PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG β – AGONIST (CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL) TRONG THỊT HEO

PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG β – AGONIST (CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL) TRONG THỊT HEO Nhóm 05 : Phù Thùy Dương 15139025 Đặng Kì Duyên 15139027 Chung Hữu Nghĩa 15139079 Nguyễn Thị Mỹ Duyên 15139028 GVHD: Phùng Võ Cẩm Hồng A MỞ ĐẦU: Lí chọn đề tài: • Trong lĩnh vực dược phẩm, β-agonist nhóm chất sử dụng nhiều điều trị bệnh hen suyễn, hai chất điển hình salbutamol clenbuterol Salbutamol dùng cho người với tên biệt dược albuterol, salbutamol… Clenbuterol dùng với tên biệt dược broncodil, clenburol, ventolax, protovent • Trong chăn nuôi, dược liệu có lúc đưa vào thức ăn gia súc nhằm làm giảm lớp mỡ da, tăng cơ, tăng trọng thú vật nuôi Theo nhiều nghiên cứu, loại dược liệu gây hại cho gia súc cho người ăn phải thịt thú vật nuôi loại thức ăn có trộn loại dược liệu trên, hóa chất thuộc nhóm β-agonist thường chất kích thích mạnh, làm suy nhược chức gan Lí chọn đề tài: • Tại Châu Âu Châu Mỹ, loại hóa chất bị cấm sử dụng Ở Việt Nam, loại dược liệu thuộc nhóm β-agonist có clenbuterol salbutamol xếp vào danh mục 18 hóa chất bị cấm Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn Tuy nhiên, chất bị phận người dân sử dụng chăn nuôi việc kiểm tra diện chúng thức ăn gia súc Việc định lượng xác dư lượng β-agonist thức ăn chăn nuôi vấn đề cần quan tâm công tác kiểm tra chất lượng sản phẩm • Xuất phát từ tình hình thực tế, sở khoa học công trình nghiên cứu Salbutamol (Sal) Clenbuterol (Clen) công bố nước, thực đề tài “ Đánh giá hàm lượng chất β-agonists (clenbuterol salbutamol) thức ăn gia súc dư lượng thịt gia súc kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ” Nghiên cứu góp phần vào việc bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng Lí chọn đề tài: Mục đích nghiên cứu: • Đề tài thực với mong muốn: • • Xây dựng phương pháp phân tích dư lượng clen sal thức ăn chăn nuôi, thịt gia súc, gia cầm kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ đạt độ nhạy độ chọn lọc cao, đáp ứng nhu cầu phân tích đơn vị kiểm nghiệm nước • • Theo dõi mức độ tồn lưu Clen Sal thực phẩm gà, heo nuôi gà, heo với thức ăn có chứa Clen Sal Đối tượng phạm vi nghiên cứu: a Mẫu thịt heo: nuôi thử nghiệm với thức ăn có chứa nồng độ định Clen Sal để kiểm tra khả tồn lưu hai chất nầy b Mẫu thịt dùng cho điều tra: lấy từ chợ đầu mối địa bàn Tp Hồ Chí Minh, nơi phân bố nguồn thịt chủ yếu khắp quận thành phố c Thiết bị phân tích: Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực LC/MS/MS TSQ Quantum Access Thermo Scientific (Công ty dịch vụ KHCN Sắc ký Hải Đăng – Thành phố Hồ Chí Minh) Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ tứ cực LC/MS 2010A Shimadzu (Công ty dịch vụ KHCN Sắc ký Hải Đăng – Thành phố Hồ Chí Minh) Phương pháp nghiên cứu: • Xây dựng phương pháp chuẩn bị mẫu để tách chiết làm giàu chất phân tích (Clenbuterol Salbutamol) trước đưa vào máy sắc ký lỏng ghép khối phổ • Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực để xác định khả tồn dư Clen Sal thịt heo B NỘI DUNG: Tổng quan Clenbutarol Salbutamol Các phương pháp phân tích dư lượng salbutamol clenbutarol thịt heo: Xác định dư lượng β2-Agonist thịt heo phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ Tổng quan Clenbutarol Salbutamol: 1.1 Khái quát họ β- agonist: -Trong lĩnh vực dược phẩm, β_agonist nhóm chất sử dụng nhiều điều trị bệnh hen suyễn, hai chất điển hình Clenbuterol Salbutamol - Trong chăn nuôi, dược liệu có lúc đưa vào thức ăn gia súc nhằm giảm lớp mỡ da, tăng cơ, tăng trọng thú vật nuôi Theo nhiều nghiên cứu, loại dược liệu gây hại cho gia súc cho người ăn phải thịt thú vật nuôi loại thức ăn có trộn loại dược liệu trên, hoá chất thuộc nhóm β_agonist thường chất kích thích mạnh, làm suy nhược chức gan • Tại Châu Âu Châu Mỹ, loại hoá chất bị cấm sử dụng Ở Việt Nam, loại dược liệu thuộc nhóm β_agonist có Clenbuterol Salbutamol xếp vào danh mục 18 hoá chất bị cấm Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn 3.6 Chuẩn bị mẫu: • Cắt thịt thành miếng nhỏ, đồng hóa mẫu cách cho mẫu qua máy xay thịt hai lần trộn Chuyển mẫu đồng sang dụng cụ đựng mẫu, đậy nắp kín lưu trữ nhiệt độ -10°C Khi thực phân tích, phải đưa mẫu nhiệt độ phòng 3.6.1 Chuẩn bị mẫu thử Cân 5,0 g mẫu đồng vào ống ly tâm 50 ml Cho vào 50 µl dung dịch hỗn hợp chuẩn nội làm việc IS1 50 ng / ml (3.3.18.9) 3.6.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng mẫu thịt heo, thịt bò xác định không nhiễm Clenbuterol, Salbutamol Ractopamin.HCl Mẫu trắng chuẩn bị mẫu thử 3.6 Chuẩn bị mẫu • 3.6.3 Chuẩn bị mẫu kiểm soát Mẫu kiểm soát chuẩn bị từ mẫu trắng mẫu thử có bổ sung thêm 50 µL dung dịch chuẩn hỗn hợp S2 vào mẫu Trộn máy lắc, sau để yên 15 phút trước tiến hành bước • 3.6.4 Chuẩn bị mẫu xây dựng đường chuẩn Đường chuẩn xây dựng dựa mẫu trắng Cân mẫu mẫu 5,0 g đồng vào ống ly tâm 50 ml, bổ sung 50 µl dung dịch hỗn hợp chuẩn nội làm việc IS1 50 ng / ml (3.3.18.9) vào ống nghiệm chứa mẫu trắng Tiến hành trộn máy lắc 15 giây, sau để yên 15 phút trước tiến hành bước 3.7 Tiến hành thử nghiệm: 3.7.1 Chiết mẫu làm mẫu • Cho ml axetonitril (3.3.7) 1ml isopropanol (3.3.10) vào ống nghiệm chứa mẫu trắng, mẫu kiểm soát, mẫu thử mẫu trắng dùng để dựng đường chuẩn Trộn máy lắc phút Tiếp theo, thêm vào ống 1,2 g NaCl (3.3.12), lắc mạnh phút, sau tiếp tục thêm vào ống g Na2SO4 0,5 g MgSO4, lắc phút máy lắc Sau lắc mẫu, ly tâm phút tốc độ 4000 vòng / phút Dùng pipet, chuyển ml lớp sang ống nghiệm thuỷ tinh Sau cho bay bay N2 (3.4.9) đến khô nhiệt độ 40°C • Sau bay đến khô Đối với mẫu trắng, mẫu kiểm soát mẫu thử hoà tan ml dung dịch 10% ACN nước (3.3.20) Đối với mẫu trắng dùng để dựng đường chuẩn, thêm chuẩn theo thể tích bảng 1, lắc khoảng 30 giây máy lắc Tiếp theo, thêm ml n-hexan Trộn máy lắc trong 10 giây , ly tâm phút 4000 vòng / phút Sau loại bỏ lớp Hút lớp lọc qua màng lọc vào lọ đựng mẫu Dung dịch sẵn sàng để phân tích thiết bị LC-MS/MS 3.7 Tiến hành thử nghiệm Bảng - Xây dựng đường chuẩn (*): Dung dịch dùng định mức: dung dịch 10% ACN nước LƯU Ý: Nếu mẫu nhiều béo, cho n-hexan vào lắc mạnh dung dịch tạo huyền phù khó tách lớp Nên lắc vừa phải tiến hành loại béo lần thứ cần STT Nồng độ chuẩn (ng/ml) CLEN SAL RAC.HCl Thể tích Thể tích Nồng độ dung dung dịch định dịch nội chuẩn chuẩn hỗn mức(*) IS, CLEN D9; hợp S3 sử (µl) SAL D3 RAC D6 (ng / ml) dụng (µl) Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu 0,1 0,2 0,4 0,8 1,6 2,5 10 20 40 10 20 40 80 0 10 20 40 80 50 0 0 1000 1000 1000 1000 1000 1000 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 3.7 Tiến hành thử nghiệm • 3.7.2 Tiến hành thử nghiệm LC-MS-MS • 3.7.2.1 Điều kiện HPLC • - Cột sắc ký Hypersil GOLD C18, đường kính là 2,1 mm, kích thước hạt nhồi là 1,9 µm, độ dài của cột là 100 mm; • - Nhiệt độ cột: 40°C; • - Thể tích tiêm mẫu: 10 μl; • - Thời gian phân tích: phút; • - Tốc độ dòng: 0,2 ml / phút; • - Pha động: chương trình gradient thể theo bảng 2: 3.7 Tiến hành thí nghiệm Bảng - Chương trình pha động Thời gian Tốc độ dòng Pha động A Pha động B (phút) Initial 0,5 1,0 4,0 4,2 6,0 (mL / phút) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 (%) 5 20 80 5 (%) 95 95 80 20 95 95 3.7 Tiến hành thử nghiệm 3.7.2 Điều kiện MS • Điều kiện MS sau: • Kiểu ion hóa: ESI (+) • Nhiệt độ nguồn ion hóa: 150°C • Nhiệt độ hóa dung môi: 400°C • Tốc độ dòng khí làm bay dung môi: 800 l / h • Tốc độ dòng khí qua Cone Gas: 30 l / h 3.7 Tiến hành thử nghiệm Các điều kiện phân ly MS-MS sau: Bảng - Điều kiện phân ly MS-MS GHI CHÚ: ion có kí hiệu (*) ion dùng để định lượng Tên hợp chất Clenbuterol Clenbuterol D9 Salbutamol Salbutamol D3 Ractopamin.HCl Ion Mẹ Ion Con (m/z) (m/z) 276,97 286,03 240,10 243,03 302,10 167,89 202,94* 168,80 203,90* 148,01 222,01* 151,01 255,10* 121,01 Năng lượng Năng lượng (Sample Cone) va chạm (V) (eV) 28 18 18 16 18 20 14 30 16 18 10 18 10 28 3.7 Tiến hành thử nghiệm: 3.7.3 Trình tự bơm mẫu 3.7.3.1 Bơm dung môi kiểm tra máy: dung dịch 10% ACN nước 3.7.3.2 Bơm dung dịch lập đường chuẩn; 3.7.3.3 Bơm mẫu trắng; 3.7.3.4 Bơm mẫu kiểm soát; 3.7.3.5 Bơm mẫu thử 3.8 Tính toán biểu thị kết quả: • 3.8.1 Tính hệ số tín hiệu • Tính cho chất cần phân tích theo phương trình: • Trong đó: RF: hệ số tín hiệu; Area: diện tích pic ion định lượng chất cần phân tích; ISConc: nồng độ ion định lượng nội chuẩn; ISArea: diện tích pic ion định lượng nội chuẩn 3.8 Tính toán biểu thị kết quả: 3.8.2 Xây dựng đường chuẩn • Xây dựng phương trình bậc hệ số tín hiệu với nồng độ chất chuẩn bổ sung vào mẫu chuẩn bị mẫu theo mục 3.3.6.4 • Phương trình có dạng: RF = ax + b Trong đó: RF: hệ số tín hiệu x: nồng độ chất chuẩn thêm vào mẫu(3.3.6.4) điểm cắt của đường chuẩn với trục tung; a: hệ số góc đường chuẩn • Phương trình đạt yêu cầu hệ số hồi quy: ≤ R2 ≤ 0.99 3.8 Tính toán biểu thị kết quả: 3.8.3 Hàm lượng chất phân tích mẫu: Dư lượng chất cần phân tích mẫu tính theo phương pháp đường chuẩn xây dựng theo mục 3.8.2 Nồng độ mẫu phân tích tính theo công thức sau: Trong đó: C: nồng độ Agonist có mẫu, tính μg / kg; Cx: nồng độ Agonist đo suy từ đường chuẩn, μg / l; V1: thể tích ban đầu mà chất phân tích có mặt (5 ml), tính ml; V2: thể tích dịch trích mang phân tích (1ml), tính ml; V3: thể tích định mức cuối (1ml), tính ml; F: hệ số pha loãng mẫu đo (nếu không pha loãng, F = 1); a: khối lượng mẫu thử, tính gam (g) Kết biểu thị đơn vị μg / kg (ppb), hai số sau dấu phẩy C Kết Luận • Chất tăng trưởng β2-Agonist chất gây nguy hiểm cho sức khỏe người, khiến thể bị nhiễm độc, gây rối loạn tiêu hóa, tuần hoàn, chí ảnh hưởng đến tính mạng • Việc sử dụng Salbutamol Clenbutarol chăn nuôi thực trạng đáng báo động, cần quan tâm nhiều có biện pháp chế tài thích đáng hành vi cá nhân, tổ chức gây hại sức khỏe công đồng hợp chất cấm salbutamol clenbutamol chăn nuôi gia súc • Vấn đề phân tích dư lượng β2-Agonist thịt heo cần thiết hữu ích Phương pháp sắc kí lỏng ghép khối phổ phương pháp hiệu quả, độ nhạy cao, độ xác cao Phương pháp phân tích hàm lượng siêu vết (ppm/ppb/ppt) ... phân tích dư lượng salbutamol clenbutarol thịt heo: Xác định dư lượng β2 -Agonist thịt heo phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ 1 Tổng quan Clenbutarol Salbutamol: 1.1 Khái quát họ β- ... các ion và phân tử trung tính khỏi bộ phân tích khối 2.2.3 Ứng dụng hệ thống Agilent 6410 Triple quad LC/MS/MS • Phân tích tiêu hàm lượng siêu vết (ppb/ppt); • Phân tích dư lượng loại... thực đề tài “ Đánh giá hàm lượng chất β- agonists (clenbuterol salbutamol) thức ăn gia súc dư lượng thịt gia súc kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ” Nghiên cứu góp phần vào việc bảo đảm vệ sinh