Thực phẩm biến đổi gen cây trồng chịu hạn

Thực phẩm biến đổi gen cây trồng chịu hạn

CHÀO THẦY VÀ CÁC BẠN ĐẾN VỚI BUỔI THUYẾT TRÌNH CỦA NHÓM Đề Tài: Thực Phẩm Biến Đổi Gene Cây Trồng Chịu Hạn GVHD: Hoàng Anh Hoàng Nhóm Đôi tương nghiên cưu • Cơ chê biêu hiêên • Phương phap nghiên cưu • Kêt qua • Kêt luâên • Nội dung Đối tượng nghiên cứu Basmati là giống lúa dạng hạt dài trồng phổ biến Ấn Độ Giống lúa này là có mùi thơm, hương vị đặc trưng và có chất lượng tốt Giống lúa Pusa Basmati – sinh trưởng và phát triển tốt điều kiện khí hậu Việt Nam, có tiềm về suất và chất lượng Các chủng vi khuẩn và các vector Chuyển gene OsNAC6 nhờ tế bào khả biến của vi khuẩn A Tumefaciens Vector chuyển gene pBCKH Vector nhân dòng pSK II, pUC19-Ubi Vi khuẩn nhân dòng E.Coli DH5 Hóa chất Môi trường sử dụng nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào và nuôi cấy vi khuẩn dùng cho thí nghiệm chuyển gene bao gồm: MS, LB, YEM Thiết bi Tủ cấy vô trùng Tủ sinh trưởng Máy PCR Máy giải trình tự Máy quang phổ kế Máy đo pH Máy ly tâm Bể ổn nhiệt Các thiết bị khác Cơ chế biểu Thay đổi về hình thái, sinh lí, sinh hoá và phân tử Về hình thái, sinh lí: đóng khí khổng, giảm hô hấp và quang hợp, giảm thể tích nước mô Mức độ phân tử: gia tăng mức độ biểu và tích luỹ của gene/protein chống chịu stress Cơ chế biểu Các protein tham gia vào trình chống hạn của thực vật chia làm loại: Nhóm protein chức trực tiếp tham gia chống lại với điều kiện hạn (ABA, LEA, proline, mannitol, sorbitol ) Nhóm protein điều khiển biểu của gene chức liên quan đến tính chịu hạn (nhân tố phiên mã, kinase ) Cơ chế biểu • * Nhân tố phiên mã OsNAC6 Họ NAC chứa trình tự đồng (được phát từ petunia NAM và từ Arabidopsis ATAF1, ATAF2 và CUC) - Có vai trò quan trọng việc xác định mô phân sinh đỉnh chồi - Phản ứng với điều kiện bị tổn thương và tác nhân gây hại công - Tăng cường tính chịu hạn Thiết kế vector chuyển gene mang gene OsNAC6 kỹ thuật Gatewaya  Tạo vector chuyển gene Việc gắn cấu trúc gene gồm promoter Ubiquitin, OsNAC6 và trình tự kết thúc phiên mã vector pUC19-Ubi- OsNAC6 vào vector nhận pBCKH để tạo vector chuyển gene pBCKH-Ubi-OsNAC6 thực theo quy trình Gateway kit (Invitrogene) Phản ứng gateway tiến hành hỗn hợp phản ứng μl với thành phần phản ứng : LR clonase buffer : μl Vecor cho (pUC19-Ubi) 100 ng/μl : 0,5 μl Vector nhận (pBCKH) 20 ng/μl : 0,5 μl TE : 2,5 μl LR clonase : 0.5μl Tổng thể tích : μl Thiết kế vector chuyển gene mang gene OsNAC6 kỹ thuật Gatewaya 0 Hỗn hợp phản ứng ủ 25 C thời gian 1giờ, sau bổ sung 0,5 μl proteinase K ủ 37 C 10 phút để loại bỏ protein 1,5 μl hỗn hợp phản ứng dùng để biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α trình bày mục 2.2.1.4 Các khuẩn lạc mọc môi trường LB chứa 50 μg/ml kanamycine kiểm tra có mặt của gene OsNAC6 vector chuyển gene pBCKH phản ứng PCR với cặp mồi: OsNac6-F/Out-R, Ubi-F/OsNac6-R, Ubi-F/Nos-RT50, OsNac6-F/OsNac6R (bảng 1) Các khuẩn lạc chứa vector chuyển gene pBCKH mang gene OsNAC6 sàng lọc môi trường LB lỏng chứa 50 μg/ml kanamycin Tạo tế bào Agrobacterium tái tổ hợp có mang gen OsNAC6 A CHUẨN BỊ TẾ BÀO KHẢ BIẾN B BIẾN NẠP BẰNG XUNG ĐIỆN Chuẩn bị tế bào khả biến Bước 1: Nuôi cấy 5ml A.Tumefaciens 500ml YEM, lắc 200v/p, 28 C, 8h, OD=0.5 – 0.8 ->Tăng sinh vi khuẩn Bước 2: Ly tâm lạnh 6000v/p, phút, C -> Thu sinh khối tế bào(cặn) Bước 3: Hòa tan - 10ml nước lạnh, trộn đều, them tiếp đến 500ml nước lạnh, ly tâm 6000v/p, phút, C -> Thu cặn tế bào Bước 4: Thêm 250 ml nước đá, ly tâm 6000v/p, phút, C -> Thu cặn tế bào Bước 5: Bổ sung 5ml glycerol 10% -> bảo vệ tế bào Bước 6: Bảo quản Nitơ lỏng -80 C Biến nạp gene OsNAC6 vào tế bào khả biến Bước 1: Trộn 100ng plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến Agrobacterium EHA105, trộn đều, để hỗn hợp đá 30 phút Bước 2: Chuyển hỗn hợp vào cuvet điện, ủ đá - 10 phút, tiến hành biến nạp máy xung điện: Điện dung 25μF, Điện 2.4 KV, Điện trở 200 Ω, Thời gian 5s Bước 3: Chuyển qua ống falcol, ủ 4h, 28 C Bước 4: Ly tâm, bỏ dịch giữ lại 50 - 100 μl, cấy trang lên môi trường LB đặc có bổ sung 50mg/l Kanamycin, ủ ngày, 28 C Bước 5: Nuôi khuẩn lạc đơn môi trường YEB lỏng có bổ sung 50mg/l Kanamycin, lắc 200v/p qua đêm Bước 6: Tách chiết plasmid, điện di để kiểm tra Bước 7: Bảo quản khuẩn lạc có kết quả dương tính môi trường YEB, có bổ sung glycerol 15% trước làm lạnh đến -70 C Chuyển gene OsNAC6 vào giống lúa Pusa Basmati thông qua vi khuẩn Agrobacterium A Tạo callus B Nuôi cấy Agrobacterium Tumefaciens C Lây nhiễm D Chọn lọc và tái sinh Tạo callus Hạt lúa bóc vỏ, rửa nước cất 4-5 lần, ngâm và lắc nhẹ cồn 70%, phút Rửa lại nước cất khử trùng, ngâm Javel 50% có bổ sung tween 20 20 phút Rửa lại nước cất 4-5 lần Thấm khô Đặt hạt vào môi trường MS có bổ sung 2,4-D, BAP, casein, L-proline , giữ tối 28 C, 15 ngày Nhiễm callus với Agrobacterium EHA105 Bước 1: Tế bào Agrobacterium EHA105 chứa gene OsNAC6 nuôi qua đêm và đo OD600, sau đem ly tâm 3000 vòng/phút 15 phút, thu tủa và hòa tan vào môi trường MS lỏng, sau pha loãng tới nồng độ OD600 = 0,5, bổ sung Acetosyringone nồng độ 30 μg/ml Bước 2: Các callus cho vào ống fancol chứa dung dịch MS hòa Agrobacterium EHA105 chuẩn bị, lắc máy lắc 30 phút Bước 3: Callus đổ lưới khử trùng và làm khô cách đặt lên giấy thấm khử trùng để loại bỏ Agrobacterium còn lại, sau callus chuyển lên môi trường Đồng nuôi cấy có ngăn giấy lọc Các callus sau nhiễm Agrobacterium EHA105 chứa gene OsNAC6 nuôi tối 280C ngày Chọn lọc và tái sinh Sau trình lây nhiễm, Callus rửa nhiều lần nước đường khử trùng có bổ sung 500 mg/l cefotaxim, làm khô giấy thấm để loại bỏ Agrobacterium EHA105 Chuyển Callus sang môi trường chọn lọc 50 mg/l hygromycin, nuôi cấy tuần, 28 C, hết tuần chuyển sang đĩa Chuyển Callus sang môi trường chọn tái sinh lọc, 25 C, độ ẩm từ 50 - 70%, quang chu kỳ 16 giờ/ngày, 3.000 Lux Các giai đoạn tạo chủng lúa Chứa gen OsNAC6 KẾT QUẢ Từ 100 hạt lúa đem vào nuôi cấy môi trường MS2, thu 95 callus và sử dụng số lượng callus này để tiến hành lây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium Sau 15 ngày nuôi cấy môi trường chọn lọc, có 20 callus sống sót và chuyển sang môi trường tái sinh Sau tuần tái sinh, kết quả thu 12 callus có chồi sinh trưởng bình thường Tổng số thu 12 dòng lúa sinh trưởng và phát triển bình thường Kiểm tra chuyển gene A Tách chiết DNA tổng số Thực theo phương pháp tách chiết plasmid B Thực pư PCR và điện di để kiểm tra Kết quả: Có 11 dòng lúa chuyen gene OsNAC6 thành công Có dòng lúa không cho kết quả PCR Hình Điện di sản phẩm nhân gene mã hoá nhân tố phiên mã OsNAC6 các dòng lúa Pusa Basmati chuyển gene KẾT LUẬN • Việc nghiên cứu thực chuyển gene giống lúa Basmati thành công tạo sở, nguồn cung cấp liệu cho việc thực tạo giống lúa mới, có khả chịu hạn nước ta • Góp phần vào khắc phục với tình trạng biến đổi khí hậu ảnh hưởng đến thời tiết, môi trường sống của trồng • Tạo hướng nghiên cứu tích cực CẢM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN ĐÃ CHÚ Ý LẮNG NGHE ... Các gene chức biểu Các gene chức Thực vật tăng cường tính chịu hạn SƠ ĐỒ THỰC HIỆN Gene OsNAC6 Phản ứng PCR Sản phẩm PCR gene OsNAC6 lần E.Coli DH5α Phản ứng PCR Nuôi LB Sản phẩm PCR gene... Kiểm tra chuyển gene Trồng ngoài thực địa NHÂN GENE OsNAC6 TỪ THƯ VIỆN BẰNG KỸ THUẬT PCR Gene OsNAC6 Phản ứng PCR Sản phẩm PCR gene OsNAC6 lần Phản ứng PCR Sản phẩm PCR gene Chu trình H2O... vùng khởi động gene của gene chức => hoạt hóa biểu của gene này => tăng cường tính chịu hạn Cơ chế biểu • * Nhân tố phiên mã OsNAC6 Điều kiện hạn hán Nhận, truyền tín hiệu Các gene điều khiển