2016 ĐHQG Chẩn đoán in vitro bằng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ

CHẨN ĐOÁN IN VITRO BẰNG KỸ THUẬT MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ TS Nguyễn văn Kính MỤC ĐÍCH  Định lƣợng hormone chất có huyết thanh, huyết tƣơng, dịch sinh học  Nghiên cứu bệnh miễn dịch  Nghiên cứu đánh giá tình trạng dinh dƣỡng  Nghiên cứu ung thƣ TS Nguyễn văn Kính NGUYÊN LÝ I Kỹ thuật miễn dịch: Dựa mối tƣơng tác đặc hiệu thuận- nghịch kháng nguyên (Ag) với kháng thể (Ab) + Nhóm kỹ thuật miễn dịch quan sát trực tiếp (lên bông, kết tủa, ngƣng kết, cố định bổ thể, trung hòa) + Nhóm kỹ thuật miễn dịch dùng chất đánh dấu  Biến phản ứng không quan sát đƣợc thành phản ứng quan sát & nhận định kết  Tăng độ nhạy, độ đặc hiệu, độ xác  Tăng khẳ tự động hóa  Có thể áp dụng thể sống TS Nguyễn văn Kính NGUYÊN LÝ  Chất đánh dấu có loại: Chất đánh dấu phóng xạ ( Enzym, Ferritin, luciferin)  Kỹ thuật miễn assay:IEMA)   dịch Enzyme (immunoenzymometric Miễn dịch huỳnh quang (immunofluorometric assay) Miễn dịch hóa phát quang ( immunochemiluminometric assay) Chất đánh dấu đồng vị phóng xạ  Đồng vị phóng xạ (RIA, IRMA: Radioimmunoassay., Immunoradiometric assay.) TS Nguyễn văn Kính NGUYÊN LÝ ĐỊNH LƯỢNG MDPX  Định nghĩa: MDPX kỹ thuật vi phân tích đồng vị phóng xạ đƣợc dùng vào XN để xác định nồng độ chất mẫu dịch sinh học  Rosalyn S Yalow & SolomonA Berson dùng đồng vị phóng xạ đánh dấu Insuline để nghiên cứu thời gian tồn lƣu Insulin tuần hoàn máu; Vitamin B12… đƣợc giải Nobel năm 1977  Ƣu điểm: Đơn giản triển khai sơ, giá thành rẻ, độ đặc hiệu & độ nhạy cao, xác định đƣợc chất có nồng độ cực thấp huyết thanh, dịch sinh học, huyết tƣơng… (10-17 – 10-18 )  Tiêu chuẩn vàng để đánh giá kỹ thuật khác TS Nguyễn văn Kính THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA XN MDPX  Kháng thể (Ab) đặc hiệu với chất cần định lƣợng đƣợc sản xuất gây miễn dịch cho động vật or công nghệ sinh học  Kháng nguyên (Ag - chất cần định lƣợng) có dịch sinh học  Chất đánh dấu (Tracer) đồng vị gắn vào kháng nguyên (Ag*) ( RIA); vào kháng thể Ab* (IRMA); thành phần cấu trúc nên chất gắn  Chất phóng xạ có hoạt tính riêng cao, gắn đặc hiệu vào phân tử Ab or Ag, thời gian bán rã không ngắn, phát xạ gamma đơn nhƣ125I  Hệ thống tách: Tách riêng phức hợp chất tự chất hấp thụ phase rắn:Than hoạt TS Nguyễn văn Kính  Bằng chất kết tủa hóa học: PEG – 6000; Kết tủa miễn dịch: thêm Ab thứ hai làm tăng trọng lƣợng Ag-Ab đƣợc dùng nhiều rút ngắn thời gian, không bị ảnh hƣởng nồng độ mẫu thử, dùng đƣợc cho Ab có lực thấp or Ag đặc hiệu thấp  Hệ thống pha rắn: Ab thứ bắt giữ gắn sẵn thành ống or gắn nên bề mặt hạt nhỏ cellulose, sepharose or hạt cellulose từ ( ly tâm)  Chất đánh dấu, Kháng thể, PH nhiệt độ phản ứng định, chất cần định lƣợng thay đổi  Các ống huyết chuẩn (Std), huyết giám sát (CS) Nguyên Lý chung: RIA Ag Ag* + Ab ↔ Ag – Ab, Ag*Ab, Ag* or Ag TS Nguyễn văn Kính NGUYÊN LÝ ĐỊNH LƯỢNG MDPX    Ag chất cần định lƣợng cao Ag*- Ab thấp, ngƣợc lại Ag thấp Ag*- Ab cao Mẫu thử thực điều kiện nhƣ ( thời gian ủ, khối lƣợng mẫu, nhiệt độ, thời gian, tốc độ quay ly tâm PH) B/T Đồ thị chuẩn: Cpm B/T% Cpm Cx TS Nguyễn văn Kính Nồng độ Thiết bị: Micropipet (100 – 1000μl), máy lắc (200-350 RPm), máy trộn, giá ống nghiệm, máy đếm gammacounter VD Quy trình FT4 : Thuốc thử & mẫu bệnh phẩm để nhiệt độ phòng 20’, đánh số ống, trộn thuốc thử… Ống Toatal (T) Standard S1-S6 P1-Pn CS 100μl Mẫu B/n 100μl control 100μl Đệm ủ 1000μl Lắc 30 phút 1000μl 1000μl nhiệt độ phòng Gạn nước, úp ngược phút giấy thấm 125I-Tracer 1000μl 1000μl 1000μl 1000μl Lắc ngang 60 phút 200-350 v/p nhiệt độ phòng Gạn nước, úp ngược phút giấy thấm Đo hoạt độ phóng TS.xạNguyễn 60 s/ống văn Kính NGUYÊN LÝ IRMA: Ab* + Ag Ab* - Ag, Ab* - Ab* - Ag tỉ lệ thuận với nồng độ chất cần định lƣợng - Ab đơn dòng làm pha rắn bắt giữ, Ab* , hai Ab & Ab* định vị trí gắn Ag Ab - Ag – Ab* , hạn chế phản ứng chéo, có độ nhạy cao & hạn chế sản xuất Ag tinh khiết giá thành cao để tạo Ab Nhƣng chất cần định lƣợng phải có trọng lƣợng phân tử lớn để có hai vị trí gắn hai Ab, Ab* , Các huyết chuẩn HT giám sát B/T Cpm B/T% Cpm Cx Nồng độ TS Nguyễn văn Kính 10 Quy trình thực chuẩn Thyroglobuline IRMA Ống nghiệm Mẫu chuẩn & bệnh phẩm Đệm T - - S0 – S6 100 300 CS1 – CS2 100 300 P1 - Pn 100 300 Lắc ngang 400 v/ ph, ủ nhiệt độ phòng 18 – 25 0c , rửa lần với đệm 125I tracer 400 400 400 ủ 16 – 20 Đếm nhiệt độ máy phòng gamm 18 -25 acount 0C, er rửa lần với đệm 400 TS Nguyễn văn Kính 11 Kỹ thuật MDPX kháng thể kẹp * Nguyên lý: Ủ Ag bệnh phẩm với Ab đơn dòng; Ab gắn với vị trí đặc hiệu Ag thành phức hợp Ab – Ag ; rửa loại bỏ Ag & Ab tự  Gắn Ab* với phức hợp Ab – Ag tạo phức hợp: Ab*- Ag – Ab  Loại bỏ Ab* or Ab – Ag tự  Ống nghiệm còn: Ab*- Ag – Ab  Đếm hoạt tính phóng xạ  Hoạt độ phóng xạ tỉ lệ thuận với nồng độ Ag mẫu thử TS Nguyễn văn Kính 12 Hiệu ứng móc đáp ứng hai pha (Hook Effect – Biphasic Response)  Hiệu ứng móc thƣờng xẩy XN bánh kẹp       Gây nhầm lẫn nhận định kết vì: Trong XN Ab có hạn so Ag dƣ thừa nên Ab – Ag không tƣơng thích với nồng độ Ag Xuất không đáp ứng phase hai: Phức hợp Ab – Ag có hạn gắn Ab* xác định, phức hợp Ab – Ag - Ab* không tƣơng thích với Ag mẫu có nồng độ cao Kết Cpm mẫu không phản ánh đƣợc nồng độ chất cần định lƣợng, kết thực cao bị nhận định sai lầm thấp Khắc phục: Pha loãng mẫu thử XN nồng độ khác Làm mẫu thử theo hai giai đoạn: phase bắt giữ, phản ứng 13 TS Nguyễn văn Kính với Ab* ĐÁNH GIÁ ĐỘ TIN CẬY CỦA PHƢƠNG PHÁP  Sai số: - Chủ quan - Khách quan: Hóa chất, thiết bị  Kiểm tra: tính CV% hai ống, Standard lần XN Các lần XN khác  Kểm tra nội bộ: huyết ngƣời bình thƣờng, huyết bệnh nhân, phân loại : thấp, trung bình, cao  Làm n= 10 mean ± 2SD TS Nguyễn văn Kính 14 KHÁC NHAU GiỮA RIA & IRMA  RIA: Cạnh tranh Ag cần định lƣợng với Ag* với Ab (lƣợng định thiếu) Chất đánh dấu Ag  IRMA: Không có cạnh tranh, Ag cần định lƣợng gắn với Ab dƣ thừa xác định Chất đánh dấu Ab*  Độ nhạy: IRMA 10 -34 mol/l > RIA 10 -17 mol/l  Độ đặc hiệu: IRMA > RIA dùng Ab đơn dòng  Có thể định lƣợng đƣợc phân tử sinh học miền nồng độ thấp pg…  Kỹ thuật đơn giản, kết ổn định bị chi phối nhiệt độ  Cần Lab thích hợp, độ độc hại phóng xạ tƣơng đƣơng nhƣ độc hại hóa chất TS Nguyễn văn Kính 15 ỨNG DỤNG  Định lƣợng nội tiết tố liên quan đến tuyến giáp  Bệnh tuyến giáp: lâm sàng & XN phong phú, nhiều phƣơng pháp để chẩn đoán, theo dõi & tiên lƣợng bệnh tuyến giáp MDPX đặc biệt quan trọng định lƣợng đƣợc nồng độ hormone tuyến giáp, nội tiết tố liên quan (Thyroid – related hormones)  Bệnh cƣờng giáp (Hyperthyroidism) hầu hết T3, T4 or FT3, FT4 , TRAb (TSH receptor antibody) tăng & TSH giảm TS Nguyễn văn Kính 16  Nhiễm độc giáp T3 or T4 hai hormone không tăng song hành  Suy giáp đa số T3 ,T4 thấp liên bào t/g giảm or khả tổng hợp TSH tăng cao  Một số yếu tố ảnh hƣởng đến T3 ,T4 nhƣ bệnh gan, thận, thai nghén & số thuốc tránh thai, an thần…  Một số hội chứng quan trọng thường gặp - Cường giáp( Hyperthyroidism), Graves – Basedow: T3 ,T4 , FT3, FT4, TSH, TRAb - Hội chứng bình giáp bệnh lý + T4 bình thƣờng, T3 giảm bệnh lý khác + T4 thấp suy giáp, giảm tiết chế TSH tuyến yên TS Nguyễn văn Kính 17 + T4 tăng: phụ nữ nhiều tuổi, dùng thuốc chứa iot, tâm thần… + Bất thƣờng liên kết hormone: T3, T4 giảm điều trị hormone không hiệu - Suy giáp: Hầu hết FT3, FT4 giảm TSH tăng - Bƣớu cổ địa phƣơng T3, T4 bình thƣờng or tăng nhẹ Tóm lại: Bệnh lý tuyến giáp nên định XN, ý đến TSH (IRMA) + Định lƣợng kháng thể kháng receptor TSH TRAb ý nghĩa theo dõi điều trị TS Nguyễn văn Kính 18 + Định lượng số loại hormone:  GH: theo dõi bệnh to đầu chi, lùn …tuyến yên, chứng khống lồ  PTH: hormone tuyến cận giáp Chuyển hóa calci,  Cortisol, Insuline, Calcitonin, Plolactin, ACTH…  Các chất dấu ấn ung thƣ: đại phân tử, có mặt chúng liên quan đến có mặt phát triển khối u ác tính Chúng hình thành từ or tế bào K or kích thích TB phân chia không kiểm soát  Dấu ấn ung thƣ tiết vào máu ngoại vi nồng độ phát đƣợc TB chuyển thành ác tính  Cho phép kết luận vị trí xuất phát khối U TS Nguyễn văn Kính 19  Kỹ thuật IRMA sử dụng XN theo dõi diễn tiến, đánh giá hiệu & tiên lƣợng  AFP: Glycoprotein , W= 70.000 daltons, hình thành gan, dày, ruột bào thai AFP đạt đỉnh tuần 12 – 16 thai kỳ giảm sinh Chăm sóc tiền sản Giám sát K gan nguyên phát, đánh giá đáp ứng điều trị  CEA: Glycoprotein , W= 180.000 daltons, KN ung thƣ phôi thai đƣợc sản xuất đời sống phôi bào thai CEA kìm hãm sau sinh, không thấy huyết ngƣời lớn bình thƣờng, KN giải tỏa tế bào số K phát triển Cao ung thƣ biểu mô tuyến đại trực tràng Giám sát tiến triển & đáp ứng điều trị b/n K đại trực tràng TS Nguyễn văn Kính 20  PSA: Glycoprotein , W= 34.000 daltons Có ống ngoại tiết tiền liệt tuyến Giám sát diễn tiến & đáp ứng điều trị K TLT Giám sát B/N phì đại TLT độ đặc hiệu 90% Là tiêu XN sàng lọc K TLT nam tuổi > 50  Tg: Glycoprotein tuyến giáp.Trong K giáp biệt hóa Tg chất điểm tồn mô giáp Tg + WBS có giá trị sau điều trị K giáp 80 – 85 % Tg + WBS phù hợp LS Sau điều trị I-131 Tg < ng/ml 15 – 20% Tg & WBS không tƣơng đồng Tg > - 10ng/ml điều trị Nồng độ Tg tăng cao có di xa TS Nguyễn văn Kính 21  CÂU HỎI Nguyên lý phƣơng pháp miễn dịch phóng xạ Ƣu điểm kỹ thuật RIA & IRMA Sự giống & khác RIA & IRMA Những yếu tố làm ảnh hƣởng đến kết XN Nêu ứng dụng phƣơng pháp miễn dịch phóng xạ chẩn đoán bệnh tuyến giáp & dấu ấn điểm khối u số bệnh ung thƣ thƣờng gặp TS Nguyễn văn Kính 22 TRÂN TRỌNG CẢM ƠN TS Nguyễn văn Kính 23 ... loại: Chất đánh dấu phóng xạ ( Enzym, Ferritin, luciferin)  Kỹ thuật miễn assay:IEMA)   dịch Enzyme (immunoenzymometric Miễn dịch huỳnh quang (immunofluorometric assay) Miễn dịch hóa phát quang... lý phƣơng pháp miễn dịch phóng xạ Ƣu điểm kỹ thuật RIA & IRMA Sự giống & khác RIA & IRMA Những yếu tố làm ảnh hƣởng đến kết XN Nêu ứng dụng phƣơng pháp miễn dịch phóng xạ chẩn đoán bệnh tuyến... nghĩa: MDPX kỹ thuật vi phân tích đồng vị phóng xạ đƣợc dùng vào XN để xác định nồng độ chất mẫu dịch sinh học  Rosalyn S Yalow & SolomonA Berson dùng đồng vị phóng xạ đánh dấu Insuline để nghiên