BƯỚC đầu NGHIÊN cứu THÀNH PHẦN AGLYCON TRONG HOA LOÀI HOA HUỆ (POLIANTHES TUBEROSA l)

Nghiên cứu và phân lập aglycon trong hoa loài hoa huệ (Polianthes tuberosa L) Hợp chất thiên nhiên đã và đang có vai trò rất quan trọng trong đời sống con người. Chúng là nguồn cung cấp nguyên liệu cho các ngành công nghiệp, nông nghiệp, mĩ phẩm, dược phẩm...Các hợp chất tìm thấy trong thiên nhiên có hoạt tính sinh học tốt có thể được dùng trực tiếp trong y học 12 và chúng được phát hiện ngày càng nhiều. Đến nay, hợp chất thiên nhiên và dẫn xuất của chúng chiếm 50% lượng thuốc điều trị lâm sàng. Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, thời tiết nóng ẩm nên có thảm thực vật phong phú và đa dạng. Theo các số liệu thống kê mới nhất, có khoảng 3200 trong số 12000 loài thực vật được dùng làm thuốc chữa bệnh, đây là nguồn cung cấp các hợp chất thiên nhiên quý báu. Ở Việt Nam thực vật họ Thùa (Agavaceae) khá đa dạng1, trong đó có nhiều loài có giá trị sử dụng cao, được dùng làm thuốc chữa nhiều bệnh. Tuy nhiên, việc nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của các loài này chưa đầy đủ, thậm chí có loài hầu như chưa được nghiên cứu. Hiện nay tỉ lệ người mắc một số bệnh như: ung thư và các bệnh về thần kinh tăng nhanh ở Việt nam và trên thế giới nên nghiên cứu các thực vật này là cần thiết, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Vì vậy, chúng tôi chọn đề tài “Bước đầu nghiên cứu thành phần aglycon trong hoa loài Hoa huệ (Polianthes tuberosa L.)” nhằm góp phần nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài thực vật này. Kết quả của đề tài sẽ góp phần định hướng cho việc ứng dụng loài thực vật này để sử dụng trong chữa bệnh. Đồng thời các kết quả của đề tài cũng góp phần nâng cao giá trị của loài thực vật này.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Văn Khang

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Hợp chất thiên nhiên đã và đang có vai trò rất quan trọng trong đời sốngcon người Chúng là nguồn cung cấp nguyên liệu cho các ngành công nghiệp,nông nghiệp, mĩ phẩm, dược phẩm Các hợp chất tìm thấy trong thiên nhiên cóhoạt tính sinh học tốt có thể được dùng trực tiếp trong y học [1-2] và chúng đượcphát hiện ngày càng nhiều Đến nay, hợp chất thiên nhiên và dẫn xuất của chúngchiếm 50% lượng thuốc điều trị lâm sàng

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, thời tiết nóng ẩm nên có thảm thựcvật phong phú và đa dạng Theo các số liệu thống kê mới nhất, có khoảng 3200trong số 12000 loài thực vật được dùng làm thuốc chữa bệnh, đây là nguồn cungcấp các hợp chất thiên nhiên quý báu

Ở Việt Nam thực vật họ Thùa (Agavaceae) khá đa dạng[1], trong đó cónhiều loài có giá trị sử dụng cao, được dùng làm thuốc chữa nhiều bệnh Tuynhiên, việc nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của các loài nàychưa đầy đủ, thậm chí có loài hầu như chưa được nghiên cứu Hiện nay tỉ lệ ngườimắc một số bệnh như: ung thư và các bệnh về thần kinh tăng nhanh ở Việt nam vàtrên thế giới nên nghiên cứu các thực vật này là cần thiết, có ý nghĩa khoa học vàthực tiễn

Vì vậy, chúng tôi chọn đề tài “Bước đầu nghiên cứu thành phần aglycon trong hoa loài Hoa huệ (Polianthes tuberosa L.)” nhằm góp phần nghiên cứu thành phần

hóa học và hoạt tính sinh học của loài thực vật này Kết quả của đề tài sẽ góp phầnđịnh hướng cho việc ứng dụng loài thực vật này để sử dụng trong chữa bệnh Đồngthời các kết quả của đề tài cũng góp phần nâng cao giá trị của loài thực vật này

2 Nhiệm vụ nghiên cứu

 Chiết xuất, phân lập aglycon trong sản phẩm thủy phân axit của hoa loài

3 Đối tượng nghiên cứu

Dịch chiết từ hoa loài Hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) trong các dung môi

có độ phân cực khác nhau

4 Nội dung

 Thu thập mẫu nghiên cứu

 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

 Phân lập các aglycon thừ mẫu nghiên cứu

 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

 Cung cấp thông tin, cơ sở, làm tư liệu cho việc nghiên cứu sau này

 Tìm hiểu những đặc trưng cấu trúc nổi bật của các hợp chất có hoạttính và khả năng biến đổi cấu trúc để có hoạt tính tốt hơn

 Giải thích một cách khoa học một số kinh nghiệm dân gian trong ứngdụng của Hoa huệ

 Tổng hợp kiến thức về hợp chất thiên nhiên phục vụ cho giảng dạy ởtrường THPT sau này

 Góp phần định hướng nuôi trồng, sử dụng và khai thác hợp lí loài Hoahuệ ở Việt Nam

 Tạo cơ sở khoa học cho việc sử dụng nguồn thực vật của Việt Nammột cách hiệu quả

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu sơ lược về loài Hoa huệ (Polianthes tuberosa L.)

1.1.1.Nguồn gốc

Hoa huệ có tên khoa học là Polianthes tuberosa L., thuộc họ Thùa

(Agavaceae) Đây là loài cho hoa quanh năm, có nguồn gốc chủ yếu từ Mexico vàhiện nay đã có mặt ở nhiều nước trên thế giới như: Việt Nam, Singapore,Indonexia, Iran, Loài thực vật này đã được du nhập vào Việt Nam từ lâu và hiệnnay, Hoa huệ đang được trồng chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam, đặc biệt là

các vùng trồng hoa lân cận Hà Nội

1.1.2.Phân loại

Trong hệ thống phân loại thực vật học:

 Giới : cây trồng (Plantae).

 Lớp : một lá mầm (Monocotylendon).

 Bộ : hành (Liliadae).

 Họ : thủy tiên (Amaryllidaceae), sau này xếp vào họ Thùa (Agavaceae).

Ở Việt Nam hiện nay, dựa vào đặc điểm của hoa thì chia thành 2 giống, chủyếu là huệ đơn và huệ kép :

- Huệ đơn (huệ xẻ) : cây thấp, mảnh khảnh, cánh hoa nhỏ, bông chỉ có mộtlớp cánh nhưng hương thơm rất đậm

- Huệ kép (huệ tứ diện): cây cao, hoa dày và bông dài hơn huệ đơn nhưnghương thơm kém hơn[3]

a) Hình ảnh của giống huệ đơn

b) Hình ảnh của giống huệ kép

Hình 1.1: Hình ảnh loài Hoa huệ (Polianthes tuberosa L.)

1.1.3 Đặc điểm thực vật học

Cây Hoa huệ là cây ưa ánh sáng, cho hoa quanh năm Tuy nhiên, Hoa huệ

nở chủ yếu vào mùa hè còn mùa đông cho ít hoa, hoa nhỏ, bông ngắn hơn

- Thân : Hoa huệ thuộc cây thân thảo, thân hành, hay còn gọi là thân giả

được kết bởi các bẹ lá xếp chồng lên nhau, bẹ lá trước xếp chồng lên bẹ lá sau,thân thẳng đứng, không phân nhánh, vươn lên thành ngồng hoa cao khoảng 0,8-1m

- Lá : cây Hoa huệ có lá đơn mọc quanh gốc, xanh và dài, cuống góc lá

rộng và to thành hình như cái bao bao lấy củ, giữa phiến lá và bẹ lá không phânbiệt rõ ràng, chiều dài lá khoảng 20-30cm, bề rộng của lá từ 0,5-1cm

- Hoa : Hoa huệ có màu trắng, bao hoa hình phễu, nhị gắn giữa ống bầu,

hoa có vị ngọt, hơi chát, thơm, không độc Hoa huệ có cấu tạo cánh khá đặc biệt,khi không khí có độ ẩm cao, những khí khổng (lỗ trao đổi khí) trên cánh hoa tựđộng mở to để dầu thơm thoát ra ngoài Ban đêm tuy không có nắng, nhưng độ

ẩm không khí lại cao hơn ban ngày, cho nên các khí khổng mở to cho mùi thơmthoát ra (mở túi thơm) Chính vì thế, ban ngày Hoa huệ chỉ toả hương thoangthoảng, nhưng ban đêm nó lại thơm ngào ngạt Hoa huệ toả mùi thơm theo độ ẩm,

vì vậy không chỉ ban đêm, mà vào ban ngày, kể cả khi trời mưa, độ ẩm không khícao, Hoa huệ cũng thơm hơn ngày nắng Tập tính nở về đêm của Hoa huệ hìnhthành qua quá trình tiến hóa Do hoa tỏa ra mùi thơm để thu hút côn trùng đến thụphấn, duy trì nòi giống, vì vậy hoa thụ phấn nhờ vào các loại côn trùng hoạt độngvào ban đêm đặc biệt là Hoa huệ thụ phấn nhờ bướm đêm, nên phải nở vào banđêm để thu hút những loài côn trùng này Nhiều người cho rằng hương thơm củaHoa huệ không tốt cho sức khoẻ nên ít ai cắm Hoa huệ trong phòng ngủ, nếu cóthì ban đêm phải đưa ra ngoài sân Ở Việt Nam, Hoa huệ là thứ hoa được dùngnhiều trong việc cúng, lễ mà ít dùng để tặng nhau

- Củ và rễ : cây Hoa huệ có bộ rễ chùm phát triển mạnh, rễ phân bố chủ

yếu ở lớp đất mặt 0-15cm, củ huệ thực chất chính là thân ngầm của cây, màu nâu,

có dạng như quả lê, to 10-12cm [3]

Trong đề tài này, chúng tôi nghiên cứu chủ yếu trên hoa của loài Hoa huệ

1.2 Các nghiên cứu sử dụng trong y học dân gian

Từ lâu trong dân gian đã sử dụng loài Hoa huệ để chữa bệnh sốt rét, ngoài

ra Hoa huệ còn có tác dụng lợi tiểu, gây nôn và củ huệ được dùng để làm thuốcđắp ngoài da để giảm đau trong các trường hợp đau do thấp khớp, do bong gân,

do ngã, do đòn đánh Nhưng do thành phần hoá học của củ huệ có 12 ancaloitkhác nhau nên có thể gây ngộ độc khi ăn phải Vì vậy, sau khi đắp thuốc chongười bệnh phải rửa sạch tay và dụng cụ cắt, giã Nếu sơ ý cầm thức ăn trong khi

1.3 Các nghiên cứu về thành phần hóa học

Đến nay, một số nghiên cứu đã công bố về thành hóa học của Hoa huệ đãđược đăng tải Các kết quả cho thấy thành phần chính là các saponin có chứa cácsapogenin như hecogenin, tigogenin và một số aglycon khác, trong đó, tigogenin

là aglycon có hàm lượng lớn nhất trong loài Hoa huệ, thể hiện một loạt các hoạttính sinh học có giá trị như: ức chế tế bào ung thư, chống viêm, chống oxi hóa và

có vai trò trong điều trị bệnh tiểu đường

Các aglycon đã phân lập ra từ loài thực vật này được xác định là saponin cókhung aglycon là spirostanol như: tigogenin, hay furostanol như hecogenin, 9-dehydroxyhecogenin và 5α-spirostan-12-one, một số khung đã được mở dị vòng 6cạnh chứa oxi[4-14] Các ví trí số 3 và 26 (dạng mở vòng) thường có các liên kếtglycozit với một hoặc nhiều phân tử đường

O

O H

H

H H

HO

O

O H

H

H H

HO

O

O

O H

H H HO

O

O

O H

H H HO

H HO

terrestrosin I

OH

O

O H

H

H H

H

HO

5-alpha-furost-3beta,22alpha,26-triol

OH O

Hình 1.2: Cấu trúc của một số aglycon có trong saponin đã phân lập

được từ loài Hoa huệ

Năm 2000, Mimaki và cộng sự [8] đã phân lập các hợp chất từ một số bộphân của loài thực vật này, kết quả cho thấy các chất này thuộc dạng saponin có

khung aglycon dạng cholesterol, (25R)-6α-hydroxy-5α-spirostan-3β-ol, hecogenin

và 5α-spirost-9-en-12-one (9-dehydroxyhecogenin)

Đến năm 2002, cũng nhóm nghiên cứu của Mimaki và cộng sự [7] đã tiếp tụcđăng tải việc phân lập các saponin từ phần dưới mặt đất của loài Hoa huệ thu đượccác chất có khung aglycon là 5-alpha-spirostan-12-one liên kết với 5 phân tửđường.

Năm 2004, Yang và cộng sự [15] phân lập từ Hoa huệ tươi 14 hợp chấtsaponin thuộc dạng spirostanols và furostanol và đánh giá hoạt tính ức chế tế bàoung thư HeLa Các hợp chất này có khung aglycon là tigogenin, chlorogenin, 5α-

furost-3β,22α,26-triol, terrestrosin I.

Bên cạnh các hợp chất saponin đã phân lập được được báo cáo qua cáccông trình đã công bố, trong loài Hoa huệ còn có nhiều tinh dầu và các thành dễhóa hơi Thành phần hóa học và hàm lượng được xác định dựa trên phương phápGC/MS Hơn ba mươi thành phần hóa học đã được nhận diện có trong loài hoanày bằng các phương pháp chiết xuất khác nhau như: chiết xuất bằng lôi cuốn hơinước, chiết siêu âm siêu tới hạn, chiết xuất bằng dung môi hữu cơ.

Hình 1.3: Sắc ký đồ GC của nước ép Hoa huệ[13]

Bảng 1.1: Thành phần các chất trong nước ép Hoa huệ [13]

TT Peak Thời gian lưu(min) % Diện tích píc Chất

Hình 1.4: Sắc ký GC của dịch chiết n-hexan của Hoa huệ [13] Bảng 1.2: Thành phần hóa học trong dịch chiết n-Hexan của Hoa huệ [13] TT

1.4 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của loài Hoa huệ

Loài Hoa huệ thuộc thực vật họ Thùa (Agavaceae) từ lâu đã được sử dụng

để chữa một số bệnh như : trị viêm nhiễm, thấp khớp, Gần đây, nhiều nghiêncứu đã chứng minh dịch chiết và các hợp chất được phân lập từ loài thực vật này

có khả năng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư, có khả năng bảo vệ các tế bào não

dưới các tác động của glutamat, hyperglycemia, β-amyloid và nhiều tác dụng

khác[2,4-6,5-7]

Các hợp chất đã phân lập được từ loài Hoa huệ chủ yếu thể hiện khả năng

ức chế các dòng tế bào ung thư như ung thư máu HL-60 [7-8], tế bào ung thư biểu

bì miệng HSC-2 [8], tế bào ung thư HeLa [9] và một vài dòng tế bào ung thưkhác Bên cạnh khả năng ức chế tế bào ung thư, các hợp chất tách ra còn thể hiệnkhả năng chống oxi hóa [9] và đây là một trong những cơ sở để tiến hành cácnghiên cứu bảo vệ tế bào Đồng thời các hoạt tính này cũng bước đầu định hướngcho việc nghiên cứu ứng dụng loài thực vật này

1.5 Nghiên cứu về aglycon được tách ra từ loài Hoa huệ

Trong số các aglycon được phân lập ra từ loài này thì hecogenin, tigogenin

là hai trong số aglycon được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất Các aglycon nàythể hiện khả năng ức chế tế bào ung thư, bảo vệ tế bào và ức chế các enzym gây

ra bệnh Alzheimer Tuy nhiên hoạt tính của chúng thường không cao và có độctính lớn nên thường được làm nguyên liệu đầu cho các quá trình bán tổng hợphữu cơ

Năm 2010, Poza[10] và các cộng sự đã tổng hợp dãy chất mới

cephalostatin/ ritterazine từ hecogenin và 22-epi-hippuristanol thông qua sự khử

và đồng phân hóa và các phản ứng ngưng tụ giữa enaminoxeton và hydroxyxeton Các dẫn xuất tổng hợp được được tiến hành thử khả năng ức chế tếbào ung thư MDA-MB-231, A-549, và HT-29 Kết quả cho thấy các dẫn xuất mới

α-này có hoạt tính mạnh hơn các 22-epi-hippuristanol.

O OH O

O O

O

Hình 1.5: Cephalostatin/ritterazine từ hecogenin axetat

Cũng trong năm 2010 [11], María và cộng sự tổng hợp dẫn xuất hydroxy-22-oxocholestanic từ hecogenin và bước đầu đánh giá hoạt tính của nótrên dòng tế bào ung thư CaSki, các kết quả cho thấy sự tăng hoạt tính với dòng tếbào này, đồng thời làm giảm độc tính của chúng so với chất đầu

26-Hình 1.6: Trích mục sơ đồ tổng hợp 26-hydroxy-22-oxocholestanic

Năm 2012, Kelly Barbosa Gama đã nghiên cứu về hecogenin và các dẫnxuất của nó Nghiên cứu này đã được thực hiện để đánh giá axetat hecogenin cócác tính chất hạ sốt và kháng viêm

O O

O O

Năm 2015[16], Gasparotto và cộng sự đã nghiên cứu cơ chế tác dụng của

hecogenin axetat, kết quả đã đưa ra một phổ rộng hoạt tính dược lý Ở đây, họ

cũng đã khảo sát ảnh hưởng của hecogenin axetat trên một dòng tế bào ung thư

phổi ở người Hecogenin axetat có tác dụng ức chế đáng kể sự gia tăng các loạiphản ứng trong tế bào gây ra bởi H2O2.

Nhận xét: Qua đây, ta nhận thấy rằng thành phần hóa học quan trong nhấttrong loài Hoa huệ là các saponin có khung cacbon là spirostanols và futostanols.Bên cạnh đó tinh dầu cũng góp phần quan trọng tạo nên sự đa dạng về thành phầnhóa học của loài thực vật này

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Nghiên cứu lí thuyết

Tìm kiếm, thu thập thông tin, tài liệu, tư liệu, sách báo trong và ngoài nước.Trao đổi, học hỏi kinh nghiệm từ thầy cô, bạn bè

2.1.2 Nghiên cứu thực nghiệm

2.1.2.1 Phương pháp xử lí và chiết mẫu

Từ mẫu khô, xử lý bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môithích hợp để thu được các cao chiết dùng cho nghiên cứu

Nguyên tắc lựa chọn dung môi: dung môi chiết phải có độ phân cực phùhợp với aglycon Đối với aglycon chưa biết thì bắt đầu thăm dò từ dung môi kémphân cực đến dung môi phân cực mạnh

2.1.2.2 Phương pháp phân tích, phân tách và phân lập các aglycon

Để phân tích và phân tách cũng như phân lập các aglycon, sử dụng cácphương pháp sắc ký như: Sắc ký cột thường sử dụng silicagel cỡ hạt230-400/mesh; sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích được tiến hành trên bản mỏngnhôm silicagel tráng sẵn (dày 0,2 mm) Hiện màu với thuốc thử là dung dịch

H2SO4 và đèn UV 254 nm

2.1.2.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất

Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương phápphổ: phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H và cacbon 13C và các phương phápkhác

2.2 Hoá chất, dụng cụ và thiết bị

Các dung môi dùng để ngâm chiết mẫu thực vật đều dùng loại tinh khiết, khidùng cho sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA) Dungmôi được sử dụng là: n-hexan, etylaxetat (EA), clorofom, etanol là các dung môi tinhkhiết

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR được đo trên máyBruker 500MHz.

2.3 Nghiên cứu định tính các nhóm chất trong dịch chiết loài Hoa huệ[3] 2.3.1 Định tính polyphenol

- Phản ứng với muối sắt (III)

Tùy theo số lượng và vị trí nhóm hydroxyl trong phân tử polyphenol màcho màu lục, xanh hoặc nâu

2.3.3 Định tính các flavonoit

* Thuốc thử: Dung dịch axit HCl đặc 36% và bột Mg kim loại

* Thí nghiệm: Lấy 0,05g cặn chiết thêm 10mL CH3OH, đun nóng cho tan vàlọc qua giấy lọc Lấy 2mL nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột Mg kimloại, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút đến

và quan sát thấy dung dịch có màu từ vàng, đỏ đến xanh là dương tính với cácflavonoit

* Hiện tượng: Dịch metanol có màu hồng Khi thêm thuốc thử thì có màu hồnghơn

2.3.4 Định tính các cumarin

* Thuốc thử: Dung dịch NaOH 10%

* Thí nghiệm: Lấy vào 2 ống nghiệm mỗi ống 2 mL dịch thử, cho vào mộttrong hai ống đó 0,5 mL dung dịch NaOH 10% Đun cả hai ống trên bếp cáchthuỷ đến sôi, lấy ra để nguội cho thêm 4mL nước cất Nếu chất lỏng ở ống cókiềm trong hơn ống không kiềm có thể xem là dương tính Nếu đem axit hoá ốngnghiệm có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc mà làm cho dịch đang trong suốthoặc có màu vàng xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra kết tủa là dương tính

2.4 Nghiên cứu các aglycon từ hoa loài Hoa huệ

2.4.1 Mẫu nghiên cứu

Mẫu nghiên cứu là mẫu khô hoa loài Hoa huệ được bảo quản cẩn thậntrước khi tiến hành nghiên cứu