Đông lạnh phôi

Đông lạnh phôi là trữ lạnh phôi ở nhiệt độ cục thấp (-196oC) trong nitơ lỏng sẽ làm ngưng hoàn toàn các phản ứng enzyme nội bào, hô hấp tế bào, chuyển hóa, phát triển … giúp lưu giữ chúng trong th

Đông lạnh phôi I Tổng quan Khái niệm Từ đứa trẻ thụ tinh ống nghiệm đời (1978) nay, kỹ thuật hỗ trợ sinh sản ngày áp dụng rộng rãi, mang lại niềm hy vọng cho cặp vợ chồng vơ sinh Sự áp dụng loại thuốc kích thích buồng trứng nhằm tăng số lượng phơi hình thành giúp cho tỷ lệ thành cơng q trình điều trị gia tăng đáng kể Người ta thường chọn phơi có chất lượng tốt số phơi có để chuyển vào buồng tử cung (chuyển phơi tươi) Tuy nhiên số phơi cịn lại cịn số phơi có chất lượng tốt, có khả làm tổ cao Những phơi trữ lạnh để sử dụng lần chuyển phôi Trường hợp có thai từ phơi người trữ lạnh báo cáo Monash, Úc Trounson Mohr vào năm 1983 Từ đến nay, trữ lạnh phôi trở thành kỹ thuật thiếu trung tâm thụ tinh ống nghiệm giới Công nghệ đơng lạnh phơi đời có ý nghĩa việc nghiên cứu nhà khoa học, mở hướng công nghệ hỗ trợ sinh sản, đặt biệt thụ tinh ống nghiệm Vậy đông lạnh phôi? Đông lạnh phôi trữ lạnh phôi nhiệt độ cục thấp (-196oC) nitơ lỏng làm ngưng hoàn toàn phản ứng enzyme nội bào, hô hấp tế bào, chuyển hóa, phát triển … giúp lưu giữ chúng thời gian dài, mà sau rã đông phôi phát triển bình thường Các phương pháp - Đông lạnh phôi phương pháp làm lạnh chậm - Đông lạnh phôi phương pháp làm lạnh nhanh (phương pháp thủy tinh hóa) II Nguyên tắc chung Để trữ tế bào sống thời gian dài tất hoạt động chức bên tế bào phải ngừng lại Ở nhiệt độ nitơ lỏng (-196oC) hầu hết phản ứng hóa học khơng xảy Các phân tử nước tồn dạng kết hợp, tinh thể dạng kính Thời gian ngừng trôi tế bào trữ Yếu tố ảnh hưởng đến tế bào trữ lạnh xạ từ môi trường Tuy nhiên thực tế yếu tố không quan trọng nghiên cứu cho thấy tế bào phôi chuột trữ lạnh sau chiếu lượng tia xạ tương đương với thời gian trữ 2000 năm phát triển bình thường sau rã đơng, chuột sinh khơng có dị tật bẩm sinh Giai đoạn ảnh hưởng đến thành cơng trữ lạnh giai đoạn làm lạnh rã đơng Các bước cần tiến hành việc đông lạnh phôi: Chọn phơi: phơi chọn để trữ lạnh phải có chất lượng cao để chúng sống sót phát triển thai tốt sau giải đông Theo Kennedy cộng vào năm 1983, chất lượng phôi xếp thành mức độ khác nhau: phôi loại tốt phơi loại suy thối Mơi trường đệm: giống nuôi cấy tế bào động vật, đơng lạnh phơi cần có mơi trường đệm Đối với phơi lồi động vật khác mơi trường đệm khác Ví dụ: PBS chứa 20% huyết bê môi trường đệm thường dùng cho việc trữ lạnh phơi bị Ở lồi động vật khác mơi trường đệm thường dùng HEPES với 10-15% huyết bê Ở người, môi trường đệm HEPES 20mM thay cho hệ đệm bicarbonate thêm 0,5-1% HAS hay 10-15% huyết người nhận Chất bảo quản lạnh: Glycerol, DMSO, ethylene glycon, polyvinyl pyrolydine (PVP) sucrose thường sử dụng bổ sung chất bảo vệ chống lại đông lạnh phôi PVP sucrose khử nước tự bên tế bào chúng không xâm nhập vào tế bào Trong đó, Glycerol DMSO, ethylene glycon khử nước tự nội bào tế bào giúp bảo vệ cytoplasm vào Ở người, chất bảo quản phôi thường sử dụng 1,2-propanediol (PROH) dimethyl sulfoxide DMSO Khả sống sót phôi liên quan đến nồng độ chất bảo quản đông lạnh thêm vào, phương pháp thêm chúng, nhiệt độ mà thêm vào cuối thời gian cân Dụng cụ chứa phôi đơng lạnh: ống nhựa nhỏ, ống thuốc tiêm hay cọng rạ dùng cho đông lạnh tinh trùng (0.25ml hay 0.5ml) Thiết bị làm lạnh đơng: Trong phương pháp làm lạnh đơng, sử dụng ancohol đặt vào vật chứa mơi trường làm lạnh, sau đưa vào đá khô hay nitơ lỏng Trong thiết bị chuyên dùng chất làm lạnh chủ yếu nitơ lỏng, nguồn điện thường sử dụng để hạ nhiệt Một số thiết bị đại chương trình hóa tốc độ giảm nhiệt nên việc đơng lạnh trở nên dễ dàng hiệu cao Tốc độ làm lạnh: Dựa vào nguyên tắc trình bày phần trên, phác đồ trữ phôi đưa hoàn chỉnh dần Hai phác đồ sử dụng rộng rãi áp dụng cho phôi giai đoạn sớm (trước phôi nang) cho giai đoạn muộn (phôi nang) KỸ THUẬT ĐÔNG LẠNH HẠ NHIỆT ĐỘ CHẬM( SLOW FREEZING) Dựa vào nguyên tắc đông lạnh phôi trữ lạnh phơi vào giai đoạn khác nhau: 1.1 Trữ phôi giai đoạn sớm  Chất bảo quản lạnh sử dụng cho giai đoạn 1,2 propanediol (PROH) Mặc dù dimethyl sulfoxide (DMSO) loại chất bảo quản lạnh sử dụng thành công người phác đồ dùng DMSO thường đòi hỏi nhiều thời gian để làm lạnh rã đơng nên dùng Với PROH, kết đạt tốt dùng kèm với sucrose để làm chất bảo quản bên tế bào  Mơi trường dùng quy trình trữ lạnh gồm có mơi trường mơi trường đệm phosphate (PBS) mơi trường cấy phơi có bổ sung 20% huyết Trước làm lạnh, phôi cho tiếp xúc với mơi trường có chất bảo quản để rút bớt nước khỏi tế bào Nồng độ PROH sucrose môi trường là:  Làm lạnh 1: 1,5M PROH (15 phút)  Làm lạnh 2: 1,5M PROH + 0,1M sucrose (5 phút)  Sau phơi cho vào ống trữ thể tích khoảng 0,25ml trữ theo chương trình:  Từ nhiệt độ phịng xuống -7oC: giảm 1-2oC/phút  Tạo mầm tinh thể: Dùng vật kim loại nhúng vào nitơ lỏng trước chạm vào thành ống trữ phôi  Giai đoạn làm lạnh chậm đến -30oC: giảm 0,3oC/phút  Giai đoạn làm lạnh nhanh: giảm 30-50oC/phút, cho trực tiếp vào nitơ lỏng  Ðến lúc phôi giữ liên tục nitơ lỏng Chỉ đến lúc sử dụng phôi rã đông Với chất bảo quản lạnh PROH, ống chứa phơi làm rã đơng cách giữ khơng khí 30 giây, sau nhúng vào nước ấm 37 oC 60 giây Ngược với trước làm lạnh, sau rã đông, phôi lại chuyển qua môi trường khác để rửa chất bảo quản lạnh vốn gây độc cho phơi PROH có nồng độ giảm dần để tránh thoát nước nhanh khỏi phôi Thời gian phôi giữ môi trường rã đông phút:  Rã đông 1: 1M PROH - 0,2M sucrose  Rã đông 2: 0,5M PROH - 0,2M sucrose  Rã đông 3: 0,25M PROH - 0,2M sucrose  Rã đông 4: 0M PROH - 0,2M sucrose  Sau môi trường rã đông 4, phôi cho trở lại vào môi trường cấy Chất lượng phôi sau rã đông kiểm tra sau Ở số trung tâm, phôi sau rã đông nuôi cấy ngày để xem khả phát triển phôi trước chuyển trở lại vào buồng tử cung 1.2 Trữ phôi giai đoạn muộn  Các bước trữ phôi tương tự trữ phôi giai đoạn sớm Tuy nhiên chất bảo quản lạnh Glycerol Nồng độ glycerol dùng trước làm lạnh là:  Làm lạnh 1: Glycerol 5% (10 phút)  Làm lạnh 2: Glycerol 9% môi trường chứa sucrose (10 phút)  Môi trường sau rã đông là:  Sucrose 0,5M (10 phút)  Sucrose 0,2% (10 phút) 1.3 Đánh giá hiệu trữ phôi Hiệu việc trữ phôi đánh giá trước tiên qua khả sống phôi sau rã đông Cấp độ thứ hai khả phát triển phôi môi trường nuôi cấy cấp độ thứ ba khả phát triển phôi sau chuyển vào tử cung người mẹ Ở cấp độ 1, phôi đánh giá hình dạng sau rã đơng Chỉ số sống (survival index) tính tỷ lệ tế bào sống tổng số tế bào Cấp độ đánh giá phôi sau 24 giờ, biểu tỷ lệ sống (survival rate) tính tỷ lệ phôi sống tổng số phôi rã đông Cấp độ 3, cấp độ quan trọng nhất, tỷ lệ phôi làm tổ sau chuyển So với trữ phôi giai đoạn sớm, trữ phôi giai đoạn muộn có tỷ lệ sống sau trữ lớn thể tích tế bào phơi nhỏ Tuy nhiên khó khăn phải có phơi giai đoạn muộn, hay nói cách khác phải ni cấy phơi đến giai đoạn phôi nang (blastocyst) Để đạt điều này, mặt bệnh nhân phải có nhiều phơi, mặt khác quy trình ni cấy phơi phải thật tốt Hiện chưa có nghiên cứu đối chứng đủ mạnh để so sánh hiệu trữ phôi giai đoạn sớm giai đoạn muộn Thực tế cho thấy quốc gia không cho phép trữ phôi giai đoạn muộn Đức, việc trữ phôi giai đoạn tiền nhân (pronucleus) có giá trị lâm sàng 1.4 Ưu, khuyết điểm phương pháp 1.4.1 Nhược điểm Tỷ lệ phôi sống không cao, nhiều thời gian, cần sử dụng máy trữ lạnh, sử dụng nhiều nitơ, chương trình khơng ổn định Trong hạ nhiệt độ chậm, trình nước cần diễn từ từ để hạn chế thành lập tinh thể nước đá Do đó, thời gian cần thiết để hồn tất quy trình đơng lạnh phương pháp hạ nhiệt độ chậm kéo dài gấp 10 lần so với hạ nhiệt độ cực nhanh Để đảm bảo tốc độ hạ nhiệt phương pháp đông lạnh chậm, người ta cần trang bị hệ thống hạ nhiệt độ nitơ lỏng Chi phí đầu tư cho hệ thống cao, chưa kể đến chi phí bảo trì sửa chữa năm Khó khăn phải có phơi giai đoạn muộn, hay nói cách khác phải ni cấy phơi đến giai đoạn phôi nang(blastocyst) 1.4.2 Ưu điểm Do sử dụng chất bảo quản nồng độ thấp nên gây tổn thương cấu trúc tế bào KỸ THUẬT THỦY TINH HOÁ (VITRIFICATION) 2.1 Khái niệm Thủy tinh hóa q trình làm lạnh mẫu trứng phơi với thời gian nhanh.Trong suốt q trình hạ nhiệt độ toàn khối vật chất bên bên tế bào chuyển thành dạng khối đặc, suốt giống thủy tinh (glass-like), đặc biệt khơng có hình thành tinh thể đá bên mẫu tế bào, mơi trường bên ngồi q trình đông lạnh Sau cân với môi trường có nồng độ chất bảo quản đơng lạnh cao (4 – 8M), mẫu trứng phôi cho vào dụng cụ chứa nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng, khơng qua q trình hạ nhiệt độ theo bước đông lạnh chậm Tốc độ làm lạnh phương pháp lớn, khoảng 2000 – 25000C / phút 2.2 Kỹ thuật: 2.2.1 Chất bảo vệ đông lạnh (cryoprotectant) Nhìn chung, chất bảo vệ đơng lạnh sử dụng kỹ thuật thủy tinh hóa gần giống kỹ thuật đông lạnh chậm trước đây, nồng độ sử dụng cao Trong dung dịch dùng để thủy tinh hóa ln bao gồm chất bảo vệ đơng lạnh có khả thấm qua màng tế bào (permeable cryoprotectant) để khử nước bên tế bào chất bảo vệ đông lạnh khơng có khả thấm qua màng tế bào (non-permeable cryoprotectant) làm đối trọng, giúp trình khử nước bên tế bào xảy nhanh Chất bảo vệ đơng lạnh có khả thẩm thấu qua màng tế bào: ethylene glycol,propylene glycol, acetamid, glycerol, raffinose, dimethylsulphoxide (DMSO) 1,2-propanediol (PrOH) Chất bảo vệ đơng lạnh khơng có khả thấm qua màng tế bào: sucrose, trehalose, glucose galactose Trong thành phần mơi trường thủy tinh hóa nay, người ta thường sử dụng ethylene glycol chất bảo vệ đơng lạnh khác có khả thấm qua màng tế bào (thường DMSO PrOH) kết hợp với sucrose Sự kết hợp vừa bảo đảm khả thẩm thấu qua màng tế bào cao so với sử dụng chất riêng lẻ, vừa giảm độc tính thành phần riêng lẻ tác động lên tế bào sử dụng chúng nồng độ cao 2.2.2 Dụng cụ  Lưới đồng (copper grid): kỹ thuật thủy tinh hóa sử dụng lưới đồng đông lạnh phôi thực Kích thước giọt mơi trường chứa phơi nhỏ phần lớn lượng môi trường qua lỗ nhỏ bề mặt lưới, cịn tế bào trứng phơi giữ lại bên mặt lưới cách an toàn Các lưới đồng chứa trứng/phôi bảo quản tube nhỏ chứa đầy nitrơ lỏng trước đưa vào thùng lưu trữ  OPS (open-pulled straw): loại straw có đường kính nhỏ nhiều so với đường kính nguyên thủy loại straw 0,25ml thường dùng đông lạnh chậm Người ta tạo OPS cách làm nóng chảy straw 0,25ml kéo dãn tay, sau cắt lưỡi dao mỏng, cho đường kính bề dày thành straw khoảng ½ so với ban đầu, bảo đảm lượng mơi trường có chứa trứng/phơi hút vào OPS khoảng 1µl, đầu OPS chứa mơi trường trứng/phơi bảo vệ straw 0,5ml; đầu cịn lại gắn nút nhựa nhằm tránh trường hợp OPS bị lên bề mặt thả vào nitơ lỏng OPS loại dụng cụ sử dụng phổ biến kỹ thuật đông lạnh cực nhanh  Cryoloop: dụng cụ bao gồm vòng tròn rỗng nhựa mềm, gắn với cán nhựa kim loại Dung dịch thủy tinh hóa tạo thành mộp lớp màng mỏng phần rỗng vòng tròn phôi/trứng đặt lớp màng mỏng này, sau tồn dụng cụ có chứa trứng phôi làm lạnh nitơ lỏng  Nilon mesh: dạng kết hợp lưới đồng cryoloop, làm nhựa dẻo Và sử dụng chủ yếu đông lạnh trứng/phôi động vật nuôi kỹ thuật thủy tinh hóa  Cryotop: loại dụng cụ phát minh vài năm gần (2000) xem dễ sử dụng có hiệu sau rã đơng cao Dụng cụ bao gồm phim mỏng bảo vệ nắp nhựa, gắn với cán cầm nhựa Trứng/phôi đặt bề mặt phim với lượng môi trường nhỏ toàn mẫu nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng Ngoài ưu điểm dễ thao tác, tốc độ làm lạnh rã đông sử dụng cryotop nhanh nhiều so với OPS, điều giúp tăng tỉ lệ sống trứng/phôi sau rã đông 2.2.3 Thao tác Thao tác đơn gian kỹ thuật thủy tinh hóa mẫu trứng/phơi cân với mơi trường có chứa chất bảo vệ đơng lạnh có nồng độ cao (4 – 8M) để khử toàn nước bên tế bào Sau đó, trứng/phơi cho vào dụng cụ chứa, toàn mẫu nhúng trực tiếp nitơ lỏng chuyển vào bình lưu trữ Thời gian cho tồn bộquy trình đơng lạnh chỉtốn 15 – 20 phút Hiện nay, số trung tâm, người ta sử dụng nitơ dạng sệt (nitrogen slush) thay cho nitơ lỏng kỹ thuật thủy tinh hóa Ưu điểm dạng nitơ tránh bay thay đổi nhiệt độ vùng bề mặt nhúng trực tiếp dụng cụ chứa mẫu vào nitơ lỏng 2.2.4 Rủi ro thường gặp kỹ thuật thủy tinh hóa  Trong kỹ thuật thủy tinh hóa, địi hỏi người thực phải thục xác kỹ thuật cao Sự thay đổi nhiệt độ ngẫu nhiên hay “tai nạn” trình lưu trữ di chuyển mẫu đông lạnh rủi ro thường gặp Do thể tích mơi trường xung quanh trứng/phơi nhỏ, vài thay đổi nhiệt độ nhỏ làm ảnh hưởng lớn đến chất lượng trứng/phôi sau rã đông  Nồng độ chất bảo vệ đông lạnh sử dụng kỹ thuật thủy tinh hóa cao nhiều so với kỹ thuật đông lạnh chậm trước Điều gây ảnh hưởng khơng nhỏ đến sức sống trứng/phôi Đặc biệt ảnh hưởng lớn đến hệ thoi vô sắc trứng sau rã đông Nhiều ý kiến cho rằng, với nồng độ chất bảo vệ đông lạnh cao, tế bào nhạy cảm trứng/phơi bị tổn thương chất liệu di truyền, nay, chưa có chứng cho thấy em bé sinh từ kỹ thuật đơng lạnh trứng/phơi phương pháp thủy tinh hóa có tỉ lệ dị tật bẩm sinh cao phương pháp đông lạnh chậm trước  Trứng/phôi sau cho vào dụng cụ chứa, thường tiếp xúc trực tiếp với nitơ lỏng mà không bảo vệ Do đó, dễ dẫn đến nguy lây truyền vi sinh vật gây bệnh mẫu trứng / phôi với qua trung gian nitơ lỏng Tuy nhiên, nguy xảy kỹ thuật Cho đến thời điểm tại, chưa có báo cáo trường hợp lây nhiễm liên quan đến việc chuyển phôi trữ lạnh cơng bố Ngồi ra, phương pháp chứa phơi cọng rạ (straw) khơng loại trừ hồn tồn việc tiếp xúc với nitơ lỏng 2.2.5 Ưu, khuyết điểm phương pháp 2.2.5.1 Ưu điểm  Ưu điểm vượt trội thời gian trữ lạnh nhanh, tỷ lệ phôi sống nguyên vẹn đạt đến 99% Tỷ lệ thụ thai từ kỹ thuật đạt tỷ lệ 50%, gấp đơi phương pháp cũ Do đó, đơng lạnh phơi cực nhanh với kỹ thuật thủy tinh hóa khắc phục nhiều nhược điểm phương pháp cũ, đồng thời giảm thiểu chi phí điều trị, giảm nguy biến chứng, gia tăng tỷ lệ thành công cho người muộn  Chi phí đầu tư cho trang thiết bị khơng cần nhiều  Nồng độ chất bảo vệ đông lạnh sử dụng phương pháp thủy tinh hóa cao gấp 4-5 lần so với nồng độ chất bảo vệ đông lạnh sử dụng phương pháp đông lạnh chậm trước Ưu giúp cho trình khử nước bên tế bào xảy nhanh hoàn toàn Kết khơng có hình thành thể đá bên tế bào, nhờ mà tế bào tránh tổn thương màng bào quan tinh thể đá gây Phương pháp thủy tinh hóa cho tỉ lệ sống sau rã đơng phơi trứng cao nhiều so với phương pháp đông lạnh chậm 2.2.5.2 Khuyết điểm Trong kỹ thuật thủy tinh hóa, địi hỏi người thực phải thục xác kỹ thuật cao Sự thay đổi nhiệt độ ngẫu nhiên hay “tai nạn” trình lưu trữ di chuyển mẫu đơng lạnh rủi ro thường gặp Do thể tích mơi trường xung quanh trứng/phôi nhỏ, vài thay đổi nhiệt độ nhỏ làm ảnh hưởng lớn đến chất lượng trứng/phôi sau rã đông Nồng độ chất bảo vệ đông lạnh sử dụng kỹ thuật thủy tinh hóa cao nhiều so với kỹ thuật đơng lạnh chậm trước Điều gây ảnh hưởng không nhỏ đến sức sống trứng phôi Đặc biệt ảnh hưởng lớn đến hệ thoi vô sắc trứng sua rã đông Nhiều ý kiến cho rằng, với nồng độ chất bảo vệ đông lạnh cao, tế bào nhạy cảm trứng/ phôi bị tổn thương vật liệu di truyền chưa có chứng cho thấy em bé sinh rừ kỹ thuật đông lạnh trứng/ phơi phương pháp thủy tinh hóa có tỉ lệ dị tật bẩm sinh cao phương pháp đông lạnh chậm trước SO SÁNH HAI PHƯƠNG PHÁP So sánh phương pháp đông lạnh cũ mới: Hạ nhiệt độ chậm Thủy tinh hóa Khoảng 15-20 phút Hệ thống hạ nhiệt độ nitơ lỏng cần không cần Lượng nitơ lỏng sửdụng cho lần thực 10 lít 0,5 lít Mơi trường Cần nhiều loại môi trường Một loại môi trường cho cho giai đoạn phát tất giai đoạn phát triển khác phôi triển phôi Thời gian hồn tất Thời gian phơi ngồi tủ cấy dài ngắn Tổn thương mang suốt không Tỷ lệ phôi sống sau rã đông 95%-100% 70%-80% Thành tựu Ngày 18/2/2003, đứa bé Việt Nam đời từ phôi trữ lạnh bé gái, cân nặng 3,1kg Chị N., 30 tuổi, mẹ bé, làm thụ tinh ống nghiệm bệnh viện Phụ sản Từ Dũ chuyển phôi tươi vào tháng 4/2002 Sau chuyển phơi chị cịn phơi có chất lượng tốt để trữ lạnh Tháng 6/2002, chị chuyển phôi trữ lạnh thành công sinh lúc thai 38 tuần tuổi Thành tựu kỹ thuật hỗ trợ sinh sản Bệnh viện Phụ sản Từ Dũ TP HCM: 1998: Thực thành công ca thụ tinh ống nghiệm Việt Nam 1999: Em bé từ kỹ thuật ICSI (tiêm trực tiếp tinh trùng vào bào tương trứng) Việt Nam đời 2000: Thực thành công kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm - xin trứng 2001: Em bé Việt Nam đời từ kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm - mang thai hộ 2002: Triển khai kỹ thuật ICSI với tinh trùng sinh thiết từ mào tinh 2003: Em bé sinh từ phôi người đông lạnh Việt Nam  ... mẫu đông lạnh rủi ro thường gặp Do thể tích mơi trường xung quanh trứng /phôi nhỏ, vài thay đổi nhiệt độ nhỏ làm ảnh hưởng lớn đến chất lượng trứng /phôi sau rã đông  Nồng độ chất bảo vệ đông lạnh. .. sinh rừ kỹ thuật đông lạnh trứng/ phôi phương pháp thủy tinh hóa có tỉ lệ dị tật bẩm sinh cao phương pháp đông lạnh chậm trước SO SÁNH HAI PHƯƠNG PHÁP So sánh phương pháp đông lạnh cũ mới: Hạ... lúc sử dụng phôi rã đông Với chất bảo quản lạnh PROH, ống chứa phơi làm rã đơng cách giữ khơng khí 30 giây, sau nhúng vào nước ấm 37 oC 60 giây Ngược với trước làm lạnh, sau rã đông, phôi lại chuyển