MTL643 -
Hình 7: So sánh MTL643 với đôi chứng âm
So với các giống lúa khác thì giống MTL643 biểu hiện ít protein hơn, tổng số điểm
protein trên gel đối chứng âm là 67 điểm thì gel MTLó643 chỉ có 54 điểm, tỉ lệ tương đồng là 63,01% Những điểm khác biệt chủ yếu giữa hai gel nằm rải rác trong khoảng pH từ 4- 7 (những vùng khoanh tròn) Hai điểm có trọng lượng phân tử và pI lần lượt là 93,1 kDa,
pI 5,5 ; 26,5, pI 3,7; 44,5, pI 6,2 là những điểm khác biệt đặc trưng giữa giống MTL643
và đối chứng âm, điểm có trọng lượng phân tử 26,5 kDa, pI 3,7 cũng có xuất hiện trong sự khác biệt giữa giống MTLó638 và đối chứng âm
Trang 35
a Soa 7 eee - @ rama Đối chứng dương MTLó643 `
Hình 8: So sánh MTLó643 với đôi chứng dương
Tuy giỗng MTLó643 biêu hiện protein ít, nhưng nhìn chung vẫn thấy rõ sự khác biệt so
với đối chứng dương Đối chứng dương có 72 điểm trên gel thì MTL643 có 54 điểm, tỉ lệ tương đồng xấp xỉ 71,3% Khác với giống MTL638, MTL643 không chứa điểm khác biệt
so với đôi chứng dương ở vùng pH 8 mà chỉ có khác biệt ở vùng pH axit Đáng chú ý nhất là điểm có trọng lượng phân tử 36.5, pI 3.7, đây là điểm khác biệt giữa giống MTL643 so với cả hai đối chứng âm và dương, điểm này cũng xuất hiện trên gel của gidng MTL638
e Giống MTLó649
Đối chứng âm MTL649
Hình 9: So sánh MTL649 với đối chứng âm
Trang 36
So với đối chứng âm thì số điểm giống MTLó649 thê hiện khá đồng đều, trong khi đối chứng âm có 67 điểm thì MTL649 có 70 điểm, tỉ lệ tương đồng là 64,2%, các điểm
khác biệt vẫn năm rải rác trong vùng pH từ 4-7 Tuy nhiên, ở vùng pH 9, giống MTL649 cịn có một cụm các protein cùng pI nhưng khác nhau về trọng lượng phân tử biểu hiện với nồng độ khá cao (vùng khoanh tròn nét liền), trong khi đó, các protein ở giống đối chứng âm biểu hiện tại vùng này khá mờ nhạt và rời rạc Vùng protein khác trọng lượng phân tử nhưng giống nhau về pI này cũng biểu hiện mạnh ở giống MTLó643 và đối chứng dương 18.0, 3.00) = 16.0, 3.00) và b ¡1 jee R Đôi chứng dương MTL649
Hình 10: So sánh MTLó649 với đối chứng dương
So với các giống khác thì giống MTL649 có sự tương đồng khá lớn với đối chứng
dương Gel đối chứng dương có 83 điểm thì gel MTL649 có 70 điểm với tỉ lệ tương đồng là 84,91% Ngoài những protein được biểu hiện giống nhau, một số protein từng biêu hiện trên giống đối chứng lại vắng mặt trên gel MTLó649, thay vào đó là sự có mặt của hai protein có plI rất gần nhau 5.5 và 5.6 (đều ở vùng pH axit) và có khối lượng phân tử khá
nhỏ, lần lượt là <14.4kDa và 27.2 kDa
e Giống MTL65I
Trang 37
i 3.00) j 7 ' Ỉ 116.0, 3.00) : mã o Hae fa] is] Đối chứng âm MTL651
Hinh 11: So sanh MTL651 voi đối chứng âm
Trong khi MTL649 tương đông lớn với đối chứng dương thì so với các giống còn lại, giống MTL651 là giống có sự tương đồng với đối chứng âm cao nhất Các điểm
protein thê hiện trên hai gel rất đồng đêu, đối chứng âm có 67 điểm thì MTL651 có 76 điểm, tỉ lệ tương đồng là 78,1% Do giống MTL651 là kết quả ưu thế lai giữa cây mẹ
IR50404 (đối chứng âm) và cây cha MTL250 nên hệ protein của giỗng MTL651 có tỉ lệ
tương đồng cao đối với đối chứng âm là điêu có thể giải thích được Tuy tỉ lệ tương đồng
rất lớn, nhưng MTL651 vẫn là giỗng kháng rầy mạnh với cấp kháng 0.7, kết quả phân tích trên gel cho thấy có ít nhất 7 điểm khác biệt chủ yếu giữa MTL651 và đối chứng âm, nằm rải rắc trong vùng pH từ 4-7 (vùng khoanh tròn) Điều này càng khẳng định giả thiết rằng sự biểu hiện của các protein này có liên quan mật thiết đến tính kháng rây nâu của lúa Đây có thể là cơ sở để xác định được vị trí của các protein liên quan đến tính kháng rầy trên các giông lúa được chọn làm thí nghiệm
Trang 38
pies 3.00) | : ; Mr 27 aa 6.9, 7.20% 4 a: 7.30 i a Meee i
Doi chimg duong MTL651
Hình 12: So sanh MTL651 với đối chứng dương
Nhìn chung MTL651 và đối chứng dương cũng có sự tương đồng tương đối cao Gel
đối chứng có 83 điểm thì gel MTLó651 có 82 điểm, tỉ lệ tương đồng giữa hai gel là 69,52% Vì giống MTL651 có nguồn gốc từ phép lai IR50404/MTL250 nên hệ protein
của nó có sự tương đồng rất lớn với đối chứng âm, ví dụ như những protein nằm trong khoảng pH rất kiêm Tuy nhiên, khi so với cá hai đối chứng để tìm những điểm protein khác biệt thì xuất hiện các điểm protein có trọng lượng phân tử và pI lần lượt là 29,3 kDa,
pl 5,1; 71 kDa, pI 5,2; 27 kDa, pI 7.7, 18,9 kDa pI 7,2 déu nam trong ving pH tir 5-7 e Giong MTL657
rt 16.0, 3.00)
mao © ome le]
te | E] K © wv A Doi chung 4m MTL657 ` “ # 9 AK ° wv ^
Hình 13: So sanh MTL657 voi doi chứng âm
Trang 39Khác với MTL651, MTL657 thể hiện sự ít tương đồng với đối chứng âm Gel của
đối chứng âm có 67 điểm thì gel của MTLó657 có 80 điểm với tỉ lệ tương đồng là 62,72%
Cũng như các giống lúa khác vừa được phân tích, các điểm khác biệt giữa đối chứng âm và MTL657 cũng nằm rải đều trong vùng pH từ 4-7
3, 3.00) 6.0, 3.00)
Đối chứng dương MTL657
Tuong tự như giống NITL 649, MỸI 657 cũng the điện sự tương đông rất lớn đối với đối chứng dương Gel đối chứng có 80 điểm thì gel MTL657 có 83 điểm với tỉ lệ tương đồng là 78,4% Các điểm protein trên gel MTL657 tập trung chủ yếu ở vùng pH 5- 7,5 Các điểm protein khác biệt cũng xuất hiện ở vùng pH này, chúng có trọng lượng phân
tu va pl lần lượt là 44 kDa, pI 6,1; 44,4 kDa, pI 7,1; 39,4 kDa, pI 7,3 v.v
Dựa vào các điểm tương thích và khơng tương thích giữa các giống trên gel hai chiều, lập ma trận nhị phân và vẽ giản đồ phả hệ biểu thị sự tương quan về mặt di truyền giữa các giông:
Trang 40IR50404(-) MTL651 MT L638 |MTL649 'PTB33(+) MTL657 MTL645 6.75 Coefficient 085
Hình 15 Gian đồ phả hệ các giống lúa thông qua điện di hai chiều
Bảng 2: So sánh độ tương đồng (%) giữa các giống so với đối chứng âm và dương
trên gel điện di hai chiều
IR50404 MILó3 MILó43 MILó49 MILó5SI MTL657 8 IR50404 MTL638 62,72 MILó43 63,01 69,82 MTL649 64,2 69,52 71 MTL651 78,16 66,27 62,72 66,56 MTL657 62,72 69,23 66,86 73,07 PTB33 64,79 71,59 71,3 84,91 78,4
Dựa vào giản đồ phả hệ ta thấy sự tương quan di truyền giữa các giống là tương đôi cao, từ 70% trở lên ở tât cả các giông Một sơ giơng có sự tương đồng tât lớn với đôi
chứng âm (MTL651) hoặc với đối chứng dương (MTL649, MTL657) chứng tỏ đây có thể
là các kết quả ưu thể lai dé tìm ra tơ hợp gen cho tính kháng rầy mạnh
Dựa vào kết quả dị tìm marker protein có liên quan đến tính kháng rầy cho thay hầu hết các điểm protein khác biệt giữa các giống lúa kháng so với hai đối chứng dương và âm đêu nằm trong khoảng pH từ 5-7,5 Ngồi ra, có ít nhất 4-6 điểm protein với trọng