QUY TRÌNH SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ VI SINH VẬT

 Cyanocobalamin, được định nghĩa là vitamin B12, là một hợp chất cobalamin bền vững, được sản xuất ở quy mô công nghiệp nhưng không tìm thấy trong tự nhiên. Vitamin B12 là một vitamin quan trọng dùng để chữa bệnh thiếu máu nguy hiểm và bệnh viêm dây thần kinh ngoại biên, cần bổ sung trong khẩu phần ăn động vật và cả con người.  Tổng hợp vitamin B12 bằng phương pháp hóa học rất khó khăn và tốn kém nên người ta thường dùng đại trà phương pháp lên men vi sinh vật gián đoạn hoặc kết hợp gián đoạn và liên tục.  Vitamin B12 thường có trong long đỏ trứng, sữa, các sản phẩm từ sữa, thịt, gia cầm và tôm cua…

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Phần I: Giới thiệu chung 1

1 Giới thiệu chung 1

2 Tính chất của vitamin B12 1

Phần II: Nguyên liệu sản xuất 2

I VI SINH VẬT 2

1 Ưu điểm của vi sinh vật 2

2 Giống vi sinh vật 2

3 Vi sinh vật tham gia tổng hợp vitamin B12 3

II RỈ ĐƯỜNG 5

1 Ưu điểm khi sử dụng rỉ đường làm nguyên liệu: 5

2 Thành phần rỉ đường: thông thường chứa nhiều trong: 5

III HÈM RƯỢU: 6

1 Ưu điểm 6

2 Thành phần hóa học của hèm rượu: 6

IV DỊCH WHEY 6

Phần III: Sản xuất 8

I QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ VI SINH VẬT 8

1 Sơ đồ khối 8

2 Sơ đồ thiết bị thu nhận vitamin b12 9

II GIẢI THÍCH CÁC GIAI ĐOẠN: 10

3 Lên men: 13

4 Ly tâm: 14

5 Acid hóa: 16

6 Hấp phụ: 17

7 Giải hấp: 18

8 Cô đặt: 19

9 Kết tinh: 21

10 Ly tâm 22

11 Sấy 23

Phần IV Sản phẩm 24

*Quy Trình Sản Xuất Viên Con Nhộng Hay Viên Nén Chứa Vitamin B12 25

Phần V Tài liệu tham khảo 29

Xin cám ơn thầy 30

Phần I : Giới thiệu chung

1 Giới thiệu chung

 Cyanocobalamin, được định nghĩa là vitamin B12, là một hợp chất cobalamin bền vững, được sản xuất ở quy mô công nghiệp nhưng không tìm thấy trong tựnhiên Vitamin B12 là một vitamin quan trọng dùng để chữa bệnh thiếu máu nguy hiểm và bệnh viêm dây thần kinh ngoại biên, cần bổ sung trong khẩu phần ăn động vật và cả con người

 Tổng hợp vitamin B12 bằng phương pháp hóa học rất khó khăn và tốn kém nên người ta thường dùng đại trà phương pháp lên men vi sinh vật gián đoạn hoặc kết hợp gián đoạn và liên tục

 Vitamin B12 thường có trong long đỏ trứng, sữa, các sản phẩm từ sữa, thịt, giacầm và tôm cua…

2 Tính chất của vitamin B12

 Công thức hóa học: C63H90N14O14PCo

 Cấu trúc hóa học gồm: Một mặt phẳng chứa các vòng pyrol và nguyên tử

coban chiếm vị trí trung tâm của các vòng đó

 Phần thứ hai của phân tử là một nhóm nucleotid thẳng góc với mặt phẳng, trên phần nucleotid này bao gồm thành phần bazơ nitơ là dimethyl benzimidazol vàthành phần đường là α-D-ribofuranoza

Phần II: Nguyên liệu sản xuất

Sơ đồ 1.biểu hiện nguyên liệu sản xuất vitamin B12

I VI SINH VẬT

1 Ưu điểm của vi sinh vật

 Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy và giống

 Chu kì sinh trưởng của vi sinh vật ngắn

 Diều khiển cơ chế sinh tổng hợp theo hướng có lợi

 Hệ enzyme vi sinh vật phong phú,hoạt tính cao

 Hiệu quả kinh tế cao

2 Giống vi sinh vật

 Yêu cầu của giống

 Khả năng sinh tổng hợp mạnh

 Khả năng sinh trưởng nhanh và phát triển mạnh

 Giống phải ổn định trong quá trình nuôi cấy

 Gia thành thấp

Vitamin B12

Vi sinh vật

Rỉ đường

Hèm rượu Dịch

whey

 Phân lập giống

 Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên

 Phân lập giống trong điều kiện sản xuất

 Bảo quản giống

 Bảo quản giống bằng phương pháp cấy truyền

 Bảo quản giống bằng phương pháp khô

 Bảo quản giống bằng phương pháp đông khô

 Bảo quản giống bằng phương pháp lạnh đông trong nito lỏng

3 Vi sinh vật tham gia tổng hợp vitamin B12

 Qúa trình sinh tổng hợp vitamin B12 là một quá trình rất phức tạp trải qua nhiều giai đoạn khác nhau nhờ sự tham gia của nhiều loại enzyme khac nhau

 Quá trình sinh tổng hợp vitamin B12 bắt đầu bằng sự tạo thành các

porphinin,sau đó gắn các nucleotat và các thành phần khác vào

 Porphinin của vitamin B12 khac với porphinin của xytocrom,clorophin ở chỗ

nó chứa rất nhiều nhóm -CH-CH2COOH và CH3

 Có trong cấu tạo vitamin B12 được gắn vào bằng ba hóa trị thông thường và bahóa trị phụ.co tạo màu đỏ cho vitamin B12

 Tham gia tổng hợp vitamin B12 có sự tham gia của nhiều vi sinh vật khac nhau như: Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Bacillus megaterium, Clostridium sticklandii, Clostridium tetanomorphum, Clostridiumthermoaceticum, Corynebacterium XG, Eubacterium limosum,

Methanobacterium arbophilicum, Methanobacterium ivanovii,

Methanobacterium ruminantium, Methanobacterium thermoautotrophicum, Methanosarcina barkeri, Propionibacterium freudenreichii, Propionobacterium shermanii, Protaminobacter ruber, Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas putida, Rhizobium meliloti, Rhodopseudomonas sphaeroides, Salmonella typhimurium, Spirulina platensis, Streptomyces antibioticus, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces griseus, ngoài ra còn có các giống thuộc xạ

khuẩn actinomyces

a Vi khuẩn propionic shermanii

Hình 1 Vi khuẩn propionic shermanii

 Đặc điểm:

 Là trực khuẩn,kích thước nhỏ

 Trong thiên nhiên chúng từng xếp thành từng đôi hoặc chuỗi ngắn

 Hiếu khí tùy nghi

 Chúng có khả năng lên men acid lactic,glyceron,glucose,

 pH hoạt động khoảng 4,5-7,5 pH tối ưu cho việc sinh tổng hợp B12 là 5,8-7,5

 Nhiệt đọ thích hợp cho sinh tổng hợp vitamin B12 là 28-30oC

 Các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng bao gồm : muối amon,

amoniac, CoCl2 hoặc Co(NO3)2 Các kim loại Cu, Fe, Zn thường làm giảm quátrình sinh tổng hợp B12

b Xạ khuẩn actinomyces

 Đặc điểm:

 Chúng phát triển mạnh và sinh nhiều vitamin B12 trong môi trường chứa

glucose, tinh bột, mật rỉ, bã rượu

 Trong thành phần môi trường này cần cho thêm các muối amon, muối coban

và CaCO3

 Sinh tổng hợp vitamin B12 chỉ xảy ra mạnh sau 24 giờ nuôi cấy

 Trong quá trình lên men, xạ khuẩn tạo ra hai pha rất rõ rệt:

 Pha tạo thành sinh khối

 Pha tạo thành vitamin B12 Thường pha tạo thành vitamin B12 chỉ mạnh khi kết thúc quá trình tăng sinh khối.

 pH ban đầu môi trường nên điều chỉnh vào khoảng 7 Ở pha thứ nhất, pH sẽ giảm xuống khoảng 6,5 v|à bước sang pha thứ hai pH sẽ tăng dần lên 8,2 - 8,7

 Thổi khí có ảnh hưởng rất lớn đến sự tổng hợp vitamin B12, do đó trong quá trình lên men bắt buộc phải có thổi khí mạnh

 Nhiệt độ cho sự phát triển và sinh tổng hợp vitamin B12 là 28-30oC

 Thời gian lên men là 60 - 120 giờ (trung bình là 60 - 96 giờ)

c Vi khuẩn sinh metan

 Đặc điểm:

 Chúng thuộc vi khuẩn Gram (-)

 Chúng không chuyển động

 Chúng không tạo bào tử

 Chúng không thuộc loại kị khí bắt buộc

II RỈ ĐƯỜNG

1 Ưu điểm khi sử dụng rỉ đường làm nguyên liệu:

 Khối lượng lớn ,dồi dào

 Sử dụng tiện lợi,nguồn cung phổ biến

 Giá rẻ

2. Thành phần rỉ đường: thông thường chứa nhiều trong:

 Mía 3-3,5 % trọng lượng mía

III HÈM RƯỢU :

Hèm rượu là sản phẩm phụ của quá trình sản xuất ethanol bằng phương pháp lên men

1 Ưu điểm

Rẻ tiền,dễ kiếm

Tận dụng được nguồn phế phụ liệu

2 Thành phần hóa học của hèm rượu:

Bảng 1 Thành phần hóa học của hèm rượu

Thành phần Nguyên liệu khoai tây Nguyên liệu khoai mì

sự phát triền và hình thành vitamin B12 từ vi sinh vật

 Trên phương diện đó, với nhược điểm của dịch Whey nên việc sử dụng để sảnxuất vitamin B12 thì nhỏ và rải rác, riêng lẻ, không đủ cung cấp cho quá trình sản xuất có lợi của vitamin B12

 Thành phần hóa học của dich whey

Bảng 2 Thành phần hóa học của dịch whey

0.8 0.120 0.065 0.050 0.1600.110 0.400

2 Sơ đồ thiết bị thu nhận vitamin b12

Hình 2 Thiết bị thu nhận vitamin B12

Hình3: cấu trúc phân tử vitamin

 Vitamin B12 thường ở dạng kết tinh, có kích thước rất nhỏ, màu đỏ sẫm, không có mùi và vị

 Tan trong nước, trong các dung dịch trung tính, cồn; không tan trong eter, acetol, benzen, clorofoc.

 Chúng bền nhiệt khi ở dạng cyamit, nhưng khi tiếp xúc với kim loại nặng thì rất dễ mất hoạt tính, không bền trong pH kiềm

 Chức năng:

 Sinh hồng cầu và tái tạo mô, chuyển thymin thành thymidin

 Giúp phân chia và tái tạo tế bào, chuyển hóa nhóm methyl, tổng hợp protein, chuyển hóa glucid, lipid

 Bảo vệ cơ thể nhiễm độc, nhiễm khuẩn

II GIẢI THÍCH CÁC GIAI ĐOẠN :

1 Nhân giống

 Mục đích công nghệ: để chuẩn bị cho quá trình lên men, làm tăng sinh khối,

tích lũy đủ số lượng tế bào cần thiết để cấy giống vào môi trường lên men.Bảng 3 Môi trường nhân giống

Thời gian tiệt trùng 30 phút

 Cách biến đổi: sinh học

 Vi khuẩn Prop.shermanii sử dụng cơ chất trong môi trường để tăng sinh khối

 Hàm cơ chất trong môi trường giảm theo thời gian, sinh khối vi khuẩn tăng

 Thiết bị nhân giống:

Hình 4 Thiết bị nhân giống

1 Hệ thống điều nhiệt (nhân giống trong erlen)

2 Bình nhân giống trung gian

3 Thiết bị nhân giống

 Phần trên nắp có các cửa khác nhau: cửa thông cánh khuấy gắn với motor, cửa nạp giống, cửa vào và ra cho không khí, cửa nạp chất phá bọt, cửa nạp chất điều chỉnh pH… Cửa nạp môi trường và tháo canh trường ra khỏi thiết bị được

bố trí ở phần đáy Còn có đầu dò pH, nhiệt độ, oxy… để theo dõi các giá trị

 Thông số công nghệ:

 Dung tích erlen: 1lits

 Dung tích thiết bị nhân giống: 1m3

 Nhiệt độ nuôi cấy: 28-320C

 pH= 6.9-7

 Thời gian nuôi cấy: 7-8 ngày

2 Chuẩn bị môi trường lên men:

 Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lên men

 Cách biến đổi: Về sinh học, các loại vi sinh vật không mong muốn

nhiễm vào môi trường bị ức chế, tiêu diệt

7 7 Thiết bị tao đổi nhiệt – thiết bị làm

mát

8 Thiết bị lên men

 Cấu tạo: gồm thùng chứa môi trường dinh dưỡng, bơm ly tâm, bộ đun nóng,

bộ giữ nhiệt, bộ thu hồi nhiệt, bộ tra đổi nhiệt, hệ thống điều chỉnh tự động các thông số của quá trình

áp suất vào thiết bị làm mát

Cùng lúc mở các van xả nước ngưng và khi đạt được nhiệt độ lớn hơn 1400C thì bắt đầu tiệt trùng

Khi nhiệt độ và áp suất trong nồi phản ứng đạt trị số ổn định thì khuấy đảo các cấu tử của môi trường dinh dưỡng, môi trường mới lại cho vào thùng chứa để bơm đẩy qua khe đứng nhỏ vào bộ phận đun nóng

 Thông kê công nghệ:

 Mục đích: Khai thác: Làm tăng hàm lượng vitamin trong tế bào vi sinh vật

 Thiết bị lên men:

Ta sử dụng hệ thống gồm nhiều bình lên men nối tiếp Cấu tạo của bình lên men: cấu tạo tương tự như thiết bị nhân giống vi sinh vật Chúng cũng cũng có dạng hình trụ đứng, được chế tạo từ vật liệu thép không rỉ Bên trong thiết bị có

hệ thống cánh khuấy và các đầu dò nhiệt độ, pH…để có thể theo dõi trực tiếp cácthông số công nghệ trong quá trình lên men Motor cho cánh khuấy thường được

đặt phía trên nắp thiết bị Còn cửa nạp và tháo môi trường được bố trí phía đáy Ngoài ra thiết bị còn có cửa quan sát, van lấy mẫu…

 Thông số công nghệ của thiết bị lên men

 Thông khí bằng cách khuấy đảo liên tục

 Tốc độ thông khí: 0.5 lít/phút

 Lên men trong 6 - 8 ngày

 Nhiệt độ lên men 28 – 30oC

 Vật lý: Độ nhớt dung dịch giảm, nhiệt độ dung dịch tăng Thực tế các

cobamide được hình thành trong quá trình lên men được tích tụ trong tế bào Bước đầu tiên là tách tế bào từ môi trường lên men

Hình 6 Thiết bị lên men

 Máy ly tâm tốc độ cao được sử dụng để tập trung vi khuẩn thành váng trên bề mặt, trong khi màng lọc được sử dụng để tách tế bào.

 Thiết bị sử dụng: thiết bị ly tâm lọc.

Trên thành thùng quay của máy ly tâm lọc có đục lỗ và được bọc bằng các lớplưới hoặc vải có kích thước lỗ phù hợp với tính chất sản phẩm Dưới i tác dụng của lực ly tâm pha lỏng bắn ra qua các lỗ, pha rắn nằm lại trên thành máy

Hình 7 Máy ly tâm lọc

 Thông số công nghệ

 Tốc độ quay: 4000 vòng/phút

 Năng suất nhập liệu: 363 lít/ phút

 Công suất động cơ: 30KW

 Khối lượng thiết bị: 1.9 tấn

5. Acid hóa:

Vào lúc kết thúc quá trình thì coenzym B12 trong tế bào được giải phóng nhờ phương pháp acid hóa bằng cách bổ sung KCN mà được chuyển thành

cyancobalamin tức là vitamin B12 thật sự

 Mục đích: Khai thác: Sau khi li tâm để thu tế bào vi sinh vật, ta sẽ tiến hành

acid hóa để giải phóng vitamin B12 là sản phẩm nội bào của vi sinh vật

 Các biến đổi:

 Sinh học: Dưới tác động của acid, nhiệt, cyanide hoặc các phương pháp khác

sẽ phá vỡ thành tế bào vi sinh vật, giải phóng vitamin B12

 Biện pháp: bổ sung dung dịch cyanide để phân ly coenzyme khỏi vitamin và kết quả là tạo thành cyanocobalamin

 Mục đích:

Khai thác: làm tăng hàm lượng vitamin B12 bằng cách hấp phụ vitamin trên divinylbenzene/styrene copolymer resin, tách vitamin khỏi tạp chất

 Các biến đổi:

Hóa lý: Vitamin B12 được hấp phụ bởi nhựa trao đổi ion cation , sẽ bền vững

hơn, đặc biệt có acid và chất bất lợi như acid ascorbic, kim loại…

- pH giảm trong quá trình hấp phụ đến vùng resin hoạt động hiệu quả

- Nhiệt độ khoảng 15 - 250C, có thể thấp hoặc cao hơn, 1 gam resin có thể hấp thu 1,5 gam vitamin B12

Hình 9 Ion exchange resinResin là acid polyacrylic hoặc acid polymethacrylic, mà trong đó có những phân tử nối với nhóm divinyl thơm như là divinylbenzenne Resin có tên thươngmại là Amberlites

Vật lý: Sự hiện diện của muối vô cơ hòa tan trong quá trình hấp phụ vitamin

B12 bằng resin sẽ làm giảm một cách tích cực tỉ lệ hấp phụ

 Thông số công nghệ:

- Kích thước resin: 10-8 – 10-7 m, tối thiểu là 10-4m, diện tích bề mặt riêng: ítnhất là 200m2/g

- Một số loại resin: Amberlite XAD-2, DIAION HP-20, HP-21, HP-2 mG.Quá trình hấp phụ diễn ra ở nhiệt độ phòng, giá trị pH tối ưu và thời gian tối

ưu tiếp xúc tiếp xúc với resin phụ thuộc vào chất lượng dung dịch chứa

vitamin và hàm lượng tạp chất trong dung dịch

 khai thác nhằm tăng nồng độ vitamin trong dung dịch.

 Thiết bị được sử dụng là: thiết bị cô đặc chân không.

Hình 11 Sơ đồ thiết bị cô đặc chân không

 Nguyên lí hoạt động

- Khởi động bơm chân không đến áp suất Pck = 0,7 at.

- Sau đó bơm dung dịch ban đầu từ bể chứa nguyên liệu vào nồi cô đặc bằngbơm ly tâm

- Khi đã nhập liệu đủ nguyên liệu thì bắt đầu cấp hơi đốt (là hơi nước bão hòa)vào buồng đốt để gia nhiệt dung dịch Buồng đốt gồm nhiều ống nhỏ truyềnnhiệt (ống chùm) và một ống tuần hoàn trung tâm có đường kính lớn hơn.Dung dịch chảy trong ống được gia nhiệt bởi hơi đốt đi ngoài ống Dung dịchtrong ống sẽ sôi và tuần hoàn qua ống tuần hoàn (do ống tuần hoàn có đườngkính lớn hơn các ống truyền nhiệt nên dung dịch trong ống tuần huần sẽ sôi íthơn trong ống truyền nhiệt, khi đó khối lượng riêng dung dịch trong ống tuầnhoàn sẽ lớn hơn khối lượng riêng dung dịch trong ống truyền nhiệt vì vậy tạo

áp lực đẩy dung dịch từ ống tuần hoàn sang các ống truyền nhiệt) Dung môi lànước bốc hơi và thốt ra ngoài qua ống dẫn hơi thứ sau khi qua buồng bốc vàthiết bị tách giọt Hơi được dẫn qua thiết bị ngưng tụ baromet và được ngưng

tụ bằng nước lạnh, sau khi ngưng tụ thành lỏng sẽ chảy ra ngoài bồn chứa.Phần không ngưng sẽ được dẫn qua thiết bị tách giọt để chỉ còn khí khôngngưng được bơm chân không hút ra ngoài Hơi đốt khi ngưng tụ chảy ra ngoàiqua cửa tháo nước ngưng, qua bẫy hơi rồi được xả ra ngoài - Quá trình cứ tiếp

tục đến khi đạt nồng độ nhất định(sau thời gian cô đặc t phút) thì ngưng cấp

hơi Mở van thông áp, sau đó tháo sản phẩm ra bằng cách mở van tháo liệu

 Ưu điểm:

- Giữ được chất lượng, tính chất sản phẩm, hay các cấu tử dễ bay hơi

- Nhập liệu và tháo sản phẩm đơn giản, không cần ổn định lưu lượng

- Thao tác dễ dàng

- Có thể cô đặc đến các nồng độ khác nhau

- Không cần phải gia nhiệt ban đầu cho dung dịch

- Cấu tạo đơn giản, giá thành thấp

 Nhược điểm:

- Quá trình không ổn định, tính chất hóa lý của dung dịch thay đổi liên tục theonồng độ, thời gian

- Nhiệt độ hơi thứ thấp, không dùng được cho mục đích khác

- Khó giữ được độ chân không trong thiết bị

9 Kết tinh:

 Mục đích:

 Khai thác: hàm lượng vitamin tang lên

 Hoàn thiện: độ tinh sạch của vitamin cao hơn

 Thiết bị: thiết bị kết tinh chân không

- Thời gian : 2 - 3h

10 Ly tâm

 Mục đích:

- Chuẩn bị: chuẩn bị cho quá trình sấy tiếp theo

- Khai thác: tăng hàm lượng vitamin

- Hoàn thiện: độ tinh sạch của sản phẩm vitamin càng cao

 Thiết bị: máy lọc ly tâm

Hình 13 Maý lọc ly tâm

 Thông số công nghệ:

- Tốc độ quay: 1000 vòng/phút

- Thời gian ly tâm: 6 phút

- Năng suất nhập liệu: 300 lít/phút

- Công suất động cơ: 30kw

- Khối lượng thiết bị: 1 tấn

11 Sấy

 Mục đích: hoàn thiện vitamin khô.

Thiết bị sử dụng là: thùng sấy chân không cánh đảo