Hoạt tính của protease kim loại (MMP-2, MMP-9) ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng trước và sau phẫu thuật

Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Hoàng Ngọc Anh HOẠT TÍNH CỦA PROTEASE KIM LOẠI (MMP-2, MMP-9) Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRƯỚC VÀ SAU PHẪU THUẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2017 Footer Page of 126 Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Hoàng Ngọc Anh HOẠT TÍNH CỦA PROTEASE KIM LOẠI (MMP-2, MMP-9) Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRƯỚC VÀ SAU PHẪU THUẬT Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Trịnh Hồng Thái TS Đỗ Minh Hà Hà Nội – 2017 Footer Page of 126 Header Page of 126 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trịnh Hồng Thái, người thầy quan tâm, tận tình bảo, hướng dẫn suốt trình học tập, thực hoàn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn với ý kiến đóng góp quý báu TS Đỗ Minh Hà suốt trình thực hoàn thành luận văn Trong trình học tập, làm việc thực luận văn, nhận giúp đỡ nhiều ThS Phạm Thị Bích, ThS Nguyễn Thị Tú Linh, ThS Lê Lan Phương bạn sinh viên làm việc Phòng Proteomics Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS BS Phạm Mạnh Cường Khoa Tế bào Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Quân y 103 đồng cảm ơn tới Khoa Xét nghiệm Sàng lọc máu Viện Huyết học -Truyền máu Trung ương cung cấp mẫu mẫu bệnh phẩm đối chứng quý giá trình thực luận văn Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình làm luận văn Cuối cùng, vô biết ơn gia đình bạn bè khích lệ, động viên bên suốt thời gian qua Hà Nội, tháng 02 năm 2017 Học viên Hoàng Ngọc Anh Footer Page of 126 Header Page of 126 MỤC LỤC BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG ii MỞ ĐẦU .1 Chương - TỔNG QUAN .3 1.1 Khái quát ung thư đại trực tràng 1.1.1 Ung thư đại trực tràng 1.1.2 Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng yếu tố nguy cơ.4 1.1.3 Phân loại ung thư đại trực tràng 1.1.4 Ảnh hưởng sau phẫu thuật .9 1.2 Tổng quan MMP 1.2.1 Matrix Metalloproteinases 1.2.2 Sự hoạt hóa dạng tiền hoạt động (pro-MMP) 12 1.2.3 Vai trò họ Matrix Metalloproteinase 13 1.3 Chương - Tình hình nghiên cứu MMP ung thư đại trực tràng .16 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21 2.1 Nguyên liệu 21 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .21 2.1.2 Thiết bị 21 2.1.3 Hóa chất 21 2.2 Phương pháp 22 2.2.1 Tách chiết protein tổng số từ mẫu mô 23 2.2.2 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford 24 2.2.3 Điện di xác định hoạt tính enzyme MMP gel polyacrylamide 25 Footer Page of 126 Header Page of 126 2.2.4 Phân tích hình ảnh gel điện di phần mềm Image J 27 2.2.5 Phân tích, đánh giá kết .28 Chương - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .29 3.1 Xác định hoạt tính enzyme gel polyacrylamide có SDS có bổ sung chất gelatin 29 3.2 Hoạt độ MMP-2 MMP-9 mẫu mô huyết tương bệnh nhân ung thư đại trực tràng 33 3.2.1 Hoạt độ MMP-2 MMP-9 theo vị trí mô 33 3.2.2 Hoạt độ MMP-2 MMP-9 huyết tương 36 3.3 Hoạt độ MMP-2 MMP-9 theo số đặc điểm bệnh học bệnh nhân ung thư đại trực tràng 40 KẾT LUẬN .46 KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC i Footer Page of 126 Header Page of 126 BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium persunfate CA Kháng nguyên ung thư (Cancer antigen) CBB Coomassie Brilliant Blue CEA Kháng nguyên ung thư phôi thai (Carcinoembryonic antigen) Cs Cộng ECM Chất ngoại bào (Extracellular Matrix) ELISA Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (Enzyme-linked immunosorbent assay) MMP Proteinase kim loại chất ngoại bào (Matrix Metalloproteinase) OD Mật độ quang (Optical density) RT-PCR Phản ứng khuếch đại chuỗi phiên mã ngược (Reverse transcription polymerase chain reaction) SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Điện di gel polyacrylamide có SDS (SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) TIMP Chất ức chế MMP (Tissue Inhibitors of Metalloproteinase) TNM Kích thước khối u - Hạch vùng - Di (Tumor - Node - Metastasis) UTĐTT Ung thư đại trực tràng UTVMH Ung thư vòm mũi họng Footer Page of 126 i Header Page of 126 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các giai đoạn UTĐTT tỷ lệ sống sót sau năm .9 Bảng 1.2 Bảng phân loại thành viên họ MMP theo chất 10 Bảng 1.3 Chức số MMP 14 Bảng 2.1 Thành phần gel polyacrylamide 9% có SDS có bổ sung chất 26 Bảng 3.1 Tần suất biểu hoạt tính MMP-2 MMP-9 mẫu mô huyết tương 37 bệnh nhân UTĐTT 30 Bảng 3.2 Hoạt độ chuẩn hóa MMP-2 MMP-9 mô T, LCU U bệnh nhân UTĐTT, n=37 33 Bảng 3.3 Hoạt độ chuẩn hóa MMP-2 MMP-9 huyết tương 37 bệnh nhân UTĐTT đối chứng 37 Bảng 3.4 Sự khác biệt hiệu số hoạt độ chuẩn hóa MMP-2 -9 mô u so với T theo số đặc điểm bệnh học bệnh nhân UTĐTT .41 Footer Page of 126 ii Header Page of 126 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo đại trực tràng Hình 1.2 Cấu trúc vùng MMP .11 Hình 1.3 Sơ đồ hoạt hóa pro-MMP 13 Hình 2.1 Sơ đồ bước thực nghiên cứu MMP-2 MMP-9 .23 Hình 3.1 Hình ảnh điện di xác định hoạt tính enzyme gel polyacrylamide có SDS, có gelatin mẫu mô (T, LCU U) huyết tương (HT-1, HT+1, HT+3 HT+7) bệnh nhân #10, mẫu đối chứng 29 Hình 3.2 Hoạt tính gelatinase mẫu mô số bệnh nhân UTĐTT 31 Hình 3.3 Biểu diễn băng hoạt tính MMP-2 MMP-9 mẫu huyết tương số bệnh nhân, đối chứng giá trị chuẩn hóa chúng 32 Hình 3.4 Hoạt độ chuẩn hóa MMP-2 MMP-9 mẫu huyết tương bệnh nhân UTĐTT 38 Hình 3.5 Hiệu số hoạt độ chuẩn hóa proMMP-9 U-T bệnh nhân UTĐTT theo mức độ xâm lấn độ biệt hóa 42 Hình 3.6 Hiệu số hoạt độ chuẩn hóa proMMP-2 HT+7 so với HT-1 proMMP-9 HT+3 so với HT-1 theo mức độ xâm lấn hạch di tương ứng bệnh nhân UTĐTT 43 Footer Page of 126 iii Header Page Luận of 126 văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh MỞ ĐẦU Theo báo cáo Tổ chức Nghiên cứu Ung thư Thế giới (International agency for research on cancer, IARC), năm 2012, ung thư đại trực tràng (UTĐTT) loại ung thư phổ biến thứ toàn giới đứng thứ ung thư đường tiêu hóa Tại Việt Nam, dựa số công bố từ năm 2005-2010 cho thấy: UTĐTT loại ung thư có tỷ lệ mắc đứng thứ số ca mắc (8768 ca) thứ số ca tử vong (5976 ca) [67] Hiện nay, phương pháp áp dụng để chẩn đoán UTĐTT như: chẩn đoán hình ảnh, chẩn đoán nội soi, chẩn đoán tế bào học, chẩn đoán mô bệnh học thường phát bệnh bệnh giai đoạn muộn, gây khó khăn cho việc điều trị Một số thị sinh học kháng nguyên ung thư (cancer antigen, CA), kháng nguyên ung thư phôi thai (carcinoembryonic antigen, CEA) dừng lại tiên lượng sau điều trị phẫu thuật [19, 7] Nhu cầu đặt phải tiếp tục tìm kiếm dấu hiệu sinh học giúp chẩn đoán có hiệu theo dõi điều trị bệnh UTĐTT Matrix metalloproteinase (MMP) biết đến nhóm enzyme tham gia vào trình phát triển xâm lấn khối u, đặc biệt MMP-2, MMP-9 dạng tiền hoạt động chúng Các enzyme nhiều công bố giới chứng minh có biểu khác biệt liên quan đến tiến triển khối u bệnh UTĐTT Vì vậy, đề tài “Hoạt tính protease kim loại (MMP-2, MMP-9) bệnh nhân ung thư đại trực tràng trước sau phẫu thuật” thực nhằm mục tiêu: Đánh giá hoạt tính mức độ biểu hoạt tính MMP-2, MMP-9 mô huyết tương bệnh nhân UTĐTT trước sau phẫu thuật Đánh giá mối liên quan hoạt độ MMP-2 MMP-9 với số đặc điểm bệnh học bệnh nhân UTĐTT 2014 – 2016 Footer Page 9Khóa of 126 Sinh học thực nghiệm Header Page Luận 10 of 126 văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh Đề tài thực Phòng Proteomics Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Khóa 2014 – 2016 Footer Page 10 of 126 Sinh học thực nghiệm Header Page Luận 23 of 126 văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh MMP-2, -3, -9, -13, -14 Biểu mức, liên quan đến Cảm ứng mạnh mẽ EMT EMT MMP-1, -7 Giải phóng E-cadherin MMP-28 Kích hoạt phân giải protein TGF-β Xâm lấn tế bào Giám sát miễn dịch MMP-9 Phát tán thụ thể α-interleukin- Ngăn chặn gia tăng tế bào lympho T tế bào lympho T MMP-9, -2, -14 Giải phóng TGF-b hoạt hóa MMP-7, -11, -1, -8, -3 Giải phóng chất ức chế a1- Giảm độ nhạy cảm proteinase tế bào ung thư với tế bào giết NK MMP-7, -8 Phân cắt chemokine α β Ngăn chặn phản ứng tế bào lympho T chống lại tế bào ung thư Ảnh hưởng đến bạch cầu liên quan đến xâm lấn Chú giải: EGFR: Thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (epidermal growth factor receptor), EMT: trình chuyển dạng trung - biểu mô (epithelial-mesenchymal transitions), TGF: nhân tố sinh trưởng chuyển hóa (Transforming growth factor), HB-EGF: yếu tố tăng trưởng thượng bì có gắn heparin (Heparin-binding EGF-like growth factor) Theo Gialeli cộng (cs): MMP-2 MMP-9 có mặt tất vai trò MMP ung thư như: xâm lấn, tăng sinh, chết theo chu trình, sinh mạch, giám sát miễn dịch chuyển dạng tế bào Qua đó, thấy đa dạng vai trò MMP-2 MMP-9 trình thúc đẩy tiến triển khối u [20] 15 Khóa 2014 – 2016 Footer Page 23 of 126 Sinh học thực nghiệm Header Page Luận 24 of 126 văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh 1.3 Tình hình nghiên cứu MMP ung thư đại trực tràng Tình hình nghiên cứu giới Với đa dạng phong phú số đường mà MMP tham gia vào, nhà nghiên cứu tìm kiếm biểu khác biệt MMP bệnh ung thư nói chung UTĐTT nói riêng Cho đến nay, giới có nhiều công bố kết nghiên cứu MMP bệnh nhân ung thư nói chung UTĐTT nói riêng Với mục tiêu nghiên cứu so sánh ý nghĩa lâm sàng MMP-9 huyết với TIMP-1 chẩn đoán UTĐTT khác biệt polyp thường với mô UTĐTT, Mroczko cs sử dụng xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) để định lượng MMP-9 TIMP-1 huyết 75 bệnh nhân UTĐTT, 35 polyp thường 70 người khỏe mạnh Bên cạnh đó, nồng độ kháng nguyên ung thư CEA CA 19-9 định lượng kỹ thuật miễn dịch enzyme vi hạt (microparticle enzyme immunoassay) Qua đó, cho thấy mức độ biểu MMP-9 huyết bệnh nhân UTĐTT cao rõ rệt với nhóm khỏe mạnh Bên cạnh đó, mức độ biểu TIMP-1 cao mô ung thư so với polyp tuyến Ngoài ra, TIMP-1 có liên quan với số đặc điểm bệnh học lâm sàng hạch di căn, di xa, giai đoạn khối u (T), tình trạng bệnh nhân (còn sống chết), tình trạng khối u (đã cắt bỏ, chưa cắt bỏ) Kết nghiên cứu cho rằng: TIMP-1 MMP-9 kết hợp với chẩn đoán cho độ nhạy cao thị sinh học CEA CA19-9 [41] Daniele cs tiến hành nghiên cứu 50 bệnh nhân ung thư vú 34 người khỏe mạnh kỹ thuật hóa mô miễn dịch mẫu mô điện di hoạt tính enzyme với mẫu huyết Kết thu cho thấy: gelatinase biểu cao rõ rệt bệnh nhân ung thư vú di so với không di nhóm chứng mẫu mô huyết Thêm vào đó, kết nghiên cứu cho rằng: MMP-9 16 Khóa 2014 – 2016 Footer Page 24 of 126 Sinh học thực nghiệm Header Page Luận 25 of 126 văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh có tương quan với CA 15.3 độ mô học Kết gợi ý rằng: MMP-2 MMP9 dấu hiệu phát triển, xâm lấn di ung thư vú [13] Công bố năm 1999 Adachi cs dựa 83 mẫu mô bệnh nhân UTĐTT, mẫu mô lấy từ bệnh nhân di sang gan Bằng phương pháp hóa mô miễn dịch điện di xác định hoạt tính enzyme gel polyacrylamide có bổ sung casein, kết nhuộm hóa mô miễn dịch cho thấy: có 46% mẫu mô 83 mẫu 10% tế bào ung thư nhuộm dương tính với MMP-7 biểu tăng MMP-7 có liên quan với có mặt hạch di di xa (pT thấp bệnh nhận UTĐTT so với nhóm đối chứng (13,6% < 21,7%) Bên cạnh đó, nghiên cứu tỷ lệ kiểu gen CT mô đại tràng trực tràng (p T Polymorphism in the Promoter Region of matrix metalloproteinase (MMP)-2 Gene in Colorectal Cancer Patients”, VNU Journal of Science: Natural Sciences and Technology, 32(1), pp 14-20 60 Waas E T., Lomme R., DeGroot J., Wobbes T., Hendriks T (2002), "Tissue levels of active matrix metalloproteinase-2 and-9 in colorectal cancer", Br J Cancer, 86(12), pp 1876–1883 61 Wei E K., Giovannucci E., Wu K., Rosner B., Fuchs C S., Willett W C.,& Colditz G A (2004), "Comparison of risk factors for colon and rectal cancer", Int J Cancer, 108(3), pp 433–442 62 Yabluchanskiy A., Ma Y., Iyer R P., Hall M E., Lindsey M L (2013), "Matrix metalloproteinase-9: many shades of function in cardiovascular disease", Physiology, 28(6), pp 391–403 63 Yin S., Bai H., Jing D (2014), "Insulin therapy and colorectal cancer risk among type diabetes mellitus patients: a systemic review and metaanalysis", Diagn Pathol, 9(1), pp 1–6 55 Khóa 2014 – 2016 Footer Page 36 of 126 Sinh học thực nghiệm Header Page Luận 37 of 126 văn thạc sĩ 64 Hoàng Ngọc Anh Zeng Z S., Cohen A M., Guillem J G (1999), "Loss of basement membrane type IV collagen is associated with increased expression of metalloproteinases and (MMP-2 and MMP-9) during human colorectal tumorigenesis", Carcinogenesis, 20(5), pp 749–755 65 Zhao T., Xia W H., Zheng M Q., Lu C Q., Han X., Sun Y J (2008), "Surgical excision promotes tumor growth and metastasis by promoting expression of MMP-9 and VEGF in a breast cancer model", Exp Oncol, 30(1), pp 60–64 66 Zucker S., Drews M., Conner C., Foda H D., DeClerck Y A., Langley K E., Bahou W F., Docherty A J P., Cao J (1998), "Tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2) binds to the catalytic domain of the cell surface receptor, membrane type 1-matrix metalloproteinase (MT1MMP)", Biochem J, 273(2), pp 1216–1222 Website 67 http://gco.iarc.fr/ ( 12/12/2016) 68 http://www.cancer.gov/(12/12/2016) 69 http://www.cancer.org/(28/12/2016) 56 Khóa 2014 – 2016 Footer Page 37 of 126 Sinh học thực nghiệm ... 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Hoàng Ngọc Anh HOẠT TÍNH CỦA PROTEASE KIM LOẠI (MMP-2, MMP-9) Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRƯỚC VÀ SAU PHẪU THUẬT... tài Hoạt tính protease kim loại (MMP-2, MMP-9) bệnh nhân ung thư đại trực tràng trước sau phẫu thuật thực nhằm mục tiêu: Đánh giá hoạt tính mức độ biểu hoạt tính MMP-2, MMP-9 mô huyết tương bệnh. .. thể trực tràng Hình 1.1 Cấu tạo đại trực tràng [68] 1.1.1 Ung thư đại trực tràng UTĐTT hay gọi ung thư ruột già thuật ngữ để loại ung thư khởi phát có nguồn gốc từ vị trí thuộc đoạn đại tràng trực