Tìm hiểu về quá trình tăng trưởng và tích lũy dầu ở củ cỏ gấu cyperus esculentus l (tóm tắt)

1 CHƯƠNG MỞ ĐẦU Cỏ gấu Cyperus esculentus L cho dầu có tiềm năng, củ chứa từ 20 % đến 36 % dầu (Muhammad cs., 2011) Hơn nữa, cỏ gấu dễ trồng, xuất nhiều nơi giới phát triển tốt đồng ruộng ngập nước, cho củ ăn được, giàu carbohydrate đặc biệt dầu có thành phần tương tự dầu oliu (Linssen, 1988, Guldhe cs., 2013) Vấn đề đặt là, điều kiện sinh trưởng tự nhiên định trình chuyển hóa để tạo tinh bột hay chất béo củ? Giải câu hỏi giúp ta hiểu rõ chế điều phối hình thành hai nhóm chất dự trữ (tinh bột dầu) mà còn giúp ta kiểm soát hình thành giọt dầu Đề tài “Tìm hiểu trình tăng trưởng tích lũy dầu củ cỏ gấu Cyperus esculentus L.” tiến hành để góp phần tìm hiểu trình tăng trưởng củ tích lũy dầu củ, từ tìm phương pháp hợp lý để gia tăng suất củ hàm lượng dầu củ, đặc biệt dầu cho nhiên liệu sinh học CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU Ba thứ cỏ gấu Cyperus esculentus L.: esculentus, sativus hermanii mọc hoang hay trồng Những thí nghiệm sơ khởi thực ba thứ cỏ gấu Kết cho thấy thứ esculentus xuất phổ biến ruộng ngập nước (ở Tiền Giang Long An), so với hai thứ hermanii sativus, nên tập trung nghiên đề tài nà 2.2 PHƯƠNG PHÁ 2.2.1 Theo dõi phát triển ba thứ cỏ gấu ruộng ngập nước mùa mưa mùa khô, từ trồng ruộng ngập nước vườn thực nghiệm, sau lập đường cong tăng trưởng củ thứ esculentus cách xác định trọng lượng tươi trọng lượng khô, từ tuần 1- tuần 14 2.2.2 Quan sát hình thái giải phẫu củ, cuống phát hoa cỏ gấu, sau nhuộm hai màu dung dịch lugol (I2KI) 2.2.3 Phân tích số tiêu sinh lý hóa học củ 2.2.3.1 Đo cường độ hô hấp quang hợp máy Hansatech với điện cực oxygen 2.2.3.2 Xác định trọng lượng tươi khô củ: cân để xác định trọng tươi, sau sấy khô đổi để xác định trọng lượng khô 2.2.3.3 Xác định hàm lượng đường tinh bột củ theo Combs cs (1987): Ly trích đường ethanol Phần bã lại chứa tinh bột sấy khô thủy giải acid percloric Thực phản ứng màu với phenol 5% acid sulfuric đậm đặc đo mật độ quang (OD) bước sóng 490 nm, để xác định lượng đường tinh bột nhờ đường cong chuẩn với dung dịch sucrose glucose 2.2.3.4 Định lượng đạm tổng số củ theo phương pháp MacroKjeldahl (Hancoock, 1984): Chất đạm vô hóa acid sulfuric, amonium sulfat sinh tác dụng với NaOH để phóng thích NH NH3 lôi máy Parnas – Wargner đến Erlen chứa H 2SO4, lượng H2SO4 thừa định phân NaOH N/100, để suy lượng nitrogen 2.2.3.5 Định lượng lipid tổng số củ theo phương pháp Soxhlet (Hancoock, 1984): dùng ete nóng để hòa tan chất béo, sau để bay ete, cân chất béo lại, tính hàm lượng lipid 100 g mẫu 2.2.3.6 Đo hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật củ: AIA, cytokinin, gibberellin, ABA dạng tự do, ly trích, phân đoạn sắc ký, cô lập, đo hoạt tính nhờ sinh trắc nghiệm (Bùi Trang Việt, 1992), Yokota cs.,1980) 3 2.2.3.7 Phân tích thành phần acid béo dầu cỏ gấu theo phương pháp sắc ký khí, Viện nghiên cứu Dầu có dầu TP Hồ Ch1 Minh 2.2.4 Kiểm tra biểu gen WRI1 cỏ gấu Tách chiết RNA mRNA Purification Kit (Thermo, Hoa Kỳ), loại bỏ DNA DnaseI (Thermo, Hoa Kỳ) Nồng độ RNA xác định máy đo quang phổ, trước µg RNA tổng dùng để tổng hợp cDNA cDNA Kit (Thermo, Hoa Kỳ) Định lượng Real-Time PCR phân tích kết 2.2.5 Đo hàm lượng nước đất (độ ẩm đất) cách xác định chênh lệch trọng lượng tươi khô đất 2.2.6 Thí nghiệm cắt quan 2.2.6.1 Dùng khúc cắt phòng thí nghiệm Cây cỏ gấu thứ esculentus 10 tuần tuổi mang cuống phát hoa cấp bắc dùng cách cắt 1, 12 tuần tuổi mang hoa dùng cách cắt - Các khúc cắt với cuống phát hoa cấp dài 10 cm, sau kiểu cắt bỏ quan khác nhau, đặt bình chứa sẵn 100 ml nước cất: (1) Đặt xuôi phần cuống phát hoa cấp (cây 10 tuần tuổi), (2) Đặt xuôi phần cuống phát hoa cấp (cây 12 tuần tuổi), (3) Đặt xuôi cuống phát hoa cấp (như nghiệm thức 2), sau cắt bỏ phát hoa cấp hai, (4) Đặt ngược cuống phát hoa cấp hai, sau cắt bỏ phát hoa cấp hai (như nghiệm thức 3), (5) Đặt xuôi phần gốc cuống phát hoa cấp với gốc giữ lại, (6) Đặt ngược phần gốc cuống phát hoa cấp với gốc giữ lại (như nghiệm thức 5) Lượng đường thoát môi trường nước xác định sau 48 (theo 2.2.4.3) 2.2.6.2 Cắt quan vườn thực nghiệm Cây cỏ gấu thứ esculentus 12 tuần tuổi mang hoa trồng điều kiện ngập nước, vườn thực nghiệm, dùng để thực thí nghiệm cắt quan: (1) Cây để nguyên, (2) Cắt phần phát hoa cấp hai bắc cấp hai, (3) Cắt bắc cấp giữ lại phát hoa cấp hai, (3) Cắt thân, (4) Cắt phần phát hoa cấp bao gồm tất bắc phát hoa, (5) Cắt phần phát hoa cấp (như nghiệm thức 5) thân Hàm lượng sucrose đoạn cuống phát hoa cấp xác định (theo 2.2.4.3) vào lúc 16 thí nghiệm ban ngày giờ, 24 thí nghiệm chiều-tối 16 ngày 2.2.7 Tích lũy lipid lát cắt củ 2.2.7.1 Xử lý chất điều hòa tăng trưởng thực vật chất khác Lát cắt ngang qua phần củ tuần 10, đường kính 2,5 mm, dày mm, đặt nuôi Erlen chứa 20 ml môi trường MS không đường (đối chứng), IAA mg/l, ABA mg/l, BA 10 mg/l, ethrel 400 mg/l, GA 20 mg/l, NaCl 5g/l, paclobutrazol (PBZ) 2g/l, thiourea g/l, hay KNO g/l Sau tuần nuôi cấy, xác định trọng lượng tươi khô, hàm lượng lipid lát cắt 2.2.7.2 Thay đổi cân nước - Lát cắt ngang qua phần củ thứ esculentus, tuần 8, 9, 10, 11 12, đường kính 2,5 cm , cao mm, nuôi Erlen chứa 15 ml môi trường MS với mannitol 0, 20, 40, 60 80 g/l - Lát cắt đặt đĩa Petri, điều kiện ngập nước (mực nước cất cao mặt khúc cắt mm) hay chồng giấy thấm ẩm (dày mm) Sau tuần, xác định trọng lượng tươi khô, hàm lượng lipid lát cắt củ 2.2.8 Tăng trưởng tích lũy lipid củ theo lượng nước đất Củ trồng vườn thực nghiệm, điều kiện: (1) “Ngập nước”: giữ mực nước ngập đất cm, (2) “Tưới nước”: tưới vào lúc 10 sáng, theo ba cách: ngày, ngày ngày lần, (3) “Ngập tưới”: ngập nước 2, 6, 10 hay 14 tuần, sau để thoát nước, tưới nước ngày lần Sự tăng trưởng củ cỏ gấu theo dõi theo thời gian Trọng lượng tươi khô, hàm lượng lipid tổng số củ phân tích 2.2.9 Xử lý giúp tăng sinh khối tích lũy lipid ruộng ngập nước 12 tuần tuổi mang hoa 2.2.9.1 Xử lý mùa mưa, lũ ● Trong điều kiện ngập nước: (1) Đối chứng ngập nước tự nhiên, (2) Cắt hoa: cắt bỏ mang tất bắc hoa, (3) Cắt hoa phun GA3: cắt bỏ phun GA3 (lên phần khí sinh lại) ● Trong điều kiện tháo nước: (1) Đối chứng: ruộng tháo cách tạo rãnh dẫn nước, (2) Cắt ngọn: cắt bỏ mang tất bắc hoa, (3) Xới gốc: xới đất xung quanh gốc cây, (4) cắt xới gốc, (5) Cắt phun GA3 20 mg/l, (6) Cắt ngọn, xới gốc phun GA3 20 mg/l Sau tuần xử lý, xác định hàm lượng đường, tinh bột lipid tổng số củ 2.2.9.2 Xử lý mùa khô Trồng thứ esculentus ruộng ngập nước, thực thí nghiệm 12 tuần tuổi: (1) Đối chứng, (2) Cắt hoa, (3) Xới đất, (4) Cắt hoa xới đất, (5) Phun GA3 20 mg/l, (6) Phun GA3 20 mg/l cắt hoa, (7) Phun ethrel 400 mg/l, (8) Phun KNO3 g/l, (9) Phun NaCl g/l, (10) Tưới PBZ, (11) Phun PBZ g/l, (12) Phun thiourea g/l, (13) Phun thiourea g/l tưới PBZ g/l Sau tuần xử lý, đo chiều dài cuống phát hoa, xác định trọng lượng tươi khô, lipid tổng số củ 2.2.9.3 Xử lý cắt hoa mùa khô: Cây 10 tuần tuổi (chưa hình thành hoa) dùng thí nghiệm: (1) Cắt hoa, (2) Xới gốc (để so sánh với xử lý cắt hoa), (3) Cắt hoa xới gốc, (4) Cắt hoa phun PBZ g/l, (5) Cắt hoa phun thiourea g/l, (6) Cắt hoa, xới gốc phun thiourea 1g/l, (7) Cắt hoa, xới gốc phun thiourea PBZ g/l Sau tuần xử lý, trọng lượng tươi khô, hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật, lipid tổng số củ phân tích 2.2.10 Bố trí thí nghiệm xử lý thống kê Các thí nghiệm bố trí theo khối hoàn toàn ngẫu nhiên số liệu bảng xử lý theo chương trình SPSS phiên 16.0 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ 3.1.1 Chu trình phát triển ba thứ cỏ gấu ● Quan sát thời điểm Trong môi trường đất ruộng ngập nước, vào tháng 5-6/2011, Tiền Giang, cỏ gấu thứ esculentus tăng trưởng thành bụi 10 - 15 cây, phân thành bốn nhóm: nhóm có - mang hoa trái, nhóm có - mang phát hoa với hoa thấy mắt thường, nhóm có - thấp mang cuống phát hoa, chưa xuất nụ hoa, nhóm có - chưa xuất cuống phát hoa xung quanh mang hoa trái ● Quan sát theo thời gian Trong môi trường đất ruộng ngập nước, tuần tuổi có - thân dạng hoa hồng Ở tuần 6, cuống phát hoa cấp xuất mang ba bắc cấp Ở tuần 10, cuống phát hoa cấp hai với ba bắc cấp hai xuất bắc cấp Ở tuần 12, cuống phát hoa cấp mang tổng cộng chín phát hoa ba bắc cấp một, bắc cấp mang ba bphát hoa cấp hai, cuống phát hoa cấp hai có bắc riêng Đến uần 14, hoa trở thành trái 7 ● Đường cong tăng trưởng thay đổi hàm lượng lipid củ thứ esculentus Trên ruộng ngập nước, củ cỏ gấu thứ esculentus trồng từ củ mẹ (ở giai đoạn 14 tuần tuổi) tăng trưởng theo đường cong gồm ba giai đoạn, dựa vào thay đổi trọng lượng tươi, trọng lượng khô: - Giai đoạn củ tăng trưởng chậm từ tuần đến cuối tuần Giai đoạn củ tăng trưởng nhanh từ đầu tuần đến cuối tuần 12 Giai đoạn củ giảm tăng trưởng từ đầu tuần 13 đến cuối tuần 14 Hàm lượng lipid tăng theo tăng trưởng củ, từ giai đoạn tăng trưởng chậm đến giai đoạn tăng trưởng nhanh, đạt mức cao tuần 12 Sau tuần 12, hàm lượng lipid giảm với giảm trọng lượng tươi khô củ (hình 3.1) Hình 3.1 Đường cong tăng trưởng củ cỏ gấu thứ esculentus theo thời gian (với mẫu tự khác hình biểu khác biệt có ý nghĩa mức p = 0,05) ● Cách phát triển củ Trong môi trường đất ruộng ngập nước, ba thứ cỏ gấu có hệ thống rễ thân ngầm phức tạp đất Các củ bụi có kích thước giai đoạn phát triển khác nhau: (1) Củ nhỏ, mang 3-9 thân, (2) Củ vừa, mang hoa củ mang mầm chồi, (3) Củ lớn mang trái mầm ngủ củ phát triển thành ● Quan sát vườn thực nghiệm Ở thứ esculentus, cách tạo củ trực tiếp từ củ tăng trưởng quan sát từ tuần ba nghiệm thức: ngập nước, tưới ngập tưới Cách tạo củ gián tiếp qua thân bò xảy sau tuần môi trường ngập nước, không xảy điều kiện tưới 3.1.2 Quan sát hình thái giải phẫu Ở lát cắt ngang, thân hay bắc cỏ gấu có cấu trúc tương tự: bó mạch xếp theo vòng, gân có tế bào bóng, nhiều khoảng khuyết mô mềm, có vòng bao mô cứng quanh bó mạch Tế bào vòng bao bó mạch cuống phát hoa cấp chứa tinh bột Cấu trúc biểu bì củ hóa mô cứng tuần Có nhiều giọt dầu tập trung vùng mô mềm trụ Mô phân sinh dày cấp diện phần ngoại vi củ Khi củ tượng, bó mạch hình thành hướng tâm từ mô phân sinh dày Sau đó, số bó mạch gia tăng ngày nhiều lớp mô phân sinh dày phân chia mạnh ngày thứ 10 Đến tuần 2, mô phân sinh dày cấp hai xuất với vách tế bào tẩm lignin Ở ruộng ngập nước, củ cỏ gấu thứ esculentus trồng từ củ mẹ tăng trưởng theo ba giai đoạn, dựa vào thay đổi trọng lượng tươi khô: (1) chậm từ tuần đến cuối tuần 5, (2) nhanh từ đầu tuần đến cuối tuần 12, (3) giảm tăng trưởng từ đầu tuần 13 đến cuối tuần 14 9 3.1.3 Sự tích lũy dầu củ môi trường đất ruộng ngập nước Hàm lượng lipid tăng theo tăng trưởng củ, từ giai đoạn tăng trưởng chậm đến tăng trưởng nhanh, đạt mức cao tuần 12 Sau tuần 12, lipid giảm với giảm trọng lượng tươi khô củ CĐHH giảm từ giai đoạn củ tăng trưởng chậm sang tăng trưởng nhanh tăng từ giai đoạn tăng trưởng nhanh sang giai đoạn giảm tăng trưởng Hàm lượng đường, protein lipid tăng hàm lượng tinh bột giảm từ củ tăng trưởng nhanh sang củ giảm tăng trưởng 3.1.4 Sự thay đổi cường độ quang hợp cường độ hô hấp Lá thân quang hợp mạnh tuần 6, sau giảm dần thấp tuần 12, bắc tăng quang hợp từ tuần đến tuần 10 giữ không đổi tuần 12 Hô hấp thân không đổi từ tuần đến tuần 10 tăng lên tuần 12, hô hấp bắc giảm mạnh tuần 12 Hô hấp củ giảm mạnh tuần tuần 12, đạt mức cao tuần 10 3.1.5 Sự thay đổi hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật Hoạt tính auxin giảm tuần 10 tăng lên tuần 12, acid abscisic tăng tuần 10 giữ mức cao tuần 12 Hoạt tính gibberellin zeatin tăng đặn theo thời gian 3.1.6 Sự phân bố đường thân mối quan hệ xuất nhập ● Trắc nghiệm khúc cắt cuống phát hoa cấp Sucrose xuất đặt xuôi 12 tuần tuổi (mang hoa) so với đặt xuôi 10 tuần tuổi (chuẩn bị hoa) Trong trường hợp đặt phần hay phần gốc 12 tuần tuổi, đặt ngược dẫn tới xuất sucrose mạnh đặt xuôi đặc biệt mạnh đặt ngược phần 10 ● Thí nghiệm cắt quan Ở đối chứng, hàm lượng sucrose khúc cắt ngọn, gốc, hàm lượng sucrose tổng luôn cao thí nghiệm chiều-tối so với ban ngày Ngược lại, cắt phát hoa bắc cấp một, hàm lượng sucrose cao thí nghiệm vào ban ngày thấp thí nghiệm vào chiều-tối, đặc biệt cao phần phần khúc cắt 3.1.7 Nuôi cấy in vitro lát cắt củ thứ esculentus ● Ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng thực vật lên tăng trưởng tích lũy lipid lát cắt củ Ở nghiệm thức xử lý IAA mg/l, ABA mg/l, BA 10 mg/l, ethrel 400 mg/l GA3 20 mg/l, trọng lượng tươi thấp, hàm lượng lipid cao đối chứng, cao với ABA mg/l Cùng với gia tăng hàm lượng lipid giảm trọng lượng khô xử lý ABA mg/l Ethrel 400 mg/l làm tăng hàm lượng lipid, giảm trọng lượng tươi không giảm trọng lượng khô ● Ảnh hưởng mannitol số hợp chất khác lên tăng trưởng tích lũy lipid lát cắt củ Trong tất xử lý, hàm lượng lipid tăng so với đối chứng, cao xử lý mannitol 80 g/l, PBZ g/l, tăng KNO3 g/l Cùng với gia tăng hàm lượng lipid giảm trọng lượng tươi trọng lượng khô Hàm lượng lipid tăng dần theo nồng độ mannitol PBZ g/l cho hàm lượng lipid cao nhất, so với NaCl g/l, KNO g/l thiourea g/l 3.1.8 Ảnh hưởng hàm lượng nước đất lên tích lũy lipid Ở nghiệm thức tháo nước sau tuần ngập nước, hàm lượng lipid củ tăng theo thời gian đạt mức cao tuần 10, sau giảm 11 tuần 18 Ở nghiệm thức tháo nước sau 10 14 tuần ngập nước, hàm lượng lipid đạt mức cao tuần 10 giữ mức cao tuần 18 3.1.9 Xử lý đồng ruộng nhằm tăng hàm lượng lipid củ cỏ gấu thứ esculentus đồng ruộng ● Ảnh hưởng tháo nước, xới gốc, cắt GA3 Hàm lượng lipid tăng tất xử lý so với đối chứng tăng cao hai nghiệm thức “tháo nước, xới gốc cắt ngọn” “tháo nước, xới gốc, cắt phun GA3 20 mg/l” Sự tăng hàm lượng lipid nghiệm thức “tháo nước, xới gốc cắt ngọn” xảy với giảm trọng lượng tươi/củ, trọng lượng khô/củ tinh bột, tăng TLK/g TLT đường so với đối chứng Sự tăng hàm lượng lipid nghiệm thức “tháo nước, xới đất cắt phun GA 20 mg/l” xảy với giảm TLT/củ, TLK/củ, TLK/g TLT tăng đường tinh bột so với đối chứng ● Ảnh hưởng cắt hoa xới gốc xử lý khác Khi cắt hoa xới gốc, chiều dài cuống phát hoa cấp thay đổi không đáng kể so với đối chứng, tăng mạnh cắt hoa giảm nhẹ xới gốc Tất xử lý khác (GA 3, Ethrel, NaCl, tưới hay phun PBZ, kết hợp PBZ thiourea) làm giảm hàm lượng lipid, trừ xử lý GA3 20 mg/l kết hợp với cắt hoa thiourea KNO g/l làm giảm hàm lượng lipid, đồng thời làm tăng mạnh chiều dài cuống phát hoa cấp Hàm lượng lipid ba tiêu (mg/g TLT, mg/g TLK, g/củ) tăng cao xử lý kết hợp cắt hoa xới gốc, so với cắt hoa hay xới gốc, hay cắt hoa xới gốc kết hợp với xử lý khác (cắt hoa PBZ , cắt hoa thiourea, cắt hoa, xới gốc thiourea hay kết hợp cắt hoa, xới gốc, thiourea PBZ) Không làm tăng hàm lượng lipid, cắt hoa xới đất làm tăng trọng lượng tươi trọng lượng khô củ 12 Ở củ rễ, auxin acid abscisic tăng mạnh sau ngày xử lý cắt hoa xới đất, nhiên cytokinin giberellin giảm củ thay đổi không đáng kể rễ Cường độ quang hợp thân hô hấp củ tăng xử lý cắt hoa xới đất 3.1.10 Sự thay đổi thành phần tỷ lệ acid béo củ cỏ gấu sau xử lý Thành phần acid béo chủ yếu củ cỏ gấu nghiệm thức đối chứng bao gồm acid oleic (42,42 %), acid lauric (17,13 %), acid linolenic (13,35 %) acid palmitic (10,09 %) Thành phần thay đổi không đáng kể củ nghiệm thức cắt hoa xới đất, với xử lý thiourea làm tăng nhẹ acid oleic (44 %) acid linolenic (15,86 %), tăng mạnh acid palmitic (22,05 %), giảm mạnh acid lauric (6,93 %) Các acid béo củ cỏ gấu có mạch carbon từ C10 C20 với mức độ bão hòa khác nhau: 43,61 % no (bão hòa), 42,24 % có nối đôi, 13,35 % có nối đôi, 0,32 % có nối đôi Trong đó, thành phần chiếm ưu acid béo có chuỗi carbon dài (C14 - C20) (79,77 %) Phun thiourea làm tăng acid béo chuỗi dài (91,84 %), giảm acid béo chuỗi trung bình (8,16 %), không thay đổi nhiều mức bão hòa acid béo 3.1.11 Biểu gen WRI1 Độ tinh mRNA xác nhận từ đo OD: OD260/OD280 khoảng 1.8 đến 2.0, OD260/OD280>2 Có diện mRNA tổng số mẫu, cao mẫu củ tăng trưởng nhanh Tuy nhiên, bảng điện di, không phát băng tương ứng với cDNA từ gen WRI1 củ có gấu thứ escalentus ba giai đoạn: tăng trưởng chậm (sau tuần), tăng trưởng nhanh (12 tuần) ngừng tăng trưởng (14 tuần) 13 3.2 THẢO LUẬN ● Sự phát triển chu trình phát triển cỏ gấu Trong môi trường đất ruộng ngập nước, thứ esculentus phát triển củ trực tiếp từ củ mẹ phát hoa mang nhiều hoa, tạo nên nơi nhập mạnh, thu hút mạnh dòng biến dưỡng, cạnh tranh với củ Cỏ gấu loài niên, phát triển bụi giúp bụi tồn nhiều năm Do đó, tùy theo nhà nghiên cứu, cỏ gấu xem loài niên đa niên (Ekeanyanwu Ononogbu, 2010; Eteshola Oraedu, 1996) Dựa vào hình thái, cấu trúc đường cong tăng trưởng củ, nói tích lũy chất dự trữ thấp giai đoạn đầu tế bào phân chia nhanh, sau tăng đồng thời với tăng trưởng tế bào Cỏ gấu đơn tử diệp, có vòng bao bó mạch, nhiều khoảng khuyết mô mềm, cuống phát hoa hoa cấp kéo dài với nhiều khoảng khuyết chứa đầy khí phù hợp với đời sống vùng ngập nước Mô phân sinh dày cấp hoạt động giúp tế bào vùng phù lên, phân chia theo hướng xuyên tâm, bước trình tạo củ cỏ gấu, khoai tây (Fujino cộng sự, 1995) nghệ đen (Nguyễn Thị Duy Bình Bùi Trang Việt, 2011) Ở củ cỏ gấu, dầu tích lũy chủ yếu mô mềm, đó, mô phân sinh dày cấp hoạt động mạnh đường kính củ số lượng mô mềm tích lũy dầu nhiều Mô phân sinh dày hoạt động sớm từ tuần 1, sau ngừng hoạt động nhanh tuần 2, nên sau củ bắt đầu kéo dài thay tăng rộng ● Liên hệ xuất-nhập thân, bắc, phát hoa củ Ở cỏ gấu, tăng trưởng dinh dưỡng phần khí sinh, phát triển hoa củ diễn theo trình tự xác định (hình 3.1) Sự phù củ xảy sớm hai tuần đầu, hoạt động mô phân sinh dày cấp gần đồng thời với xuất tăng trưởng thân Sau đó, củ vào giai đoạn tăng trưởng chậm tuần 6, mô phân sinh dày cấp 14 ngừng hoạt động sớm, dù số thân không ngừng gia tăng Củ tăng trưởng nhanh từ tuần tuần 12 (nhờ tăng trưởng tế bào) với xuất bắc, dù hoa xuất chồi bắt đầu nhú lên từ tuần 10 Củ giảm tăng trưởng tuần 12 - 14, hoa phát triển thành trái chồi củ phát triển thành con, với phần gốc phù lên thành củ, thân ban đầu vào giai đoạn lão suy Phát hoa với trái phát triển củ non quan nhập cạnh tranh dòng carbon với củ tăng trưởng tích lũy chất dự trữ Hình 3.1 Sơ đồ liên hệ xuất hoa củ thứ cỏ gấu esculentus Sự đặt xuôi khúc cắt bị cắt bỏ hoa từ 12 tuần tuổi làm tăng lượng sucrose xuất so với đối chứng giữ nguyên hoa, đặt xuôi khúc cắt gốc làm giảm lượng sucrose xuất so với đặt ngược chứng tỏ, dòng sucrose chuyển lên phần để nuôi hoa mạnh Lá bắc quang hợp, góp phần giữ vai trò xuất, giúp không dùng cạn lượng dự trữ từ củ, củ có khả tích lũy lipid mang hoa Đối với trắc nghiệm với ba loại khúc cắt cuống phát hoa cấp một, lượng đường thoát từ phần gốc khúc cắt chưa mang hoa nhiều so với khúc cắt mang hoa Điều cho thấy, mang hoa nơi nhập mạnh sucrose Do đó, cắt bỏ phát hoa cấp hai, lượng sucrose thoát phần gốc tăng vượt trội so với đối chứng, dòng chuyển vị sucrose lên giảm 15 Kết thí nghiệm cắt quan vườn thực nghiệm cho thấy, cỏ gấu nguyên vẹn chịu tương tác quan khác nhau: thân, bắc, phát hoa cấp củ Vào ban ngày, quang hợp, phần sucrose chuyển đến quan khác, phần lại dự trữ tạm thời Vào ban đêm, tinh bột thủy giải chuyển đến quan (Nguyễn Quốc Bình, 1991) Do đó, tối, có xuất sucrose mạnh từ khúc cắt cuống phát hoa cấp một, hàm lượng sucrose tổng cao so với nghiệm thức sáng Trong tối, lượng sucrose cuống phát hoa cấp giảm mạnh cắt bắc cấp một, hoa phần phụ hoa Lá bắc thân đóng vai trò quan trọng mối quan hệ nhập-xuất hoa củ, tóm tắt hình 3.2: - Khi tăng trưởng dinh dưỡng, thân nơi nhập củ (củ lúc đầu nơi xuất) - Khi mang hoa trái giai đoạn 12 tuần tuổi củ cấp tạo củ cấp hai, củ cấp trở thành nơi xuất quan trọng cho nơi nhập: củ cấp hai, cuống phát hoa cấp phát hoa cấp hai, dù nơi nhập sản phẩm từ thân, cuống phát hoa cấp bắc - Lá thân trước tuần nơi nhập, sau tuần trở thành nơi xuất quan trọng cho củ cấp một, cuống phát hoa cấp phát hoa cấp hai - Cuống phát hoa cấp nơi nhập sản phẩm từ củ, thân bắc cấp một, nơi xuất (sucrose từ thủy giải tinh bột dự trữ) cho củ phát hoa 16 Hình 3.2 Sơ đồ nơi xuất nhập non giai đoạn sinh sản cỏ gấu 17 ● Hiệu ứng hormone tăng trưởng tích lũy lipid củ cỏ gấu Ở giai đoạn phù củ, gibberellin giúp tăng đường kính củ mô phân sinh dày phân chia kéo dài theo trục dọc thân (Abelenda cs, 2014) Gibberellin làm gia tăng thủy giải tinh bột (Barani vàcs., 2012), cung cấp tiền chất cho sinh tổng hợp lipid củ, tín hiệu hoạt hóa chuyển đổi đường biến dưỡng tinh bột, lipid đường, kích thích chuyển vị libe, làm gia tăng sức hút nơi nhập phát triển (Iqbal cs., 2011) Ở cỏ gấu, hoạt tính zeatin tăng theo tăng trưởng củ, từ giai đoạn tăng trưởng chậm đến giai đoạn tăng trưởng nhanh, đồng thời với tăng hàm lượng lipid Tỉ lệ gibberellin/zeatin cao củ có khuynh hướng thủy giải tinh bột, hàm lượng lipid cao (Seo cộngsự, 2009) Hoạt tính auxin giảm vào đầu giai đoạn tăng trưởng nhanh, sau tăng gần cuối giai đoạn này, vào thời điểm mang hoa đồng thời với gia tăng hàm lượng lipid mạnh Hoạt tính auxin giảm tuần 10 tăng lên tuần 12, gia tăng trọng lượng tươi, trọng lượng khô hàm lượng lipid tuần 10 12 củ cỏ gấu Do đó, nói auxin kích thích hay làm giảm hàm lượng lipid Auxin kích thích thành lập củ (Roumeliotis cộng sự, 2012), hàm lượng auxin củ cỏ gấu tăng cao tuần 12 giai đoạn củ mang nhiều mầm chồi củ mẹ Auxin giúp phân chia tế bào tăng trưởng củ (Xu cộng sự, 1998)  Mối quan hệ hoạt động biến dưỡng, tăng trưởng thay đổi hàm lượng chất điều hòa tăng trưởng thực vật Dựa vào kết thí nghiệm, mối liên hệ hoạt động biến dưỡng thay đổi hàm lượng chất chất điều hòa tăng trưởng thực vật tăng trưởng tích lũy lipid củ cỏ gấu thứ esculentus tóm tắt hình 3.3: 18 - Cỏ gấu tích lũy lipid từ sớm hàm lượng lipid tăng theo giai đoạn tăng trưởng củ cho, tăng đến giai đoạn hoa, giảm mang trái mầm củ phát triển thành (ở tuần 13-14) - Khi hàm lượng tinh bột giảm lipid tăng, ngược lại - Khi quang hợp thân giảm quang hợp bắc tăng, để góp phần tạo chất hữu cho - Hoạt tính auxin giảm đầu giai đoạn tăng trưởng nhanh tăng lên vào giai đoạn tăng trưởng nhanh, ABA tăng không đổi suốt giai đoạn tích lũy lipid, zeatin gibberellin tăng suốt giai đoạn tăng trưởng củ Hình 3.4 Mối liên hệ hoạt động biến dưỡng thay đổi hàm lượng chất chất điều hòa tăng trưởng thực vật tăng trưởng tích lũy lipid củ cỏ gấu thứ esculentus ( : tăng, : giảm, : không thay đổi) 19  Xử lý thay đổi hàm lượng nước đất ruộng Đối với 12 tuần tuổi, tháo nước làm tăng mạnh hàm lượng lipid củ, so với đối chứng ngập nước Sự giảm hàm lượng nước đất giúp tích lũy dầu củ cỏ gấu, có tác dụng ngược lại Jojoba (Ali cs., 2012) Sự tháo nước liên quan tới stress nước nhẹ, giúp đất thoáng khí hơn, tế bào rễ củ hô hấp mạnh hơn, sản phẩm quang hợp di chuyển xuống rễ mạnh dùng để tổng hợp tích lũy chất dự trữ, bao gồm lipid củ Stress nước thực vật thường xảy khô, tác động qua vai trò ABA lên biến dưỡng (Lobell cs., 2013) Trên đồng ruộng, trình gây stress dễ bị gián đoạn  Xử lý gibberellin, thiourea, PBZ, ethrel muối Trong môi trường ngập hay tháo nước, kết hợp cắt hoa với phun gibberellin làm giảm tăng nhẹ hàm lượng lipid củ Kết xác nhận vai trò cản tích lũy lipid gibberellin Tuy nhiên, kết hợp với xới đất, gibberellin giúp tăng hàm lượng lipid, có lẽ gián tiếp qua thủy giải tinh bột giúp trình tăng trưởng Khi phun thiourea lên phần khí sinh, hàm lượng lipid củ tăng mạnh Thiourea làm tăng chuyển vị sucrose từ nơi xuất tới nơi nhập, tăng suất củ (Srivastava cộng sự, 2008) Ở củ cỏ gấu, hàm lượng lipid tăng khoảng 23 %, phù hợp với nghiên cứu Pandey cộng (2013), tăng 10 - 20 % xử lý thiourea Ở nghiệm thức xới đất, chiều dài cuống phát hoa cấp giảm phun gibberrellin, phun hay tưới PBZ, tăng phun ethrel, KNO 3, NaCl phun hỗn hợp thiourea PBZ, xử lý làm giảm hàm lượng lipid so với đối chứng Như vậy, cỏ gấu, PBZ giúp tăng trưởng, phù hợp với nghiên cứu Moreno cộng (2011) Ethrel hay muối KNO3 NaCl giúp tăng trưởng, không giúp tích lũy lipid 20  Xử lý cắt hoa xới đất Khi cắt hoa, dù điều kiện ngập hay tháo nước, 10 tuần tuổi hay 12 tuần tuổi, hàm lượng lipid củ tăng mạnh so với đối chứng Điều lần cho thấy, phát hoa phát triển vùng nhập mạnh, thu hút mạnh sucrose, nên bị loại bỏ sucrose tập trung củ, giúp tăng tích lũy lipid củ Hàm lượng lipid tăng mạnh cắt hoa xới đất tuần 10, tăng 58% so với đối chứng cắt hoa, cắt hoa xới đất tuần 12 làm tăng 21% so với đối chứng cắt hoa Điều cho thấy tác động làm tăng hàm lượng lipid hiệu thực sớm tuần 10, vùng nhập phát hoa chưa phát triển mạnh Khi cắt bỏ phát hoa, hàm lượng lipid tăng đáng kể vào mùa mưa tăng mạnh nhiều vào mùa khô 12 tuần tuổi Điều cho thấy, mùa mưa giúp cho cỏ gấu tăng trưởng nhanh, mùa khô thích hợp cho việc tích lũy lipid ● Ảnh hưởng xử lý đến thành phần hàm lượng acid béo Thành phần hàm lượng acid béo dầu thứ esculentus mẫu đối chứng tương tự với kết công bố Bado cộng (2015) Cyperus esculentus L., hầu hết acid béo chuỗi dài (C14 - C20) Ở cỏ gấu với thành phần chủ yếu acid oleic (C:18,1), khoảng 42,24 %, cao so với dầu oliu (dầu có giá trị dinh dưỡng cao) 58,8-80 % (Leon cs., 2004) Sự cắt hoa xới đất (ở 10 tuần tuổi) chủ yếu làm giảm bớt cạnh tranh dinh dưỡng hoa củ, tập trung dòng lượng củ, từ làm tăng hàm lượng lipid củ, không làm thay đổi thành phần acid béo Khác hơn, xử lý thiourea, hàm lượng acid béo không 21 cắt hoa xới đất, làm tăng acid có chuỗi carbon dài thích hợp cho việc chế biến nhiên liệu sinh học ● Biểu gen WRI1 cỏ gấu Theo kết qRT-PCR, biểu gen WRI1 củ ba giai đoạn: chậm (tuần 2), nhanh (tuần 12) ngừng tăng trưởng (tuần 14), dù có diện mRNA mẫu, cao vào giai đoạn nhanh củ Củ ba giai đoạn tích lũy dầu (TAG), cao củ 12 tuần tuổi Điều hòa sinh tổng hợp acid béo kiểm soát trực tiếp yếu tố mã WRI1 (Vanhercke cs, 2014) Sự biểu WRI1 cao, hàm lượng dầu hạt tăng nhiều loài thực vật, khoai tây chuyển gen (Turresson, 2014) Tuy nhiên, thứ esculentus, WR11 không biểu giai đoạn củ hình thành dầu, vào tuần 2, 12 14, WRI1 tác động vào trình sinh tổng hợp acid béo, cỏ gấu, hình thành dầu bắt đầu vào tuần Phải WRI1 hoạt động sớm hơn, giai đoạn tạo acid béo dừng hoạt động giọt dầu hình thành từ tuần quan sát kính hiển vi? CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Trong môi trường đất ruộng ngập nước, ba thứ cỏ gấu esculentus, hermanii sativus phát triển nhanh, tạo thành bụi, củ hình thành trực tiếp từ chồi mọc củ mẹ (ở esculentus hermannii) hay gián tiếp từ thân bò kéo dài (ở sativus) Quá trình tạo củ bắt đầu sớm từ tuần 1, mô phân sinh dày bắt đầu phân chia kéo dài theo trục dọc, gần đồng thời với thân (tuần 0-2), sau đó, củ tăng trưởng (tuần - 10) đồng thời với cuống phát hoa, củ giảm tăng trưởng từ tuần 12 hoa xuất chồi non nhú củ cấp 22 Khi củ chuyển từ giai đoạn tăng trưởng nhanh sang giai đoạn giảm tăng trưởng, trọng lượng tươi khô, hàm lượng tinh bột lipid giảm sucrose protein gia tăng Trong thí nghiệm với lát cắt từ củ giai đoạn 10 tuần tuổi, acid abscisic mg/l, manitol 80 g/l, paclobutrazol g/l kích thích mạnh tích lũy lipid, đặc biệt điều kiện ngập nước in vitro tuần 10 Củ cấp giai đoạn - tuần tuổi nơi nhập từ nguồn thân, giai đọan -12 tuần tuổi nơi nhập từ nguồn thân, bắc, cuống phát hoa cấp nơi xuất cho củ cấp hai, phát hoa, cuống phát hoa cấp Trong xử lý cắt quan phòng thí nghiệm, sucrose di chuyển theo hướng ưu từ gốc lên Hoạt tính gibberellin zeatin nói chung tăng theo tăng trưởng củ, auxin giảm vào đầu tăng trở lại gần cuối giai đoạn tăng trưởng nhanh, acid absicic tăng từ đầu giữ mức cao đến cuối giai đoạn tăng trưởng nhanh Các kết xử lý đồng ruộng: - Xử lý paclobutrazol, KNO3 NaCl không làm tăng giảm tích lũy lipid, phun thiourea giúp tăng mạnh lượng lipid củ - Sự tháo nước làm tăng hàm lượng lipid, kết hợp với cắt phát hoa xới đất - Sự cắt phát hoa cấp tuần 10 giúp tích lũy lipid cao so với cắt tuần 12 khoảng bốn lần (275,06 ± 4,21 mg/g TLK so với 65,66 ± 0,59 mg/g TLK) - Sự tích lũy lipid mạnh với xử lý cắt phát hoa kết hợp với xới đất tuần 10 so với cắt phát hoa hay xử lý khác 23 4.2 KIẾN NGHỊ Áp dụng phương pháp cắt phát hoa hay đàn áp phát triển phát hoa diện rộng kết hợp với phương pháp trồng trọt thích hợp, dựa vào mối liên hệ xuất-nhập chuyển hướng dòng carbon vào đường biến dưỡng lipid củ cỏ gấu Tiếp tục nghiên cứu biểu gen WRI1 gen liên quan đến tích lũy lipid DAGT1 giai đoạn tạo củ cỏ gấu DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ Trần Thị Thanh Hiền, Bùi Minh Trí Bùi Trang Việt, 2012 Phân tích tăng trưởng tích lũy chất dự trữ củ cỏ gấu Cyperus esculentus L Tạp chí khoa học kỹ thuật Nông Lâm nghiệp, số 3/2012 Trần Thị Thanh Hiền, Bùi Minh Trí Bùi Trang Việt, 2015 Khảo sát tăng trưởng tích lũy lipid củ cỏ gấu Cyperus esculentus L Khi thay đổi hàm lượng nước đất.Tạp chí khoa học kỹ thuật Nông Lâm nghiệp, số 2/2015 ... hàm l ợng chất chất điều hòa tăng trưởng thực vật tăng trưởng tích l y lipid củ cỏ gấu thứ esculentus tóm tắt hình 3.3: 18 - Cỏ gấu tích l y lipid từ sớm hàm l ợng lipid tăng theo giai đoạn tăng. .. khô xử l ABA mg /l Ethrel 400 mg /l làm tăng hàm l ợng lipid, giảm trọng l ợng tươi không giảm trọng l ợng khô ● Ảnh hưởng mannitol số hợp chất khác l n tăng trưởng tích l y lipid l t cắt củ Trong... giai đoạn tăng trưởng nhanh tăng l n vào giai đoạn tăng trưởng nhanh, ABA tăng không đổi suốt giai đoạn tích l y lipid, zeatin gibberellin tăng suốt giai đoạn tăng trưởng củ Hình 3.4 Mối liên hệ