Đại cương về saponin của trường đại hoc y dược Tp.Hồ Chí MInh Saponin là một Glycosyd tự nhiên thường gặp trong nhiều loài thực vật. Tiền tố latinh sapo có nghĩa là xà phòng; và thực tế thường gặp từ saponification có nghĩa là sự xà phòng hóa trong cả tiếng Anh và tiếng Pháp. Saponin có tính chất chung là khi hoà tan vào nước có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch tạo nhiều bọt, có tính chất phá huyết, độc đối với động vật máu lạnh nhất là đối với cá, tạo thành phức với cholesterol, có vị hắc và làm hắt hơi mạnh. Một vài động vật cũng có saponin như các loài hải sâm, cá sao. Các saponin đều là các chất hoạt quang. Thường các steroit saponin thì tả truyền còn triterpenoit saponin thì hữu truyền. Điểm nóng chảy của các sapogenin thường rất cao. Dưới tác dụng của enzym có trong thực vật hay vi khuẩn hoặc do axít loãng, saponin bị thuỷ phân thành các phần gồm genin gọi là sapogenin và phần đường gồm một hoặc nhiều phân tử đường. Các đường phổ biến là Dglucoza, Dgalactoza, Larabinoza, axít galactunoic, axít Dglucuronic... Phần genin có thể có cấu trúc cholan như sapogeninsteroi hoặc sapogenintritecpen dạng βamirin (axít olenoic), dạng αamirin (axít asiatic), dạng lupol (axit buletinie) hoặc tritecpen bốn vòng. Dựa vào cấu trúc của phần sapogenin, người ta chia saponin ra làm 3 nhóm lớn là triterpenoit saponin, steroit saponin và glicoancaloit dạng steroit. Saponin có loại axít, trung tính hoặc kiềm. Trong đó, triterpenoit saponin thường là trung tính hoặc axít (phân tử có nhóm –COOH). Steroit saponin nhóm spirostan và furostan thuộc loại trung tính còn nhóm glicoancaloit thuộc loại kiềm.
Trang 1• Định nghĩa, phân loại các saponin
• Các tính chất (lý, hóa) chính của saponin
• Các phương pháp chiết xuất, phân lập saponin
• Các phương pháp định tính, định lượng saponin
• Tác dụng & Công dụng chính của các saponin
• Các dược liệu* chứa saponin đáng chú ý
1 Khái niệm - Định nghĩa
2 Cấu trúc - Phân loại
Trang 2• Từ xưa, con người đã biết sử dụng một số thực vật để tắm gội,
giặt giũ… do chúng có tính tạo bọt, tẩy rửa
• Nhiều loài cây đã được sử dụng cùng mục đích giặt tẩy:
- soapbark: Quillaja saponaria họ Quillajaceae
- soapwort: Saponaria officinalis họ Caryophyllaceae
- soapberry: Sapindus saponaria họ Sapindaceae
- soapnut: Sapindus mukurossi họ Sapindaceae
- soaproot: Chlorogalum pomeridianum Asparagaceae
Saponin xuất phát từ “sapo” = soap, savon vừa nói lên tính chất,
vừa nói lên xuất xứ thực vật của nhóm hợp chất tự nhiên này
(ban đầu, được chiết từ chi Saponaria hay từ loài Q saponaria)
6
• Vài tài liệu khác lại cho rằng thuật ngữ “saponin” được sử dụng đầu tiên bởi: P.A Bucholz, từ 1811 (theo Bernard, 1949) hoặc bởi Grothus, từ 1815 (theo Kichter, 1939)
• Hiện nay, nhiều tài liệu vẫn công nhận Gmelin (1819) là người khai sinh ra thuật ngữ “saponin” hiện đang được sử dụng
Tham khảo Ludwig Kofler (1927), Die Saponine, p 4 (slide sau)
• Khi dùng các cây nói trên để tắm giặt, người ta nhận thấy chúng
có thể làm chết cá, ốc, đỉa… và 1 số động vật thân mềm khác(nên chúng còn được dùng để thuốc cá *; khác Derris elliptica!)
7
• Ludwig Kofler (1927): Xuất bản cuốn “Die Saponine” tổng quan
hệ thống về lịch sử nghiên cứu, về tính chất lý hóa, sinh học…
cùng sự phân bố, xuất xứ của nhiều saponin thực vật
• Rosenthaler (1939): Saponin là các chất có tính tạo bọt bền
trong dung dịch nước, có cấu tạo glucosid (hay ∆’ glucuronid)
của polyterpen hay của cholan (tức sterol)
• Bernard (1949): Saponin là các heterosid, có bản chất keo
(colloidal), tan được và có tính tạo bọt trong nước
Chúng có mùi hăng nồng, vị đắng, gây hắt hơi, gây phá huyết
8
• Ph.ứng màu: (Salkowski, 1872; Liebermann, 1885; Burchard, 1889)
• Phản ứng tạo phức Digitonin + Cholesterol: (Windaus, 1909)
• Phân loại saponin theo tính acid-kiềm: (Robert, 1917)
• Chiết saponin với n-BuOH bão hòa nước: (M.E Wall, 1952)
Trang 39 10
11
1.1 Quan niệm truyền thống: Saponin là các glycosid tự nhiên
(gặp chủ yếu trong thực vật, một số từ động vật) có tính:
• Làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch
• Tạo bọt nhiều, bền khi lắc với nước
• Làm vỡ hồng cầu (phá huyết) ở nồng độ rất thấp
• Độc đối với cá & các loài thân mềm (giun, sán, ốc…)
• Kích ứng niêm mạc (gây hắt hơi, đỏ mắt…)
• Tạo phức với cholesterol & các ∆’ 3β-OH-steroid Lưu ý:
• Như vậy, các glycosid trợ tim cũng thuộc nhóm saponin
• Các sapogenin, tuy không là glycosid, mặc nhiên vẫn được xếp vào “nhóm saponin”
1.2 Quan niệm hiện nay: Saponin là các glycosid có MW lớn của triterpenoid hay steroid (Kurt Hostettmann, 1995)
Tuy nhiên, nhiều saponin kinh điển (/ Đậu nành, Cam thảo, Nhân sâm, Tam thất…) lại ko thể hiện đầy đủ các tính chất này; nhất là tính phá huyết & tính tạo phức với cholesterol…
Trang 4Robert, 1917: Phân loại saponin → saponin acid, trung tính, kiềm.
Hiện nay: phân loại theo khung của aglycon = sapogenin = genin.
14
- Đại đa số: O-glycosid (thường gặp ở 3β-OH → ose)
Ít gặp hơn: ψ-glycosid (thường gặp ở 28β-COOH →ose)
- Sap steroid: thường chỉ là mono-desmosid (1 mạch đường) Saponin triterpenoid: có thể có 1, 2 hoặc 3 mạch đường
- Mạch đường (desmos) có thể thẳng hoặc phân nhánh
Mỗi mạch đường có thể 1-5; đôi khi: hàng chục đường đơn
- Các hexose, pentose hay gặp trong cấu tạo saponosid:
* hexose: βD-Glc (và ∆’ GlcA) βD-Fuc (6-desoxy)
βD-Gal (và ∆’ GalA) αL-Rha (6-desoxy)
* pentose: βD-Xyl (f, p) αL-Ara (fura/pyranose)
3 5 OH
O OH OH HO
HO
COOH
O OH OH HO
HO
HO
CH2OH
1 6
O OH
OH
OH HO
1 2 3 4 5
O OH OH HO
OH 4
1
6 Me
β D-fucose
• βD-Glc: Mọi nhóm thế đều định hướng equatorial (eq)
• βD-Gal: Chỉ nhóm 4-OH là định hướng axial (ax)
• Khi CH2OH → COOH: ose → các acid glycuronic (GlcA…)
• Fucose (Fuc) và Rhamnose (Rha) đều là 6-deoxy ose
• Xylose (Xyl) và Arabinose (Ara) đều là các pentose
• βD-Fuc # βD-Gal (nhưng mất Oxy ở C-6: CH2OH → CH3)
• αL-Ara(p) # βD-Gal (nhưng mất nhóm CH2OH cuối mạch)
• βD-Xyl(p) # βD-Glc (nhưng mất nhóm CH2OH cuối mạch)
Trang 5Tần suất gặp các Ose / Sap Oleanan ở 25 bộ thực vật
đã gặp (theo Vincken 2007, Phytochemistry 68)
2.1.2 Saponin triterpenoid 4 vòng (all: trans)
a Phân nhóm Dammaran * (Me: 10β+ 8β)
b Phân nhóm Lanostan (Me: 10β+ 13β)
c Phân nhóm Cucurbitan (Me: 9β+ 13β)
d Phân nhóm Tirucallan (Me: 10β+ 13α)
3 4
5 6 7 8 9 10
11 12 13
14 15 16 17 18
19 20 2122
3 4
5 6 7 8 9 10
11 12 13
14 15 16 17 18
1 2
3 4
5 6 78 9 10
11 12 13
15 16 17 18
19 20 21 22
23 24
25 26
27
28 29 30
29 30 29
Trang 61
13 17
23 24
19 2118
28 22
1
13 17
23 24
25 26
27 COOH
19 2118
28 22
→ acid oleanolic hederagenin
→ acid ursolic acid quinovic
1
13 17
23 24
25 26
27 COOH
19 21 18
23 24
25 26
27 COOH COOH
19 21 18
1 2
3 4
5 6 78 9 10
11 12 13
14 15 16 17 18
3 4
5 6 78 9 10
11 12 13
15 16 17 18
19 20 21 22
23 24
25 26
27
28 29 30
All = 8 nhóm methyl
• Trong 5 vòng A, B, C, D, E: vòng E có thể là 6 cạnh hay 5 cạnh.
• 4 vòng A-D: có 6 nhóm Me (lưu ý: gem-dimethyl ở vòng A)
• E 6 cạnh: thêm 2 nhóm Me (geminal: Oleanan, vicinal: Ursan).
• E 5 cạnh: thêm 2 nhóm Me / isopropyl (↑: Lupan; ↓: Hopan).
• Tổng cộng: 30 C (trong đó có 8 nhóm Me ; ≠ sap steroid).
E
20
29 30
E
20
29 30
22 29
30
20
21 19
E
22 29
30
Trang 713 14
20
21 22
23 24 25 26
11 12
14 15
16 17 18 19
20 21
22 24 26
27
28 29
11 12
14 15
16 17 18 19
20 21
22 24 26
27
28 29
30
OH
các ginsenosid Rb1, Rb2, Rc, Rd…
các ginsenosid Rg1, Rg2, Re, Rf…
27 26 25 24 23 22 21 20
2.1.2a Khung dammaran
Các mạch đường sẽ nối O-glycosid vớ1 nhóm OH ở C-3, 6, 20
20
19
18
17 16
15 13
R
2.1.2c Khung Cucurbitan (9-Me) Cucurbitacin B (in Cucurbitaceae)
OAc O
O
O
H HO
25
30 5
23 24
26
27 21
26
27 21
• Vòng D thêm nhánh 8 C; trong đó có 3 nhóm Me nữa (→ 30 C).
• Tổng cộng: 30 C (trong đó có 8 nhóm Me ; khác hẳn sap steroid).
• Từ Lanostan → các phân nhóm khác nhau về vị trí gắn nhóm Me:
Trang 82.2.1 Phân nhóm Spirostan (chủ yếu, phổ biến)
2.2.2 Phân nhóm Furostan (dễ biến thành Spirostan)
Nhận xét về khung của saponin steroid:
• Vòng (A): không có gem-dimethyl ở C-4 (≠ sap triterpenoid)
- các khung sap steroid chỉ có # 4 nhóm methyl
- còn khung sap triterpenoid có tới # 8 nhóm methyl
Rất dễ phân biệt bằng các phổ 13C-NMR (CPD, DEPT)
• Saponin steroid đa số chỉ có 1 mạch đường (monodesmosid);
còn sap triterpenoid có thể đến 3 mạch đường (tridesmosid)
19
20
21 22
23 24
25 26 27
5 6
19
20 21
22 23 24
25 26 27
12
Hecogenin Diosgenin
8 C
(17 + 2) C
Là nguyên liệu quan trọng để bán tổng hợp các thuốc steroid
Hai genin đáng chú ý: diosgenin / Dioscorea & hecogenin / Agave
O
OH
H HO
HO
20
21
22 23 24
25 26 27
Ít gặp hơn Spirostan Furostan dễ đóng vòng thành Spirostan
Tương tư“ Furostan, 3-OH → 3-NH22.3.4 Phân nhóm Polypodo-saponin2.3.5 Phân nhóm Osladin
2.3.6 Phân nhóm α-Spinasteroid
Trang 921 22 23 24 25
26 27
N
O Oses
27 26 25
24 23 22 21 20
3 10
Thường từ tên khoa học (tên Chi, tên loài) của mẫu
Aglycon thường có vĩ ngữ “genin”: diosgenin (= EU, USA)
Glycosid thường có vĩ ngữ “osid”: ginsenosid (EU, USA: oside)
Tên thông thường:
Theo EU, USA
• saponin: không có e cuối
• alkaloid: có e cuối*
Theo DĐVN IV
• saponin: không có e cuối
• alkaloid: không có e cuối
Genin: Smilagenin, Diosgenin, Hederagenin, Gypsogenin…
Glycosid: Panaxosid, Ginsenosid, Asiaticosid, Polysciacosid
Senegin, Mollugocin, Glycyrrhizin, Cucurbitacin…
36
1 Rh2
2 Rg3
4 Rs1, Rs2
5 Ra1, Ra2, Ra3
Khung Oleanan với 3 ose ở 2 mạch Ro
1 Rh1
2
Rf, Rg1, Rg2
3 Re
3 Rd
4 Rb1, Rb2, Rb3, Rc
protopanaxatriol (Σ các đường đơn)
protopanaxadiol (Σ các đường đơn) Ginsenosid
Ginsenosid của Rễ củ (Radix) và Lá (Folium) = R và L
Trang 103.1 Cảm quan
• Nói chung, saponosid thường ở trạng thái bột vô định hình,
không màu, mùi hăng, đ số: vị đắng nhẫn đến đắng (*)
• Các sapogenin có thể ở dạng tinh thể (thường là hình kim)
Một số “glycosid trợ tim” (cũng là saponin!) dễ ở dạng tinh thể
3.2 Độ phân cực và tính tan
• Saponosid thì phân cực hơn sapogenin tương ứng
Độ phân cực tăng theo độ dài & số lượng mạch đường
• Càng kém phân cực (như sapogenin): càng dễ tan / dung môi
phân cực kém → phân cực trung bình (CHCl3, DCM, EtOAc…)
• Các saponosid: thường kém tan / d môi (rất) kém phân cực
(Et2O, petrol ether PE, n-hexan, CHCl3, DCM, aceton…)
38
các acid
EtOH, MeOH Aceton
CCl4
n-BuOH EtOAc
CHCl3, CH2Cl2n-heptan, n-hexan
H2O AcCN
Benzen, Toluen
i-ProOH
Et2O Petrol Ether (PE)
Nhóm IV (rất phân cực)
Nhóm III (phân cực tr bình)
Nhóm II (kém phân cực)
Nhóm I (rất kém phân cực)
3.3 Tính tạo bọt (bền trong môi trường nước)
Do có tính lưỡng cực, làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch,
các saponin có tính tạo bọt nhiều và bền khi được lắc mạnh
Mạch ose càng nhiều & dài, tính tạo bọt càng rõ rệt
Tính chất này được ứng dụng trong tẩy rửa, làm thuốc long đàm
3.4 Tính phá huyết (ngay cả khi ở nồng độ rất thấp)
Nhiều saponin có tính phá huyết rất mạnh (làm vỡ hồng cầu →
không được đưa saponin vào mạch máu, nguy cơ gây tan máu)
Tuy nhiên, 1 số saponin lại thể hiện tính chất này không rõ
3.5 Tính kích ứng niêm mạc
Nhiều saponin có tính kích ứng niêm mạc
(làm đỏ mắt, chảy nước mắt; gây hắt hơi mạnh; vd bột Bồ kết…)
40
Ghi chú: Có nhiều ghi nhận về tính phá huyết (TPH) của saponin
• Tốc độ và TPH của sap steroid > sap triterpenoid
• TPH của monodesmosid > bidesmosid hay tridesmosid
• Trong monodesmosid thì:
- TPH sẽ giảm khi aglycon có nhiều nhóm phân cực
- TPH sẽ tăng khi mạch ose dài đến 4-6 đường đơn
- TPH của 3-O-Glc > 3-O-GlcA (glycyrrhin có TPH rất kém)
• Chưa thấy sự liên hệ giữa TPH // tính tạo phức với cholesterol
• Riêng về tỉ lệ khối lượng giữa [aglycon / ose]:
nhiều báo cáo lại có ghi nhận ngược nhau về sự tăng / giảm TPH
(Ref: SM Hassan, 2008, Ph.D Thesis, pp 30-32)
Trang 11• Các saponosid & genin thường không cho phổ hấp thu UV-Vis
Cực đại hấp thu của chúng thường << 250 nm
HPLC-UV, HPLC-PDA thường không thích hợp với saponin
Detector hữu hiệu thường phải ~ 205 nm
Thay vào đó, cần dùng các detector khác (RI, ELSD, MS…)
3.6a Phổ UV của saponin
• Genin triterpenoid + H2SO4 đđ → sản phẩm có λmax310 nm
Các genin steroid không có tính chất này *
Ref: VD Ponomarev, ET Oganesyan, VF Semenchenko (1971)
Phổ UV-Vis của các saponin thực tế không có ứng dụng nhiều
như trường hợp của Flavonoid
42
Phổ UV của 1 số saponin triterpenoid 5 vòng + H2SO4 đđ.
VD Ponomarev, ET Oganesyan, VF Semenchenko (1971).
Khimiya Prirodynykh Soedinenii, No 2, pp 147-150.
• Trên phổ IR, sẽ cho các băng hấp thu đặc trưng của các nhóm
OH: ~3300; -O-C: ~1100 và O=C<: ~1700 cm-1
25R: 1* > 860
25R: [2] > [3]
25S: [2] < [3]
25S: 1* < 860 cấu hình
860-866 1*
[4]
980-987 4*
[3]
915-923 3*
[2]
894-905 2*
[1]
850-857
cường độ
ν (cm –1 ) band
• Có thể phân biệt các đồng phân 25R vs 25S nhờ quan sát cường độ
của bộ tứ tín hiệu tại band 1*, 2*, 3* và 4 như sau:
23 24
25 26 27
5 6 Phổ IR (KBr) của Diosgenin (25R, theo SDBS)
Trang 12922 [3]
35%
895 [2]
42%
850 [1]
[cường độ]
ν (cm –1 ) band
Phổ IR của neohecogenin (thực đo)
O
O
25
24 23 22 21
20
26 27
O
O 20
21
22 23 24
25 26
20
26 27
•
hecogenin: 25R (H-25 axial)
O
O 20
21
22 23 24
25 26
27
•
16.0 (ax) 65.1
27.0 ( S ) 25.8
26.0 γ
neohecogenin
17.1 (eq) 66.9
30.2 ( R ) 28.8
31.5 γ
(25 R ) hecogenin
C-27 C-26
C-25 C-24
C-23
Tham khảo (Học phần Dược liệu 3, năm V)
A Phân tích bộ 5 tín hiệu của C-23 → C-27 (thuộc vòng F) trên phổ 13 C-NMR,
có thể phân biệt được 2 đồng phân hecogenin (25 R ) & neohecogenin (25 S ).
B Phân tích tín hiệu phổ 1 H-NMR của 26-CH2(Jaa >> Jae, Jea > Jee)
• hecogenin: [H-26ax & H-26eq] ghép với [H-25ax] → Jaa (lớn) và Jea (nhỏ).
• neohecogenin: [H-26ax & H-26eq] ghép với [H-26eq] → Jae (nhỏ) và Jee (nhỏ).
Trang 13Đặc biệt quan trọng khi khảo sát cấu trúc các saponosid
có nhiều mạch đường Trên phổ MS, khi có sự phân mảnh:
• ∆m/z 162: dấu hiệu có glucose, galactose (M = 180)
• ∆m/z 146: dấu hiệu có rhamnose (desoxy) (M = 164)
• ∆m/z 132: dấu hiệu có xylose, arabinose (M = 150)
Hiện nay, các ose được xác định nhờ các kỹ thuật phổ MS, NMR
(định danh + α/β + fura/pyranose + cách ghép trong mạch…)
3.7 Khối phổ (MS)
Trước đây, các ose thường được xác định bằng ph pháp SKLM
(so sánh với các ose chuẩn; thực hiện sau phản ứng thủy phân)
50
Một ví dụ về sự phân mảnh của glycosid có MW 1240
MS của saponin là 1 lĩnh vực rất rộng Các công bố riêng về từng kiểu khung genin cũng đã rất đồ sộ Ví dụ tham khảo: MS và sự phân mảnh hay LC-MS, LC-HRMS của các ginsenosid trong chi Panax (internet)
51
• Các saponin cho nhiều tín hiệu methylen nên phổ 1H-NMR
tương đối khó phân tích (vì nhiều tín hiệu bị xen phủ)
• Để so sánh dữ liệu, thường khai thác phổ 13C hơn là 1H-NMR
• Dung môi đo phổ NMR có thể là:
- CDCl3, MeOD, DMDO-d6 đối với sapogenin
- Pyridin-d5, MeOD, DMDO-d6 đối với saponosid
Lưu ý: Trên phổ 13C-NMR (CPD, DEPT), khung của
• saponin triterpenoid→ nhiều (~ 8) tín hiệu methyl
• saponin steroid → ít (~ 4) tín hiệu methyl
(xem lại các slide 20-30 ở mục 2 Cấu trúc & Phân loại)
3.8 Phổ NMR của saponin
52
Có thể phân biệt loại và kiểu khung saponin nhờ phổ 1 chiều:
A Sap triterpenoid vs steroid: Trên phổ 13C-CPD, DEPT có sựkhác biệt rất rõ về số lượng nhóm methyl ở vùng δC < 30 ppm.(Triterpenoid > 5 tín hiệu Me; còn Steroid < 5 tín hiệu Me)
B Khung β-amyrin vs α-amyrin (cùng là triterpenoid 5 vòng):
• Phổ 13C: như nhau về số lượng nhóm Me ở vùng δC < 30 ppm
• Phổ 1H: α-amyrin có 2 nhóm >CH-Me → cho 2 tín hiệu doublet
(β-amyrin không có các tín hiệu doublet này)
C Glycosid vs genin: Trên phổ 13C-CPD có sự khác biệt rất rõ (Glycosid thì có và genin thì không có cụm tín hiệu của ose tạivùng 60 – 80 ppm)
Trang 14Phổ 1H-NMR (pyridin-d5, 500 MHz) của ginsenosid Re
Vùng 1,00 – 2,50 ppm (CH3, CH2) bị xen phủ (overlapped), khó phân tích.
54
Phổ 1H-NMR (pyridin-d5, 500 MHz) của ginsenosid Re
(ngay cả khi dãn rộng, cũng khó phân tích)
55
(trích) Phổ 13 C-CPD (DMSO-d6, 125 MHz) của 1 saponosid / Glinus
dấu hiệu của ose
dấu hiệu của Me
56
Các tín hiệu CH3 (*) ở vùng trường cao (< 30 ppm) của 2 saponin có khung hopan (triterpenoid 5 vòng)
OHOO
Trang 15Phổ 13 C-CPD của 1 saponin triterpenoid & 1 saponin steroid
8 tín hiệu CH3 / một ginsenosid 4 tín hiệu CH3 / một sap steroid
Khi gắn thêm (n x rhamnose): sẽ có thêm n tín hiệu CH3 nữa.
3 H Wagner, S Bladt (1998), Plant Drug Analysis, A TLC Atlas.
59
3.9 Sắc ký lớp mỏng saponin
Saponin (genin + glycosid) là nhóm hợp chất rất lớn & đa dạng
SKLM saponin là 1 nghệ thuật Cần chú ý các điểm sau:
• Bản mỏng: thông dụng nhất là silica gel F 254 pha thuận (NP)
• Mẫu thử: càng sạch càng tốt; hòa trong [CHCl3– MeOH; x : y]
nên chấm thành vạch dài # 10 mm (phân giải tốt hơn điểm)
• Dung môi: cùng “tính chất” với đối tượng nghiên cứu
- sapogenin dùng dung môi kém phân cực hơn saponosid
- mẫu có tính acid: dung môi nên có acid (AcOH, TFA, ForOH)
• Phát hiện vết: UV 254 và/hay thuốc thử AS, VS, VP, H2SO410%
• Để có sắc đồ đẹp: tham khảo tài liệu với keywords tương ứng
(Ginsenosid, Gypenosid, Cardenolid, Madecassoid, Glinus, …)
• Kỹ thuật cụ thể: Tham khảo và ghi chú trong phần thực tập
Tránh thuốc thử loang lổ không đều
4 Để thật khô dung môi sắc ký
Tránh di chuyển khi đang khai triển
3 Khi khai triển bản mỏng
Tránh làm Rf bị thay đổi do dm còn sót
2 Để thật khô dung môi hòa mẫu
Tăng khả năng phân giải của bản mỏng
1 Chấm mẫu thành băng # 6 -10 mm
Ghi chú, mục đích Chú ý kỹ thuật thực hiện
T C
Trang 16Mẫu thử: Cao EtOAc (đã loại bớt tạp) của hạt Móc mèo
Bản Si gel F 254 (Merck) Hiện màu vết = thuốc thử VS.
Tham khảo kỹ thuật chấm mẫu thử thành băng 1 cm
62
• Bản mỏng Silica gel F254 (Art No1.05554, Merck)
• Mẫu thử: Ginsenosid Σ của các loài Panax (đã loại tạp),chấm vạch dài 8-10 mm, dày 1 mm, cách nhau 6-8 mm
• Khai triển 1 lần với các hệ dung môi (tham khảo n nguồn):
- S1 = CHCl3- MeOH - H2O (65:35:10±; lớp dưới)
- S2 = CHCl3- MeOH - H2O (CMW) (70:30:4±)
- S3 = n-BuOH - EtOAc - H2O (4:1:1±)
- S4 = CHCl3- EtOAc - MeOH - H2O (15:40:22:10; lớp dưới)
• Phát hiện vết bằng cách phun / nhúng các thuốc thử sau:
AS, VS, VP, H2SO410% hay (NH4HSO4/ H2SO415%)
Một ví dụ về TLC & HPTLC các ginsenosid trong Panax spp
(xem hình sắc ký đồ ở slide sau)
63
Dung môi CMW (70:30:4) Nhúng thuốc thử Vanillin Phosphoric, sấy.
Ref: H Wagner et als.(2011), Chromatographic Fingerprint… p 884.
các chuẩn
Hồng sâm
Sâm Mỹ
Tam thất
Rb1 Re
Rg1 Rf F11
Rb1 Re Rg1
Ref: P Xie (2006), J Chromatog A, 1112, p 174.
CHCl3–EtOAc–MeOH–H2O (15:40:22:10; lớp dưới)
Trang 173.10 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC, UPLC, LC-detector)
Tài liệu & các công bố về HPLC của saponin cực kỳ phong phú
Ví dụ, các ginsenosid có thể được phân tích trong các điều kiện:
• Cột sắc ký: RP-18 hay RP-8 (cỡ hạt 5 µm, dài 15 - 25 cm)
• Pha động: [MeOH – H2O] hay [MeOH – AcCN] (x : y) hay
[A: 10 ml 0.1% H3PO4/ 1 L H2O] + [B: AcCN]
• Tốc độ dòng & chương trình dung môi: rất thay đổi
• Detector: Khúc xạ (LC-RI), tán xạ bay hơi (LC-ELSD),
Khối phổ (LC-MS), LC-PDA/UV ở < 210 nm
66
HPLC–ELSD chromatograms of ginsenosides (2 slide kế)
(A) Mixed standards (C) Red ginseng (B) White ginseng (D) Black ginseng
Ref: B.S Sun et als (2009),
J Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 50, pp 15-22
(g1 – e – d – b1 – c – b2)
Trang 1814 ginsenosid chuẩn
1, Rg1; 2, Re; 3, Rf; 4, Rh1; 5, Rg2; 6, Rb1; 7, Rc; 8, Rb2; 9, Rb3;
10, Rd; 11, Rg3; 12, Rk1; 13, Rg5; 14, Rh2; IS, internal standard (digoxin).
S.N Kim et al (2007), J Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 45, 164–170.
S.N Kim et al (2007), J Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 45, 164–170.
4: polyacetylen 5: stigmasterol
PPD
PPT Rb1
Re
Ref: Wagner et als (2011), p.888
Trang 194.1 Tính tạo tủa với dd chì acetat
4.2 Các phản ứng màu của saponin
• Salkowski (1872)
• Liebermann-Burchard (1889) ***
• Carr-Price (1926); Rosenthaler (1905)
• Với thuốc thử AS, VS, VP, acid sulfuric…
4.3 Tính tạo phức với cholesterol
4.4 Phản ứng thủy phân của saponosid
74
Saponin có thể tạo tủa với 3 loại d.dịch chì acetat (acid, kiềm và trung tính) Vì vậy, Robert (1917) đã chia saponin thành 3 loại:
• saponin kiềm: tủa với dd chì acetat kiềm
• saponin trung tính: tủa với dd chì acetat trung tính
• saponin acid: tủa với dd chì acetat acid
4.1 Tính tạo tủa phức với d dịch chì acetat
Có thể áp dụng tính chất này để làm giàu, tinh chế saponin trong quá trình chiết xuất – phân lập saponin
4.2 Các phản ứng màu
Từng saponin riêng biệt có thể cho một số phản ứng màu khá chuyên biệt Tuy nhiên, phản ứng màu chung cho nhóm saponin (để định tính, phát hiện) thì khá ít và lại không thực sự đặc hiệu
4.2.2 Phản ứng Liebermann-Burchard (L-B, 1889)
Cho ~ 1 ml H2SO4 đđ dọc theo thành ống nghiệm chứa sẵn
~ 1 ml d dịch saponin (hòa tan kỹ trong CHCl3+ Ac2O)
• mặt ngăn cách: có vòng nhẫn màu sậm (tím hồng – tím than)
• lớp d dịch phía trên có màu xanh lá (~ có khung steroid)
hoặc màu nâu đỏ (~ có triterpenoid)
Ph ứng này chỉ nên dùng để phát hiện saponin (q sát vòng nhẫn)
Việc phân biệt (q sát màu d dịch bên trên) thì ko thực sự chắc chắn
4.2.1 Phản ứng Salkowski (1872)
Cho ~ 1 ml H2SO4 đđ dọc theo thành ống nghiệm chứa sẵn
~ 1 ml d dịch saponin (hòa tan kỹ trong CHCl3)
• mặt ngăn cách: có vòng nhẫn màu sậm (tím – tím than)
• lớp d dịch phía trên có màu tím, nâu, nâu đỏ (không thật rõ)
76
H2SO4 đđ. • vòng nhẫn (màu sậm)
• lớp trên có màu (xanh, đỏ, tím…)
(saponin) (Ac2O + CHCl3)
Trang 20• Toàn bộ hệ thống (mẫu, tube, pipet…) phải thật khô
Nếu không: Khi cho acid vào sẽ sôi mạnh, tỏa nhiệt nhiều
• Nếu vòng nhẫn quá dày hoặc/và lớp trên có màu quá sậm:
Cần phải pha loãng mẫu thử (với Ac2O hay với CHCl3)
• Phản ứng dương tính (có saponin; steroid hay triterpenoid) khi:
- Có vòng nhẫn màu sậm (hồng tím, tím, tím than, nâu sậm…)
- Lớp trên màu xanh rêu, xanh lá đậm nhạt; nâu đỏ… đều được
• Phản ứng nguy hiểm:
- Không thực hiện trên tay (phải để nghiêng / giá, becher…)
- Khi rửa tube: tuyệt đối không rót nước vào tube còn nhiều acid
• •
78
Một số tài liệu còn đề cập tới vài phản ứng màu của saponin:
• Ph.ứng Rosenthaler (Vanillin + HCl, ∆) → màu tím hoa cà
• Ph.ứng Carr-Price (SbCl3/ CHCl3) → h quang vàng, xanh
Thường dùng các th’ thử có [ald thơm] hay [Oxy acid mạnh]:
• Vanillin Sulfuric (VS) hay Vanillin Phosphoric (VP)
• Anisaldehyd Sulfuric (AS) hay H2SO410% / cồn tuyệt đối
Phản ứng Salkowski, Liebermann vs Liebermann-Burchard
Ban đầu, cả 3 phản ứng màu này đều áp dụng riêng cho cholesterol.
Có thể tóm tắt như sau (mẫu = vài mg cholesterol / 1 ml dung môi).
• nhẫn: nâu, nâu đen (loang)
• lớp trên: xanh lá sậm, tối
đỏ rồi →→ xanh lá
1 ml Ac2O
Liebermann
(1885)
• nhẫn: nâu, nâu đen (loang)
• lớp trên: đỏ nâu, vàng nâu màu đỏ, đỏ nâu
1 ml CHCl3
Salkowshi
(1872)
+ 1 ml H2SO4 dọc thành ống ng o + 1-2 γ H2SO4, lắc
dung môi
Phản ứng
hay EtOAc, n-BuOH, AcOH
80
• Trước 1960s, nhiều tác giả dùng phản ứng L – B để phân biệt 2 nhóm
- triterpenoid: lớp d.dịch bên trên có màu nâu vàng, nâu đỏ, nâu sậm.
- steroid: lớp d.dịch bên trên có các màu xanh rêu, xanh lá, xanh tím.
• Đến 1960s, người ta nhận thấy saponin/quả Bồ kết tuy là triterpenoid, nhưng lớp dung dịch bên trên lại có màu xanh rêu đến xanh lá.
• Tuy vậy, nếu lớp d dịch phía trên có màu xanh rêu, xanh lá thì vẫn
có thể sơ bộ kết luận rằng: có khung steroid trong mẫu thử (áp dụng trong định tính khung steroid / glycosid steroid trợ tim).
• Phổ NMR hiện là công cụ hữu hiệu để phân biệt steroid // triterpenoid.
• Hiện nay, không thấy báo cáo phân biệt steroid vs triterpenoid bằng cách quan sát màu lớp dung dịch bên trên nữa
Chỉ còn quan sát vòng nhẫn: (+) → saponin (triterpenoid or steroid).