PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG B2 – AGONIST (CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL) TRONG THỊT HEO

A. MỞ ĐẦU: 1. Lí do chọn đề tài: Trong lĩnh vực dược phẩm, βagonist là nhóm chất được sử dụng nhiều trong điều trị bệnh hen suyễn, hai chất điển hình là salbutamol và clenbuterol . Salbutamol được dùng cho người với tên biệt dược là albuterol, salbutamol… Clenbuterol được dùng với tên biệt dược là broncodil, clenburol, ventolax, protovent. (Theo tài liệu trên trang web http:en.wikipedia.orgwikiSalbutamol) Trong chăn nuôi, các dược liệu này đã có lúc được đưa vào trong thức ăn gia súc nhằm làm giảm lớp mỡ dưới da, tăng cơ, tăng trọng đối với thú vật nuôi. Theo nhiều nghiên cứu, các loại dược liệu này gây hại cho gia súc và cả cho người nếu ăn phải thịt thú vật nuôi bằng loại thức ăn có trộn các loại dược liệu trên, vì các hóa chất thuộc nhóm βagonist thường là những chất kích thích mạnh, làm suy nhược chức năng gan. Tại Châu Âu và Châu Mỹ, những loại hóa chất trên bị cấm sử dụng. Ở Việt Nam, các loại dược liệu thuộc nhóm βagonist trong đó có clenbuterol và salbutamol được xếp vào danh mục 18 hóa chất bị cấm của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn (Quyết định số 54 ngày 20 tháng 06 năm 2002 của Bộ NN PTNT). Tuy nhiên, các chất này vẫn còn bị một bộ phận người dân lén sử dụng trong chăn nuôi và việc kiểm tra sự hiện diện của chúng trong thức ăn gia súc, gia cầm vào những năm 20052008 phần lớn chỉ dừng lại ở mức độ định tính và định lượng bằng ELISA với độ chính xác chưa cao. Việc định lượng chính xác dư lượng của các βagonist trong thức ăn chăn nuôi là vấn đề cần được quan tâm trong công tác kiểm tra chất lượng sản phẩm. Đồng thời, việc xác định tồn dư βagonist trong thịt một số gia súc là rất cần thiết về mặt quản lý để đánh giá tình hình mức độ sử dụng các chất này trong thức ăn chăn nuôi và đưa ra những cảnh báo về vệ sinh an toàn thực phẩm nếu có. Xuất phát từ tình hình thực tế, trên cơ sở khoa học của các công trình nghiên cứu về Salbutamol (Sal) và Clenbuterol (Clen) được công bố trong và ngoài nước, chúng tôi đã thực hiện đề tài “ Đánh giá hàm lượng các chất βagonists (clenbuterol và salbutamol) trong thức ăn gia súc và dư lượng trong thịt gia súc bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ”. Nghiên cứu này sẽ góp phần vào việc bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng. 2. Mục đích nghiên cứu: Đề tài này được thực hiện với mong muốn: • Xây dựng được phương pháp phân tích dư lượng clen và sal trong thức ăn chăn nuôi, thịt gia súc, gia cầm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ đạt độ nhạy và độ chọn lọc cao, đáp ứng được nhu cầu phân tích của các đơn vị kiểm nghiệm trong nước. • Theo dõi mức độ tồn lưu của Clen và Sal trong thực phẩm gà, heo khi nuôi gà, heo với thức ăn có chứa Clen và Sal. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: a. Mẫu thịt heo nuôi thử nghiệm với thức ăn có chứa nồng độ nhất định Clen và Sal để kiểm tra khả năng tồn lưu của hai chất nầy. b. Mẫu thịt dùng cho điều tra được lấy từ các chợ đầu mối trên địa bàn Tp Hồ Chí Minh, là nơi phân bố nguồn thịt chủ yếu đi khắp các quận trên thành phố. c. Thiết bị phân tích • Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực LCMSMS TSQ Quantum Access của Thermo Scientific (Công ty dịch vụ KHCN Sắc ký Hải Đăng – Thành phố Hồ Chí Minh). • Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ 1 tứ cực LCMS 2010A của Shimadzu (Công ty dịch vụ KHCN Sắc ký Hải Đăng – Thành phố Hồ Chí Minh). 4. Phương pháp nghiên cứu: • Xây dựng phương pháp chuẩn bị mẫu để tách chiết và làm giàu chất phân tích (Clenbuterol và Salbutamol) trước khi đưa vào máy sắc ký lỏng ghép khối phổ. • Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực để xác định khả năng tồn dư Clen và Sal trong thịt heo.   B. Nội dung: 1. Tổng quan về Clenbuterol và Salbutamol: 1.1 Khái quát về họ β_agonist: Trong lĩnh vực dược phẩm, β_agonist là nhóm chất được sử dụng nhiều trong điều trị bệnh hen suyễn, hai chất điển hình là Clenbuterol và Salbutamol Trong chăn nuôi, các dược liệu này đã có lúc được đưa vào trong thức ăn gia súc nhằm giảm lớp mỡ dưới da, tăng cơ, tăng trọng đối với thú vật nuôi. Theo nhiều nghiên cứu, các loại dược liệu này gây hại cho gia súc và cả cho người nếu ăn phải thịt thú vật nuôi bằng loại thức ăn có trộn các loại dược liệu trên, vì các hoá chất thuộc nhóm β_agonist thường là những chất kích thích mạnh, làm suy nhược chức năng gan.

Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ***** Tên đề tài: PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG B2 – AGONIST (CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL) TRONG THỊT HEO Nhóm thực hiện: Chung Hữu Nghĩa Đặng Kỳ Duyên Phù Thùy Dương Nguyễn Thị Mỹ Duyên 15139079 15139027 15139025 15139028 GVHD: Phùng Võ Cẩm Hồng Thành phố Hồ Chí Minh 2017 Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo A MỞ ĐẦU: Lí chọn đề tài: Trong lĩnh vực dược phẩm, β-agonist nhóm chất sử dụng nhiều điều trị bệnh hen suyễn, hai chất điển hình salbutamol clenbuterol Salbutamol dùng cho người với tên biệt dược albuterol, salbutamol… Clenbuterol dùng với tên biệt dược broncodil, clenburol, ventolax, protovent (Theo tài liệu trang web http://en.wikipedia.org/wiki/Salbutamol) Trong chăn nuôi, dược liệu có lúc đưa vào thức ăn gia súc nhằm làm giảm lớp mỡ da, tăng cơ, tăng trọng thú vật nuôi Theo nhiều nghiên cứu, loại dược liệu gây hại cho gia súc cho người ăn phải thịt thú vật ni loại thức ăn có trộn loại dược liệu trên, hóa chất thuộc nhóm β-agonist thường chất kích thích mạnh, làm suy nhược chức gan Tại Châu Âu Châu Mỹ, loại hóa chất bị cấm sử dụng Ở Việt Nam, loại dược liệu thuộc nhóm β-agonist có clenbuterol salbutamol xếp vào danh mục 18 hóa chất bị cấm Bộ Nơng Nghiệp Phát Triển Nông Thôn (Quyết định số 54 ngày 20 tháng 06 năm 2002 Bộ NN & PTNT) Tuy nhiên, chất bị phận người dân sử dụng chăn nuôi việc kiểm tra diện chúng thức ăn gia súc, gia cầm vào năm 2005-2008 phần lớn dừng lại mức độ định tính định lượng ELISA với độ xác chưa cao Việc định lượng xác dư lượng β-agonist thức ăn chăn nuôi vấn đề cần quan tâm công tác kiểm tra chất lượng sản phẩm Đồng thời, việc xác định tồn dư β-agonist thịt số gia súc cần thiết mặt quản lý để đánh giá tình hình mức độ sử dụng chất thức ăn chăn nuôi đưa cảnh báo vệ sinh an tồn thực phẩm có Xuất phát từ tình hình thực tế, sở khoa học cơng trình nghiên cứu Salbutamol (Sal) Clenbuterol (Clen) cơng bố ngồi nước, chúng tơi thực đề tài “ Đánh giá hàm lượng chất β-agonists (clenbuterol salbutamol) thức ăn gia súc dư lượng thịt gia súc kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ” Nghiên cứu góp phần vào việc bảo đảm vệ sinh an tồn thực phẩm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo Mục đích nghiên cứu: Đề tài thực với mong muốn: • Xây dựng phương pháp phân tích dư lượng clen sal thức ăn chăn nuôi, thịt gia súc, gia cầm kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ đạt độ nhạy độ chọn lọc cao, đáp ứng nhu cầu phân tích đơn vị kiểm nghiệm nước • Theo dõi mức độ tồn lưu Clen Sal thực phẩm gà, heo ni gà, heo với thức ăn có chứa Clen Sal Đối tượng phạm vi nghiên cứu: a Mẫu thịt heo ni thử nghiệm với thức ăn có chứa nồng độ định Clen Sal để kiểm tra khả tồn lưu hai chất nầy b Mẫu thịt dùng cho điều tra lấy từ chợ đầu mối địa bàn Tp Hồ Chí Minh, nơi phân bố nguồn thịt chủ yếu khắp quận thành phố c Thiết bị phân tích • Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực LC/MS/MS TSQ Quantum Access Thermo Scientific (Công ty dịch vụ KHCN Sắc ký Hải Đăng – Thành phố Hồ Chí Minh) • Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ tứ cực LC/MS 2010A Shimadzu (Công ty dịch vụ KHCN Sắc ký Hải Đăng – Thành phố Hồ Chí Minh) Phương pháp nghiên cứu: • Xây dựng phương pháp chuẩn bị mẫu để tách chiết làm giàu chất phân tích (Clenbuterol Salbutamol) trước đưa vào máy sắc ký lỏng ghép khối phổ • Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực để xác định khả tồn dư Clen Sal thịt heo Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo B Nội dung: Tổng quan Clenbuterol Salbutamol: 1.1 Khái quát họ β_agonist: -Trong lĩnh vực dược phẩm, β_agonist nhóm chất sử dụng nhiều điều trị bệnh hen suyễn, hai chất điển hình Clenbuterol Salbutamol - Trong chăn nuôi, dược liệu có lúc đưa vào thức ăn gia súc nhằm giảm lớp mỡ da, tăng cơ, tăng trọng thú vật nuôi Theo nhiều nghiên cứu, loại dược liệu gây hại cho gia súc cho người ăn phải thịt thú vật ni loại thức ăn có trộn loại dược liệu trên, hố chất thuộc nhóm β_agonist thường chất kích thích mạnh, làm suy nhược chức gan Tại Châu Âu Châu Mỹ, loại hoá chất bị cấm sử dụng Ở Việt Nam, loại dược liệu thuộc nhóm β_agonist có Clenbuterol Salbutamol xếp vào danh mục 18 hố chất bị cấm Bộ Nơng Nghiệp Phát Triển Nông Thôn (Quyết định số 54 ngày 20 tháng 06 năm 2002 Bộ NN&PTNT) Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo 1.2 Giới thiệu Clenbuterol Salbutamol: Hình 1: Clenbutmol Hình 2: Salbutamol Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo Clenbuterol: -Công thức phân tử : C12H8Cl2ON2 - Khối lượng phân tử: 276.0796 ( đvC) - Công thức cấu tạo: 1.2.1 -Tên gọi: 2-(tert-butylamino)-1-(4-amino-3,5-diclophenyl) ethanol - Tên thương mại: vetipulmin - Hình dạng: tinh thể khơng màu, mịn - Nhiệt độ nóng chảy (℃): 174-175.5 - Nhiệt độ sơi (℃): 404.9 - pKa: 9.29 - Độ tan: tan nhiều nước, aceton, methanol; tan clorofom; khơng tan benzen ** Trong y học, Clenbuterol có tác dụng làm giãn phế quản, giãn trơn cuống phổi, Clenbuterol dược phẩm định để điều trị chứng bệnh có liên quan đến phổi hen, suyễn, nhiên hại đến hệ thần kinh tuần hoàn người ** Trong thú y,Clenbuterol sử dụng để điều trị bệnh dị ứng đường hô hấp ngựa (tên thương mại ventipulmin), điều trị bệnh đường hô hấp trâu bò,…Thuốc thải qua đường tiểu qua phân với thời gian dài Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo - 1.2.2 Salbutamol: Công thức phân tử : C13H21O3N Khối lượng phân tử: 239,152 (đvC) Công thức cấu tạo: - Tên gọi: 2-(tert-butylamino)-1-(3-hydroxyethyl-2-hydroxyphenyl) ethanol Tên thương mại: Ventolin Hình dạng: tinh thể màu trắng, mịn Nhiệt độ nóng chảy (℃): 157-158 Nhiệt độ sôi (℃): 433.5 pKa: 9.27 Độ tan: tan nhiều nước, aceton ethanol; tan eter ** Salbutanol ứng dụng y học dùng để điều trị bệnh hen suyễn hiệu nghiệm Thuốc điều trị hen suyễn có chứa Salbutanol có nhiều thị trường nước giới ** Tác dụng Clenbuterol Salbutamol lên động vật ni người: Clenbuterol Salbutamol tích luỹ thực phẩm thịt làm ảnh hưởng đến sức khoẻ người tiêu dùng thông qua dây chuyền thực phẩm, gây triệu chứng rối loạn nhịp tim, tim đập nhanh, tăng huyết áp, co thắt phế quản, phù nề, run cơ, liệt cơ, chống váng,… Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo 1.3 Những dấu hiệu nhận biết thịt gia súc, gia cầm có chứa Clenbuterol Salbutamol : Với loại lợn siêu nạc tốt nước ta nay, người ta phải tháng đạt trọng lượng 95-100 kg/con cho thêm thìa cà phê salbutamol vào thức ăn (cho 10 lợn loại 78-80kg/con), thời gian xuất chuồng rút ngắn tháng Người sử dụng chất tạo nạc cho lợn ăn không nửa tháng trước xuất chuồng nuôi nửa tháng lợn tự khuỵu chân,vì hóa chất làm xương giòn Khắp người lợn bắt đầu xuất vết lở rỉ nước ** Cách nhận biết thịt có chất tạo nạc hay thịt bình thường: Theo ơng Nguyễn Xn Dương, Phó cục trưởng Cục Chăn ni (Bộ NN&PTNT): “ Nếu nhìn mắt thường khó phân biệt thịt lợn ni thức ăn tạo nạc thịt nạc bình thường Để biết thịt lợn bị nhiễm chất tạo nạc phải lấy mẫu thịt để kiểm tra, phân tích đưa kết luận chắn Tuy nhiên, người dân nên tránh loại thịt lợn phần nạc có màu đỏ giống thịt bò” Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo Sau đặc điểm nhận biết thịt siêu nạc có hóa chất theo chuyên gia Cục Chăn nuôi: Xem lớp mỡ bên da miếng thịt, lớp mỡ mỏng lỏng lẻo nên tránh Thông thường lợn siêu nạc ăn hóa chất nên lớp mỡ mỏng hẳn đi, có dày đến cm (thông thường khoảng 0,4 cm), lớp mỡ thịt lợn bình thường khoảng 1,5-2 cm Nhìn màu sắc: Thịt lợn chứa chất độc Ractophamine Clenbuterol thường có màu đỏ tươi khác thường, sáng bóng Thái miếng thịt dày 2-3 ngón tay, thấy thịt mềm, không đứng thẳng bàn thịt nhiễm chất tăng trọng Quan sát xem chỗ liên kết phần nạc mỡ, thấy tách rời rõ rệt, đồng thời có nước dịch màu vàng rỉ ra, chắn thịt siêu nạc Người tiêu dùng ln sáng suốt thông minh để lựa chọn thịt tươi ngon, chất lượng để gia đình ln có bữa ăn đảm bảo sức khỏe dinh dưỡng 10 Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo Các phương pháp phân tích dư lượng salbutamol clenbutarol thịt heo: 2.1 Phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ GC/MS: 2.1.1 Giới thiệu chung: Kết hợp kỹ thuật sắc ký khí đầu dò khối phổ cho kỹ thuật sắc ký khí khối phổ, với cấu tạo gọn nhẹ giảm thời gian phân tích nhiều Với loại thiết bị kết hợp cho khả phân tích nhiều ứng dụng Mặc dù không dùng nhiều LC/MS GC/MS công cụ hữu hiệu để xác định hợp chất chưa biết, cho độ phân giải cao nhiều liệu điện tử hóa học hợp chất Ứng dụng nhiều pháp y, xét nghiệm, dược phẩm, hóa dầu, mơi trường, phân tích sinh học… 2.1.2 Nguyên tắc hệ thống GC/MS: GC/MS kỹ thuật phân tích có độ chọn lọc cao để xác định chất nhờ vào trình đo khối lượng Giống sắc ký lỏng LC, sắc ký khí GC gồm pha động pha khí, sắc ký lỏng pha động pha lỏng Lưu ý GC/MS trình chuẩn bị mẫu lựa chọn dung mơi mẫu bị bẩn phân hủy làm sai lệch độ nhạy khối phổ nhiều Các kỹ thuật chuẩn bị mẫu thường dùng: Chiết pha rắn (SPE), chiết lỏng – lỏng (LLE), vi chiết pha rắn (SPME) 2.1.3 Quy trình định tính định lượng β- agonists (salbutamol clenbuterol): Hầu hết phương pháp phân tích sắc ký dùng phát định lượng salbutamol clenbuterol trãi qua ba giai đoạn sau : • Chiết chất phân tích khỏi mẫu (mẫu nguyên liệu) • Làm mẫu, loại tạp chất khỏi dịch chiết làm giàu chất phân tích • Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ để định lượng chất phân tích 2.1.4 Thiết bị , hóa chất dung dịch thử: 2.1.4.1 Thiết bị: Hệ thống máy LC-MS/MS Thermo Finnigan gồm: • Hệ thống máy sắc ký lỏng: Bơm hệ thống tiêm mẫu tự động • Đầu dò khối phổ ba tứ cực TSQ Quantum Access với hai loại nguồn ion hóa ESI APCI • Cột sắc ký lỏng pha đảo Purospher Star C18, 150 mm x 4,6 mm, kích cỡ hạt µm, cột bảo vệ pha đão C18 (hãng Merck) • Phần mềm Xcalibur, điều khiển thiết bị xử lý liệu sắc ký 11 Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo 2.1.4.2 Hóa chất dung dịch thử: Nước cất lần khử ion, CH3OH loại HPLC; H3PO4, p.a (pure analysis); HCOOH loại HPLC K2HPO4, p.a (pure analysis); Dung dịch thử K2HPO4 0,1M Dung dịch pha động: MeOH (0,1% HCOOH) H2O (0,1% HCOOH) (v/v) 2.1.5 Chất chuẩn nội chuẩn: Clenbuterol hydrochloride, Dr Ehrenstorfer, 95% (C12H18Cl2ON2,HCl) Clenbuterol–d9 (100 mg/L), Dr Ehrenstorfer (C12H 9D9 Cl2ON2) Salbutamol sulfate, Dr Ehrenstorfer, 99 % (C13H22O3N, ½ H2SO4 Salbutamol–d3 (100 mg/L), Dr Ehrenstorfer (C13H19D3O3N) 2.2 Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ đầu dò tứ cực: Xác định dư lượng β2-Agonist thịt heo phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC/MS/MS): 3.1 Phạm vi áp dụng: Xác định dư lượng nhóm β2 Agonist gồm chất Clenbuterol, Salbutamol Ractopamine thịt bò, thịt heo kỹ thuật sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ Giới hạn định lượng phương pháp cho chất Clenbuterol 0,2 µg/kg, Salbutamol µg/kg Ractopamin.HCl 10 µg /kg 3.2 Nguyên tắc: Dư lượng Clenbuterol, Salbutamol Ractopamine tự thịt heo chiết từ mẫu hỗn hợp Axetonitrile isopropanol Sử dụng muối natri clorit, natri sunphat magiê sunphate để tủa protein loại nước có dịch chiết mẫu Dịch chiết làm bay dung mơi đến khơ, phần cặn hòa tan dung dịch nước chứa 10% Axetonitril, làm n-hexan đưa vào phân tích kỹ thuật sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC-MS-MS) để xác định định lượng Clenbutarol, Salbutamol Ractopamine có mẫu 3.3 Thuốc thử: Trong tiêu chuẩn này, sử dụng thuốc thử có cấp độ tinh khiết phân tích nước cất hai lần khử ion 3.3.1 Chuẩn Clenbuterol.HCL (CLEN.HCl) , ≥ 98,5 %; 3.3.2 Chuẩn Salbutamol sunphat (SAL.SUL), ≥ 99 %; 3.3.3 Chuẩn Ractopamin.HCL (RAC.HCl), ≥ 98%; 3.3.4 Nội chuẩn Clenbuterol D9 (CLEN D9), > 99 %; 3.3.5 Nội chuẩn Salbutamol D3 (SAL D3), ≥ 98%; 12 Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo 3.3.6 Nội chuẩn Ractopamin.HCL D6 (RAC D6), > 99 %; 3.3.7 Axetonitril (ACN), loại dùng cho LC-MS; 3.3.8 Nước, loại dùng cho LC-MS; 3.3.9 Metanol (MeOH), loại dùng cho LC-MS; 3.3.10 Isopropanol (IPA), loại dùng cho HPLC; 3.3.1 n-Hexan, loại dùng cho phân tích; 3.3.12 Natri clorit (NaCl), loại dùng cho phân tích; 3.3.13 Natri sunphat (Na2SO4), loại dùng cho phân tích; 3.3.14 Magiê sunphat (MgSO4) khan; 3.3.15 Axit formic, độ tinh khiết tối thiểu 99 %; 3.3.16 Khí argon, tinh khiết 99,9%; 3.3.17 Khí nitơ, tinh khiết 99,9% 3.3.18 Pha chế dung dịch chuẩn nội chuẩn: 3.3.18.1 Dung dịch chuẩn gốc CLEN, SAL 1000 µg / ml metanol Cân 22.98 mg chuẩn CLEN.HCL (3.1) 24.34 mg chuẩn SAL.SUL (3.2) vào bình định mức dung tích 20 ml (4.4) Hồ tan định mức đến vạch metanol (3.9) để dung dịch chuẩn gốc CLEN, SAL có nồng độ 1000 µg/ml Dung dịch chuẩn gốc bảo quản -18°C năm 3.3.18.2 Dung dịch chuẩn gốc RAC.HCL 1000 µg / ml metanol Cân 20 mg chuẩn RAC.HCL (3.3.3) vào bình định mức dung tích 20 ml Hồ tan định mức đến vạch metanol (3.3.9) để dung dịch chuẩn gốc RAC.HCL có nồng độ 1000 µg / ml Dung dịch chuẩn gốc bảo quản -18°C năm 13 Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo LƯU Ý: - Lượng cân chuẩn CLEN.HCl SAL.SUL phải điều chỉnh dạng CLEN SAL (xem phụ lục) CLEN SAL chất phân tích cần quan tâm Lượng cân chuẩn RAC.HCl không điều chỉnh dạng RAC RAC.HCl chất phân tích cần quan tâm - Lượng chuẩn chất phân tích phải điều chỉnh hợp lý để đạt nồng độ chuẩn gốc 1000 µg / ml sau tính tốn hiệu chỉnh theo giấy chứng nhận độ tinh khiết nhà sản xuất 3.3.18.3 Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian CLEN: µg / ml; SAL: 50 µg / ml; RAC.HCL: 100 µg / ml (S1) Hút 40 µl chuẩn gốc CLEN 1000 µg/ml; 1000 µl chuẩn gốc SAL 1000 µg/ml 2000 µl chuẩn gốc RAC.HCL 1000 µg/ml cho vào bình định mức 20 ml, định mức đến vạch metanol Dung dịch bảo quản -18°C tháng 3.3.18.4 Dung dịch chuẩn hỗn hợp CLEN: 20 ng / ml; SAL: 500 ng / ml; RAC.HCL: 1000 ng / ml (S2) Hút xác 200 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (S1) cho vào bình định mức 20 ml , định mức đến vạch axetonitril (3.3.7) Dung dịch bảo quản -18°C tháng 3.3.18.5 Dung dịch chuẩn hỗn hợp CLEN, SAL: ng / ml; SAL: 50 ng / ml; RAC.HCL: 100 ng / ml (S3) Hút xác ml dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (S2) cho vào bình định mức 20 ml, định mức đến vạch axetonitril (3.3.7) Dung dịch bảo quản -20°C tháng 3.3.18.6 Dung dịch nội chuẩn gốc SAL D3 9.8 µg / ml metanol Pha lỗng 1ml dung dịch chuẩn gốc SAL D3 (3.3.5) có nồng độ 100 ng / µl (98%) bình định mức 10 ml , định mức đến vạch metanol (3.3.9) Dung dịch bảo quản -20°C năm LƯU Ý: Nồng độ nội chuẩn phải tính toán hiệu chỉnh theo giấy chứng nhận độ tinh khiết nhà sản xuất 14 Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo 3.3.18.7 Dung dịch nội chuẩn gốc CLEN D9 100 µg / ml metanol Lấy metanol (3.3.9) cho vào lọ chứa mg chuẩn gốc CLEN D9 (3.3.4), lắc chất rắn tan hồn tồn, sau cho dung dịch vào bình định mức 10 ml, tráng rửa ống chứa chất chuẩn vài lần metanol (3.3.9), gộp tất dung dịch vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch metanol (3.3.9) Dung dịch chuẩn bảo quản -20 °C năm 3.3.18.8 Dung dịch nội chuẩn gốc RAC.HCL D6 100µg/ml metanol Lấy metanol (3.3.9) cho vào lọ chứa mg chuẩn gốc RAC.HCL D6 (3.3.6), lắc chất rắn tan hồn tồn, sau cho dung dịch vào bình định mức 10 ml , tráng rửa ống amplous chứa chất chuẩn vài lần metanol , gộp tất dung dịch vào bình định mức 10 ml , định mức đến vạch metanol Dung dịch chuẩn bảo quản -20°C năm 3.3.18.9 Dung dịch hỗn hợp nội chuẩn CLEN D9, RAC.HCL D6, 10 µg / ml (IS1) Hút ml nội chuẩn CLEN D9 (3.3.18.6) RAC.HCL D6 (3.3.18.7) cho vào bình định mức 10 ml , định mức đến vạch metanol Dung dịch bảo quản -20 °C tháng 3.3.18.10 Dung dịch hỗn hợp chuẩn nội làm việc 50 ng / ml axetonitril (IS2) Hút 100 µl dung dịch hỗn hợp nội chuẩn IS1 (3.3.18.8) 102 µl dung dịch nội chuẩn SAL D3 (3.3.18.5) cho vào bình định mức 10 ml , định mức đến vạch axetonitril (3.3.7) Dung dịch chuẩn bảo quản -20°C tháng 3.3.19 Pha động A: axetonitril (3.3.7) B: Nước (3.3.8) + 0,1 % axit formic (3.3.15) 3.3.20 Dung dịch 10%ACN nước cất Lấy 10 ml axetonitril cho vào bình định mức 100 ml định mức đến vạch nước cất, lắc Dung dịch pha trước sử dụng bảo quản nhiệt độ phòng 15 Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo 3.4.Thiết bị, dụng cụ: Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: 3.4.1 Hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ LC-MS-MS - Bơm kênh dung mơi biến đổi dòng; - Đầu dò MS-MS; - Máy tính phần mềm phân tích; - Cột sắc ký Hypersil GOLD C18, đường kính 2,1 mm, kích thước hạt nhồi 1,9 µm, độ dài cột 100 mm 3.4.2 Ống ly tâm nhựa, dung tích 50 ml có nắp; 3.4.3 Ống ly tâm thủy tinh, dung tích 10 ml; 3.4.4 Bình định mức thủy tinh, dung tích 10 ml, 20 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml; 1000 ml; 3.4.5 Pipet tự động, dung tích 50 µl, 100 µL, 250 µl, 1000 µl, 5000 µl; 3.4.6 Máy ly tâm lạnh, tốc độ 4000 vòng / phút; 3.4.7 Cân phân tích, có độ xác đến 0,1 mg; 3.4.8 Bơm hút chân không; 3.4.9 Màng lọc dung mơi, đường kính 45 mm, kích thước lỗ 0,2 µm, làm chất liệu chịu nước dung môi hữu cơ; 3.4.10 Bộ lọc dung môi thủy tinh; 3.4.11 Máy lắc, tốc độ tối thiểu 4000 vòng / phút; 3.4.12 Máy lắc ngang, tốc độ tối thiểu 300 vòng / phút; 3.4.13 Lọ đựng mẫu, dung tích ml; 3.4.14 Màng lọc mẫu, đường kính 13 mm, kích thước lỗ 0,2 µm, làm PTFE; 3.4.15 Bộ hút dung mơi tự động, thể tích 25 ml; 3.4.16 Bộ bay nitơ, có điều chỉnh nhiệt độ; 3.4.17 Máy xay thịt 16 Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo 3.5 Lấy mẫu: Việc lấy mẫu theo TCVN 4833 – 1: 2002 (ISO 3100-1:1991) Mẫu phân tích phòng thử nghiệm phải mẫu đại diện không bị hư hỏng bị biến đổi trình vận chuyển bảo quản 3.6 Chuẩn bị mẫu: Cắt thịt thành miếng nhỏ, đồng hóa mẫu cách cho mẫu qua máy xay thịt hai lần trộn Chuyển mẫu đồng sang dụng cụ đựng mẫu, đậy nắp kín lưu trữ nhiệt độ -10°C Khi thực phân tích, phải đưa mẫu nhiệt độ phòng 3.6.1 Chuẩn bị mẫu thử Cân 5,0 g mẫu đồng vào ống ly tâm 50 ml Cho vào 50 µl dung dịch hỗn hợp chuẩn nội làm việc IS1 50 ng / ml (3.3.18.9) 3.6.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng mẫu thịt heo, thịt bò xác định không nhiễm Clenbuterol, Salbutamol Ractopamin.HCl Mẫu trắng chuẩn bị mẫu thử 3.6.3 Chuẩn bị mẫu kiểm soát Mẫu kiểm soát chuẩn bị từ mẫu trắng mẫu thử có bổ sung thêm 50 µL dung dịch chuẩn hỗn hợp S2 (3.3.18.4) vào mẫu Trộn máy lắc, sau để yên 15 phút trước tiến hành bước 3.6.4 Chuẩn bị mẫu xây dựng đường chuẩn Đường chuẩn xây dựng dựa mẫu trắng Cân mẫu mẫu 5,0 g đồng vào ống ly tâm 50 ml, bổ sung 50 µl dung dịch hỗn hợp chuẩn nội làm việc IS1 50 ng / ml (3.3.18.9) vào ống nghiệm chứa mẫu trắng Tiến hành trộn máy lắc 15 giây, sau để yên 15 phút trước tiến hành bước 3.7 Tiến hành thử nghiệm: 3.7.1 Chiết mẫu làm mẫu Cho ml axetonitril (3.3.7) 1ml isopropanol (3.3.10) vào ống nghiệm chứa mẫu trắng, mẫu kiểm soát, mẫu thử mẫu trắng dùng để dựng đường chuẩn Trộn máy lắc phút Tiếp theo, thêm vào ống 1,2 g NaCl (3.3.12), lắc mạnh phút, sau tiếp tục thêm vào ống g Na2SO4 0,5 g MgSO4, lắc phút máy lắc Sau lắc mẫu, ly tâm phút tốc độ 4000 vòng / phút Dùng pipet, chuyển ml lớp sang ống nghiệm thuỷ tinh Sau cho bay bay N (3.4.9) đến khơ nhiệt độ 40°C 17 Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo Sau bay đến khô Đối với mẫu trắng, mẫu kiểm sốt mẫu thử hồ tan ml dung dịch 10% ACN nước (3.3.20) Đối với mẫu trắng dùng để dựng đường chuẩn, thêm chuẩn theo thể tích bảng 1, lắc khoảng 30 giây máy lắc Tiếp theo, thêm ml n-hexan Trộn máy lắc trong 10 giây , ly tâm phút 4000 vòng / phút Sau loại bỏ lớp Hút lớp lọc qua màng lọc vào lọ đựng mẫu Dung dịch sẵn sàng để phân tích thiết bị LC-MS/MS Bảng - Xây dựng đường chuẩn STT CLE N SAL RAC HCl Mẫu 0 0 1000 Nồng độ dung dịch nội chuẩn IS, CLEN D9; SAL D3 RAC D6 (ng / ml) 0,5 Mẫu 0,1 2,5 50 1000 0,5 Mẫu 0,2 10 10 1000 0,5 Mẫu 0,4 10 20 20 1000 0,5 Mẫu 0,8 20 40 40 1000 0,5 Mẫu 1,6 40 80 80 1000 0,5 (*) Nồng độ chuẩn (ng/ml) Thể tích dung dịch chuẩn hỗn hợp S3 sử dụng (µl) Thể tích định mức(*) (µl) : Dung dịch dùng định mức: dung dịch 10% ACN nước 3.7.2 Tiến hành thử nghiệm LC-MS-MS 3.7.2.1 Điều kiện HPLC - Cột sắc ký Hypersil GOLD C18, đường kính 2,1 mm, kích thước hạt nhồi 1,9 µm, độ dài cột 100 mm; - Nhiệt độ cột: 40°C; - Thể tích tiêm mẫu: 10 μl; - Thời gian phân tích: phút; - Tốc độ dòng: 0,2 ml / phút; - Pha động: chương trình gradient thể theo bảng 2: 18 Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo Bảng - Chương trình pha động Thời gian Tốc độ dòng Pha động A Pha động B (phút) (mL / phút) (%) (%) Initial 0,2 95 0,5 0,2 95 1,0 0,2 20 80 4,0 0,2 80 20 4,2 0,2 95 6,0 0,2 95 3.7.2.2 Điều kiện MS Điều kiện MS sau: Kiểu ion hóa: ESI (+); Nhiệt độ nguồn ion hóa: 150°C; Nhiệt độ hóa dung mơi: 400°C; Tốc độ dòng khí làm bay dung mơi: 800 l / h; Tốc độ dòng khí qua Cone Gas: 30 l / h Các điều kiện phân ly MS-MS sau: Bảng - Điều kiện phân ly MS-MS Tên hợp chất Ion Mẹ (m/z) Ion Con (m/z) Năng lượng (Sample Cone) (V) Clenbuterol Clenbuterol D9 276,97 286,03 167,89 202,94* 168,80 18 18 Năng lượng va chạm (eV) 28 14 30 19 Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo Tên hợp chất Ion Mẹ (m/z) Ion Con (m/z) Năng lượng (Sample Cone) Năng lượng (eV) (V) 203,90* Salbutamol Salbutamol D3 Ractopamin.HCl Ractopamin.HCl D6 240,10 243,03 302,10 308,10 va chạm 16 148,01 18 16 222,01* 151,01 10 18 18 255,10* 121,01 10 28 20 164,06* 290,10 16 22 20 168,10* 16 GHI CHÚ: ion có kí hiệu (*) ion dùng để định lượng 3.7.3 Trình tự bơm mẫu 3.7.3.1 Bơm dung môi kiểm tra máy: dung dịch 10% ACN nước (3.3.20); 3.7.3.2 Bơm dung dịch lập đường chuẩn; 3.7.3.3 Bơm mẫu trắng; 3.7.3.4 Bơm mẫu kiểm soát; 3.7.3.5 Bơm mẫu thử 3.8 Tính tốn biểu thị kết quả: 3.8.1 Tính hệ số tín hiệu: RF = Area × Tính cho chất cần phân tích theo phương trình: ISConc ISArea Trong đó: RF: hệ số tín hiệu; Area: diện tích pic ion định lượng chất cần phân tích; ISConc: nồng độ ion định lượng nội chuẩn; 20 Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo ISArea: diện tích pic ion định lượng nội chuẩn 3.8.2 Xây dựng đường chuẩn Xây dựng phương trình bậc hệ số tín hiệu với nồng độ chất chuẩn bổ sung vào mẫu chuẩn bị mẫu theo mục 3.3.6.4 Phương trình có dạng: RF = ax + b Trong đó: - RF: hệ số tín hiệu, tính theo mục 3.3.8.1; - x: nồng độ chất chuẩn thêm vào mẫu, chuẩn bị theo mục 3.3.6.4; - b: điểm cắt đường chuẩn với trục tung; - a: hệ số góc đường chuẩn Phương trình đạt yêu cầu hệ số hồi quy ≤ R2 ≤ 0.99 3.8.3 Hàm lượng chất phân tích mẫu Dư lượng chất cần phân tích mẫu tính theo phương pháp đường chuẩn xây dựng theo mục 3.8.2 Nồng độ mẫu phân tích tính theo cơng thức sau: C = Cx ×V ×V × F a ×V Trong đó: C: nồng độ Agonist có mẫu, tính μg / kg; Cx: nồng độ Agonist đo suy từ đường chuẩn, μg / l; V1: thể tích ban đầu mà chất phân tích có mặt (5 ml), tính ml; V2: thể tích dịch trích mang phân tích (1ml), tính ml; V3: thể tích định mức cuối (1ml), tính ml; F: hệ số pha lỗng mẫu đo (nếu khơng pha lỗng, F = 1); a: khối lượng mẫu thử, tính gam (g) Kết biểu thị đơn vị μg / kg (ppb), hai số sau dấu phẩy 21 Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo C KẾT LUẬN: Chất tăng trưởng β2-Agonist chất gây nguy hiểm cho sức khỏe người, khiến thể bị nhiễm độc, gây rối loạn tiêu hóa, tuần hồn, chí ảnh hưởng đến tính mạng Việc sử dụng Salbutamol Clenbutarol chăn nuôi thực trạng đáng báo động, cần quan tâm nhiều có biện pháp chế tài thích đáng hành vi cá nhân, tổ chức gây hại sức khỏe công đồng hợp chất cấm salbutamol clenbutamol chăn ni gia súc Vấn đề phân tích dư lượng β2-Agonist thịt heo cần thiết hữu ích Phương pháp sắc kí lỏng ghép khối phổ phương pháp hiệu quả, độ nhạy cao, độ xác cao Phương pháp phân tích hàm lương siêu vết (ppm/ppb/ppt) 22 Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo Tài liệu tham khảo: TCNV: 2014 Thực phẩm- xác định dư lương 2- Agonist thịt gia súc _ Phương pháp sắc kí lỏng ghép lần khối phổ, Cục Quản lý Chất lượng Nông lâm sản thủy sản biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ cơng bố Nguyễn Văn Ri (2009), Giáo trình Các phương pháp tách, khoa Hóa học trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Đình Thành (2011), Cơ sở phương pháp phổ ứng dụng hóa học, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Phạm Luận (1998), Cơ sở lý thuyết phân tích sắc ký lỏng hiệu cao, ĐH Quốc Gia Hà Nội Tạ Thị Thảo (2010), Giáo trình Thống kê Hóa học phân tích, khoa Hóa học trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội 23 Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo MỤC LỤC: 24 ... tháng 06 năm 2002 Bộ NN&PTNT) Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo 1.2 Giới thiệu Clenbuterol... lựa chọn thịt tươi ngon, chất lượng để gia đình ln có bữa ăn đảm bảo sức khỏe dinh dưỡng 10 Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo Các phương pháp phân tích dư lượng. .. dùng Phân tích hàm lượng β – Agonist (Clebuterol & salbutamol) thịt heo Mục đích nghiên cứu: Đề tài thực với mong muốn: • Xây dựng phương pháp phân tích dư lượng clen sal thức ăn chăn nuôi, thịt