Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng kaviran

Một số kiểu thiết kế của đĩa phun ly tâm 31 3.1 Sự phụ thuộc của mật độ quang theo nồng độ của quercetin 58 3.2 Ảnh hưởng của thời gian đến chiết xuất flavonoid từ CHV 61 3.3 Ảnh SEM bột

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS NGUYỄN THANH HẢI PGS.TS NGUYỄN TÙNG LINH

HÀ NỘI – NĂM 2017

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:

PGS TS Nguyễn Thanh Hải PGS TS Nguyễn Tùng Linh

Là những người thầy đã tận tình hướng dẫn và hết lòng giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám đốc Học viện Quân y, Phòng sau đại học và các cơ quan chức năng trong Học viện đã cho phép và tạo điều kiện cho tôi học tập và thực hiện luận án này

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Minh Chính và các cán bộ, giảng viên, kỹ thuật viên Trung tâm Đào tạo - Nghiên cứu Dược đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án này

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện của GS.TS Hoàng Văn Lương, PGS.TS Nguyễn Văn Long, PGS.TS Vũ Bình Dương cùng các cán

bộ, kỹ thuật viên Trung tâm nghiên cứu Y Dược học quân sự, Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sản xuất thuốc thực nghiệm - Học viện Quân y

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Bộ môn Dược lý, Bộ môn Y học quân binh chủng, Bộ môn Giải phẫu bệnh lý, Khoa Y học hạt nhân - Học viện Quân y, Bộ môn Dược lý - Trường Đại học y Hà Nội, TT kiểm nghiệm Dược -

Mỹ phẩm Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án này Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp

đã động viên, ủng hộ tôi trong quá trình thực hiện luận án này

Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2017

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Trọng Điệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của riêng tôi Tất cả

số liệu trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào

TÁC GIẢ

NGUYỄN TRỌNG ĐIỆP

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt và ký hiệu trong luận án

Danh mục bảng

Danh mục hình

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 DƯỢC LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU 3

1.1.1 Cây nhàu 3

1.1.2 Cúc hoa vàng 8

1.1.3 Sâm Ngọc linh sinh khối 13

1.2 KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU VÀ PHUN SẤY 15

1.2.1 Kỹ thuật chiết xuất dược liệu 15

1.2.2 Kỹ thuật phun sấy và ứng dụng trong làm khô dịch chiết dược liệu 29

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 36

2.1.1 Nguyên vật liệu 36

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 36

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 37

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.2.1 Nghiên cứu bào chế bột cao khô tiêu chuẩn cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối 38

2.2.2 Nghiên cứu bào chế, tiêu chuẩn hóa và đánh giá độ ổn định của viên nang cứng Kaviran 48

2.2.3 Nghiên cứu tính độc tính và tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran trên động vật thực nghiệm 52

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 55

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56

3.1 KẾT QUẢ BÀO CHẾ BỘT CAO KHÔ TIÊU CHUẨN 56

3.1.1 Kết quả định tính, định lượng các hoạt chất trong dược liệu 56

3.1.2 Kết quả bào chế và tiêu chuẩn hóa bột cao khô cúc hoa vàng 58

3.1.3 Kết quả bào chế và tiêu chuẩn hóa bột cao khô quả nhàu 72

3.1.4 Kết quả chiết xuất, bào chế và tiêu chuẩn hóa bột cao khô sâm Ngọc linh sinh khối 89

3.2 KẾT QUẢ XÂY DỰNG CÔNG THỨC, TIÊU CHUẨN CƠ SỞ VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA VIÊN NANG CỨNG KAVIRAN 97

3.2.1 Xây dựng công thức viên nang Kaviran 97

3.2.2 Kiểm nghiệm và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở viên nang cứng Kaviran 101

3.2.3 Kết quả đánh giá độ ổn định của viên nang cứng Kaviran 101

3.3 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH, CHỐNG OXY HÓA, BẢO VỆ GAN CỦA VIÊN NANG KAVIRAN 101

3.3.1 Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn 101

3.3.2 Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa và bảo vệ gan của viên nang cứng Kaviran 105

Chương 4 BÀN LUẬN 112

4.1 CHIẾT XUẤT, BÀO CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN CƠ SỞ BỘT CAO KHÔ CÚC HOA VÀNG, QUẢ NHÀU VÀ SÂM NGỌC LINH SINH KHỐI 112

4.1.1 Lựa chọn nguyên liệu và kiểm định các dược liệu đầu vào 112

4.1.2 Điều chế cao cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối 113

4.1.3 Bào chế bột cao khô cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối bằng phương pháp phun sấy 121

4.1.4 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở bột cao khô cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối 131

4.2 XÂY DỰNG CÔNG THỨC, TIÊU CHUẨN CƠ SỞ VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA VIÊN NANG CỨNG KAVIRAN 133

4.2.1 Xây dựng công thức bào chế 133

4.2.2 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở viên nang cứng Kaviran 135

4.3 ĐÁNH GIÁ TÍNH AN TOÀN VÀ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH, CHỐNG OXY HÓA, BẢO VỆ GAN CỦA VIÊN NANG KAVIRAN 1384.3.1 Đánh giá tính an toàn của viên nang cứng Kaviran 1384.3.2 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan, chống oxy hóa trên động vật thực

nghiệm của viên nang Kaviran 1384.3.3 Đánh giá tác dụng của viên nang Kaviran trên chuột nhắt trắng

bị suy giảm miễn dịch do chiếu tia xạ 141KẾT LUẬN 146KIẾN NGHỊ 148TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ

2 ALT Alanin Transaminase

3 AST Aspartat Transaminase

5 BP British Pharmacopoeia (Dược điển Anh)

7 CHV-PS Cao cúc hoa vàng phun sấy

8 CI Carr’s compressibility index (Chỉ số nén)

10 CR/DP Chất rắn/ dịch phun (Tỷ lệ chất rắn trong dịch phun sấy)

13 d Khối lượng riêng (g/ml)

14 DĐVN Dược điển Việt Nam

23 HPLC High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng

hiệu năng cao)

25 KLTB Khối lượng trung bình

26 KLCT Khối lượng cơ thể

27 KLLTĐ Khối lượng lách tương đối

TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ

28 KLƯTĐ Khối lượng ức tương đối

29 MAE Microwave - assisted Extraction (Chiết xuất vi sóng)

34 NLSK Ngọc linh sinh khối

35 Noni-ppt Phần kết tủa trong ethanol giàu hợp chất polysaccharid

của dịch chiết quả nhàu

38 SEM Scanning Electron Microscope (Quét hiển vi điện tử)

39 SGMD Suy giảm miễn dịch

41 TD/CR Tá dược/ chất rắn (Tỷ lệ tá dược so với chất rắn trong cao

dược liệu)

42 TCCS Tiêu chuẩn cơ sở

43 USP United State Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ)

44 TNJ Tahitian noni juice (Nước ép quả nhàu)

46 Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Một số ứng dụng của MAE trong chiết xuất dược liệu 23 2.1 Thành phần công thức khảo sát bào chế viên nang cứng Kaviran 49 3.1 Hàm lượng luteolin và apigenin trong CHV 56

3.3 Hàm lượng ginsenosid Rg1 và Rb1 trong sâm NLSK 57 3.4 Hàm lượng flavonoid toàn phần trong CHV 58 3.5 Ảnh hưởng của phương pháp đến chiết xuất flavonoid từ CHV 59 3.6 Ảnh hưởng của dung môi đến chiết xuất flavonoid từ CHV 59 3.7 Ảnh hưởng của số lần chiết và tỷ lệ DM/DL đến chiết xuất

flavonoid từ CHV

60

3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chiết xuất flavonoid từ CHV 61 3.9 Thông số qui trình điều chế dịch chiết CHV 62 3.10 Chiết xuất flavonoid từ CHV ở qui mô 3kg/mẻ 62 3.11 Kết quả chiết xuất, cô đặc và loại tạp cao CHV 2:1 63 3.12 Thành phần cao CHV dùng để nghiên cứu phun sấy 64 3.13 Công thức khảo sát loại tá dược phun sấy cao CHV 64 3.14 Ảnh hưởng của loại tá dược đến phun sấy cao CHV 64 3.15 Công thức khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược/chất rắn đến phun

nhàu 1:1

78

3.27 Thiết kế công thức khảo sát loại tá dược phun sấy cao quả nhàu 79 3.28 Ảnh hưởng của loại tá dược đến phun sấy cao quả nhàu 79 3.29 Công thức khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ TD/CR đến phun sấy cao

3.32 Ảnh hưởng của nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch đến phun sấy

cao quả nhàu

84

3.33 Công thức khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chất CR/DP đến phun sấy

cao quả nhàu

86

3.34 Ảnh hưởng của tỷ lệ CR/DP đến phun sấy cao quả nhàu 86 3.35 Thông số qui trình bào chế bột cao khô quả nhàu bằng phun sấy 88 3.36 Thành phần nguyên liệu và cao sâm NLSK 89 3.37 Công thức khảo sát ảnh hưởng của loại tá dược đến phun sấy cao

sâm NLSK

90

3.38 Ảnh hưởng của tá dược đến kết quả phun sấy cao sâm NLSK 90 3.39 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến phun sấy cao sâm NLSK 91 3.40 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phun sấy cao sâm NLSK 92 3.41 Công thức khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ TD/CR đến phun sấy cao

Bảng Tên bảng Trang

3.46 Giá trị IC50 của hỗn hợp cao và các cao thành phần 97 3.47 Thành phần công thức khảo sát bào chế viên nang cứng Kaviran 99 3.48 Thành phần công thức cho một viên nang cứng Kaviran 100 3.49 Tỷ lệ chuột sống, chết sau 72 giờ uống Kaviran 102 3.50 Ảnh hưởng của Kaviran đối với khối lượng cơ thể thỏ 102 3.51 Ảnh hưởng của Kaviran đối với điện tim thỏ 103 3.52 Chỉ số hồng cầu, huyết sắc tố, bạch cầu và tiểu cầu ở các lô thỏ

nghiên cứu

103

3.53 Nồng độ AST, ALT, Creatinin và Ure của các lô thỏ 104 3.54 Tóm tắt nhận xét mô bệnh học gan, thận, lách thỏ thí nghiệm 105 3.55 Ảnh hưởng của Kaviran lên khối lượng gan tương đối 106 3.56 Ảnh hưởng của Kaviran lên hoạt độ AST, ALT trong huyết thanh

của các nhóm chuột nghiên cứu

106

3.57 Tóm tắt nhận xét về đại thể và vi thể gan của các nhóm chuột

đánh giá tác dụng bảo vệ gan của viên nang cứng Kaviran

107

3.58 Ảnh hưởng của Kaviran lên KLƯTĐ và KLLTĐ chuột nhắt trắng 108 3.59 Ảnh hưởng của Kaviran lên số lượng bạch cầu chuột nhắt trắng 108 3.60 Nhận xét về vi thể tuyến lách của các lô chuột nghiên cứu 109 3.61 Nhận xét về vi thể tuyến ức của các lô chuột nghiên cứu 110 3.62 Nhận xét về vi thể hạch của các lô chuột nghiên cứu 110 3.63 Nhận xét về vi thể tủy xương của các lô chuột nghiên cứu 111

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.5 Sơ đồ cấu tạo thiết bị và quy trình phun sấy 29 1.6 Một số kiểu thiết kế của đĩa phun ly tâm 31 3.1 Sự phụ thuộc của mật độ quang theo nồng độ của quercetin 58 3.2 Ảnh hưởng của thời gian đến chiết xuất flavonoid từ CHV 61 3.3 Ảnh SEM bột cao khô CHV phun sấy với các tá dược khác nhau 65 3.4 Ảnh SEM bột cao khô CHV phun sấy với tỷ lệ TD/CR khác nhau 67 3.5 Ảnh SEM bột cao khô CHV phun sấy ở các nhiệt độ khác nhau 69 3.6 Ảnh hưởng của dung môi đến chiết flavonoid từ quả nhàu 73 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chiết flavonoid từ quả nhàu 75 3.8 Ảnh hưởng của thời gian đến chiết flavonoid từ quả nhàu 75 3.9 Hàm lượng và hiệu suất thu hồi scopoletin trong bột cao khô quả

nhàu phun sấy với các tá dược khác nhau

Hình Tên hình Trang

3.19 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng và hiệu suất thu hồi

ginsenosid của bột cao khô sâm NLSK

92

3.20 Ảnh SEM của bột cao khô sâm NLSK khi phun sấy ở 120ºC (a) và

140ºC (b)

92

3.21 Ảnh hưởng của tỷ lệ TD/CR đến hàm lượng và hiệu suất thu hồi

ginsenosid của bột cao khô sâm NLSK

93

3.22 Ảnh SEM của bột cao khô sâm NLSK phun sấy ở tỷ lệ TD/CR

khác nhau

94

3.23 Ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn/ dịch phun sấy đến hàm lượng và

hiệu suất thu hồi ginsenosid của bột cao khô sâm NLSK

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, các thuốc nguồn gốc dược liệu được sử dụng rộng rãi và phát triển nhanh chóng trong hệ thống y tế Ngay ở các nước phát triển, thuốc nguồn gốc dược liệu đã được sử dụng rất phổ biến như là một liệu pháp bổ trợ hoặc thay thế (Canada 70%, Úc 48%, Mỹ 42%, Pháp 75%) [148] Thuốc cổ truyền đã được đưa vào chương trình đào tạo ở các trường đại học từ bậc cử nhân đến tiến

sỹ (39 nước, 30% các nước khảo sát) [150] Ở Việt Nam, thuốc nguồn gốc dược liệu được sử dụng từ lâu đời, nhưng vấn đề tiêu chuẩn hóa từ nguyên liệu ban đầu, bán thành phẩm đến thành phẩm nhằm nâng cao chất lượng và độ ổn định còn chưa được thực hiện triệt để Phát triển các dạng thuốc hiện đại từ dược liệu cũng còn nhiều vấn đề cần giải quyết Việc áp dụng các tiến bộ khoa học (công nghệ chiết xuất, bào chế bột cao khô và bào chế thành phẩm) để hiện đại hóa các dạng thuốc này là rất cần thiết, nhằm đảm chất lượng, tác dụng điều trị cũng như các lợi ích trong ứng dụng trên lâm sàng

Suy giảm miễn dịch mắc phải là hậu quả của nhiều quá trình bệnh lý như: Suy dinh dưỡng, nhiễm khuẩn, ung thư, sau khi dùng các thuốc ức chế hoặc độc với các tế bào của hệ thống miễn dịch, do tia xạ hoặc hoá chất điều trị ung thư, đặc biệt là trong nhiễm HIV/AIDS [13], [17] Trong các trường hợp bệnh lý trên, ngoài điều trị đặc hiệu để loại trừ tác nhân gây bệnh thì điều trị nhằm nâng

đỡ cơ thể, tăng cường miễn dịch là cần thiết Tuy nhiên, do chi phí điều trị cao, đặc biệt là khi sử dụng thuốc kháng retrovirus trong điều trị HIV/AIDS, nhiều bệnh nhân không có cơ hội tiếp cận, thì việc tìm kiếm các thuốc điều trị bổ sung hoặc thay thế, với giá thành dễ chấp nhận là vấn đề cấp bách và có ý nghĩa thực tiễn cao

Các nghiên cứu gần đây cho thấy, một số hoạt chất chiết xuất từ dược liệu

có tác dụng ức chế sự nhân lên của HIV [105], [133], kích thích miễn dịch [82], [90] và chống oxy hóa [133], [158], do vậy rất có thể có hiệu quả trong điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV, vì những người này bị tổn thương hệ miễn dịch nghiêm trọng Mặt khác, tình trạng cân bằng oxy hóa khử gây ảnh hưởng đến các hoạt động của hệ miễn dịch và stress oxy hóa có liên quan đến sự nhân lên

của HIV [11] Các nghiên cứu này đã gợi ý việc sử dụng các chất chiết xuất từ dược liệu có tác dụng tăng cường miễn dịch hết hợp với chống oxy hóa như một biện pháp trị liệu thay thế hoặc bổ sung trong điều trị các trường hợp suy giảm miễn dịch mắc phải nói chung và HIV/AIDS nói riêng

Quả nhàu và cúc hoa vàng (CHV) là các dược liệu sẵn có ở Việt Nam với trữ lượng lớn, đã được sử dụng từ lâu để làm thuốc Các nghiên cứu gần đây cho thấy quả nhàu và CHV có nhiều tác dụng sinh học quí như: tăng cường miễn dịch, chống oxy hoá, ức chế khối u, kháng khuẩn, chống nấm, chống viêm Sâm Ngọc linh sinh khối (NLSK) được tạo ra bằng công nghệ sinh khối tế bào thực vật, có chất lượng ổn định Các nghiên cứu bước đầu cho thấy sâm NLSK có một số tác dụng sinh học tương tự với sâm tự nhiên như: tăng lực, tăng quá trình nhận thức và ghi nhớ, chống oxy hóa, bảo vệ gan Tuy nhiên, các nghiên cứu về chiết xuất, bào chế chế phẩm từ ba dược liệu này còn đơn giản và chưa có chế phẩm thuốc nào bào chế phối hợp từ ba dược liệu này Do vậy, để góp phần nghiên cứu phát triển một chế phẩm thuốc mới từ quả nhàu, CHV và sâm NLSK (Viên Kaviran) nhằm tăng cường miễn dịch và chống oxy hóa theo hướng hiện đại, an toàn, hiệu quả, thuận tiện khi sử dụng và ứng dụng được vào sản xuất, đề

tài: “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng

Kaviran” được tiến hành nhằm các mục tiêu sau:

1 Bào chế được bột cao khô định chuẩn của cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối

2 Bào chế được viên nang cứng Kaviran từ bột cao khô định chuẩn cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối

3 Đánh giá được độc tính, tác dụng tăng cường miễn dịch, chống oxy hoá và bảo vệ gan của viên nang cứng Kaviran trên thực nghiệm

Chương 1 TỔNG QUAN1.1 DƯỢC LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU

1.1.1 Cây nhàu

1.1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

Nhàu có tên khoa học là Morinda citrifolia L, họ Cà phê (Rubiaceae),

nguồn gốc từ Đông Nam Á đến Úc, được trồng ở Ấn độ, vùng Ca-ri-bê, Nam

mỹ [38] Ở Việt Nam, cây mọc chủ yếu ở miền Nam từ Quảng Bình trở vào [20] Cây Nhàu là cây nhỡ hay to, cao 6 - 8m, có nhiều cành to, lá mọc đối xứng hình bầu dục, đỉnh lá nhọn hoặc tù, dài 12 - 30cm, rộng 6 - 15cm, mép uốn lượn, mặt trên xanh lục bóng, mặt dưới nhạt Quả nhàu hình bầu dục, dài 3 - 10cm, rộng 3 - 6cm, mọc thành chùm, quả chín có màu trắng vàng hoặc hồng nhạt, bề mặt lồi lõm Mùa quả: tháng 3 - 5 Sản lượng quả nhàu ở Hawaii có thể đạt 50 tấn/ha/năm [4], [38] Bộ phận dùng: Vỏ, rễ, lá, quả phơi hoặc sấy khô [4]

nordamnacathal, rubiadin, rubiadin-1-methyl ether và các anthraquinon glycosid khác Damnacanthal là một antraquinon có tác dụng chống ung thư Scopoletin

là một coumarin đã được phân lập vào năm 1993 tại Đại học Hawaii, có hoạt tính giảm đau, kháng khuẩn, chống tăng huyết áp, đồng thời kiểm soát mức độ serotonin trong cơ thể Các acid hữu cơ chính là acid aproic và caprylic Trong khi alcaloid quan trọng nhất là xeronin - là một alcaloid có khả năng kết hợp với protein của người làm tăng chức năng của chúng Có khoảng 51 hợp chất dễ bay hơi đã được xác định trong quả nhàu chín [38], [144] Quả nhàu chứa hàm lượng cao các polysarcharid, là thành phần chính có tác dụng tăng cường miễn dịch và chống khối u [28], [66]

Theo Nguyễn Trọng Thông và cs, quả nhàu non, già và chín đều chứa anthraglycosid, flavonoid, coumarin, triterpenoid, saponin, polyphenol, alcaloid, dầu béo, tinh dầu, acid hữu cơ, đường khử, acid uronic Trong đó, anthraquinon trong quả nhàu non là 0,56%, quả nhàu già là 0,55% [24]

1.1.1.3 Tác dụng sinh học

Nhàu đã được sử dụng làm thuốc trong dân gian từ hơn 2000 năm, với nhiều tác dụng điều trị [144] Tuy nhiên, những bằng chứng nghiên cứu khoa học gần đây góp phần làm sáng tỏ những tác dụng điều trị của nhàu, bao gồm:

a Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm và kháng virus:

Một số nghiên cứu cho thấy, quả nhàu ức chế sự phát triển của một số vi

khuẩn như Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Proteus morgaii, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Helicobacter pylori, Salmonella và Shigella

Tác dụng kháng khuẩn có thể do sự hiện diện của các hợp chất phenolic như acubin, L-asperuloside, alizarin, scopoletin trong quả nhàu Dịch chiết ethanol

và hexan của quả nhàu có tác dụng chống lao với khả năng ức chế 89-95% sự

phát triển của Mycobacterium tuberculosis Quả nhàu có tác dụng kháng virus

và kháng nấm, nó có thể dùng như một hoạt chất để chống nấm [38], [62], [144]

b Tác dụng tăng cường miễn dịch và chống ung thư:

Các đặc tính điều hòa miễn dịch và chống ung thư của quả nhàu đã được công bố trong nhiều nghiên cứu gần đây, trong đó tính đến năm 2011 đã có 19

nghiên cứu liên quan đến ung thư (7 nghiên cứu in vitro, 9 nghiên cứu in vivo trên động vật và 3 nghiên cứu in vivo trên người), nhưng chủ yếu là thử nghiệm

với nước ép quả nhàu không tinh khiết [35] Một số nghiên cứu tập trung vào phần kết tủa trong ethanol (Noni-ppt) của nước ép quả nhàu, tương ứng với một hợp chất giàu polysaccharid gồm acid glucuronic, galactose, arabinose và rhamnose Noni-ppt đã được chứng minh là có tác dụng điều hòa miễn dịch và chống khối u trong ung thư biểu mô phổi trên chuột thực nghiệm, được báo cáo lần đầu bởi Hiramizu A và cs [66] Trên mô hình tế bào, Noni-ppt kích thích việc sản xuất các tế bào lympho T, tế bào tuyến ức và đại thực bào sản xuất cytokin, là những chất trung gian quan trọng trong ức chế tăng trưởng tế bào và độc tế bào khối u [38]

Noni-ppt cũng có khả năng kích thích giải phóng một số các chất trung gian

từ các tế bào chuột phản ứng, bao gồm yếu tố hoại tử khối u (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), IL-10, IL-12 p70, interferon-γ (IFN-γ) và nitơ oxid (NO), ngăn chặn giải phóng IL-4, nhưng không có tác dụng trên IL-2 Noni-ppt làm chậm chu kỳ tế bào trong khối u, tăng đáp ứng của tế bào để các tế bào miễn dịch chống lại sự phát triển của khối u và tăng hoạt động của đại thực bào Làm tăng thời gian sống sót và tác dụng điều trị khi dùng kết hợp noni-ppt với ngưỡng dưới liều điều trị tối ưu của các tác nhân hóa trị liệu chuẩn như adriamycin, cisplatin, 5-fluorouracil và vincristin Điều này cho thấy ứng dụng lâm sàng quan trọng của noni-ppt như một chất bổ sung trong điều trị ung thư [66] Nghiên cứu về cơ chế tác dụng cho thấy, nước ép quả nhàu cô đặc điều chỉnh các hệ thống miễn dịch thông qua kích hoạt của thụ thể cannabinoid 2 (CB2), nhưng ức chế CB1, ức chế sản xuất IL-4, nhưng tăng sản xuất của IFN-α Đồng thời nó cũng có ích trong đáp ứng miễn dịch không đầy đủ [111] Một số

nghiên cứu gần đây cho thấy, không chỉ nhóm polysacharid trong quả nhàu mà các phân đoạn chiết bằng dung môi hữu cơ cũng thể hiện tác dụng ức chế ung thư Đặc biệt, phân đoạn chiết với ethyl acetat hoặc ethyl acetat - nước thể hiện tác dụng ức chế ung thư mạnh nhất khi thử nghiệm với dòng ung thư vú và gan Phân tích về thành phần hóa học cho thấy ethyl acetat - nước chứa hàm lượng cao chrysin [69], [121]

Trên mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid và tia xạ, cao quả nhàu liều 6g/kg uống liên tục trong 5 ngày và 9 ngày đã làm cải thiện rõ rệt các chỉ số đánh giá chức năng miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào cũng như tình trạng chung miễn dịch như: Khối lượng tuyến lách, tuyến ức tương đối và

số lượng bạch cầu của chuột nhắt trắng [2], [24], [25]

c Tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan:

- Dịch chiết ethyl acetat từ quả nhàu gây ức chế mạnh quá trình oxy hóa lipid khi so sánh với tocopherol và butyl hydroxy toluen Hoạt động dọn gốc tự

do của nước ép quả nhàu là do khả năng bảo vệ các tế bào hoặc lipid từ thay đổi oxy hóa được thúc đẩy bởi các gốc tự do anion superoxid (SAR) và lipid peroxid (LPO) Tác dụng ức chế của nước ép quả nhàu phụ thuộc vào liều của cả LPO

và SAR khi thử nghiệm in vitro Hoạt động dọn SAR của nước ép quả nhàu cao

gấp 2,8 lần so với vitamin C, 1,4 lần so với pycnogenol và 1,1 lần so với bột hạt nho [38], [144] Trên mô hình gây tổn thương cấp tính gan gây ra bởi carbon tetraclorid (CCl4) in vivo, nước ép quả nhàu 10% cho uống trong 12 ngày đã có

khả năng làm giảm mức SAR và LPO của gan đến mức 20% và 50% so với ba nhóm chứng sau 3 giờ uống CCl4 Như vậy, nước ép quả nhàu có thể bảo vệ gan

từ một tiếp xúc với CCl4 gây ung thư bên ngoài [144]

- Phân đoạn dịch chiết ethyl acetat của nước ép quả nhàu lên men có tác dụng chống oxy hóa mạnh hơn mannitol hoặc vitamin C, trong khi phân đoạn chiết với ether dầu hỏa và n-butanol có hoạt tính chống oxy hóa thấp hơn

mannitol Ba thành phần phân lập từ dịch chiết ethyl acetat là isoscopoletin, aesculetin và quercetin [89]

- Cao quả nhàu toàn phần (cao 5:1) liều 1,2g và 2,4g/kg, uống liên tục trong

8 ngày làm giảm hoạt độ của các emzym AST, ALT trong huyết thanh, làm giảm hàm lượng MDA dịch đồng thể gan của chuột nhắt trắng bị tổn thương tế bào gan bằng CCl4 và paracetamol liều cao Tác dụng của cao quả nhàu ở hai liều như nhau và tương đương silymarin liều 67mg/kg [3]

d Tác dụng chống viêm:

Nước ép quả nhàu ức chế chọn lọc enzym cyclo-oxygenase (COX - 1 và COX-2), ức chế phù chân chuột do carragenan, ức chế sản xuất NO và prostaglandin E2 [51] Hoạt tính ức chế trên COX-2 và COX-1 của nước ép quả nhàu (liên quan trong ung thư vú, đại tràng và phổi) được so sánh với các chất chống viêm kinh điển nhóm NSAIDs như aspirin, indomethacin (ức chế COX-1)

và Celebrex (ức chế COX-2) Kết quả này cho thấy, nước ép quả nhàu có tác dụng ức chế chọn lọc COX-2 được so sánh với Celebrex [38], [144] Nước ép quả nhàu và chất đánh dấu là scopoletin đã được chứng minh là có tác dụng trong phòng và điều trị viêm dạ dày - thực quản, chủ yếu thông qua kháng tiết, tăng cường bảo vệ màng nhầy niêm mạc thông qua ức chế serotonin, gốc tự do

và cytokin trung gian viêm [95] Cao quả nhàu toàn phần (cao 5:1) có tác dụng giảm thể tích viêm chân chuột do carragenin gây nên, giảm thể tích dịch và số lượng bạch cầu trong dịch rỉ viêm, giảm khối lượng u hạt Tác dụng phụ thuộc vào liều dùng, bắt đầu từ liều 24g/kg mới có tác dụng chống viêm [24]

e Một số tác dụng sinh học khác:

- Tác dụng giảm đau: Nước ép quả nhàu (TNJ) có tác dụng giảm đau khi

thử trên mô hình đau quặn So với nhóm chứng, nhóm dùng TNJ giảm số lượng cơn đau quặn lần lượt là 82,30%, 74,53% và 64,29% tương ứng với nhóm dùng TNJ 20%, 10% và 5% [144] Quả nhàu liều từ 24g/kg thể hiện tác dụng giảm

đau rõ rệt trên mô hình mâm nóng và gây quặn đau bằng acid acetic Tuy nhiên, bắt đầu từ liều 24g/kg mới có tác dụng này [24]

- Tác dụng trên tim mạch và huyết áp: Nghiên cứu gần đây đã chứng minh

hiệu quả của quả nhàu trong việc ngăn ngừa xơ cứng động mạch, liên quan đến quá trình oxy hóa lipoprotein tỷ trọng thấp [38] Nước ép quả nhàu liều 50 và 100mg/kg làm giảm đáng kể cholesterol toàn phần, triglycerid và lipoprotein - cholesterol tỷ trọng thấp trên chuột thực nghiệm [123] Dịch chiết ethanol từ lá

và quả nhàu có tác dụng hạ huyết áp khi thử nghiệm trên chuột gây cao huyết áp bởi dexamethason [146] Cao quả nhàu có tác dụng hạ huyết áp với liều 1,5g/kg, liều càng cao tác dụng hạ huyết áp càng mạnh [24]

- Quả nhàu và xeronin: Quả nhàu có chứa một tiền chất tự nhiên cho sản

xuất xeronin, được đặt tên là proxeronin - một alcaloid có khả năng kết hợp với protein của người, làm tăng một số chức năng của cơ thể Trong cơ thể, proxeronin được chuyển đổi thành xeronin nhờ một enzyme gọi là proxeroninase Alcaloid này là một yếu tố quan trọng giúp duy trì quá trình trao đổi chất bình thường trong cơ thể Khi bị ốm, quả nhàu có thể giúp ích trong các trường hợp như: Huyết áp cao, viêm khớp, viêm loét dạ dày, bong gân, chấn thương, trầm cảm, lão suy, tiêu hóa kém và đau đớn [144]

- Công năng, chủ trị của quả nhàu: Nhuận tràng, lợi tiểu, điều kinh, hoạt

huyết Dùng khi táo bón, tiểu tiện không thông, điều kinh, hạ sốt, chữa ho, hen; còn dùng với tính chất tăng cường miễn dịch, tăng sức đề kháng cho cơ thể Ngày dùng 12 - 16 g dạng thuốc sắc [5]

1.1.2 Cúc hoa vàng

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

Cúc hoa vàng (CHV) còn có tên khác là Kim cúc, Hoàng cúc, Dã cúc, Cam

cúc, Khổ ý; Tên khoa học: Chrysanthimum indicum L Họ cúc (Asteraceae)

CHV là dạng cây thảo, sống hàng năm hay sống dai, cao 20-50cm Thân mọc thẳng, nhẵn, có khía dọc Lá mọc so le, hình bầu dục, chia nhiều thuỳ sâu, mép

có răng cưa nhọn không đều, mặt trên màu lục đen sẫm, mặt dưới nhạt, cuống lá ngắn, có tai ở gốc Cụm hoa mọc thành đầu trên một cuống dài ở ngọn thân hoặc kẽ lá, đường kính 1-1,5cm [4], [20]

Hình 1.2 Cúc hoa vàng

Nguồn: Theo Đỗ Duy Bích và cộng sự (2004) [4]

CHV có nguồn gốc ở vùng Đông Á: Trung Quốc và Nhật Bản Ở Việt Nam, CHV được trồng từ lâu đời Hiện nay cây có nhiều ở Hưng Yên, Hải Dương, Bắc Ninh, Hà Nội và một số tỉnh khác ở phía bắc với trữ lượng lớn Cây ra hoa nhiều hàng năm, hiếm có hạt Mùa đông có hiện tượng rụng lá hơi tàn lụi Bộ phận dùng: Hoa thu hái vào đầu tháng 10 đến tháng 1-2 năm sau Hoa hái về đem đồ rồi phơi 3-4 nắng đến khô [4], [20]

1.1.2.2 Thành phần hoá học

a Tinh dầu:

Hàm lượng tinh dầu trong hoa tươi, hoa khô và hoa chế biến của CHV Trung Quốc chiếm tỷ lệ lần lượt là 0,25%, 0,43% và 0,23% Trong tinh dầu CHV Hàn Quốc có 73 hợp chất (chiếm 96,65% tổng tinh dầu chiết xuất được) [72] Thành phần chính trong tinh dầu CHV là α-pinen, 1,8-cineol, - terpineol,

cis-sabinol, thujon, camphor, borneol, bornyl acetat, cis-chrysanthenol,

β-caryophyllen, germacren D, α-cadinol [72], [125] Theo Vũ Thị Len và cs, tinh dầu hoa CHV có 68 cấu tử, trong đó có 24 cấu tử với hàm lượng trên 1% và 14 cấu tử có hàm lượng dưới 1% [18]

b Phenolic và flavonoid:

CHV chứa hàm lượng cao phenolic và flavonoid Trong đó, đã được xác định được 10 flavonoid trong CHV Trung Quốc [153] Cao khô bào chế từ dịch chiết nước của CHV chứa 2,71% phenolic và 2,52% flavonoid, đây là hai nhóm hoạt chất liên quan đến tác dụng trong điều trị biến chứng tiểu đường và lão hóa [103] Theo Chen Q và cs: CHV chứa 2,2% phenolic (tính theo acid galic) và 2,8% flavonoid (tính theo rutin), là các nhóm hoạt chất liên quan đến tác dụng chống oxy hóa và chống viêm [41] Tuy nhiên, theo Yang C H và cs: CHV Trung Quốc chứa 6,02mg/g phenolic và 2,23mg/g flavonoid (tính theo quercetin) [154] Như vậy, hàm lượng phenolic và flavonoid giữa các nghiên cứu là có sự khác biệt, điều này phụ thuộc vào nguồn gốc và chất lượng dược liệu, cũng như phương pháp phân tích áp dụng Trần Vân Hiền và cs đã phân lập

từ CHV trồng ở Hưng Yên được 2 chất tinh khiết là apigenin và luteolin Đã đánh giá được tác dụng kháng HIV của hai hợp chất này và do đó có thể coi các flavonoid này là thành phần có hoạt tính từ CHV [9], [10]

Các thành phần khác trong CHV: Carotenoid (chrysanthemoxanthin); Acid amin: adenin, cholin, stachydrin; Sesquiterpen: angeloyl cumambrin B,

arteglasin A, angeloylajadin, chrysetunon, tuncfulin, cumambrin A [4]

1.1.2.3 Tác dụng và công dụng

a Theo y học cổ truyền: CHV vị ngọt, đắng, tính hơi hàn Vào các kinh

phế, can, thận Có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, mát gan, sáng mắt Thường được dùng để chữa các chứng phong nhiệt ở can kinh, mắt mờ, mắt đỏ sưng đau, hoa mắt chóng mặt Liều dùng mỗi ngày 8-30g dạng thuốc sắc hay bột [4], [20]

b Tác dụng trên vi khuẩn và virus:

Tác dụng kháng khuẩn của CHV chủ yếu là thành phần tinh dầu trong hoa Thành phần chính trong tinh dầu CHV như α-pinen, 1,8-cineole, α-terpineol, cis-sabinol, thujon, camphor, borneol và bornyl acetat…có các hoạt tính sinh học như: chống hen, chống ho, kháng khuẩn, kháng virus và diệt ký sinh trùng Vì vậy, cụm hoa nở của CHV được sử dụng trong y học cổ truyền theo đường uống

hoặc bôi ngoài để điều trị các bệnh khác nhau trên lâm sàng như nhiễm khuẩn, cúm, viêm amiđan, viêm miệng, viêm phế quản, viêm phổi, viêm ruột thừa, viêm da và mụn nhọt [125] Tinh dầu CHV có hoạt tính kháng khuẩn mạnh, chống lại các vi khuẩn trong miệng (nồng độ ức chế tối thiểu từ 0,1-1,6 mg/ml)

Các dữ liệu in vitro cho thấy, sử dụng tinh dầu CHV với các kháng sinh khác có

thể tạo nên tác dụng hiệp đồng có lợi trong điều trị nhiễm khuẩn [72]

Trần Vân Hiền và cs nghiên cứu về CHV trồng ở Hưng Yên cho thấy, hợp chất chiết từ CHV thể hiện tác dụng ức chế sự nhân bản của HIV trên 2 chủng virus HIV là HIV-1 IIIB và HIV-1 SF2 Từ dịch chiết CHV đã phân lập được các phân đoạn flavonoid là F1, F2, F3, F5 Trong đó, F2 là apigenin, F3 là luteolin, F5 là một hỗn hợp gồm ít nhất 3 flavonoid (Apigenin-, luteolin, acacetin 7-O--D-glucopyranosid) Các phân đoạn dịch chiết này đều có tác dụng ức chế hình thành NO, nhưng phân đoạn F3 cho tác dụng ức chế mạnh nhất Ở nồng độ 25 và 150µM, các phân đoạn dịch chiết có tác dụng ức chế sản xuất NO ở mức có ý nghĩa thống kê (P < 0,05 và P < 0,01) Những phân đoạn dịch chiết này thể hiện cả tác dụng ức chế tạo ra NO và hoạt động kháng HIV-1 Kết quả này cho rằng, các phân đoạn dịch chiết CHV thử nghiệm có tác dụng rất mạnh trong ức chế sự hình thành NO sinh ra bởi lipopolysaccharid (LPS) và HIV-1 Cùng với tác dụng kháng HIV-1 và chống oxy hóa, trên thực tế là tác dụng ức chế sản xuất NO, dịch chiết CHV có thể làm chậm sự phát triển của HIV và ngăn ngừa nhiễm trùng cơ hội trong bệnh nhân nhiễm HIV [9]

c Tác dụng trên hoạt động viêm, dị ứng và miễn dịch:

Nghiên cứu của Cheng W và cs cho thấy: Phân đoạn chiết bằng butanol của CHV có tác dụng ức chế phù tai chuột với liều 150mg/kg, không làm tăng đáng kể tuýp phản ứng muộn sự nhạy cảm gây ra bởi 2,4 dinitro-flurobenzen, nhưng làm tăng đáng kể sự sinh kháng thể bởi tế bào tuỷ của chuột và kháng thể IgG và IgM trong huyết thanh chuột trong gây miễn dịch bằng tế bào máu cừu

và gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid Hơn nữa, phân đoạn chiết

butanol có hiệu lực trên chức năng của hệ thống thực bào bạch cầu đơn nhân gây

ra bởi cyclophosphamid trên chuột Như vậy, phân đoạn butanol có tác dụng chống viêm, điều chỉnh đáp ứng miễn dịch tế bào, dịch thể và hoạt động thực bào của bạch cầu đơn nhân Phân tích về hóa học cho thấy, phân đoạn butanol chứa ba flavonoid chính là luteolin, luteolin-7-glucosid và acacetin- 7-rhamnoglucosid, các thành phần này được cho là gây nên hoạt tính chống viêm

và miễn dịch [44] Dịch chiết ethanol 70% của CHV ức chế mạnh sự sản xuất

NO, PGE2, TNFα và IL-1β do đó nó có hoạt tính chống viêm, có thể là kết quả của sự ức chế các chất trung gian gây viêm [45] Theo Luyen B.T.T và cs, nhóm flavonoid và dẫn xuất của acid quinic là những chất đánh dấu gây nên tác dụng ức chế sản xuất NO, TNFα và tác dụng chống viêm của CHV chủ yếu liên quan đến nhóm phenolic [91]

Dịch chiết CHV có tác dụng tốt trong viêm da cơ địa khi thử nghiệm trên chuột thực nghiệm với việc làm giảm rõ rệt mức IgE, IgG1, IL-4, IFN-γ trong huyết tương và mRNA của IFN-γ, IL-4, IL-13 trong tổn thương da lưng Tác dụng của dịch chiết CHV nồng độ cao tương tự như hydrocortison, nhưng không

có tác dụng phụ như teo da, nhiễm trùng thứ cấp Do vậy, CHV có thể là một giải pháp thay thế cho hydrocortison trong điều trị viêm da dị ứng [113]; Dịch chiết CHV còn có tác dụng ức chế phù nề tại chỗ ở tai chuột, dẫn đến giảm đáng

kể độ dày và khối lượng mô da, giảm sự sản xuất ra cytokin gây viêm, hoạt động của myeloperoxidase qua trung gian bạch cầu trung tính và các chỉ số mô bệnh học khác nhau Do đó, dịch chiết CHV có tiềm năng trong điều trị một số bệnh ngoài da liên quan đến miễn dịch [83]

d Tác dụng chống oxy hóa:

Nhóm phenolic và flavonoid trong CHV là những hoạt chất chính gây nên hoạt tính chống oxy hóa [41], [92] Theo Debnath T và cs, cả dịch chiết nước và

ethanol CHV đều có hoạt tính chống oxy hóa in vitro, bao gồm hoạt động dọn

gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), hydroxyl, superoxid, ức chế

sự oxy hóa acid linoleic Tác dụng chống oxy hóa của CHV có sự tương quan với hàm lượng phenolic và flavonoid trong dịch chiết, trong đó dịch chiết ethanol cho hoạt tính chống oxy hóa cao hơn so với dịch chiết nước Ngoài ra, dịch chiết ethanol có khả năng ngăn cản mạnh sự phá hủy DNA do oxy hóa và không gây độc trong tế bào gan [50] Flavonoid chiết từ CHV có tác dụng ức chế phản ứng peroxy hóa lipid màng tế bào gan và hạn chế giảm hoạt độ enzym SOD trên chuột gây độc bằng CCl4 Các phân đoạn flavonoid chiết từ CHV có tác dụng dọn gốc tự do DPPH, ức chế tạo thành gốc tự do anion superoxid và ức

chế NO in vitro ở nồng độ tương đối thấp [8]

e Tác dụng trên tế bào ung thư:

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy, CHV có tác dụng trên tế bào ung thư

Li Z F và cs nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết CHV trên ức chế chu trình tế bào và chết theo chương trình (apoptosis) trong tế bào ung thư gan người dòng MHCC97H Kết quả cho thấy, dịch chiết CHV ức chế sự tăng sinh của các tế bào MHCC97H phụ thuộc vào liều và thời gian, không gây độc tế bào gan chuột

và tế bào nội mô người Dịch chiết CHV đã gây ảnh hưởng đáng kể đến sự chết theo chương trình của tế bào qua con đường của ty thể và trì hoãn chu kỳ tế bào bằng điều chỉnh protein liên quan đến chu kỳ tế bào trong tế bào MHCC97H mà không ảnh hưởng đến các tế bào bình thường Do đó, dịch chiết CHV có thể có triển vọng trong điều trị ung thư trên người mà không gây tác dụng phụ [87]

1.1.3 Sâm Ngọc linh sinh khối

1.1.3.1 Nguồn gốc và đặc điểm nguyên liệu

Sâm Ngọc linh sinh khối (NLSK) là khối sâm được tạo ra bởi công nghệ sinh khối tế bào thực vật Sinh khối tế bào thực vật là kỹ thuật nuôi cấy và tạo khối lượng lớn tế bào thực vật trong môi trường dinh dưỡng phù hợp mà không cần thâm canh gieo trồng Các tế bào nuôi cấy vẫn giữ nguyên được các đặc tính vốn có ban đầu, đặc biệt là các hoạt chất hay các chất chuyển hóa thứ cấp sinh ra

từ tế bào gần như được giữ nguyên

Học viện Quân y đã ứng dụng thành công công nghệ sinh khối tế bào thực vật tạo khối tế bào sâm Ngọc linh từ rễ sâm Ngọc Linh tự nhiên, qui mô 100 lít/mẻ (0,75kg khô/mẻ) Bằng công nghệ này, nguyên liệu sâm NLSK tạo ra ổn định, đảm bảo tiêu chuẩn chất lượng nguyên liệu và có thể cung cấp cho công nghiệp dược phẩm mà không phụ thuộc vào mùa vụ, thời tiết khí hậu và thời gian canh tác [1]

1.1.3.2 Thành phần hóa học

Sâm NLSK tạo ra trên hệ thống nuôi cấy 100 lít/ mẻ có hàm lượng hoạt chất tương đối ổn định Trong đó, hàm lượng các ginsenosid Rg1, Rb1 và Rd đạt trên 0,9% Đồng thời, sự tồn dư các chất kích thích sinh trưởng như 1-NAA, kinetin đều ở mức thấp Do vậy, sâm NLSK hoàn toàn đủ tiêu chuẩn để làm nguyên liệu cho sản xuất thuốc, thực phẩm chức năng [1]

và ghi nhớ, thể hiện qua đánh giá bằng mô hình mê cung nước và mô hình tránh

né chủ động trên chuột gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin Rút ngắn thời gian hình thành và dập tắt phản xạ khi thử trên mô hình mê lộ, gây hưng phấn, tăng hoạt động [19]

+ Có tác dụng bảo vệ gan: Làm giảm ALT và AST huyết tương, làm giảm lượng MDA tạo ra ở gan, làm tăng lượng GSH trong gan, làm giảm khối lượng gan bị viêm và giảm tổn thương gan (trên cả hình ảnh đại thể và vi thể) trên chuột nhắt trắng gây độc bằng CCl4 [19]

- Sâm NLSK có tính an toàn cao khi thử trên động vật thực nghiệm:

+ Chưa xác định được LD50 của cao sâm NLSK trên chuột nhắt trắng theo đường uống, mặc dù đã cho chuột uống sâm NLSK ở mức liều cao nhất có thể đưa vào dạ dày chuột nhắt trắng (100g/kg) mà không gây chết một con chuột nhắt trắng nào [19]

+ Với liều 2g và 4g/kg/ 24 giờ của sâm NLSK khô cho thỏ uống liên tục trong thời gian 42 ngày, sâm NLSK không ảnh hưởng đến sự phát triển cân nặng

cơ thể và điện tim của thỏ, không độc với cơ quan tạo máu (hồng cầu, hemoglobin, tiểu cầu, bạch cầu không thay đổi, không gây tổn thương lách) Không làm ảnh hưởng đến chức năng thận (nồng độ ure, creatinin ở mức bình thường, không gây tổn thương thận) và chức năng gan (hoạt độ ALT, AST bình thường, không gây tổn thương gan) [19]

1.2 KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU VÀ PHUN SẤY

1.2.1 Kỹ thuật chiết xuất dược liệu

1.2.1.1 Khái niệm và phân loại

a Khái niệm về chiết xuất dược liệu:

Hiểu theo nghĩa chung nhất thì chiết xuất là quá trình dùng dung môi thích hợp để hòa tan các chất tan có trong dược liệu, chủ yếu là các hoạt chất có tác dụng điều trị, sau đó tách chúng ra khỏi phần không tan của dược liệu [16] Sản phẩm chiết xuất có thể ở một trong ba dạng: (i) dịch chiết toàn phần hay dịch chiết thô (cao thuốc, cồn thuốc, rượu thuốc ); (ii) các nhóm hoạt chất chọn lọc (alcaloid, flavonoid, phenolic, anthraquinon ); (iii) các hợp chất tinh khiết được phân lập (Rutin, berberin, rotundin, artemirinin ) Tùy theo mục đích cụ thể mà quá trình chiết xuất tạo ra các sản phẩm ở một trong ba dạng nêu trên

b Một số thuật ngữ liên quan:

- Tỉ lệ dịch chiết: Là tỉ lệ giữa số lượng dược liệu sử dụng để bào chế ra chế

phẩm và số lượng chế phẩm thu được, biểu thị bằng (a-b):1 Con số được viết trước dấu hai chấm là số lượng tương đối của dược liệu dùng để bào chế, con số sau dấu hai chấm là số lượng tương đối của chế phẩm dược liệu [53], [54]

- Chất đánh dấu (Marker):

Là thành phần hoặc nhóm các thành phần của một dược liệu, một chế phẩm dược liệu hoặc một sản phẩm thuốc dược liệu, được dùng để kiểm soát độc lập xem liệu các chất đó có hoạt tính điều trị hay không Marker còn dùng để tính toán số lượng của các dược liệu hoặc các chế phẩm dược liệu trong các sản phẩm thuốc dược liệu nếu như marker đã được định lượng trong dược liệu hoặc các chế phẩm dược liệu Có hai loại marker: Marker sinh học là các thành phần hoặc nhóm thành phần có hoạt tính điều trị Marker phân tích là thành phần hoặc nhóm thành phần chỉ dùng với mục định phân tích [53], [54], [55]

- Cao định chuẩn: Một cao định chuẩn hay tiêu chuẩn (standardised

extract) phải mô tả được bản chất và nồng độ dung môi sử dụng để chiết xuất, trạng thái vật lý của dịch chiết, số lượng tương đương của dược liệu dùng để bào chế dịch chiết biểu thị bằng x-y hoặc tỷ lệ (a-b):1 của dược liệu để bào chế với

số lượng của chế phẩm bào chế Hơn nữa, giới hạn hàm lượng của chất định lượng cũng phải dược nêu rõ [53] Ví dụ cao khô bào chế từ rễ nhân sâm (G115)

tỷ lệ 5:1 (3-7:1), chứa 4% ginsenosid (tính theo Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg2), dung môi chiết xuất là ethanol 40% [56]

c Phân loại:

Có nhiều cách phân loại phương pháp chiết xuất Với phương pháp chiết xuất thông thường bằng dung môi dựa trên việc lựa chọn dung môi kết hợp song song với sử dụng nhiệt độ và khuấy trộn, phương pháp chiết xuất có thể được phân thành hai loại là phương pháp chiết lạnh (ngâm lạnh, ngấm kiệt ) và phương pháp chiết nóng (sắc, hầm, hãm, chiết soxhlet )

Ngoài các kỹ thuật chiết xuất thông thường nêu trên, hiện nay nhiều kỹ thuật mới đã được ứng dụng rộng rãi thể hiện tính ưu việt trong chiết xuất các hợp chất tự nhiên ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp (dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm, công nghệ hóa học…) Một số phương pháp mới như: Chiết xuất với sự hỗ trợ của sóng siêu âm, chiết xuất với sự hỗ trợ của vi sóng, chiết

xuất lỏng siêu tới hạn, chiết xuất bằng dung môi dưới áp lực cao [64] Trong đề tài luận án này tập trung giới thiệu vào các phương pháp chiết xuất hiện đại

1.2.1.2 Một số phương pháp chiết xuất hiện đại

a Chiết xuất có tác động của siêu âm (Ultrasonication Assisted Extraction)

Chiết xuất có sự tác động của siêu âm (UAE) là phương pháp ngâm cải tiến với việc sử dụng sóng siêu âm tần số cao giúp chiết xuất dễ dàng hơn Siêu âm bao gồm các khu vực tần số giữa 18 kHz và 100 MHz, giới hạn trên không được

rõ nét Gần đây, một lượng lớn các hóa chất và các quá trình công nghiệp dựa vào siêu âm cường độ cao, ví dụ như làm sạch, làm tăng các phản ứng hóa học, nhũ hóa, khử khuẩn, đồng nhất hóa, tăng khả năng hòa tan, chống kết tụ của khối bột, phá vỡ các tế bào sinh học, dùng trong chiết xuất, làm khô, lọc, kết tinh, đông khô…[47]

* Nguyên lý và cơ chế:

Sóng âm thanh có tần số cao hơn 20 kHz, là những rung động cơ học trong một chất lỏng, rắn và khí Tác dụng có lợi của sóng âm trong chiết xuất được cho là do sự hình thành và sự sụp đổ không đối xứng của các tiểu bong bóng

(microcavities) trong vùng lân cận của thành tế bào tạo ra tia phản lực tốc độ cao

của chất lỏng, phản lực này tác động mạnh mẽ trên bề mặt rắn Sự sụp đổ của các tiểu bong bóng có thể tạo ra các hiệu ứng vật lý, hóa học và cơ học dẫn đến

sự phá vỡ các màng sinh học để tạo điều kiện thuận lợi cho việc giải phóng của các hợp chất, làm tăng sự thâm nhập của dung môi vào các nguyên liệu và làm tăng chuyển khối Sự phá vỡ thành tế bào và tăng sự chuyển khối là hai yếu tố chính dẫn đến việc tăng cường sử dụng lực siêu âm trong chiết xuất Ngoài phá

vỡ thành tế bào và tăng sự chuyển khối, sóng siêu âm còn tác động làm cải thiện tính thấm của dung môi, làm tăng sự trương nở, khả năng mao dẫn và quá trình hydrat hóa nên làm tăng quá trình chiết xuất [64], [143]

* Thiết bị chiết với sự tác động của sóng siêu âm:

Trong số vài loại hệ thống chiết bằng siêu âm hiện có thì sử dụng phổ biến nhất là bể siêu âm và thiết bị que siêu âm Cả hai hệ thống được dựa trên bộ chuyển đổi điện từ (tức là thiết bị có khả năng chuyển đổi năng lượng cơ học hoặc điện thành âm thanh tần số cao) như là một nguồn năng lượng siêu âm, thường hoạt động ở một tần số cố định của 20kHz Trong đó, bể siêu âm được ứng dụng trong rửa hoặc làm sạch dụng cụ Chiết siêu âm được áp dụng với loại que siêu âm Loại thiết bị que siêu âm áp dụng để chiết xuất cho lực siêu âm cao hơn gấp 100 lần so với một bể rửa siêu âm, do đó nó có hiệu quả tốt hơn nhiều Một đặc trưng chính cho việc áp dụng thành công của que siêu âm chính là năng lượng siêu âm được đưa trực tiếp vào hệ thống chiết Sơ đồ thiết kế que siêu âm

và bể chiết siêu âm được thể hiện ở hình 3 [47]

Hình 1.3 Thiết kế bình chiết sử dụng que siêu âm

Nguồn: Theo Cooke M (2000) [47]

* Các thông số chính cần xem xét khi chiết xuất bằng siêu âm:

Bên cạnh sự đổi mới về công nghệ chiết xuất, thì độ tin cậy và khả năng lặp lại của kết quả là một trong những mục tiêu chính khi nâng cấp qui mô của bất

kỳ quá trình chiết xuất nào Trong trường hợp của UAE, cần phải xem xét ảnh hưởng của các thông số như: Công suất siêu âm, tần số sóng siêu âm, nhiệt độ, dung môi, tỷ lệ dung môi/dược liệu, thời gian chiết, kích thước và cấu trúc nguyên liệu Các thông số này cho phép xác định điều kiện chiết xuất tối ưu, đồng thời cũng là yếu tố cần xem xét khi nâng cấp qui mô chiết xuất Hơn nữa, trong qui trình chiết xuất, mục tiêu của qui trình không phải lúc nào cũng để đạt

hiệu suất cao nhất, mà cần xem xét đến cả chi phí và tiêu thụ nguồn năng lượng

Do đó, xác định các thông số chiết xuất thích hợp là cần thiết đối với một qui trình của UAE [52] Trong phần này, chỉ đề cập đến lực siêu âm và tần số siêu

âm - là hai thông số đặc trưng cho một thiết bị UAE Các thông số khác sẽ được

đề cập ở Mục 1.2.1.3 (Các yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất dược liệu)

- Lực siêu âm: Việc đo năng lượng âm thực tế áp dụng trong quá trình chiết siêu âm là rất khó và thường không được báo cáo Đôi khi chỉ đề cập đến mức công suất của thiết bị, ví dụ như chiết với công suất 20% so với tổng công suất điện, nên đây không phải là phép đo chính xác Trên thực tế, trong hầu hết các thiết bị chiết siêu âm, công suất đo không tỷ lệ với công suất tiêu thụ, dẫn đến kết quả sai hoặc không chính xác Ngay cả khi biết chính xác công suất thực, thì cũng rất khó để đánh giá hiệu quả chiết xuất, vì hiệu quả qui trình còn phụ thuộc vào các yếu tố khác như: Hình dạng bể siêu âm hay thể tích của bình chiết (thường không được nêu ở các báo cáo khoa học) Hiệu suất chiết xuất thường tăng theo cường độ lực tác động, đôi khi là tuyến tính Tuy nhiên, lực siêu âm không chỉ ảnh hưởng đến tổng lượng chiết xuất, mà có thể ảnh hưởng khác nhau đến từng chất chiết Ví dụ như khi chiết xuất polysaccharid từ lá chè, tăng công suất từ 100 lên 300W, làm giảm tỷ lệ polysaccharid trung tính, nhưng không ảnh hưởng đến polysaccharid tổng hoặc các chất có tính acid Như vậy, lực siêu âm

có thể ảnh hưởng đến chiết xuất, không chỉ làm tăng hiệu suất chiết trong thời gian ngắn, mà trong một số trường hợp là cả sản phẩm cuối cùng Do đó, các nhà nghiên cứu hoặc thiết kế cần đánh giá đặc tính của thiết bị để đảm bảo tính lặp lại của kết quả khi thực hiện trên các thiết bị khác nhau hoặc kiểm tra công suất siêu âm áp dụng [52]

- Tần số siêu âm: Tần số siêu âm càng thấp thì “bong bóng” tạo thành càng lớn Do vậy, ở cùng cường độ siêu âm thì tần số siêu âm thấp hơn sẽ tạo được lực tác động lớn hơn, do phản lực sinh ra từ sự sụp đổ của các bong bóng tăng lên, nên làm tăng hiệu quả chiết xuất Tần số siêu âm không chỉ ảnh hưởng đến

sự hình thành và sụp đổ của các bong bóng để tạo thành vi phản lực cao, mà nó còn ảnh hưởng đến quá trình chuyển khối (như đã trình bày ở phần nguyên lý) Tuy nhiên, có rất ít nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của tần số siêu âm đến chiết xuất Như Ma và cs quan sát thấy với cùng công suất áp dụng, tần số tốt nhất

cho việc chiết xuất hesperidin từ vỏ quýt (Citrus reticulata) là 60 kHz, thay vì

20 hoặc 100 kHz Hoặc theo Dong và cs thì hiệu suất chiết acid salvianolic B từ

rễ cây Đan sâm ở tần số siêu âm khác nhau (28, 45 và 100 kHz), thì hiệu suất chiết ở tần số cao là thấp hơn ở tần số thấp [52] Như vậy, tần số siêu âm có thể ảnh hưởng đến hiệu suất và động học quá trình chiết xuất Tuy nhiên, sự ảnh hưởng này còn phụ thuộc vào tính chất của nguyên liệu Tần số nhỏ có thể làm tăng hiệu suất (như làm tăng khoảng 32% khi chiết pyrethrin từ hoa cây

pyrethrum), hoặc rất ít ảnh hưởng đến hiệu suất (như chiết dầu từ hạt cải) Mặt

khác, sự phân bố sóng siêu âm bên trong thiết bị chiết cũng là một đặc điểm quan trọng trong việc thiết kế bể siêu âm Cường độ siêu âm mạnh nhất là ở vùng lân cận của đầu phát siêu âm, càng xa thì cường độ siêu âm càng giảm, đặc biệt là khi có mặt của các tiểu phân dược liệu rắn [143]

* Ưu và nhược điểm của chiết xuất bằng sóng siêu âm:

Chiết xuất với sự trợ giúp của siêu âm thể hiện sự hiệu quả, đơn giản và ít tốn kém so với các kỹ thuật chiết xuất thông thường Ưu điểm chính của phương pháp này là làm tăng khối lượng chiết xuất và động học của quá trình chiết xuất cũng nhanh hơn nên rút ngắn được thời gian chiết xuất Siêu âm cũng có thể làm giảm nhiệt độ chiết xuất, cho phép chiết xuất các hợp chất kém bền với nhiệt So với chiết xuất bằng vi sóng và siêu tới hạn thì thiết bị chiết siêu âm rẻ hơn và tiến hành dễ dàng hơn Hơn nữa, các dung môi sử dụng trong chiết xuất siêu âm cũng giống như chiết soxhlet, có thể sử dụng nhiều loại dung môi để chiết xuất một khoảng rộng các hoạt chất [143]

Tuy nhiên, những ảnh hưởng của siêu âm trên khối lượng chiết xuất và động học có thể liên quan đến bản chất của cấu trúc dược liệu Sự có mặt của

một pha phân tán góp phần vào sự suy giảm sóng siêu âm và phần hoạt động của siêu âm bên trong bình chiết được giới hạn trong khu vực phát ra siêu âm [143]

* Một số ứng dụng của chiết xuất bằng siêu âm:

Siêu âm đã được áp dụng quy ở cả mô nhỏ và công nghiệp trong chiết xuất các hợp chất từ tự nhiên đối với một khoảng rộng các dịch chiết dược liệu và các nhóm hoạt chất như dầu béo, protein, saponin, antraquinon, phenolic, flavonoid, polysaccharid, acid hữu cơ, các chất màu thực vật…[140] Mười hai thí nghiệm với các dược liệu khác nhau được thực hiện ở qui mô công nghiệp với phương pháp ngâm trong 28 ngày kết hợp khuấy trộn liên tục trong ethanol ở 45ºC cho hiệu suất chiết tương đương khi chiết bằng siêu âm trong 6h [141] Siêu âm được ứng dụng phổ biến để chiết các ginsenosid từ nhân sâm So với phương pháp chiết soxhlet, chiết siêu âm có thể rút ngắn thời gian chiết xuất (khoảng 3 lần), hơn nữa phương pháp này cho phép chiết ở nhiệt độ thấp, là yếu tố làm hạn chế sự giáng hóa của một số ginsenosid khi chiết ở nhiệt độ cao Chiết ginsenosid bằng siêu âm (bể hay đầu dò) trong 2 giờ cho hiệu suất cao hơn khi chiết soxhlet ở nhiệt độ sôi trong 8 giờ [152] Khi chiết xuất anthraquinon từ rễ nhàu bằng siêu âm với hỗn hợp ethanol - nước làm giảm 75% thời gian chiết xuất khi so sánh với phương pháp không dùng siêu âm Trong cả công nghiệp thực phẩm và dược phẩm, siêu âm đã được ứng dụng để chiết các hợp chất polyphenol và carotenoid bằng nước và các dung môi khác, làm tăng khối lượng chiết xuất trong khoảng từ 6 đến 35% [140]

Lee M H và cs nghiên cứu chiết xuất isoflavon chính từ sắn dây (Pueraria lobata), áp dụng ba phương pháp là chiết xuất truyền thống, chiết bằng dung

môi ở áp suất cao và chiết siêu âm Kết quả cho thấy, chiết isoflavon bằng siêu

âm có năng suất cao hơn hai phương pháp còn lại, làm giảm dung môi tiêu thụ, tiết kiệm thời gian và sử dụng nhiệt độ thấp Phương pháp chiết ở áp suất cao phù hợp hơn khi chiết ở qui mô nhỏ để phân tích định lượng với các chất bền

với nhiệt, trong khi phương pháp siêu âm thích hợp để chiết xuất lượng lớn cho các dịch chiết không bền với nhiệt [84]

b Chiết xuất bằng vi sóng (Microwave - assisted Extraction)

Chiết xuất dưới hỗ trợ của vi sóng (MAE) là một phương pháp mới, thể hiện tính ưu việt hơn so với các phương pháp chiết truyền thống MAE là phương pháp chiết xuất rất hấp dẫn do tốc độ chiết xuất nhanh, lượng dung môi

sử dụng nhỏ, chi phí thấp và thân thiện với môi trường [47], [64]

* Nguyên lý và cơ chế:

Vi sóng là sóng điện từ tần số cao được đặt giữa tần số vô tuyến điện và các vùng hồng ngoại của quang phổ điện từ (Tần số trong khoảng 0,3 - 300GHz) Vi sóng được truyền đi như sóng, có thể xuyên qua các vật liệu sinh học và tương tác với các phân tử có cực như nước trong vật liệu sinh học để tạo ra nhiệt Do

đó, vi sóng có thể làm nóng một vật liệu cùng lúc với sự thâm nhập của nó MAE cung cấp nhiệt lượng nhanh đến toàn bộ dung môi và khối nguyên liệu rắn với hiệu quả cao và đồng nhất Nước trong các cấu trúc nguyên liệu cũng góp phần hấp thụ nhiệt lượng từ vi sóng [47], [64], [73], [143]

Năng lượng vi sóng ảnh hưởng đến các phân tử bởi truyền dẫn ion và sự quay lưỡng cực Trong truyền dẫn ion, các ion trong dung dịch sẽ di chuyển khi một trường điện từ được áp dụng Sự quay lưỡng cực có nghĩa là sắp xếp lại các lưỡng cực với trường điện từ áp dụng Ở 2,45 GHz, lưỡng cực sắp xếp thẳng và ngẫu nhiên là 4,9 x 109 lần/ giây Điều này đã cưỡng bức sự di chuyển của các phân tử gây ra ma sát phân tử và do đó làm nóng dung dịch [47], [73]

* Thiết bị chiết xuất vi sóng:

Hiện nay, có hai loại hệ thống MAE chính: (i) Loại có bể vi sóng tập trung hay bể chiết vi sóng chuẩn hoạt động ở áp suất khí quyển; (ii) Loại có bể chiết kín có khả năng kiểm soát về nhiệt độ và áp suất trong quá trình chiết Loại hệ thống MAE kín thường sử dụng để chiết xuất ở trong các điều kiện nhiệt độ cao

Áp suất trong bể chiết về cơ bản phụ thuộc vào thể tích và nhiệt độ sôi của dung

môi Loại hệ thống MAE tập trung có thể hoạt động ở nhiệt độ cao nhất xác định bởi điểm sôi của dung môi ở áp suất khí quyển [47], [64], [143].

* Ưu và nhược điểm của chiết xuất bằng vi sóng:

Chiết xuất bằng vi sóng là một phương pháp mới, có khả năng chiết xuất rất nhanh, lượng dung tiêu thụ ít hơn so với chiết soxhlet và siêu âm (30ml trong MAE so với 300 - 500 ml trong chiết soxhlet); Cải thiện năng suất và hiệu quả chiết xuất khi so sánh với các kỹ thuật chiết xuất hiện đại khác như chiết siêu

âm, chiết siêu tới hạn, chiết áp suất cao Nó cho phép kiểm soát các thông số chiết xuất (thời gian, nhiệt độ và lực tác động) và có thể khuấy trộn khi chiết xuất MAE là kỹ thuật thân thiện với môi trường, khi thực hiện trong thiết bị kín

có thể kiểm soát tốt dung môi chiết và có chế độ an toàn khi có bất kỳ sự dò rỉ dung môi trong quá trình chiết xuất Tuy nhiên, MAE có một số hạn chế như: Cần phải sử dụng các dung môi phân cực, có thể ít hiệu quả để chiết xuất các hoạt chất hoặc các dung môi không phân cực hay dễ bay hơi Làm sạch hay loại tạp dịch chiết là cần thiết vì phương pháp này có hiệu quả chiết rất cao đối với

cả hoạt chất và tạp chất, thiết bị chiết vi sóng tương đối đắt tiền [47], [143]

* Một số ứng dụng của MAE:

Từ những ưu điểm vượt trội mà MAE được ứng dung rộng rãi trong chiết xuất dược liệu Một số ứng dụng tiêu biểu được trình bày ở bảng 1.1 [96]

Bảng 1.1 Một số ứng dụng của MAE trong chiết xuất dược liệu

Rễ Cam thảo Acid glycyrrhizic Ethanol (50-60%) 4-5 phút

Rễ cây Nghệ Curcumol, curdion và germacron Nước 4 phút

Lá chè xanh Polyphenol và caffein Ethanol 50% 4 phút

c Phương pháp chiết xuất lỏng siêu tới hạn

* Trạng thái siêu tới hạn:

Đối với một chất ở điều kiện nhất định chúng sẽ tồn tại ở một trong ba trạng thái là rắn, lỏng và hơi, nó phụ thuộc vào nhiệt độ, áp suất và thể tích Nếu

nén chất khí tới một áp suất đủ cao, chất khí sẽ hóa lỏng Tuy nhiên, có một giá trị áp suất mà ở đó, nếu nâng dần nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng không trở về trạng thái khí, mà rơi vào một vùng trạng thái đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới

hạn (supercritical) Hay nói cách khác, trạng thái siêu tới hạn đạt được khi nhiệt

độ và áp suất của một chất được nâng lên trên giá trị tới hạn của nó Ở điều

kiện thích hợp, mọi chất lỏng có thể đạt được trạng thái siêu tới hạn Tuy nhiên, chỉ những chất có nhiệt độ tới hạn không cao quá so với nhiệt độ môi trường mới được sử dụng làm dung môi siêu tới hạn Trong đó, CO2 có nhiệt độ tới hạn

là 31,06ºC và áp suất tới hạn là 73,81bar, được sử dụng phổ biến nhất làm dung môi siêu tới hạn [65], [97], [143] Hình 1.4 biểu diễn trạng thái của các chất theo nhiệt độ và áp suất

Hình 1.4 Đồ thị biểu diễn trạng thái của các chất

(Điểm ba pha (P T , T T ); Điểm tới hạn (P C , T C ))

* Nguyên lý và quy trình chiết xuất siêu tới hạn:

Trong quá trình siêu tới hạn, nguyên liệu được nạp vào trong bình chiết (một hoặc nhiều bình) Dung môi (như CO2 lỏng) từ bình chứa được làm lạnh sau đó nén dưới áp suất cao bằng bơm cao áp, sau đó CO2 được dẫn qua thiết bị làm nóng để chuyển thành trạng thái tiền siêu tới hạn trước khi vào bình chiết Bình chiết được kiểm soát về nhiệt độ và áp suất để đạt được trạng thái siêu tới hạn, khi đó CO2 siêu tới hạn sẽ khuếch tán vào trong nguyên liệu và hòa tan các hoạt chất Dòng CO2 siêu tới hạn hòa tan chất chiết được dẫn chuyển sang bình tách (một hoặc nhiều bình tách) Tại bình tách được hạ áp suất và hạ nhiệt độ để

CO2 từ trạng thái siêu tới hạn thành trạng thái khí, ở trạng thái này CO2 mất đặc

tính hòa tan do vậy chất chiết sẽ được tách ra khỏi hỗn hợp, lắng xuống dưới và được lấy ra ngoài CO2 ở thể khí được chuyển tiếp qua bình ngưng, tại bình ngưng CO2 được làm lạnh và nén dưới áp lực cao để chuyển CO2 sang thể lỏng, sau đó tuần hoàn trở lại hệ thống và quá trình chiết xuất tiếp tục Một số hệ thống chiết xuất quy mô phòng thí nghiệm không có hệ thống tuần hoàn dung môi, khi đó CO2 ở thể khí được thoát ra môi trường [65], [97], [143]

* Ưu điểm:

- Trạng thái siêu tới hạn có khả năng hòa tan tương tự như dung môi hữu

cơ nhưng khuếch tán nhanh hơn, độ nhớt và sức căng bề mặt thấp hơn Đặc tính hòa tan của một chất lỏng siêu tới hạn dễ kiểm soát hơn vì nó phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ và áp suất Có thể dễ dàng và nhanh chóng điều chỉnh nhiệt

độ và áp suất của bình chiết và bình tách để chiết và tách phân đoạn các chất Khi thêm các đồng dung môi (như methanol, ethanol ) có thể thay đổi độ phân cực của dung môi để tăng tính chọn lọc tách chiết các chất nên có thể chiết được

cả các nhóm chất có tính phân cực hơn như flavonoid, alcaloid…Trong qui trình công nghiệp liên quan đến thuốc hoặc thực phẩm, không phải lo lắng vì tồn dư của dung môi Chất sử dụng thông thường nhất là CO2 có đặc tính trơ, tinh khiết,

rẻ tiền, không tự kích nổ, không bắt lửa và duy trì sự cháy, ít độc với cơ thể, không ăn mòn thiết bị CO2 có thể được thu hồi nên chi phí sản xuất thấp Sản phẩm thu được tinh khiết, ít bị phân hủy và biến đổi do trạng thái siêu tới hạn đạt được ở nhiệt độ và áp suất thấp [143]

* Nhược điểm: Thiết bị chuyên dùng, đắt tiền Không thích hợp với mẫu

chiết ở thể lỏng Chỉ thích hợp để chiết các hợp chất ít phân cực Khó lường được khi dùng hỗn hợp dung môi

* Một số ứng dụng của chiết xuất siêu tới hạn:

Từ những ưu điểm trên nên phương pháp chiết siêu tới hạn được áp dụng rộng rãi để chiết tách dầu béo, tinh dầu, hương liệu, chất màu, chất béo, các hoạt chất có hoạt tính sinh học kém phân cực (carotenoid, flavonoid, alcaloid,

paclitaxel ) [65], [97], [143] Ngoài ra, phương pháp này cũng áp dụng để chiết loại các thành phần không mong muốn ra khỏi nguyên liệu như loại cafein ra hạt

cà phê, loại các chất kích thích sinh trưởng, chất bảo quản, thuốc trừ sâu trong thực phẩm, loại các chất béo trong dược liệu

1.2.1.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất dược liệu

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất dược liệu, dưới đây là những yếu tố có thể thay đổi được bằng các biện pháp kỹ thuật khác nhau, nhằm điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất, bao gồm:

a Độ mịn của dược liệu:

Bột dược liệu thô làm dung môi khó thấm ướt dược liệu nên khó chiết kiệt hoạt chất Khi giảm kích thước dược liệu, làm tăng diện tích tiếp xúc giữa dung môi và dược liệu nên tăng hiệu suất và rút ngắn thời gian chiết Tuy nhiên, trong thực tế, nếu dược liệu quá mịn sẽ gây ra một số bất lợi khi chiết xuất như: Bột dược liệu bị dính bết vào nhau khi có mặt dung môi, tạo thành dạng bột nhão, vón cục nên khó khuấy trộn hoặc khó rút dịch chiết khi chiết xuất bằng các phương pháp thông thường như ngâm hay ngấm kiệt Khi bột dược liệu quá mịn, nhiều tế bào thực vật bị phá huỷ, dịch chiết bị lẫn nhiều tạp nên gây khó khăn cho quá trình tinh chế và bảo quản Do vậy, cần phải lựa chọn độ mịn của dược liệu thích hợp, tuỳ thuộc vào bản chất dược liệu, dung môi và phương pháp chiết xuất Đối với trường hợp dùng loại dung môi dễ hòa tan nhiều tạp, nên tránh xay dược liệu quá mịn Đối với trường hợp chiết xuất ở nhiệt độ cao, cũng nên tránh xay dược liệu quá mịn để tránh đưa nhiều tạp vào dịch chiết

b Dung môi và tỷ lệ dung môi/ dược liệu:

Chiết xuất là bước đầu tiên và quan trọng để phân tách và lựa chọn được các thành phần hoạt chất mong muốn từ dược liệu, sau đó là tinh chế và phân lập chúng Việc lựa chọn dung môi thích hợp khi chiết xuất có vai trò quan trọng, cùng với việc áp dụng một phương pháp chiết xuất thích hợp Nói chung dung môi ít phân cực thì dễ hòa tan các chất không hoặc ít phân cực và khó hòa tan