1. Trang chủ
  2. » Khoa Học Tự Nhiên

Hoạt tính của protease kim loại (MMP 2, MMP 9) ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng trước và sau phẫu thuật

91 117 0

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 91
Dung lượng 2,26 MB

Nội dung

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Hoàng Ngọc Anh HOẠT TÍNH CỦA PROTEASE KIM LOẠI (MMP-2, MMP-9) BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRƯỚC SAU PHẪU THUẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Hoàng Ngọc Anh HOẠT TÍNH CỦA PROTEASE KIM LOẠI (MMP-2, MMP-9) BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRƯỚC SAU PHẪU THUẬT Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Trịnh Hồng Thái TS Đỗ Minh Hà Hà Nội – 2017 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trịnh Hồng Thái, người thầy quan tâm, tận tình bảo, hướng dẫn suốt trình học tập, thực hoàn thành luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn với ý kiến đóng góp quý báu TS Đỗ Minh Hà suốt trình thực hoàn thành luận văn Trong trình học tập, làm việc thực luận văn, nhận giúp đỡ nhiều ThS Phạm Thị Bích, ThS Nguyễn Thị Tú Linh, ThS Lê Lan Phương bạn sinh viên làm việc Phòng Proteomics Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS BS Phạm Mạnh Cường Khoa Tế bào Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Quân y 103 đồng cảm ơn tới Khoa Xét nghiệm Sàng lọc máu Viện Huyết học -Truyền máu Trung ương cung cấp mẫu mẫu bệnh phẩm đối chứng quý giá trình thực luận văn Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình làm luận văn Cuối cùng, vô biết ơn gia đình bạn bè khích lệ, động viên bên suốt thời gian qua Hà Nội, tháng 02 năm 2017 Học viên Hoàng Ngọc Anh MỤC LỤC BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG ii MỞ ĐẦU .1 Chương - TỔNG QUAN .3 1.1 Khái quát ung thư đại trực tràng 1.1.1 Ung thư đại trực tràng 1.1.2 Nguyên nhân gây ung thư đại trực tràng yếu tố nguy cơ.4 1.1.3 Phân loại ung thư đại trực tràng 1.1.4 Ảnh hưởng sau phẫu thuật .9 1.2 Tổng quan MMP 1.2.1 Matrix Metalloproteinases 1.2.2 Sự hoạt hóa dạng tiền hoạt động (pro-MMP) 12 1.2.3 Vai trò họ Matrix Metalloproteinase 13 1.3 Chương - Tình hình nghiên cứu MMP ung thư đại trực tràng .16 NGUYÊN LIỆU PHƯƠNG PHÁP 21 2.1 Nguyên liệu 21 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .21 2.1.2 Thiết bị 21 2.1.3 Hóa chất 21 2.2 Phương pháp 22 2.2.1 Tách chiết protein tổng số từ mẫu mô 23 2.2.2 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford 24 2.2.3 Điện di xác định hoạt tính enzyme MMP gel polyacrylamide 25 2.2.4 Phân tích hình ảnh gel điện di phần mềm Image J 27 2.2.5 Phân tích, đánh giá kết .28 Chương - KẾT QUẢ BÀN LUẬN .29 3.1 Xác định hoạt tính enzyme gel polyacrylamide có SDS có bổ sung chất gelatin 29 3.2 Hoạt độ MMP-2 MMP-9 mẫu mô huyết tương bệnh nhân ung thư đại trực tràng 33 3.2.1 Hoạt độ MMP-2 MMP-9 theo vị trí mô 33 3.2.2 Hoạt độ MMP-2 MMP-9 huyết tương 36 3.3 Hoạt độ MMP-2 MMP-9 theo số đặc điểm bệnh học bệnh nhân ung thư đại trực tràng 40 KẾT LUẬN .46 KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC i BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium persunfate CA Kháng nguyên ung thư (Cancer antigen) CBB Coomassie Brilliant Blue CEA Kháng nguyên ung thư phôi thai (Carcinoembryonic antigen) Cs Cộng ECM Chất ngoại bào (Extracellular Matrix) ELISA Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme (Enzyme-linked immunosorbent assay) MMP Proteinase kim loại chất ngoại bào (Matrix Metalloproteinase) OD Mật độ quang (Optical density) RT-PCR Phản ứng khuếch đại chuỗi phiên mã ngược (Reverse transcription polymerase chain reaction) SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Điện di gel polyacrylamide có SDS (SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) TIMP Chất ức chế MMP (Tissue Inhibitors of Metalloproteinase) TNM Kích thước khối u - Hạch vùng - Di (Tumor - Node - Metastasis) UTĐTT Ung thư đại trực tràng UTVMH Ung thư vòm mũi họng i DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các giai đoạn UTĐTT tỷ lệ sống sót sau năm .9 Bảng 1.2 Bảng phân loại thành viên họ MMP theo chất 10 Bảng 1.3 Chức số MMP 14 Bảng 2.1 Thành phần gel polyacrylamide 9% có SDS có bổ sung chất 26 Bảng 3.1 Tần suất biểu hoạt tính MMP-2 MMP-9 mẫu mô huyết tương 37 bệnh nhân UTĐTT 30 Bảng 3.2 Hoạt độ chuẩn hóa MMP-2 MMP-9 mô T, LCU U bệnh nhân UTĐTT, n=37 33 Bảng 3.3 Hoạt độ chuẩn hóa MMP-2 MMP-9 huyết tương 37 bệnh nhân UTĐTT đối chứng 37 Bảng 3.4 Sự khác biệt hiệu số hoạt độ chuẩn hóa MMP-2 -9 mô u so với T theo số đặc điểm bệnh học bệnh nhân UTĐTT .41 ii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo đại trực tràng Hình 1.2 Cấu trúc vùng MMP .11 Hình 1.3 Sơ đồ hoạt hóa pro-MMP 13 Hình 2.1 Sơ đồ bước thực nghiên cứu MMP-2 MMP-9 .23 Hình 3.1 Hình ảnh điện di xác định hoạt tính enzyme gel polyacrylamide có SDS, có gelatin mẫu mô (T, LCU U) huyết tương (HT-1, HT+1, HT+3 HT+7) bệnh nhân #10, mẫu đối chứng 29 Hình 3.2 Hoạt tính gelatinase mẫu mô số bệnh nhân UTĐTT 31 Hình 3.3 Biểu diễn băng hoạt tính MMP-2 MMP-9 mẫu huyết tương số bệnh nhân, đối chứng giá trị chuẩn hóa chúng 32 Hình 3.4 Hoạt độ chuẩn hóa MMP-2 MMP-9 mẫu huyết tương bệnh nhân UTĐTT 38 Hình 3.5 Hiệu số hoạt độ chuẩn hóa proMMP-9 U-T bệnh nhân UTĐTT theo mức độ xâm lấn độ biệt hóa 42 Hình 3.6 Hiệu số hoạt độ chuẩn hóa proMMP-2 HT+7 so với HT-1 proMMP-9 HT+3 so với HT-1 theo mức độ xâm lấn hạch di tương ứng bệnh nhân UTĐTT 43 iii Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh MỞ ĐẦU Theo báo cáo Tổ chức Nghiên cứu Ung thư Thế giới (International agency for research on cancer, IARC), năm 2012, ung thư đại trực tràng (UTĐTT) loại ung thư phổ biến thứ toàn giới đứng thứ ung thư đường tiêu hóa Tại Việt Nam, dựa số công bố từ năm 2005-2010 cho thấy: UTĐTT loại ung thư có tỷ lệ mắc đứng thứ số ca mắc (8768 ca) thứ số ca tử vong (5976 ca) [67] Hiện nay, phương pháp áp dụng để chẩn đoán UTĐTT như: chẩn đoán hình ảnh, chẩn đoán nội soi, chẩn đoán tế bào học, chẩn đoán mô bệnh học thường phát bệnh bệnh giai đoạn muộn, gây khó khăn cho việc điều trị Một số thị sinh học kháng nguyên ung thư (cancer antigen, CA), kháng nguyên ung thư phôi thai (carcinoembryonic antigen, CEA) dừng lại tiên lượng sau điều trị phẫu thuật [19, 7] Nhu cầu đặt phải tiếp tục tìm kiếm dấu hiệu sinh học giúp chẩn đoán có hiệu theo dõi điều trị bệnh UTĐTT Matrix metalloproteinase (MMP) biết đến nhóm enzyme tham gia vào trình phát triển xâm lấn khối u, đặc biệt MMP-2, MMP-9 dạng tiền hoạt động chúng Các enzyme nhiều công bố giới chứng minh có biểu khác biệt liên quan đến tiến triển khối u bệnh UTĐTT Vì vậy, đề tài “Hoạt tính protease kim loại (MMP-2, MMP-9) bệnh nhân ung thư đại trực tràng trước sau phẫu thuật” thực nhằm mục tiêu: Đánh giá hoạt tính mức độ biểu hoạt tính MMP-2, MMP-9 mô huyết tương bệnh nhân UTĐTT trước sau phẫu thuật Đánh giá mối liên quan hoạt độ MMP-2 MMP-9 với số đặc điểm bệnh học bệnh nhân UTĐTT Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm Luận văn thạc sĩ Hoàng Ngọc Anh Đề tài thực Phòng Proteomics Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Khóa 2014 – 2016 Sinh học thực nghiệm Hoàng Ngọc Anh K23CH Hoạt độ chuẩn hóa proMMP-2 Hoạt độ chuẩn hóa MMP-2 Mã BN T LCU U HT-1 HT+1 HT+3 HT+7 T LCU U HT-1 HT+1 55 50,62 17,13 9,60 24,72 7,23 15,02 11,14 0,00 5,16 2,84 0,00 0,00 0,00 0,00 56 25,80 29,72 9,26 3,20 3,85 2,30 4,20 9,48 9,04 5,53 0,00 0,00 0,00 0,00 57 8,48 87,31 14,96 19,36 14,68 5,65 5,76 11,53 12,69 11,62 0,00 0,00 0,00 0,00 58 13,06 13,05 0,90 17,25 4,66 10,19 31,76 0,00 0,00 0,61 0,00 0,00 0,00 0,00 60 19,97 72,87 15,53 34,86 17,77 21,06 33,50 1,75 5,65 0,72 0,00 0,00 0,00 0,00 61 33,78 37,24 14,87 5,97 2,59 2,40 7,31 0,00 0,00 1,07 0,00 0,00 0,00 0,00 62 30,87 17,71 5,48 27,65 15,92 29,26 21,07 0,88 0,00 6,59 0,00 0,00 0,00 0,00 63 65,05 44,95 4,07 14,14 27,41 20,98 17,86 0,00 5,90 1,15 0,00 0,00 0,00 0,00 HT+3 HT+7 Ghi chú: T, LCU, U : mô thường, lân cận u, u, tương ứng; HT-1: mẫu huyết tương trước phẫu thuật ngày; HT+1, HT+3, HT+7: mẫu huyết tương sau phẫu thuật 1, 3, ngày, tương ứng xiii Hoàng Ngọc Anh K23CH Phụ lục Hoạt độ chuẩn hóa MMP-9 Hoạt độ chuẩn hóa proMMP-9 Hoạt độ chuẩn hóa MMP-2 Mã BN T LCU U HT-1 HT+1 HT+3 HT+7 T LCU U HT-1 HT+1 10 58,45 36,89 73,25 21,26 26,92 26,46 15,73 0,00 0,00 0,00 7,06 8,59 6,72 7,57 11 57,39 49,55 48,10 32,95 62,12 27,01 43,52 2,01 4,36 9,76 14,60 37,88 6,88 11,28 12 53,16 47,82 44,03 68,05 70,23 44,73 62,18 5,71 4,12 25,55 5,24 2,49 3,45 3,57 14 31,04 51,35 37,68 23,26 77,05 64,52 72,12 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 3,63 0,00 22 25,62 54,20 39,00 29,18 50,55 33,21 56,90 0,00 0,00 23,58 0,00 0,00 0,00 0,00 23 59,34 68,68 69,34 19,40 40,07 45,70 42,55 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 24 64,57 58,29 70,07 28,07 47,91 44,70 43,80 0,00 0,00 0,00 8,84 2,36 1,71 4,58 25 75,13 74,62 63,24 40,77 15,89 48,10 29,55 0,00 5,12 7,92 0,00 0,00 5,37 4,86 26 66,59 70,62 41,45 14,71 60,86 78,74 5,97 0,00 0,00 40,28 0,00 2,04 0,00 0,00 27 63,84 54,80 66,31 40,74 43,92 46,08 49,86 0,00 0,00 16,83 0,00 0,00 0,00 0,00 28 68,60 65,77 53,91 50,47 69,04 28,54 31,80 0,00 0,00 0,00 2,39 1,54 8,07 5,56 29 25,69 50,73 73,97 23,99 40,34 33,44 31,59 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,18 1,81 31 39,75 74,92 96,92 19,29 85,82 27,54 22,52 0,00 0,00 0,00 3,33 1,87 6,64 9,45 33 57,17 75,19 53,92 43,09 47,67 58,59 77,89 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 1,35 1,43 xiv HT+3 HT+7 Hoàng Ngọc Anh K23CH Hoạt độ chuẩn hóa proMMP-9 Hoạt độ chuẩn hóa MMP-2 Mã BN T LCU U HT-1 HT+1 HT+3 HT+7 T LCU U HT-1 HT+1 37 52,10 68,16 55,98 22,96 37,72 21,37 13,96 0,00 0,00 16,47 1,94 5,30 3,30 3,30 38 16,36 26,61 31,36 29,22 40,67 41,21 62,64 0,00 0,00 9,46 0,00 0,76 0,00 0,00 39 63,95 42,44 67,11 34,21 53,15 46,00 49,73 7,79 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 40 84,73 83,63 65,20 21,17 71,03 44,12 37,26 1,29 0,00 0,52 7,04 0,00 2,41 5,15 42 13,42 63,07 26,62 10,03 29,66 29,01 31,81 0,00 3,93 40,84 0,00 0,85 0,00 0,00 43 62,92 63,62 49,06 56,44 53,41 56,23 50,04 0,00 0,00 2,67 0,00 0,00 0,00 0,00 44 56,79 73,23 47,16 74,18 81,54 62,07 70,58 0,00 3,61 29,14 0,00 0,00 0,00 0,00 46 34,22 65,60 20,09 31,72 15,10 24,19 16,48 0,00 0,00 0,00 10,96 5,21 3,27 5,06 47 45,54 38,28 46,53 54,95 65,14 69,42 76,66 0,00 0,00 0,00 4,82 0,92 0,00 1,28 48 65,87 66,57 61,31 57,91 48,11 55,09 45,18 0,00 0,00 15,15 2,51 0,92 3,43 4,44 49 74,97 65,94 49,02 30,27 45,10 43,63 42,20 0,00 0,00 16,65 1,84 1,87 0,69 1,22 50 78,93 69,05 70,96 40,84 70,36 31,12 38,04 3,25 1,29 5,85 6,93 2,11 8,19 6,00 51 61,62 57,71 58,90 50,03 63,58 54,12 55,78 0,00 0,00 5,84 0,00 0,14 0,28 3,51 52 71,97 57,47 65,85 45,83 43,75 47,57 51,32 1,69 0,91 5,08 7,60 1,57 1,31 7,98 54 66,23 67,78 41,26 47,51 51,69 50,49 55,17 2,64 0,00 27,25 0,00 0,34 1,22 0,00 xv HT+3 HT+7 Hoàng Ngọc Anh K23CH Hoạt độ chuẩn hóa proMMP-9 Hoạt độ chuẩn hóa MMP-2 Mã BN T LCU U HT-1 HT+1 HT+3 HT+7 T LCU U HT-1 HT+1 55 49,38 59,34 42,46 42,19 49,23 53,64 52,49 0,00 4,66 31,66 3,44 3,53 0,99 2,73 56 60,68 54,31 41,28 56,66 61,49 72,37 67,27 0,00 0,00 22,63 0,00 0,00 0,00 0,00 57 20,15 0,00 64,65 52,39 63,80 83,31 85,98 23,53 0,00 0,00 2,65 1,51 0,36 0,00 58 86,94 85,92 67,24 52,10 70,58 73,16 48,44 0,00 0,00 27,60 0,59 0,00 0,00 0,00 60 77,36 16,81 72,82 40,52 60,42 62,38 45,70 0,00 1,84 7,50 3,17 1,19 1,21 0,96 61 62,18 61,79 78,09 75,02 78,38 77,67 77,16 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,05 0,96 62 65,53 80,47 51,17 40,80 52,97 37,31 38,54 0,00 0,00 24,33 1,85 1,14 2,91 1,88 63 34,95 44,77 65,59 64,51 44,72 63,48 56,37 0,00 0,00 6,26 0,50 1,77 1,08 2,12 HT+3 HT+7 Ghi chú: T, LCU, U : mô thường, lân cận u, u, tương ứng; HT-1: mẫu huyết tương trước phẫu thuật ngày; HT+1, HT+3, HT+7: mẫu huyết tương sau phẫu thuật 1, 3, ngày, tương ứng xvi Hoàng Ngọc Anh K23CH Phụ lục Hoạt độ MMP-2 MMP-9 mô bệnh nhân UTĐTT theo vị trí lấy mẫu khác Hoạt độ chuẩn hóa ( pro MMP-2 U T U 12,84 ) MMP-2 Active/pro MMP-2 Pro MMP-9 MMP-9 Active/pr oMMP-9 6,82 0,52 55,97 11,32 0,25 T 32,59 3,69 0,20 55,49 1,29 0,04 P 6,78E-07 1,08E-02 4,85E-07 2,62E-01 9,21E-05 1,67E-04 U LCU U 12,84 6,82 0,52 55,97 11,32 0,25 LCU 28,87 3,55 0,17 58,00 0,81 0,02 P 1,76E-05 5,28E-03 4,21E-06 1,52E-01 9,40E-06 1,07E-05 LCU T LCU 28,87 3,55 0,17 58,00 0,81 0,02 T 32,59 3,69 0,20 55,49 1,29 0,04 P 9,15E-02 4,12E-01 3,51E-01 2,11E-01 4,38E-01 3,57E-01 Ghi chú: TB: giá trị trung bình; T, LCU U: mô thường, lân cận u u, tương ứng xvii Hoàng Ngọc Anh K23CH Phụ lục Hoạt độ MMP-2 MMP-9 huyết tương bệnh nhân UTĐTT theo ngày lấy mẫu trước sau phẫu thuật Hoạt độ chuẩn hóa ( ) proMMP-2 MMP-2 proMMP-9 MMP-9 HT+1 HT-1 HT+1 17,78 0,33 53,78 2,35 HT-1 29,50 0,35 40,18 2,63 1,1E-04 5,0E-01 5,2E-05 9,2E-02 HT+3 22,99 0,23 48,82 2,07 HT-1 29,50 0,35 40,18 2,63 4,9E-03 3,1E-01 1,3E-03 2,4E-01 HT+7 HT-1 HT+7 21,86 0,28 47,43 2,61 HT-1 29,50 0,35 40,18 2,63 8,1E-03 3,8E-01 9,6E-03 4,5E-01 Đ/c 5,91 0,00 80,42 0,67 HT-1 29,50 0,35 40,18 2,63 3,7E-10 6,9E-01 2,6E-12 9,2E-03 HT+3 22,99 0,23 48,82 2,07 HT+1 17,78 0,33 53,78 2,35 6,3E-03 3,1E-01 1,7E-01 2,9E-01 HT+7 HT+1 HT+7 21,86 0,28 47,43 2,61 HT+1 17,78 0,33 53,78 2,35 1,7E-02 6,3E-01 5,1E-02 5,9E-02 5,91 0,00 80,42 0,67 17,78 0,33 53,78 2,35 3,9E-06 6,9E-01 6,9E-10 2,2E-03 P HT+3 HT-1 P P Đ/c HT-1 P HT+3 HT+1 P P Đ/c HT+1 Đ/c HT+1 P xviii Hoàng Ngọc Anh K23CH Hoạt độ chuẩn hóa ( ) proMMP-2 MMP-2 proMMP-9 MMP-9 HT+7 HT+3 HT+7 21,86 0,28 47,43 2,61 HT+3 22,99 0,23 48,82 2,07 3,0E-01 3,1E-01 4,7E-01 4,4E-02 5,91 0,00 80,42 0,67 22,99 0,23 48,82 2,07 4,8E-09 4,2E-01 8,5E-11 6,7E-04 Đ/c 5,91 0,00 80,42 0,67 HT+7 21,86 0,28 47,43 2,61 6,0E-10 5,5E-01 1,2E-10 9,6E-04 P Đ/c HT+3 Đ/c HT+3 P Đ/c HT+7 P Ghi chú: TB: giá trị trung bình; HT-1: huyết tương trước phẫu thuật ngày; HT+1, HT+3, HT+7: huyết tương sau phẫu thuật 1, ngày, tương ứng; ĐC: Đối chứng xix Hoàng Ngọc Anh K23CH Phụ lục Hiệu số hoạt độ MMP-2 MMP-9 mô u LCU theo số đặc điểm bệnh học bệnh nhân UTĐTT Đặc điểm Độ tuổi

Ngày đăng: 27/08/2017, 18:34

TỪ KHÓA LIÊN QUAN

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w