Nghiên cứu sản xuất đường Erythritol từ nấm men Moniliella phân lập tại Việt Nam

Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Ánh Thao NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT ĐƢỜNG ERYTHRITOL TỪ NẤM MEN MONILIELLA PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 Footer Page of 126 Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Ánh Thao NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT ĐƢỜNG ERYTHRITOL TỪ NẤM MEN MONILIELLA PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS LÊ ĐỨC MẠNH TS LÊ HỒNG ĐIỆP Hà Nội - 2016 Footer Page of 126 Header Page Luận of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin đƣợc bày tỏ lòng cảm ơn và kính trọng sâu sắc tới PGS.TS Lê Đức Mạnh và TS Lê Hồng Điệp tận tình hƣớng dẫn, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập, nghiên cứu và thực luận văn này Lời cảm ơn xin gửi tới Cán bộ Trung tâm Hóa sinh công nghiệp và môi trƣờng - Viện Công nghiệp thực phẩm chia sẻ, hƣớng dẫn và tạo điều kiện tốt để học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn Tôi c ng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo, cô giáo Khoa Sinh học c ng nhƣ thầy, cô thuộc Bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên truyền đạt cho nhiều kiến thức tảng bổ ích Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố m , ông bà và ngƣời thân gia đình dành tình cảm và động viên, khích lệ suốt trình học tập Và cuối xin cảm ơn bạn bè ủng hộ và giúp đỡ hoàn thành luận văn Hà Nội, tháng 12 năm 2016 Học viên Nguyễn Thị Ánh Thao Khóa 2014 - 2016 Footer Page of 126 Header Page Luận of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đƣờng erythritol .3 1.1.1 Cấu tạo và tính chất đƣờng erythritol 1.1.2 Lợi ích cho sức khỏe đƣờng erythritol 1.1.3 Ứng dụng đƣờng erythritol 1.2 Công nghệ sản xuất ertythritol từ tinh bột .4 1.3 Tình hình sản xuất erythritol giới và Việt Nam .6 1.4 Nấm Moniliella 1.4.1 Đặc điểm nấm men Moniliella 1.4.2 Ƣu điểm và ứng dụng nấm men đen Moniliella sản xuất erythritol .9 1.4.3 Con đƣờng sinh tổng hợp đƣờng erythritol nấm men 10 1.5 Một số phƣơng pháp thu nhận erythritol dịch lên men 14 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Đối tƣợng, nguyên vật liệu nghiên cứu 17 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 17 2.1.2 Các môi trƣờng nghiên cứu 17 2.1.3 Các hóa chất dùng nghiên cứu .18 2.1.4 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu .18 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Phƣơng pháp lên men sinh tổng hợp erythritol .19 2.2.2 Phƣơng pháp sắc ký HPLC 19 2.2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học nấm men Moniliella 20 2.2.4 Phƣơng pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp đƣờng erythritol 22 2.2.5 Các phƣơng pháp làm dịch lên men thu hồi đƣờng erythritol 23 2.2.6 Phƣơng pháp khảo sát yếu tố ảnh hƣởng tới trình kết tinh .24 2.2.7 Phƣơng pháp kiểm tra một số tiêu chất lƣợng đƣờng erythritol 26 Khóa 2014 - 2016 Footer Page of 126 i Header Page Luận of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao Chƣơng KẾT QUẢ THẢO LUẬN .27 3.1 Sàng lọc chủng nấm men đen Moniliella có khả sinh tổng hợp đƣờng erythritol .27 3.2 Đặc điểm chủng nấm men M megachiliensis TBY 3406.6 30 3.2.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng TBY 3406.6 30 3.2.2 Đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng M megachiliensis TBY 3406.6 31 3.3 Nghiên cứu điều kiện lên men sinh tổng hợp erythritol chủng M megachiliensis TBY 3406.6 từ dịch đƣờng thủy phân sản phẩm trình dịch hóa đƣờng hóa tinh bột sắn .33 3.3.1 Nghiên cứu lựa chọn hàm lƣợng đƣờng glucose .33 3.3.2 Nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ cao nấm men 35 3.3.3 Ảnh hƣởng tỷ lệ ure 36 3.3.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ 37 3.3.5 Ảnh hƣởng pH 37 3.3.6 Ảnh hƣởng tốc độ khuấy lắc .38 3.3.7 Ảnh hƣởng thời gian 39 3.4 Nghiên cứu trình làm và thu hồi eyrthritol 41 3.4.1 Nghiên cứu loại bỏ tạp chất dịch lên men - Xử lý than hoạt tính (khử mùi, khử màu) 41 3.4.1.1 Ảnh hƣởng tỷ lệ than hoạt tính 41 3.4.1.2 Ảnh hƣởng thời gian xử lý chất hấp phụ 42 3.4.2 Xử lý dịch đƣờng cột trao đổi ion (tẩy khoáng) .42 3.4.3 Nghiên cứu điều kiện kết tinh đƣờng erythritol 43 3.4.3.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng nồng độ chất khô hòa tan tới trình kết tinh 43 3.4.3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng tỉ lệ mầm tinh thể tới trình kết tinh 44 3.4.3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ đến trình kết tinh 46 3.4.3.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian đến trình kết tinh 46 Khóa 2014 - 2016 Footer Page of 126 ii Header Page Luận of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao 3.4.4 Nghiên cứu điều kiện sấy và thu hồi sản phẩm .48 3.4.4.1 Nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ sấy đến chất lƣợng đƣờng .48 3.4.4.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng thời gian sấy kết hợp với mức nhiệt độ đến độ ẩm đƣờng thu đƣợc 48 3.5 Sơ đồ quy trình công nghệ 50 3.6 Sản xuất thử nghiệm quy mô phòng thí nghiệm 51 3.7 Phân tích đánh giá sản phẩm 54 3.7.1 Đánh giá cảm quan đƣờng erythritol thu nhận đƣợc .54 3.7.2 Phân tích đánh giá thành phần sản phẩm đƣờng erythritol .54 3.7.3 Đánh giá tiêu vi sinh vật 54 3.7.4 Đánh giá tiêu kim loại nặng .55 3.8 Một số ứng dụng đƣờng erythritol vào sản phẩm thƣơng mại .55 3.8.1 Qui trình sản xuất viên nén đƣờng erythritol 56 3.8.2 Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm nƣớc uống có thành phần erythritol 57 KẾT LUẬN 60 KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO .61 PHỤ LỤC 65 Khóa 2014 - 2016 Footer Page of 126 iii Header Page Luận of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ AMG o Bx CFU CNTP CTPT DE DNA DNS DSMZ Amyloglucosidase (Glucoamylase) Độ Brix - Nồng độ chất khô hòa tan Colony Forming Unit Công nghiệp thực phẩm Công thức phân tử Dextrose equivalent Deoxyribonucleic acid acid dinitrosalicylic Ký hiệu chủng giống thuộc Bộ sƣu tập Vi sinh vật và Tế bào Đức, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Food and Agriculture Organization Frozen Carbonated Beverage Glycemic index General High fructose corn syrup High fructose corn syrup High-performance liquid chromatography of high-pressure liquid chromatography Joint Expert Committee on Food Additives Khối lƣợng phân tử Kilo Novo Unit alpha-amylase Nicotinamide adenine diculeotide phosphate Polymerase Chain Reaction ARN riboxom Tiêu chuẩn Việt Nam Volume/volume Volatile fatty acids Weigh/volume Weigh/weigh World Health Organisation Yeast Malt Association of Official Analytical Chemist Hiệu suất chuyển hóa FAO FCB GI GSFA HFCS HFCS HPLC JECFA KLPT KNU NADPH PCR rARN TCVN v/v VFA w/v w/w WHO YM AOAC HSCH Khóa 2014 - 2016 Footer Page of 126 iv Header Page Luận of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 So sánh đặc điểm hình thái chi Moniliella với một số chi thƣờng gặp bị nhầm lẫn với Monilliela [4] Bảng 2.1 Bảng thành phần dịch đƣờng thủy phân sau cô đặc 120 phút 17 Bảng 2.2 Danh sách nguồn chất 20 Bảng 3.1 Hàm lƣợng erythritol tích l y chủng nấm men đen sau ngày nuôi cấy môi trƣờng chứa 20% 27 Bảng 3.2 Hàm lƣợng erythritol tích l y dịch lên men chủng thuộc loài M megachiliensis .28 Bảng 3.3 Khảo sát sơ bộ sinh tổng hợp erythritol chủng TBY 3406.6 TBY 3438.2 .30 Bảng 3.4 Bảng đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào chủng TBY 3406.6 31 Bảng 3.5 Một số đặc điểm M megachiliensis TBY 3406.6 31 Bảng 3.6 Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng M megachiliensis TBY 3406.6 .32 Bảng 3.7 Ảnh hƣởng tỷ lệ dịch đƣờng đến trình chuyển hóa erythritol chủng M megachiliensis TBY 3406.6 .34 Bảng 3.8 Đánh giá dịch sau lên men chủng sau 13 ngày nuôi cấy .41 Bảng 3.9 Ảnh hƣởng tỷ lệ than hoạt tính 42 Bảng 3.10 Ảnh hƣởng thời gian xử lý than hoạt tính 42 Bảng 3.11 Thành phần dịch đƣờng sau làm 43 Bảng 3.12 Ảnh hƣởng nồng độ chất khô hòa tan trình kết tinh 44 Bảng 3.13 Kết ảnh hƣởng thời gian đến trình kết tinh 47 Bảng 3.14 Kết ảnh hƣởng nhiệt độ đến trình sấy (sấy giờ) .48 Bảng 3.15 Ảnh hƣởng thời gian sấy đến độ ẩm đƣờng 49 Bảng 3.16 Chỉ tiêu cảm quan đƣờng erythritol 54 Bảng 3.17 Kết tiêu đánh giá sản phẩm đƣờng erythritol 54 Bảng 3.18 Các tiêu vi sinh vật erythritol .55 Bảng 3.19 Hàm lƣợng kim loại nặng .55 Khóa 2014 - 2016 Footer Page of 126 v Header Page Luận of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Công thức hóa học erythritol [10] Hình 1.2 Hình ảnh khuẩn lạc nấm men Moniliella suavedens var suavedens nuôi cấy đĩa thạch [7] Hình 1.3 Hình ảnh sinh sản nảy chồi nấm men đen [2] Hình 1.4 Quá trình sinh tổng hợp erythritol nấm men vi khuẩn [26] 11 Hình 1.5 Tác động enzym chuyển hóa Transketolase Transaldoase đƣờng pentose – phosphate [26] .12 Hình 1.6 Con đƣờng pentose phosphate chuyển hóa đƣờng glucose thành đƣờng erythritol [26] 13 Hình 3.1 Ảnh hƣởng tỷ lệ dịch đƣờng tới khả tích l y erythritol chủng M megachiliensis TBY 3406.6 34 Hình 3.2 Ảnh hƣởng tỷ lệ cao nấm men đến sinh trƣởng phát triển chủng TBY 3406.6 35 Hình 3.3 Ảnh hƣởng tỷ lệ cao nấm men đến sinh trƣởng phát triển chủng TBY 3406.6 .36 Hình 3.4 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới khả tích l y erythritol chủng TBY 3406.6 37 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn tốc độ sinh trƣởng phụ thuộc vào pH 38 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng tốc độ khuấy lắc đến khả sinh tổng hợp erythritol 39 Hình 3.7 Biểu đồ thể tốc độ sinh trƣởng phụ thuộc vào thời gian lên men .40 Hình 3.8 Hình ảnh đƣờng erythritol kết tinh nồng độ khác khoảng thời gian 16 44 Hình 3.9 Quá trình kết tinh lƣợng mầm tinh thể bổ sung thay đổi 45 Hình 3.10 Đồ thị mối liên hệ lƣợng mầm tinh thể hiệu suất kết tinh 45 Hình 3.11 Đồ thị ảnh hƣởng nhiệt độ kết tinh đến hiệu suất kết tinh đƣờng 46 Hình 3.12 Quá trình kết tinh đƣờng theo thời gian 47 Hình 3.13 Sơ đồ quy trình sản xuất erythritol quy mô phòng thí nghiệm .50 Khóa 2014 - 2016 Footer Page of 126 vi Header Page Luận 10 of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao Hình 3.14 Quá trình lên men thu dịch len men sử dụng chủng 3406.6 51 Hình 3.15 Dịch lên men trƣớc sau ly tâm 52 Hình 3.16 Dịch lên men đƣợc lọc qua than hoạt tính chất trợ lọc 52 Hình 3.17 Quá trình kết tinh đƣờng erythritol 53 Hình 3.18 Đƣờng đƣợc rửa sau kết tinh 53 Hình 3.19 Sản phẩm đƣờng erythritol 53 Hình 3.20 Quy trình sản xuất viên nén đƣờng erythritol 56 Hình 3.21 Các ví viên nén đƣờng erythritol 57 Hình 3.22 Quy trình sản xuất nƣớc uống dâu tằm erythritol 58 Hình 3.23 Sản phẩm thử nghiệm nƣớc dâu tằm có chứa thành phần erythritol 59 Khóa 2014 - 2016 Footer Page 10 of 126 vii Header Page Luận 15 of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao xúc tác nike [31] Phƣơng pháp sản xuất này không đƣợc đƣa sản xuất quy mô công nghiệp hiệu thấp Ngày nay, tổng hợp erythritol từ vi sinh vật đƣợc nghiên cứu và phát triển mạnh Erythriyol là polyol đƣợc sản xuất hoàn toàn quy trình công nghệ sinh học một số nhóm nấm men, đặc biệt là nhóm ƣa thẩm thấu có khả tích l y đƣờng này hàm lƣợng lớn Đa số là đƣợc tổng hợp từ nấm men nhƣ: Pichia, Cadida, Torulopsis, Trigonopsis, Moniliella, Aureobasidium Trichosporon spp Tuy khác vi sinh vật sử dụng nhƣng phƣơng pháp sử dụng nguyên liệu là loại ng cốc, quy trình sản xuất trải qua bƣớc sau:  Tách tinh bột từ ng cốc  Thủy phân tinh bột thành glucose enzym thủy phân  Lên men glucose nhờ vi sinh vật  Lọc, tinh chế, kết tinh, làm khô sản phẩm Ngày việc ứng dụng trình lên men sản xuất loại đƣờng đƣợc sử dụng rộng rãi là trình đơn giản cần vài bƣớc và tốn chất ban đầu thấp, chi phí sản xuất thấp Quá trình sản xuất công nghiệp erythriol dựa trình lên men tự nhiên, sử dụng nấm Moniliella pollinis Nấm men M.pollinis lần đƣợc phân lập từ phấn hoa tƣơi tìm thấy một tổ ong, sau dƣới điều kiện có sẵn sinh vật này sản sinh đƣờng erythritol mức tƣơng đối cao Các nguyên liệu ban đầu là dextrose sucrose hay tinh bột ngô đƣợc thủy phân enzym tạo glucose tiến hành lên men M.pollinis sau đƣợc tiến hành kết tinh, lọc, rửa và sấy khô thu nhận đƣợc erythritol có độ tinh khiết lên đến 99,5% Ngoài thu đƣợc hỗn hợp polyol chứa chủ yếu là erythritol, glycerol và ribitol Vi sinh vật là một yếu tố quan trọng góp phần định hiệu suất trình lên men Các vi sinh vật này biến đổi glucose thành erythritol nhờ enzym erythose reductase, là enzym hoạt động phụ thuộc vào NADPH Khóa 2014 - 2016 Footer Page 15 of 126 Header Page Luận 16 of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao 1.3 Tình hình sản xuất erythritol giới Việt Nam Hiện giới erythritol đƣợc sản xuất thƣơng mại quy mô công nghiệp sử dụng chủng Moniliella Công nghệ sản xuất erythritol sử dụng nấm men Moniliella khía cạnh khác đƣợc bảo vệ một loạt sáng chế công ty hóa chất và viện nghiên cứu Ví dụ nhƣ: USP (United States Patent) #8187847 (2012) công ty hóa chất Jungbunzlauer Austria AG (Aó) bảo hộ cho việc sử dụng môi trƣờng chứa nitrate cho lên men erythritol sử dụng Moniliella tomentosa (=Moniliella pollinis) [32] Tƣơng tự, công ty Nikken Chemicals Co., Ltd (Nhật) sở hữu USP#5916797 (1999), USP#6074857 (2000), USP#610715 (2000), USP#6214605 (2001); Mitsubishi Chemical Corporation (Nhật) sở hữu USP#5902739 (1999), USP#5981241 (1999) Các loài nấm Moniliella có khả lên men loại đƣờng đơn giản để sản xuất erythritol Sàng lọc và đột biến đƣợc sử dụng để xác định chủng cải tiến Moniliella có khả sản lƣợng sản xuất erythritol hiệu [24] Cho đến chƣa có một nhà máy hay cở sở sản xuất nào Việt Nam sản xuất erythritol Đƣờng erythritol phụ thuộc chủ yếu vào nguồn nhập nhu cầu sử dụng đƣờng thấp lƣợng ngày càng tăng Đƣờng erythritol đƣợc Bộ Y tế Việt Nam cho phép đƣợc sử dụng thực phẩm nhƣ chất tạo ngọt, chất ẩm, chất điều vị thông tƣ 27/2012/TT-BYT ngày 30/11/2012 Đƣờng erythritol có danh sách polyol đƣợc sử dụng để sản xuất bánh k o nhà máy, công ty sản xuất bánh k o Hải Hà, Hải Châu, Kinh Đô, Hữu Nghị, Bibica, Tràng An; đƣợc sử dụng nƣớc giải khát Tribeco, Hoàng Gia, Acecook, Ngoài ra, đƣờng erythritol đƣợc sử dụng dƣợc phẩm, thực phẩm chức năng, đồ ăn uống ăn kiêng cho bệnh nhân tiểu đƣờng Hiện giá đƣờng erythritol bán thị trƣờng Việt Nam là 150.000đ/400g Chính việc tìm một quy trình công nghệ phù hợp hiệu cao, chi phí rẻ để sản xuất erythritol là có ý nghĩa và cấp thiết Khóa 2014 - 2016 Footer Page 16 of 126 Header Page Luận 17 of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao 1.4 Nấm Moniliella 1.4.1 Đặc điểm nấm men Moniliella Vào khoảng cuối kỉ 19 ngƣời biết đến nấm men đen Moniliella là một nhóm phân loại không đồng nhất, thành tế bào có melanine và sinh sản phƣơng pháp nẩy chồi Nảy chồi là phƣơng pháp sinh sản phổ biến nấm men đen, ngoài nấm men có một số hình thức sinh sản khác nhƣ: sinh sản cách phân đôi, sinh sản bảo tử [2, 8] Nhƣng nấm men đen lại là một loại nấm khó để nhận biết hình thái, hình dạng nên hiểu biết loại nấm này chƣa đƣợc hoàn chỉnh [6] Điều tạo nên khác biệt nấm men đen và nhóm nấm men khác là chúng có melain thành tế bào làm cho khuẩn lạc có mầu vàng lục, mầu ô liu đến nâu sẫm, đen Ngoài nấm men đen chứa carotenoid mycosporines [1] Moniliella là nấm men đen có khuẩn lạc hình tròn hầu hết non có màu trắng già chuyển sang màu xám đen, đen oliu màu xám hay xanh xám Bề mặt khuẩn lạc nhẵn mƣợt [7] Hình 1.2 Hình ảnh khuẩn lạc nấm men Moniliella suavedens var suavedens nuôi cấy đĩa thạch [7] Khóa 2014 - 2016 Footer Page 17 of 126 Header Page Luận 18 of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao Hình 1.3 Hình ảnh sinh sản nảy chồi nấm men đen [2] Bảng 1.1 So sánh đặc điểm hình thái chi Moniliella với số chi thƣờng gặp bị nhầm lẫn với Monilliela [4] Đặc điểm hình thái Chi Moniliella Phân bố Khuẩn lạc mịn, sau xù, thƣờng từ Phân bố nơi có màu trắng chuyển dần sang màu xanh, nhiều dầu mỡ xám, đen Sinh sản phƣơng thức nảy nới có áp suất thẩm thấu cao chồi phân đốt Thành tế bào dày, có nhƣ mật ong, phấn hoa sắc tố đen Geotrichum Khuẩn lạc màu trắng, bột lông xù giống Moniliella nhƣng khuẩn lạc không chuyển sang màu xám đen Chi sinh sản phân đốt, không nảy chồi Tế bào to và dài, khoảng xấp xỉ 10 Phân bố đất, nƣớc và không khí Trichosporon Khuẩn lạc màu kem, ƣớt khô, có không xù Tế bào bé mỏng Sinh sản nảy chồi phân đốt Kích thƣớc từ 5-10 µm Phân bố đất nơi nhiều dầu mỡ Candida Phân bố nhiều tự nhiên, thƣờng nơi có nồng Tế bào hình tròn hay elip Sinh sản vô tính độ đƣờng cao nhƣ mật mía, theo kiểu nảy chồi một số chi xuất nơi nhiều dầu mỡ nhƣ C sake, C haemulonii Khuẩn lạc ban đầu mầu trắng, sau chuyển sang mầu sẫm đen Đƣờng kính sợi Aureobasidium nấm từ 2-10 µm Sinh sản theo phƣơng thức nảy chồi Khóa 2014 - 2016 Footer Page 18 of 126 Phân bố đất, xác thực vật, Header Page Luận 19 of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao Ngoại trừ M fonsecae, loài Moniliella đặc biệt Basidiomycota với khả lên men và ƣa áp suất thẩm thấu cao Thành tế bào Moniliella có cấu trúc đa lớp, không chứa xylose và fructose Vách ngăn liên bào chứa dolipore với khe liên thông h p [25] Moniliella phản ứng dƣơng tích với Diazonium blue Tất loài có khả đồng hóa nitrat và sản sinh urease 1.4.2 Ưu điểm ứng dụng nấm men đen Moniliella sản xuất erythritol Đối với công nghệ lên men yếu tố chủng giống, nguồn gen là yêu tố quan trọng ảnh hƣởng đến sản lƣợng sản phẩm sản xuất với quy mô lớn Trong tự nhiên có nhiều vi sinh vật có khả sản xuất erythritol từ glucose, ví dụ nhƣ là: nấm men đen Moniliella, Pichia, Candida, Torulopsis, Trigonopsis, Auriobasidium, Delbaryomyces, Aspergillus, Eurotium, Fennellia, and Yarrowia [20, 23] Hiện giới nhà khoa học sử dụng một vài chủng phổ biến để lên men, sản xuất erythritol nhƣ là: Yarrowia lipolytica, Trichosporonoides madida DS 91, Moniliella pollinis… Yarrowia lipolytica có khả sinh một vài loại polyol nhƣ là erythritol, glycerol và một vài loại axit hữu nhƣ là axit xitric Để sản xuất erythritol nhóm nhà nghiên cứu Gholam Reza Ghezelbash, Iraj Nahvi, Mohammad Rabbani đến từ Iran sử dụng chủng Y lipolytica DSM70562 đƣợc lựa chọn từ bộ sƣu tập giống DSMZ [16] Chủng đƣợc lựa chọn nuôi cấy môi trƣờng bao gồm 200 g/l glucose, 10 g/l cao nấm men, 10 mg/l MnSO4.4H2O mg/l CuSO4.5H2O thời gian lên men là 48 điều kiện nhiệt độ là 30oC Theo kết nghiên cứu điều kiện nuôi cấy chủng Y lipolytica DSM70562 cho hiệu suất chuyển hóa đƣờng thành erythrtitol lên đến 60 % tổng số toàn bộ polyol đƣợc tạo thành [16] Trichosporonoides madida c ng đƣợc biết đến là một loài có hiệu suất cao công nghiệp sản xuất erythritol Thậm chí một chủng thuộc loài Trichosporonoides madida đƣợc đề cập đến sáng chế tác giả Jin Byung Park, USA Patent No US6060291 A, 2000 [28] Khóa 2014 - 2016 Footer Page 19 of 126 Header Page Luận 20 of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao Moniliella là nhóm đối tƣợng đƣợc đặc biệt quan tâm hiệu suất chuyển hóa đƣờng để tạo erythritol tƣơng đối cao, là nhóm vi sinh vật có nhiều đặc điểm có lợi sử dụng quy mô công nghiệp nhƣ là khả chịu áp suất thẩm thấu cao, ƣa lipit, khả chịu nồng độ đƣờng cao….Nổi bật chi Moniliella loài Moniliella pollinis, đƣợc sử dụng nhiều nƣớc giới nhƣ Mỹ, Đức, Nga để sản xuất erythritol quy mô công nghiệp [12] Từ khía cạnh công nghệ, nấm men Moniliella có nhiều ƣu điểm nhƣ khả sinh sản nhanh điều kiện hiếu khí, phát triển dạng đơn bào môi trƣờng lỏng, phù hợp với công nghệ lên men chìm phổ biến Ngoài ra, Moniliella có khả phát triển điều kiện áp suất thẩm thấu cao tƣơng đƣơng với nồng độ glucose lên đến 60 % Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng sản xuất thƣơng mại cần nâng cao nồng độ chất và sản phẩm Tính ƣa áp suất thẩm thấu c ng góp phần giảm thiểu tạp nhiễm trình lên men So với nấm men khác c ng nhƣ vi khuẩn, tế bào nấm men Moniliela có kích thƣớc lớn, thuận lợi cho công nghệ thu hồi sản phẩm (lọc và ly tâm) Ngoài ra, môi trƣờng chất rắn, Moniliella phát triển dạng sợi, thích hợp với công nghệ sản xuất lên men bề mặt [36] 1.4.3 Con đường sinh tổng hợp đường erythritol nấm men Nấm men đen Moniliella sinh tổng hợp đƣờng erythritol c ng nhƣ sản phẩm khác đƣờng phổ biến loại nấm men c ng nhƣ loại vi sinh vật có nhân điển hình là đƣờng – Pentose phosphat (hay gọi là đƣờng hexo-monophosphate) Đây là đặc điểm hoàn toàn khác biệt so với khả tích l y đƣờng erythrtitol từ vi khuẩn (hình 1.6) [26] Con đƣờng sản xuất erythrytol từ vi khuẩn bắt đầu là trình oxy hóa khử glucose 6-phosphate để hình thành fructose 6-phosphate Tiếp sau là phản ứng phân cắt fructose-6-phosphate thành acetyl phosphate erythrose-4-phosphate nhờ phosphoketolase có acid heterolactic vi khuẩn Dƣới tác dụng enzym phophatease thủy phân erythritol-4- phosphate để hình thành erythritol Khóa 2014 - 2016 Footer Page 20 of 126 10 Header Page Luận 21 of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao Khác với vi khuẩn, nấm men trực tiếp sử dụng glucose-6-photphat mà không cần thông qua trình oxy hóa để hình thành fructose-6-photphate Thông qua đƣờng Pentose photphate để hình thành erythrose-4-photphate dƣới tác dụng enzym erythrose-4-phosphatekinase tạo erythrose, nhờ có enzym erythrose reductase tổng hợp nên erythitol và đồng thời giải phóng lƣợng dƣới dạng NADP và NADPH [17] Con đƣờng pentose - phosphate Hình 1.4 Quá trình sinh tổng hợp erythritol nấm men vi khuẩn [26] - EPDH: Erythritol-4-dehydrogenase phosphate - 1,3- 1,3 BPG: diphoglycerate - PG: phosphoglycerate, Pentaketide - PK: phosphoketolase đƣờng cho melanin biosynthesis - E4PK: erythrose-4-phosphatekinase nấm - Pi: phosphate vô - CoA: coenzym A - PTase: phosphatase - TCA: acid tricarboxylic - ER: erythrose reductase - 4HNR: tetrahydroxynaphthalene - G-6-P: glucose - 6-phosphate reductase - F-6-P: fructose - 6-phosphate - 2-HJ: 2-hydroxyjuglone - F-1,6-P: fructose-1,6-diphosphate - THN: trihydroxynaphthalene - GA-3-P: glyc-eraldehyde 3-phosphate - DHN: dihydroxynaphthalene reductase erythrose Khóa 2014 - 2016 Footer Page 21 of 126 11 Header Page Luận 22 of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao Hình 1.5 Tác động enzym chuyển hóa Transketolase Transaldoase đƣờng pentose – phosphate [26] Kết chung là phân tử glucose-6-phosphate đƣợc chuyển thành fructose6- phosphate, glyceraldehyde-3-phosphate và phân tử CO2 theo phƣơng trình sau [3] glucose-6-phosphate + 6NADP+ + 3H2O → fructose-6-phosphate + glyceraldehyde-3-phosphate + 3CO2 + N ADPH + 6H+ Những nấm men chịu áp suất thẩm thấu cao tích l y chất hoà tan tƣơng thích gặp phải muối áp suất thẩm thấu Chất tan tƣơng thích bảo vệ và ổn định enzym, cho phép chức tế bào điều kiện thẩm thấu Khóa 2014 - 2016 Footer Page 22 of 126 12 Header Page Luận 23 of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao Hình 1.6 Con đƣờng pentose phosphate chuyển hóa đƣờng glucose thành đƣờng erythritol [26] Khóa 2014 - 2016 Footer Page 23 of 126 13 Header Page Luận 24 of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Con đƣờng Nguyễn Thị Ánh Thao pentosephotphate đƣợc gọi là đƣờng hexozomonophotphate có trình oxi hoá estemonophotphate glucose Con đƣờng pentose photphate là một trình biến đổi hiếu khí, phản ứng trùng với phản ứng đƣờng phân Sự phân biệt hai đƣờng bắt đầu sau tạo thành glucose-6- photphate: Glucose — > Glucose-6-photphate — > Con đƣờng đƣờng phân Quá trình pentose photphate có ý nghĩa quan trọng Nó là nguồn chủ yếu tạo pentose cần thiết cho tổng hợp axit nucleic và c ng là nguồn tạo ribose từ hình thành nên chất nhận CO2 quang hợp – ribulozosediphotphate Quá trình này tạo nhiều chất có số nguyên tử cacbon khác cần cho trình sinh tổng hợp khác nhƣ: đƣờng erythritol, glycerol, ribitol [12, 15] 1.5 Một số phƣơng pháp thu nhận erythritol dịch lên men Hỗn hợp polyol sau lên men chứa phần lớn là erythritol, glycerol, ribitol và một lƣợng nhỏ polyol khác [9] Trong dịch lên men chứa nhiều tế bào nấm men.Vì gia nhiệt để bất hoạt vi sinh vật và loại bỏ xác tế bào Erythritol dịch lên men đƣợc làm nhựa trao đổi ion, than hoạt tính, lọc qua máy siêu lọc và kết tinh, sấy khô Sản phẩm cuối là hạt màu trắng bột tƣơng tự nhƣ đƣờng Phương pháp lọc than hoạt tính Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để làm dịch lên men, độ dịch lên men định màu đƣờng thu đƣợc từ trình kết tinh đƣờng và đƣờng thành phẩm Than hoạt tính hấp thụ chất hữu tạo màu và hợp chất phenol Sử dụng than hoạt tính để loại màu là một phƣơng pháp hữu hiệu và có hiệu nhƣng vấn đề đặt là thân erythritol c ng bị hấp thụ than hoạt tính việc tìm tỷ lệ than hấp phụ phù hợp và thời gian hấp phụ là một yếu tố quan trọng, ngoài việc hấp phụ nhiệt độ cao c ng là một Khóa 2014 - 2016 Footer Page 24 of 126 14 Header Page Luận 25 of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao giải pháp giúp trình hấp phụ diễn nhanh và hiệu quả, giảm thiểu trình hấp phụ đƣờng erythritol Phương pháp trao đổi ion Phƣơng pháp này cho phép thu hồi chất có giá trị với độ làm nƣớc cao, áp dụng vào thu dịch đƣờng sau lên men là tốt Trao đổi anion và cation đƣợc sử dụng để loại thành phần muối khoáng có dịch lên men Phương pháp kết tinh Kết tinh là trình tách chất rắn hòa tan dung dịch dựa chuyển đổi trạng thái chất tan từ hòa tan sang bão hòa Quá trình kết tinh đƣờng diễn giai đoạn:  Giai đoạn 1: Hình thành nhân tinh thể Các nhân tinh thể đƣờng khuếch tán dung dịch tập hợp lại và phân bố lên mạng tinh thể Giai đoạn diễn nhanh  Giai đoạn 2: Nhân tinh thể phát triển Các phân tử đƣờng dạng tan dung dịch khuếch tán lên bề mặt nhân tinh thể làm cho nhân tinh thể lớn lên Giai đoạn diễn chậm, tốc độ kết tinh tính theo giai đoạn Trạng thái bão hòa đƣờng chia thành vùng với đặc tính sau:  Vùng ổn định Nếu dung dịch có sẵn tinh thể tinh thể lớn dần lên không xuất tinh thể  Vùng trung gian Nếu dung dịch có sẵn tinh thể tinh thể lớn lên đồng thời xuất thêm tinh thể Nếu có dung dịch chƣa có sẵn tinh thể kích thích để dung dịch xuất tinh thể Một số cách kích thích: tác động học, hạ nhiệt độ đột ngột, tác động sóng siêu âm cho vào dung dịch một hạt đƣờng làm nhân tinh thể Khóa 2014 - 2016 Footer Page 25 of 126 15 Header Page Luận 26 of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao  Vùng biến động Tại vùng này tinh thể tự nhiên xuất liên tục đồng thời lớn lên nhƣng chậm  Giai đoạn 3: Nuôi tinh Dùng nguyên liệu để nuôi tinh thể lớn lên, vừa mở cô đặc dung dịch đƣờng non, vừa cho nguyên liệu vào Chú ý giữ v ng độ bão hòa để tránh tan hạt  Giai đoạn Sau tinh thể lớn lên đủ thích thƣớc, đạt yêu cầu ngƣời ta tiến hành cô đặc cuối, ngƣng cho nguyên liệu nhƣng tiếp tục mở cô đặc để độ bão hòa tăng dần từ từ và giảm từ từ để tránh độ bão hòa tăng đột ngột Cô đặc lên 90-98oBx kết thúc trinh kết tinh Khóa 2014 - 2016 Footer Page 26 of 126 16 Header Page Luận 27 of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao 13 De Cock P., Berchert C L (2002), “Erythritol Funtionality in noncaloric funtional beverages”, Pure and Applied Chemistry, 74 (7), pp 1281-1290 14 Den Hartog G J., Boots A W., Adam-Perrot A., Brouns F., Verkooijen I W., Weseler A R., Haenen G R., Bast A (2010), “Erythritol is a sweet antioxidant”, Nutrition, 26 (4), pp 449-458 15 Dooms L., Hennebert G L., Verachtert H (1971), “Polyols synthesis and taxonomic characters in the genus Moniliella” Antoni van Leeuwenhoek, 37 (1), pp 107-118 16 Gholam G., Iraj N., Mohammad R (2012), “Study of polyols production by Yarrowia lipolytica in Batch Culture and Optimization of growth condition for maximum production”, Jundishapur Journal of Microbiology, 5(4), pp 546-549 17 Greenley D., Smith D (1979), “A novel pathway of glucose catabolism in Thiobacillus novellus”, Archives of Microbiology, 122 (3), pp 257–261 18 Röper H H., Goossens J (1993), “Erythritol, a New Raw Material for Food and Non-food Applications” Starch, 45 (11), 400-405 19 Ishizuka H., Waka K., Kasumi T., Sasaki T (1989), “Breeding of a mutant of Aureobasidium sp with High erythritol production”, Jourmal of Fermentation and Bioengineering, 68 (5), pp 310-314 20 Jeya M., Lee K M., Tiwari M K., Kim J S., Gunasekaran P., Kim S Y., Kim I W., Lee J K (2009), “Isolation of a novel high erythritol-producing Pseudozyma tsukubaensis and scale-up of erythritol fermentation to industrial level”, Applied Microbiological Biotechnology, 83 (2), pp 225231 21 Kawanabe J., Hirasawa M., Takeuchi T., Oda T., Ikeda T (1992), “Noncariogenicity of erythritol as a substrate”, Caries Research, 26 (5), pp 258-362 22 Kim K A., Noh B S., Lee J K., Kim S Y., Park Y C., & Oh D K (2000), “Optimization of culture conditions for erythritol production by Torula sp”, Journal of Microbiology and Biotechnology, 10 (1), pp 69-74 23 Kohl E S., Leet T H., Lee D Y., Kim H J., Ryu Y W., Seo J H (2003), “Scale-up of erythritol production by an osmophilic mutant of Candida magnolia” Biotechnology Letters, 25 (24), pp 2103-2105 24 Laxman S S., Ramchandra V G., Bhalchandra K V., Karthik N (2011), “Strain improvement and statistical media optimization for enhanced erythritol production with minimal by-products from Candida magnoliase mutant R23” Biochemical Engineering Journal, 55 (2), pp 92-100 Khóa 2014 - 2016 Footer Page 27 of 126 62 Header Page Luận 28 of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao 25 Martinez A T., de Hoog G S., Smith M T (1979), “Physiological characteristics of Moniliella, Trichosporonoides and Hyalodendron” Studies in Mycology, 19, pp 58-68 26 Moon H J., Kim I W., Lee J K (2010), “Biotechnological production of erythritol and its applications”, Applied Microbiology and Biotechnology, 86 (4), pp 1017-1025 27 Ohmori S., Ohno Y., Makino T., Kashihara T (2004), “Characteristics of erythritol and formulation of a novel coating with erythritol termed thinlayer sugarless coating”, Int J Pharm, 278(2), pp 447-457 28 Park J B., Seo B C., Kom J R (2000), “Fermentation process for preparing erythritol using Trichosporonoides madida DS 911”, USA Patent No US6060291 A 29 Park J., Seo B., Kim J (1998), “Production of erythritol in fed-batch culture of Trichosporon sp”, J Ferment Bioenginieering, 86 (6), pp 577-580 30 Perko R., De Cock P (2007), Sweeteners and sugar Alternatives in Food Technology, Blackwell Publishing Ltd, Oxford, London 31 Pfeifer V F., Sohns V E., Conway H F., Lancaster E B., Dabic S., Griffin E (1960), “Two Stage Process for: Dialdehyde Starch Using Electrolytic Regenaration of Periodic Acid” Industrial & Engineering Chemistry, 52 (3), pp 201-206 32 Robert E., & Stefan T (2012), “Process for producing erythritol using Moniliella tomentosa strains in the presence of neutral inorganic nitrates, such as potassium nitrate, ammonium nitrate or sodium nitrate, as nitrogen source”, United State Patent No 8187847 B2 33 Sasaki S T., Miki Y., Eguchi T., Hagiwara K., Ichikawa T (1988), “Dertermination of erythritol in fermented foods by high performance liquid chromatography”, Shokuhin Eiseigaku Zasshi, 6, pp 419-422 34 Shie-Jea L., Chiou-Yen W., Pei-Ming W., Jang-Cheng H (2010), “Highlevel production of erythritol by mytants of osmophilic Moniliella sp”, Process Biochemistry, 45 (6), pp 973-979 35 Shindou T., Sasaki Y., Euguchi K., Hagiwara K., Ichikawa T (1989), “Identification of erythritol by HPLC and GC-MS and quantitative measurement in pulps of various fruit”, Agric Food Chem, 37 (6), pp 1474-1476 Khóa 2014 - 2016 Footer Page 28 of 126 63 Header Page Luận 29 of 126 văn Thạc sĩ Khoa học Nguyễn Thị Ánh Thao 36 Thanh V N., Hai D A., Hien D D., Takashima M., Lachance M A (2012), “Moniliella carnis sp.nov and Moniliella dehoogii sp nov, two novel species of black yeast isolated from meat processing environment”, Int J Syst Evol Microbiol, 62 (Pt12), pp 3088-3094 37 Yoshida H., Hayashi J., Sugahara T (1986), “Studies on free sugar, free sugar alcohols and organic acids of wild mushroom”, J Japan SocFood Sci Technol (Japan), 33 (6), pp 426-433 Khóa 2014 - 2016 Footer Page 29 of 126 64 ... Tình hình sản xuất erythritol giới Việt Nam Hiện giới erythritol đƣợc sản xuất thƣơng mại quy mô công nghiệp sử dụng chủng Moniliella Công nghệ sản xuất erythritol sử dụng nấm men Moniliella. .. hồi, sản xuất Việt Nam loại đƣờng này Xuất phát từ lý thực đề tài : Nghiên cứu sản xuất đƣờng erythritol từ nấm men Moniliella phân lập Việt Nam nhằm Khóa 2014 - 2016 Footer Page 11 of 126... ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thị Ánh Thao NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT ĐƢỜNG ERYTHRITOL TỪ NẤM MEN MONILIELLA PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114