BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN AGLYCON TRONG HOA LOÀI HOA HUỆ (POLIANTHE TUBEROSA L)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ROÃN THỊ CHINH BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN AGLYCON TRONG HOA LỒI HOA HUỆ (POLIANTHES TUBEROSA L.) Chun ngành: Hố học ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Văn Khang Thái Nguyên, năm 2016 LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn thầy giáo, giáo Khoa Hóa học, Bợ mơn Hóa Hữu tḥc Khoa Hóa học, anh chị làm luận văn bạn sinh viên nghiên cứu khoa học Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư Phạm - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ chúng em trình học tập nghiên cứu Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn thầy giáo, TS Phạm Văn Khang, thầy hướng dẫn bảo tận tình cho em q trình thực hiện hồn thành đề tài Đồng thời em xin chân thành cảm ơn Học viên Nguyễn Hữu Phong (K22) CN Đào Mai Phương (K47) giúp đỡ em trình nghiên cứu giúp thực nghiệm đo phổ chất Do bước đầu làm quen với nghiên cứu khoa học một số yếu tố khách quan khác nên đề tài nghiên cứu khoa học em tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận được góp ý bảo thầy giáo, cô giáo bạn để đề tài được hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng năm 2016 Sinh viên Roãn Thị Chinh MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT  1H-NMR: Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton)  13C-NMR: Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13)  GC-MS: Gas Chromatography Mass Spectometry (Phương pháp Sắc ký khí       kết hợp với Khối phổ) UV-B: Ultra violet B (tia cực tím B) TLC: Thin Layer Chromatography (Sắc kí lớp mỏng) EA: Etylaxetat CHCl3: Cloroform CCl4: Cacbon tetraclorua CH3OH:Metanol DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH, SƠ ĐỒ  Bảng Bảng 1.1: Thành phần chất nước ép Hoa huệ 16 Bảng 1.2: Thành phần hóa học dịch chiết n-Hexan Hoa huệ 17 Bảng 3.1: Kết định tính mợt số nhóm chất hữu có dịch chiết etanol 90% hoa loài Hoa huệ 26 Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR hợp chất tham khảo 27 Bảng 3.3: Số liệu phổ NMR hợp chất tham khảo 30  Hình Hình 1.1: Hình ảnh lồi Hoa ḥ (Polianthes tuberosa L.) Hình 1.2: Cấu trúc mợt số aglycon có saponin phân lập được từ loài Hoa huệ 12 Hình 1.3: Sắc ký đồ GC nước ép Hoa huệ 16 Hình 1.4: Sắc ký GC dịch chiết n-hexan Hoa huệ 17 Hình 1.5: Cephalostatin/ritterazine từ hecogenin axetat .19 Hình 1.6: Trích mục sơ đồ tổng hợp 26-hydroxy-22-oxocholestanic 19 Hình 3.1: Phổ 1H NMR chất 29 Hình 3.2: Phổ 13C NMR chất .29 Hình 3.3: Cấu trúc stigmasterol 30 Hình 3.4: Phổ 1H NMR chất 32 Hình 3.5: Phổ 13C NMR chất .32 Hình 3.6 : Cấu trúc β-sitosterol .33  Sơ đồ Sơ đồ 2.1 : Sơ đồ nghiên cứu hoa loài Hoa huệ 18 Sơ đồ 2.2 : Sơ đồ phân lập hợp chất 25 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Hợp chất thiên nhiên có vai trị quan trọng đời sống người Chúng nguồn cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp, nơng nghiệp, mĩ phẩm, dược phẩm Các hợp chất tìm thấy thiên nhiên có hoạt tính sinh học tốt được dùng trực tiếp y học [1-2] chúng được phát hiện ngày nhiều Đến nay, hợp chất thiên nhiên dẫn xuất chúng chiếm 50% lượng thuốc điều trị lâm sàng Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, thời tiết nóng ẩm nên có thảm thực vật phong phú đa dạng Theo số liệu thống kê nhất, có khoảng 3200 số 12000 loài thực vật được dùng làm thuốc chữa bệnh, nguồn cung cấp hợp chất thiên nhiên quý báu Ở Việt Nam thực vật họ Thùa (Agavaceae) đa dạng[1], có nhiều lồi có giá trị sử dụng cao, được dùng làm thuốc chữa nhiều bệnh Tuy nhiên, việc nghiên cứu thành phần hố học hoạt tính sinh học lồi chưa đầy đủ, chí có lồi chưa được nghiên cứu Hiện tỉ lệ người mắc một số bệnh như: ung thư bệnh về thần kinh tăng nhanh Việt nam giới nên nghiên cứu thực vật cần thiết, có ý nghĩa khoa học thực tiễn Vì vậy, chúng tơi chọn đề tài “Bước đầu nghiên cứu thành phần aglycon hoa loài Hoa huệ (Polianthes tuberosa L.)” nhằm góp phần nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi thực vật Kết đề tài góp phần định hướng cho việc ứng dụng loài thực vật để sử dụng chữa bệnh Đồng thời kết đề tài góp phần nâng cao giá trị loài thực vật Nhiệm vụ nghiên cứu  Chiết xuất, phân lập aglycon sản phẩm thủy phân axit hoa loài Hoa huệ  Xác định cấu trúc aglycon thu được phương pháp vật lí Đối tượng nghiên cứu Dịch chiết từ hoa loài Hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) dung mơi có đợ phân cực khác Nội dung     Thu thập mẫu nghiên cứu Tổng quan về đối tượng nghiên cứu Phân lập aglycon thừ mẫu nghiên cứu Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập được Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài  Cung cấp thông tin, sở, làm tư liệu cho việc nghiên cứu sau  Tìm hiểu đặc trưng cấu trúc bật hợp chất có hoạt tính khả biến đổi cấu trúc để có hoạt tính tốt  Giải thích mợt cách khoa học một số kinh nghiệm dân gian ứng dụng Hoa huệ  Tổng hợp kiến thức về hợp chất thiên nhiên phục vụ cho giảng dạy trường THPT sau  Góp phần định hướng ni trồng, sử dụng khai thác hợp lí lồi Hoa ḥ Việt Nam  Tạo sở khoa học cho việc sử dụng nguồn thực vật Việt Nam một cách hiệu Chương TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu sơ lược loài Hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) 1.1.1.Nguồn gốc Hoa huệ có tên khoa học Polianthes tuberosa L., tḥc họ Thùa (Agavaceae) Đây lồi cho hoa quanh năm, có nguồn gốc chủ yếu từ Mexico hiện có mặt nhiều nước giới như: Việt Nam, Singapore, Indonexia, Iran, Loài thực vật được du nhập vào Việt Nam từ lâu hiện nay, Hoa huệ được trồng chủ yếu tỉnh phía Bắc Việt Nam, đặc biệt vùng trồng hoa lân cận Hà Nội 1.1.2.Phân loại Trong hệ thống phân loại thực vật học: • Giới : trồng (Plantae) • Lớp : mợt mầm (Monocotylendon) • Bộ : hành (Liliadae) • Họ : thủy tiên (Amaryllidaceae), sau xếp vào họ Thùa (Agavaceae) Ở Việt Nam hiện nay, dựa vào đặc điểm hoa chia thành giống, chủ yếu huệ đơn huệ kép : - Huệ đơn (huệ xẻ) : thấp, mảnh khảnh, cánh hoa nhỏ, có mợt lớp cánh hương thơm đậm - Huệ kép (huệ tứ diện): cao, hoa dày dài huệ đơn hương thơm hơn[3] a) Hình ảnh giống huệ đơn b) Hình ảnh giống ḥ kép Hình 1.1: Hình ảnh lồi Hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) 1.1.3 Đặc điểm thực vật học Cây Hoa huệ ưa ánh sáng, cho hoa quanh năm Tuy nhiên, Hoa huệ nở chủ yếu vào mùa hè cịn mùa đơng cho hoa, hoa nhỏ, ngắn - Thân : Hoa huệ thuộc thân thảo, thân hành, hay gọi thân giả được kết bẹ xếp chồng lên nhau, bẹ trước xếp chồng lên bẹ sau, thân thẳng đứng, không phân nhánh, vươn lên thành ngồng hoa cao khoảng 0,81m - Lá : Hoa huệ có đơn mọc quanh gốc, xanh dài, cuống góc rợng to thành bao bao lấy củ, phiến bẹ không phân biệt rõ ràng, chiều dài khoảng 20-30cm, bề rộng từ 0,5-1cm - Hoa : Hoa ḥ có màu trắng, bao hoa hình phễu, nhị gắn ống bầu, hoa có vị ngọt, chát, thơm, khơng đợc Hoa ḥ có cấu tạo cánh đặc biệt, khơng khí có đợ ẩm cao, khí khổng (lỗ trao đổi khí) cánh hoa tự đợng mở to để dầu thơm ngồi Ban đêm khơng có nắng, đợ ẩm khơng khí lại cao ban ngày, khí khổng mở to cho mùi thơm (mở túi thơm) Chính thế, ban ngày Hoa huệ toả hương thoang thoảng, ban đêm lại thơm ngào ngạt Hoa ḥ toả mùi thơm theo đợ ẩm, khơng ban đêm, mà vào ban ngày, kể trời mưa, đợ ẩm khơng khí cao, Hoa ḥ thơm ngày nắng Tập tính nở về đêm Hoa ḥ hình thành qua q trình tiến hóa Do hoa tỏa mùi thơm để thu hút côn trùng đến thụ phấn, trì nịi giống, hoa thụ phấn nhờ vào loại côn trùng hoạt động vào ban đêm đặc biệt Hoa huệ thụ phấn nhờ bướm đêm, nên phải nở vào ban đêm để thu hút lồi trùng Nhiều người cho hương thơm Hoa huệ không tốt cho sức khoẻ nên cắm Hoa ḥ phịng ngủ, có ban đêm phải đưa ngồi sân Ở Việt Nam, Hoa huệ thứ hoa được dùng nhiều việc cúng, lễ mà dùng để tặng - Củ rễ : Hoa huệ có bộ rễ chùm phát triển mạnh, rễ phân bố chủ yếu lớp đất mặt 0-15cm, củ huệ thực chất thân ngầm cây, màu nâu, có dạng lê, to 10-12cm [3] Trong đề tài này, chúng tơi nghiên cứu chủ yếu hoa lồi Hoa huệ 1.2 Các nghiên cứu sử dụng y học dân gian 10 Các dung môi dùng để ngâm chiết mẫu thực vật đều dùng loại tinh khiết, dùng cho sắc ký lớp mỏng sắc ký cột sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA) Dung mơi được sử dụng là: n-hexan, etylaxetat (EA), clorofom, etanol dung môi tinh khiết Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR 13 C-NMR được đo máy Bruker 500MHz 2.3 Nghiên cứu định tính nhóm chất dịch chiết lồi Hoa huệ[3] 2.3.1 Định tính polyphenol - Phản ứng với muối sắt (III) Tùy theo số lượng vị trí nhóm hydroxyl phân tử polyphenol mà cho màu lục, xanh nâu - Tác dụng với H2SO4 đặc Khi nhỏ H2SO4 lên dẫn xuất flavon flavonol cho màu vàng đậm, chalcon auron cho màu đỏ, đỏ thắm đỏ tươi; flavanon cho màu đỏ da cam chuyển thành chalcon 2.3.2 Định tính alkaloit * Các thuốc thử sử dụng - Thuốc thử Dragendorff Dung dịch A: Hòa tan 0,05 g bitmut nitrat (Bi(NO3)3 5H2O) 20 mL dung dịch axit axetic 20% Dung dịch B: mL dung dịch KI 40% nước Trước sử dụng trộn 20 mL dung dịch A, mL dung dịch B 70 mL H2O - Thuốc thử Mayer Dung dịch A: hòa tan 1,36 g HgCl2 60mL H2O Dung dịch B: Hòa tan 5g KI 10mL H2O Trộn hai dung dịch lại, thêm nước vừa đủ 100mL * Thí nghiệm: Lấy 0,05g cặn chiết cho thêm mL H 2SO4 5%, khuấy đều, lọc qua giấy lọc Cho vào ống nghiệm, ống mL nước lọc axít thêm: 22 - Ống 1: 1-2 giọt thuốc thử Dragendorff, xuất hiện màu da cam phản ứng dương tính Ống 2: 3-5 giọt thuốc thử Mayer thấy xuất hiện kết tủa trắng dương tính * Hiện tượng - Ống 1: Dung dịch chuyển sang màu da cam - Ống 2: Xuất hiện kết tủa trắng 2.3.3 Định tính flavonoit * Thuốc thử: Dung dịch axit HCl đặc 36% bột Mg kim loại * Thí nghiệm: Lấy 0,05g cặn chiết thêm 10mL CH3OH, đun nóng cho tan lọc qua giấy lọc Lấy 2mL nước lọc vào ống nghiệm, thêm mợt bợt Mg kim loại, sau cho vào giọt HCl đậm đặc, đun bình cách thuỷ vài phút đến quan sát thấy dung dịch có màu từ vàng, đỏ đến xanh dương tính với flavonoit * Hiện tượng: Dịch metanol có màu hồng Khi thêm thuốc thử có màu hồng 2.3.4 Định tính cumarin * Thuốc thử: Dung dịch NaOH 10% * Thí nghiệm: Lấy vào ống nghiệm ống mL dịch thử, cho vào mợt hai ống 0,5 mL dung dịch NaOH 10% Đun hai ống bếp cách thuỷ đến sôi, lấy để nguội cho thêm 4mL nước cất Nếu chất lỏng ống có kiềm ống khơng kiềm xem dương tính Nếu đem axit hố ống nghiệm có kiềm một vài giọt HCl đậm đặc mà làm cho dịch suốt có màu vàng xuất hiện vẩn đục tạo kết tủa dương tính 2.3.5 Phản ứng Steroit 23 Phản ứng Liebermann – Burchardt: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn glycozittim 1ml anhydrit axetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống 45 0, cho từ từ theo thành ống 0,5ml axit sunfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng ống Ở mặt tiếp xúc hai lớp chất lỏng xuất hiện mợt vịng màu tím đỏ Lớp chất lỏng phía có màu hồng, lớp có màu xanh 2.4 Nghiên cứu aglycon từ hoa loài Hoa huệ 2.4.1 Mẫu nghiên cứu Mẫu nghiên cứu mẫu khơ hoa lồi Hoa ḥ được bảo quản cẩn thận trước tiến hành nghiên cứu 2.4.2 Phân lập hợp chất Mẫu khô (3kg) sau lấy về được chiết hồi lưu với etanol 90% nhiệt độ 70˚c thời gian 3h lặp lại lần Cất thu hồi dung môi được 700 gam cặn chiết etanol, sau chiết với cloroform để loại diệp lục chất béo Phần dịch chiết được tiến hành thủy phân dung dịch H 2SO4 10% thời gian có đun hồi lưu Sau kết thúc thủy phân, hỗn hợp được trung hịa đến mơi trường trung tính NaOH đặc Phần chất rắn dung dịch được chiết với dung môi cloroform, etyl axetat Cất thu hồi dung môi được cao chiết tương ứng có khối lượng là: 50 gam; 50 gam Cao chiết cloroform được tiến hành sắc ký cột silicagel (500 g) với hệ dung môi n-hexan:axeton = 25:1 (v/v), cợt có kích thước x 60 cm với hệ dung môi rửa giải PE/Axeton với tỉ lệ từ 50/1-5/1 (v/v) thu được phân đoạn Phân đoạn gồm ống số đến 10 được gộp lại, được tiến hành sắc ký cột silicagel lần với hệ dung môi n-hexan:EA = 15:1 (v/v), kết tinh lại thu được chất tinh khiết : 30 mg chất rắn không màu 20mg chất rắn màu trắng vơ định hình Chất rắn được đem đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc Sơ đồ 2.1 : Sơ đồ nghiên cứu hoa loài Hoa huệ 24 kg mẫu hoa - Làm nhỏ - Chiết etanol (90%) Cặn chiết etanol 700 g - Thủy phân axit H2SO4 đặc - Trung hòa NaOH - Lọc thu cặn - Chiết cloroform, etylxetat Cao cloroform 50 g Cao etyl axetat 55g Phần không tan Sơ đồ 2.2 : Sơ đồ phân lập hợp chất Cao CHCl3 ( 50g) - Sắc kí cột silicagel - Hệ dung môi n-hexan:axeton = 25:1 (v/v) Phân đoạn1 ống 01-05 Phân đoạn ống 06-10 Phân đoạn ống 16-18 Phân đoạn ống 11-15 Phân đoạn ống 19-22 Phân đoạn ống 23-25 - Sắc kí cột silicagel - Hệ dung môi n-hexan:EA = 15:1 (v/v) Kết tinh lại thu 30mg Chất rắn Kết tinh lại thu 20mg Chất rắn 25 Xác định cấu trúc Phân đoạn ống 26-28 ... nên nghiên cứu thực vật cần thiết, có ý nghĩa khoa học thực tiễn Vì vậy, chúng chọn đề tài ? ?Bước đầu nghiên cứu thành phần aglycon hoa loài Hoa huệ (Polianthes tuberosa L.)” nhằm góp phần nghiên. .. sở để tiến hành nghiên cứu bảo vệ tế bào Đồng thời hoạt tính bước đầu định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng loài thực vật 1.5 Nghiên cứu aglycon tách từ loài Hoa huệ Trong số aglycon được... hồng, lớp có màu xanh 2.4 Nghiên cứu aglycon từ hoa loài Hoa huệ 2.4.1 Mẫu nghiên cứu Mẫu nghiên cứu mẫu khơ hoa lồi Hoa ḥ được bảo quản cẩn thận trước tiến hành nghiên cứu 2.4.2 Phân lập hợp