PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG B2 – AGONIST (CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL) TRONG THỊT HEO

A. MỞ ĐẦU: 1. Lí do chọn đề tài: Trong lĩnh vực dược phẩm, βagonist là nhóm chất được sử dụng nhiều trong điều trị bệnh hen suyễn, hai chất điển hình là salbutamol và clenbuterol . Salbutamol được dùng cho người với tên biệt dược là albuterol, salbutamol… Clenbuterol được dùng với tên biệt dược là broncodil, clenburol, ventolax, protovent. (Theo tài liệu trên trang web http:en.wikipedia.orgwikiSalbutamol) Trong chăn nuôi, các dược liệu này đã có lúc được đưa vào trong thức ăn gia súc nhằm làm giảm lớp mỡ dưới da, tăng cơ, tăng trọng đối với thú vật nuôi. Theo nhiều nghiên cứu, các loại dược liệu này gây hại cho gia súc và cả cho người nếu ăn phải thịt thú vật nuôi bằng loại thức ăn có trộn các loại dược liệu trên, vì các hóa chất thuộc nhóm βagonist thường là những chất kích thích mạnh, làm suy nhược chức năng gan. Tại Châu Âu và Châu Mỹ, những loại hóa chất trên bị cấm sử dụng. Ở Việt Nam, các loại dược liệu thuộc nhóm βagonist trong đó có clenbuterol và salbutamol được xếp vào danh mục 18 hóa chất bị cấm của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn (Quyết định số 54 ngày 20 tháng 06 năm 2002 của Bộ NN PTNT). Tuy nhiên, các chất này vẫn còn bị một bộ phận người dân lén sử dụng trong chăn nuôi và việc kiểm tra sự hiện diện của chúng trong thức ăn gia súc, gia cầm vào những năm 20052008 phần lớn chỉ dừng lại ở mức độ định tính và định lượng bằng ELISA với độ chính xác chưa cao. Việc định lượng chính xác dư lượng của các βagonist trong thức ăn chăn nuôi là vấn đề cần được quan tâm trong công tác kiểm tra chất lượng sản phẩm. Đồng thời, việc xác định tồn dư βagonist trong thịt một số gia súc là rất cần thiết về mặt quản lý để đánh giá tình hình mức độ sử dụng các chất này trong thức ăn chăn nuôi và đưa ra những cảnh báo về vệ sinh an toàn thực phẩm nếu có. Xuất phát từ tình hình thực tế, trên cơ sở khoa học của các công trình nghiên cứu về Salbutamol (Sal) và Clenbuterol (Clen) được công bố trong và ngoài nước, chúng tôi đã thực hiện đề tài “ Đánh giá hàm lượng các chất βagonists (clenbuterol và salbutamol) trong thức ăn gia súc và dư lượng trong thịt gia súc bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ”. Nghiên cứu này sẽ góp phần vào việc bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng. 2. Mục đích nghiên cứu: Đề tài này được thực hiện với mong muốn: • Xây dựng được phương pháp phân tích dư lượng clen và sal trong thức ăn chăn nuôi, thịt gia súc, gia cầm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ đạt độ nhạy và độ chọn lọc cao, đáp ứng được nhu cầu phân tích của các đơn vị kiểm nghiệm trong nước. • Theo dõi mức độ tồn lưu của Clen và Sal trong thực phẩm gà, heo khi nuôi gà, heo với thức ăn có chứa Clen và Sal. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu: a. Mẫu thịt heo nuôi thử nghiệm với thức ăn có chứa nồng độ nhất định Clen và Sal để kiểm tra khả năng tồn lưu của hai chất nầy. b. Mẫu thịt dùng cho điều tra được lấy từ các chợ đầu mối trên địa bàn Tp Hồ Chí Minh, là nơi phân bố nguồn thịt chủ yếu đi khắp các quận trên thành phố. c. Thiết bị phân tích • Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực LCMSMS TSQ Quantum Access của Thermo Scientific (Công ty dịch vụ KHCN Sắc ký Hải Đăng – Thành phố Hồ Chí Minh). • Máy sắc ký lỏng ghép khối phổ 1 tứ cực LCMS 2010A của Shimadzu (Công ty dịch vụ KHCN Sắc ký Hải Đăng – Thành phố Hồ Chí Minh). 4. Phương pháp nghiên cứu: • Xây dựng phương pháp chuẩn bị mẫu để tách chiết và làm giàu chất phân tích (Clenbuterol và Salbutamol) trước khi đưa vào máy sắc ký lỏng ghép khối phổ. • Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực để xác định khả năng tồn dư Clen và Sal trong thịt heo.   B. Nội dung: 1. Tổng quan về Clenbuterol và Salbutamol: 1.1 Khái quát về họ β_agonist: Trong lĩnh vực dược phẩm, β_agonist là nhóm chất được sử dụng nhiều trong điều trị bệnh hen suyễn, hai chất điển hình là Clenbuterol và Salbutamol Trong chăn nuôi, các dược liệu này đã có lúc được đưa vào trong thức ăn gia súc nhằm giảm lớp mỡ dưới da, tăng cơ, tăng trọng đối với thú vật nuôi. Theo nhiều nghiên cứu, các loại dược liệu này gây hại cho gia súc và cả cho người nếu ăn phải thịt thú vật nuôi bằng loại thức ăn có trộn các loại dược liệu trên, vì các hoá chất thuộc nhóm β_agonist thường là những chất kích thích mạnh, làm suy nhược chức năng gan.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

*****

Tên đề tài:

PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG B2 – AGONIST

(CLENBUTEROL VÀ SALBUTAMOL) TRONG THỊT HEO

(Theo tài liệu trên trang web http://en.wikipedia.org/wiki/Salbutamol)

Trong chăn nuôi, các dược liệu này đã có lúc được đưa vào trong thức ăn gia súcnhằm làm giảm lớp mỡ dưới da, tăng cơ, tăng trọng đối với thú vật nuôi Theo nhiềunghiên cứu, các loại dược liệu này gây hại cho gia súc và cả cho người nếu ăn phải thịtthú vật nuôi bằng loại thức ăn có trộn các loại dược liệu trên, vì các hóa chất thuộc nhómβ-agonist thường là những chất kích thích mạnh, làm suy nhược chức năng gan

Tại Châu Âu và Châu Mỹ, những loại hóa chất trên bị cấm sử dụng Ở Việt Nam,các loại dược liệu thuộc nhóm β-agonist trong đó có clenbuterol và salbutamol được xếp

vào danh mục 18 hóa chất bị cấm của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn

(Quyết định số 54 ngày 20 tháng 06 năm 2002 của Bộ NN & PTNT) Tuy nhiên, các chất

này vẫn còn bị một bộ phận người dân lén sử dụng trong chăn nuôi và việc kiểm tra sựhiện diện của chúng trong thức ăn gia súc, gia cầm vào những năm 2005-2008 phần lớnchỉ dừng lại ở mức độ định tính và định lượng bằng ELISA với độ chính xác chưa cao.Việc định lượng chính xác dư lượng của các β-agonist trong thức ăn chăn nuôi là vấn đềcần được quan tâm trong công tác kiểm tra chất lượng sản phẩm Đồng thời, việc xácđịnh tồn dư β-agonist trong thịt một số gia súc là rất cần thiết về mặt quản lý để đánh giátình hình mức độ sử dụng các chất này trong thức ăn chăn nuôi và đưa ra những cảnh báo

về vệ sinh an toàn thực phẩm nếu có

Xuất phát từ tình hình thực tế, trên cơ sở khoa học của các công trình nghiên cứu

về Salbutamol (Sal) và Clenbuterol (Clen) được công bố trong và ngoài nước, chúng

tôi đã thực hiện đề tài “ Đánh giá hàm lượng các chất β-agonists (clenbuterol vàsalbutamol) trong thức ăn gia súc và dư lượng trong thịt gia súc bằng kỹ thuật sắc ký lỏngghép khối phổ” Nghiên cứu này sẽ góp phần vào việc bảo đảm vệ sinh an toàn thực

2 Mục đích nghiên cứu:

Đề tài này được thực hiện với mong muốn:

• Xây dựng được phương pháp phân tích dư lượng clen và sal trong thức ăn chăn nuôi, thịtgia súc, gia cầm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ đạt độ nhạy và độ chọn lọc cao,đáp ứng được nhu cầu phân tích của các đơn vị kiểm nghiệm trong nước

• Theo dõi mức độ tồn lưu của Clen và Sal trong thực phẩm gà, heo khi nuôi gà, heo với thức ăn có chứa Clen và Sal

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

a Mẫu thịt heo nuôi thử nghiệm với thức ăn có chứa nồng độ nhất định Clen và Sal

để kiểm tra khả năng tồn lưu của hai chất nầy

b Mẫu thịt dùng cho điều tra được lấy từ các chợ đầu mối trên địa bàn Tp Hồ Chí

Minh, là nơi phân bố nguồn thịt chủ yếu đi khắp các quận trên thành phố

4 Phương pháp nghiên cứu:

• Xây dựng phương pháp chuẩn bị mẫu để tách chiết và làm giàu chất phân tích(Clenbuterol và Salbutamol) trước khi đưa vào máy sắc ký lỏng ghép khối phổ

• Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ ba tứ cực để xác định khả năng

tồn dư Clen và Sal trong thịt heo.

B Nội dung :

1 Tổng quan về Clenbuterol và Salbutamol:

1.1 Khái quát về họ β_agonist:

-Trong lĩnh vực dược phẩm, β_agonist là nhóm chất được sử dụng nhiều trong điều trịbệnh hen suyễn, hai chất điển hình là Clenbuterol và Salbutamol

- Trong chăn nuôi, các dược liệu này đã có lúc được đưa vào trong thức ăn gia súc nhằmgiảm lớp mỡ dưới da, tăng cơ, tăng trọng đối với thú vật nuôi Theo nhiều nghiên cứu,các loại dược liệu này gây hại cho gia súc và cả cho người nếu ăn phải thịt thú vật nuôibằng loại thức ăn có trộn các loại dược liệu trên, vì các hoá chất thuộc nhóm β_agonistthường là những chất kích thích mạnh, làm suy nhược chức năng gan

1.2 Giới thiệu về Clenbuterol và Salbutamol:

Hình 1: Clenbutmol

Hình 2: Salbutamol

1.2.1 Clenbuterol:

-Công thức phân tử : C12H8Cl2ON2

- Khối lượng phân tử: 276.0796 ( đvC)

- Công thức cấu tạo:

-Tên gọi: 2-(tert-butylamino)-1-(4-amino-3,5-diclophenyl) ethanol

- Tên thương mại: vetipulmin

- Hình dạng: tinh thể không màu, mịn

** Trong thú y,Clenbuterol được sử dụng để điều trị các căn bệnh dị ứng đường hô hấp ở

ngựa (tên thương mại là ventipulmin), điều trị bệnh đường hô hấp ở trâu bò,…Thuốc cóthể thải qua đường tiểu và qua phân nhưng với thời gian rất dài

1.2.2 Salbutamol:

- Công thức phân tử : C13H21O3N

- Khối lượng phân tử: 239,152 (đvC)

- Công thức cấu tạo:

- Tên gọi: 2-(tert-butylamino)-1-(3-hydroxyethyl-2-hydroxyphenyl) ethanol

- Tên thương mại: Ventolin

- Hình dạng: tinh thể màu trắng, mịn

- Nhiệt độ nóng chảy (℃): 157-158

- Nhiệt độ sôi (℃): 433.5

- pKa: 9.27

- Độ tan: tan nhiều trong nước, aceton và ethanol; ít tan trong eter

** Salbutanol được ứng dụng trong y học được dùng để điều trị bệnh hen suyễn rất hiệu nghiệm Thuốc điều trị hen suyễn có chứa Salbutanol có nhiều trên thị trường trong nước

cũng như trên thế giới

** Tác dụng của Clenbuterol và Salbutamol lên động vật nuôi và người: Clenbuterol vàSalbutamol tích luỹ trong thực phẩm thịt sẽ làm ảnh hưởng đến sức khoẻ người tiêu dùngthông qua dây chuyền thực phẩm, gây ra các triệu chứng rối loạn nhịp tim, tim đập nhanh,tăng huyết áp, co thắt phế quản, phù nề, run cơ, liệt cơ, choáng váng,…

1.3 Những dấu hiệu nhận biết thịt gia súc, gia cầm có chứa Clenbuterol hoặc Salbutamol :Với loại lợn siêu nạc tốt nhất ở nước ta hiện nay, người ta phải mất 5 tháng mới đạt đượctrọng lượng 95-100 kg/con nhưng cho thêm 1 thìa cà phê salbutamol vào thức ăn (cho 10con lợn loại 78-80kg/con), thời gian xuất chuồng rút ngắn chỉ còn 3 tháng.

Người sử dụng chất tạo nạc này chỉ cho lợn ăn không quá nửa tháng trước khi xuấtchuồng nếu nuôi quá nửa tháng lợn sẽ tự khuỵu chân,vì hóa chất này làm xương giòn.Khắp người con lợn sẽ bắt đầu xuất hiện những vết lở rỉ nước

** Cách nhận biết thịt nào có chất tạo nạc hay thịt bình thường:

Theo ông Nguyễn Xuân Dương, Phó cục trưởng Cục Chăn nuôi (Bộ NN&PTNT): “Nếu nhìn bằng mắt thường thì rất khó phân biệt thịt lợn được nuôi bằng thức ăn tạo nạc

và thịt nạc bình thường Để biết thịt lợn nào bị nhiễm chất tạo nạc thì phải lấy mẫu thịt

để kiểm tra, phân tích mới có thể đưa ra kết luận chắc chắn Tuy nhiên, người dân nêntránh những loại thịt lợn phần nạc có màu đỏ giống thịt bò”

Sau đây là 4 đặc điểm nhận biết thịt siêu nạc có hóa chất theo các chuyên gia Cục Chăn nuôi:

1. Xem lớp mỡ bên dưới da miếng thịt, nếu lớp mỡ mỏng và lỏng lẻo nên tránh Thôngthường lợn siêu nạc được ăn hóa chất nên lớp mỡ mỏng hẳn đi, có khi chỉ dày đến 1

cm (thông thường khoảng 0,4 cm), trong khi lớp mỡ của thịt lợn bình thườngkhoảng 1,5-2 cm

2. Nhìn màu sắc: Thịt lợn chứa các chất độc Ractophamine và Clenbuterol thường cómàu đỏ tươi khác thường, sáng và bóng

3. Thái miếng thịt ra dày bằng 2-3 ngón tay, nếu thấy thịt mềm, không đứng thẳngđược trên bàn thì rất có thể thịt đã nhiễm chất tăng trọng

4. Quan sát xem chỗ liên kết giữa phần nạc và mỡ, nếu thấy tách rời rõ rệt, đồng thời

có nước dịch màu vàng rỉ ra, chắc chắn đó là thịt siêu nạc

Người tiêu dùng hãy luôn sáng suốt và thông minh để lựa chọn thịt tươi ngon, chất lượng

để gia đình luôn có những bữa ăn đảm bảo sức khỏe và dinh dưỡng

2 Các phương pháp phân tích dư lượng salbutamol và clenbutarol trong thịt heo:

2.1 Phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ GC/MS:

2.1.1 Giới thiệu chung:

Kết hợp kỹ thuật sắc ký khí và đầu dò khối phổ cho kỹ thuật sắc ký khí khối phổ, với cấu tạogọn nhẹ và giảm thời gian phân tích đi rất nhiều Với loại thiết bị kết hợp này có thể cho khảnăng phân tích trong rất nhiều ứng dụng Mặc dù không được dùng nhiều như LC/MS nhưngGC/MS là công cụ hữu hiệu để xác định các hợp chất chưa biết, cho độ phân giải cao và nhiều

dữ liệu về điện tử và hóa học của hợp chất Ứng dụng nhiều trong pháp y, xét nghiệm, dượcphẩm, hóa dầu, môi trường, phân tích sinh học…

2.1.2 Nguyên tắc hệ thống GC/MS:

GC/MS là kỹ thuật phân tích có độ chọn lọc cao để xác định các chất nhờ vào quá trình đo khốilượng Giống như trong sắc ký lỏng LC, sắc ký khí GC cũng gồm một pha động là pha khí, còntrong sắc ký lỏng pha động là pha lỏng

Lưu ý trong GC/MS là quá trình chuẩn bị mẫu và lựa chọn dung môi vì mẫu bị bẩn hoặc phânhủy sẽ làm sai lệch độ nhạy của khối phổ rất nhiều Các kỹ thuật chuẩn bị mẫu thường

dùng: Chiết pha rắn (SPE), chiết lỏng – lỏng (LLE), vi chiết pha rắn (SPME).

2.1.3 Quy trình định tính và định lượng β- agonists (salbutamol và clenbuterol):

Hầu hết các phương pháp phân tích sắc ký dùng phát hiện và định lượng salbutamol và clenbuterol đều trãi qua ba giai đoạn như sau :

• Chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu (mẫu nguyên liệu)

• Làm sạch mẫu, loại tạp chất ra khỏi dịch chiết và làm giàu chất phân tích

• Sử dụng các phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ để định lượng chất phân tích

2.1.4 Thiết bị , hóa chất và dung dịch thử:

2.1.4.1 Thiết bị:

Hệ thống máy LC-MS/MS Thermo Finnigan gồm:

• Hệ thống máy sắc ký lỏng: Bơm và hệ thống tiêm mẫu tự động

• Đầu dò khối phổ ba tứ cực TSQ Quantum Access với hai loại nguồn ion hóa ESI vàAPCI

• Cột sắc ký lỏng pha đảo Purospher Star C18, 150 mm x 4,6 mm, kích cỡ hạt 5 µm, cộtbảo vệ pha đão C18 (hãng Merck)

• Phần mềm Xcalibur, điều khiển thiết bị và xử lý dữ liệu sắc ký

2.1.4.2 Hóa chất và dung dịch thử:

Nước cất 2 lần khử ion, CH3OH loại HPLC; H3PO4, p.a (pure analysis); HCOOH loại HPLC vàK2HPO4, p.a (pure analysis); Dung dịch thử K2HPO4 0,1M

Dung dịch pha động: MeOH (0,1% HCOOH) và H2O (0,1% HCOOH) (v/v)

2.1.5 Chất chuẩn và nội chuẩn:

Clenbuterol hydrochloride, Dr Ehrenstorfer, 95% (C12H18Cl2ON2,HCl)

Clenbuterol–d 9 (100 mg/L), Dr Ehrenstorfer (C12H 9D9 Cl2ON2)

Salbutamol sulfate, Dr Ehrenstorfer, 99 % (C13H22O3N, ½ H2SO4

Salbutamol–d 3 (100 mg/L), Dr Ehrenstorfer (C13H19D3O3N)

2.2 Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ đầu dò 3 tứ cực:

3 Xá c đ ị n h d ư l ư ợ n g β2-Agonist trong thịt heo bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khốiphổ (LC/MS/MS):

Ractopamine có trong mẫu.

3.3.6 Nội chuẩn Ractopamin.HCL D6 (RAC D6), > 99 %;

3.3.7 Axetonitril (ACN), loại dùng cho LC-MS;

3.3.8 Nước, loại dùng cho LC-MS;

3.3.9 Metanol (MeOH), loại dùng cho LC-MS;

3.3.10 Isopropanol (IPA), loại dùng cho HPLC;

3.3.1 n-Hexan, loại dùng cho phân tích;

3.3.12 Natri clorit (NaCl), loại dùng cho phân tích;

3.3.13 Natri sunphat (Na 2 SO 4 ), loại dùng cho phân tích;

3.3.14 Magiê sunphat (MgSO 4 ) khan;

3.3.15 Axit formic, độ tinh khiết tối thiểu 99 %;

3.3.16 Khí argon, tinh khiết 99,9%;

3.3.17 Khí nitơ, tinh khiết 99,9%.

3.3.18 Pha chế dung dịch chuẩn và nội chuẩn:

3.3.18.1 Dung dịch chuẩn gốc CLEN, SAL 1000 µg / ml trong metanol

Cân lần lượt 22.98 mg chuẩn CLEN.HCL (3.1) và 24.34 mg chuẩn SAL.SUL (3.2) vào cácbình định mức dung tích 20 ml (4.4) Hoà tan và định mức đến vạch bằng metanol (3.9) đểđược dung dịch chuẩn gốc CLEN, SAL có nồng độ 1000 µg/ml Dung dịch chuẩn gốc đượcbảo quản ở -18°C trong 1 năm

3.3.18.2 Dung dịch chuẩn gốc RAC.HCL 1000 µg / ml trong metanol

Cân 20 mg chuẩn RAC.HCL (3.3.3) vào bình định mức dung tích 20 ml Hoà tan và địnhmức đến vạch bằng metanol (3.3.9) để được dung dịch chuẩn gốc RAC.HCL có nồng độ

1000 µg / ml Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở -18°C trong 1 năm

LƯU Ý:

- Lượng cân của chuẩn CLEN.HCl và SAL.SUL phải được điều chỉnh về dạng

CLEN và SAL (xem phụ lục) vì CLEN và SAL là chất phân tích cần quan tâm Lượng cân

của chuẩn RAC.HCl không điều chỉnh về dạng RAC vì RAC.HCl là chất phân tích cầnquan tâm

- Lượng chuẩn của các chất phân tích phải được điều chỉnh hợp lý để đạt nồng độcác chuẩn gốc 1000 µg / ml sau khi tính toán và hiệu chỉnh theo giấy chứng nhận độ tinhkhiết của nhà sản xuất

3.3.18.3 Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian CLEN: 2 µg / ml; SAL: 50 µg / ml; RAC.HCL: 100 µg / ml (S1)

Hút lần lượt 40 µl chuẩn gốc CLEN 1000 µg/ml; 1000 µl chuẩn gốc SAL 1000 µg/ml và

2000 µl chuẩn gốc RAC.HCL 1000 µg/ml cho vào bình định mức 20 ml, định mức đếnvạch bằng metanol Dung dịch bảo quản ở -18°C trong 6 tháng

3.3.18.4 Dung dịch chuẩn hỗn hợp CLEN: 20 ng / ml; SAL: 500 ng / ml; RAC.HCL: 1000 ng / ml (S2)

Hút chính xác 200 µl dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (S1) cho vào bình định mức 20

ml , định mức đến vạch bằng axetonitril (3.3.7) Dung dịch bảo quản ở -18°C trong 3 tháng

3.3.18.5 Dung dịch chuẩn hỗn hợp CLEN, SAL: 2 ng / ml; SAL: 50 ng / ml; RAC.HCL: 100 ng / ml (S3)

Hút chính xác 2 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (S2) cho vào bình định mức 20 ml,

định mức đến vạch bằng axetonitril (3.3.7) Dung dịch bảo quản ở -20°C trong 3 tháng

3.3.18.6 Dung dịch nội chuẩn gốc SAL D3 9.8 µg / ml trong metanol

Pha loãng 1ml dung dịch chuẩn gốc SAL D3 (3.3.5) có nồng độ 100 ng / µl (98%) trongbình định mức 10 ml , định mức đến vạch bằng metanol (3.3.9) Dung dịch được bảo quản ở-20°C trong 1 năm

LƯU Ý:

3.3.18.7 Dung dịch nội chuẩn gốc CLEN D9 100 µg / ml trong metanol

Lấy một ít metanol (3.3.9) cho vào lọ chứa 1 mg chuẩn gốc CLEN D9 (3.3.4), lắc cho đếnkhi chất rắn tan hoàn toàn, sau đó cho dung dịch vào bình định mức 10 ml, tráng rửa ốngchứa chất chuẩn vài lần bằng metanol (3.3.9), gộp tất cả dung dịch vào bình định mức 10

ml, định mức đến vạch bằng metanol (3.3.9) Dung dịch chuẩn này được bảo quản ở -20°Ctrong 1 năm

3.3.18.8 Dung dịch nội chuẩn gốc RAC.HCL D6 100µg/ml trong metanol

Lấy một ít metanol (3.3.9) cho vào lọ chứa 1 mg chuẩn gốc RAC.HCL D6 (3.3.6), lắc chođến khi chất rắn tan hoàn toàn, sau đó cho dung dịch vào bình định mức 10 ml , tráng rửaống amplous chứa chất chuẩn vài lần bằng metanol , gộp tất cả dung dịch vào bình địnhmức 10 ml , định mức đến vạch bằng metanol Dung dịch chuẩn này được bảo quản ở-20°C trong 1 năm

3.3.18.9 Dung dịch hỗn hợp nội chuẩn CLEN D9, RAC.HCL D6, 10 µg / ml (IS1)

Hút lần lượt 1 ml nội chuẩn CLEN D9 (3.3.18.6) và RAC.HCL D6 (3.3.18.7) cho vào bìnhđịnh mức 10 ml , định mức đến vạch bằng metanol Dung dịch bảo quản ở -20°C trong 6tháng

3.3.18.10 Dung dịch hỗn hợp chuẩn nội làm việc 50 ng / ml trong axetonitril (IS2)

Hút lần lượt 100 µl dung dịch hỗn hợp nội chuẩn IS1 (3.3.18.8) và 102 µl dung dịch nộichuẩn SAL D3 (3.3.18.5) cho vào bình định mức 10 ml , định mức đến vạch bằngaxetonitril (3.3.7) Dung dịch chuẩn này được bảo quản ở -20°C trong 3 tháng

3.3.19 Pha động

A: axetonitril (3.3.7)

B: Nước (3.3.8) + 0,1 % axit formic (3.3.15)

3.3.20 Dung dịch 10%ACN trong nước cất

Lấy 10 ml axetonitril cho vào bình định mức 100 ml rồi định mức đến vạch bằng nước cất,lắc đều Dung dịch pha trước khi sử dụng và bảo quản ở nhiệt độ phòng

3.4.2 Ống ly tâm nhựa, dung tích 50 ml có nắp;

3.4.3 Ống ly tâm thủy tinh, dung tích 10 ml;

3.4.4 Bình định mức thủy tinh, dung tích 10 ml, 20 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml; 1000 ml; 3.4.5 Pipet tự động, dung tích 50 µl, 100 µL, 250 µl, 1000 µl, 5000 µl;

3.4.6 Máy ly tâm lạnh, tốc độ 4000 vòng / phút;

3.4.7 Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,1 mg;

3.4.8 Bơm hút chân không;

3.4.9 Màng lọc dung môi, đường kính 45 mm, kích thước lỗ 0,2 µm, làm bằng chất liệuchịu được cả nước và dung môi hữu cơ;

3.4.10 Bộ lọc dung môi bằng thủy tinh;

3.4.11 Máy lắc, tốc độ tối thiểu 4000 vòng / phút;

3.4.12 Máy lắc ngang, tốc độ tối thiểu 300 vòng / phút;

3.4.13 Lọ đựng mẫu, dung tích 2 ml;

3.4.14 Màng lọc mẫu, đường kính 13 mm, kích thước lỗ 0,2 µm, làm bằng PTFE;