Tách chiết polyphenol kháng nấm, vi khuẩn, chống oxy hóa

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆPKHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA, KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT POLYPHENOL TỪ LÁ CÂY VÚ SỮA Chrysophyllum cainito Người hướng dẫn: TS TRẦN THỊ DUNG Người th

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA, KHÁNG NẤM, KHÁNG

KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT

POLYPHENOL

TỪ LÁ CÂY VÚ SỮA

(Chrysophyllum cainito)

Người hướng dẫn: TS TRẦN THỊ DUNG

Người thực hiện : PHÙNG QUỐC VINH

Lớp :

10060302

Khóa : 14

LỜI CẢM ƠN

Em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu trường đại học Tôn ĐứcThắng đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quátrình học tập; cùng với đó là sự tận tâm dạy dỗ, truyền đạt kiếnthức của thầy cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học trong koảg thời giantrên giảng đường

Để hoàn thành được khóa luận này, em xin bày tỏ lòng cám ơnsâu sắc tới TS Trần Thị Dung đã dành nhiều thời gian và công sứctruyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý giá, tạo mọi điều kiện tốtcho em hoàn thành được khóa luận này

Xin gửi lời cám ơn chân thành tới các cô quản lý phòng thínghiệm đã tận tình hỗ trợ cho em những nguyên vật liệu, dụng cụthí nghiệm và những người bạn luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ

em trong suốt khoảng thời gian thực hiện khóa luận

LỜI CAM ĐOAN CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi vàđược sự hướng dẫn khoa học của TS Trần Thị Dung Các nội dungnghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bốdưới bất kỳ hình thức nào trước đây Những số liệu trong các bảngbiểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tácgiả thu nhập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệutham khảo

Ngoài ra, trong khóa luận còn sử dụng một số nhận xét, đánhgiá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khácđều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc

Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịutrách nhiệm về nội dung khóa luận của mình Trường Đại học TônĐức Thắng không liên quan đến những phạm vi tác quyền, bảnquyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện (nếu có)

TP Hồ Chí Minh, ngày tháng năm

Tác giả

Phùng Quốc Vinh

TÓM TẮT

Phùng Quốc Vinh, Đại học Tôn Đức Thắng, với đề tài “Khảo sáthoạt tính chống oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn của dịch chiết

polyphenol từ lá cây vú sữa (Chrysophyllum cainito)”, dưới sự

hướng dẫn của TS Trần Thị Dung Đề tài được thực hiện tại trườngĐại học Tôn Đức Thắng Thời gian nghiên cứu từ tháng 2/1016 đếntháng 6/2016 Đề tài được thực hiện với các nội dung:

- Khảo sát điều kiện tách chiết hiệu quả hợp chất polyphenol

từ lá vú sữa

- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩncủa dịch chiết polyphenol lá vú sữa

Qua thực nghiệm, thu được một số kết quả như sau:

- Tìm ra được điều kiện chiết tách polyphenol từ lá vú sữa chohiệu suất cao nhất là nồng độ Ethanol 70%, thời gian chiết60phút, nhiệt độ 600C và tỉ lệ mẫu/ethanol là 1/30 mg/mL

- Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết polyphenol

lá vú sữa thông qua khả năng ức chế gốc tự do DPPH với giátrị IC50 là 31,90 mg/mL so với IC50 của vitamin C là 19,33mg/mL

- Dịch chiết polyphenol lá vú sữa được bổ sung vào môi trườngPGA với tỉ lệ thể tích dịch chiết : môi trường là 1:10 (V:V) cókhả năng kháng trung bình các loại nấm được khảo sát là

Phytophthora capsici, Aspergillus oryzae và Sclerotium rolfsii.

- Dịch chiết polyphenol lá vú sữa với nồng độ 10 mg/mL và 20mg/mL cho khả năng kháng vi khuẩn thấp, khi tăng nồng độlên 40 mg/mL khả năng kháng vi khuẩn tăng lên mức trung

bình với các chủng vi khuẩn được khảo sát là Bacillus subtilis

và Staphylococcus aureus, riêng với Escherichia coli vẫn ở

mức thấp

MỤC LỤC

GAE: gallic acid equivalent

IC50: inhibitory concentration (nồng độ chất chống oxy hóa cần để

ức chế 50% gốc tự do DPPH trong khoảng thời gian xác định)

PGA: potato glucose agar

ROS: reactive oxygen species (các chất hoạt động chứa oxy)

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH ẢNH

DANH MỤC SƠ ĐỒ - ĐỒ THỊ

Chương 1 GIỚI THIỆU1.1 Đặt vấn đề

Cây vú sữa (Chrysophyllum cainino) là một loại cây rất quen

thuộc ở nước ta, được người Việt Nam sử dụng từ hàng trăm nămtrước Đây là loại cây trồng lớn nhanh, thân dẻo, tán lá rộng, chiềucao lên tới từ 10 - 15 mét Cây vú sữa hiện nay còn được đưa vàodanh mục cây trồng làm cảnh trong thành phố

Trong lá vú sữa có polyphenol, là một hợp chất sinh học có khảnăng chống oxy hóa rất tốt và đã có nhiều công trình nghiên cứu

về hợp chất này Các nghiên cứu cho thấy khả năng chống oxyhóa, làm chậm sự lão hóa, ngoài ra là khả năng kháng khuẩn củahợp chất này là rất đáng kể

Hiện nay, con người đang có xu hướng trở về với thiên nhiên,nên việc sử dụng sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên lại càng tăngbởi độ thân thiện và an toàn Do vậy, đề tài “Nghiên cứu chiết táchpolyphenol và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa của

lá cây vú sữa” được thực hiện

1.2 Mục tiêu đề tài

Thu nhận được hợp chất polyphenol với quy trình chiết táchphù hợp từ lá vú sữa Đánh giá khả năng kháng oxy hóa và khángmột số chủng vi khuẩn và nấm của dịch chiết polyphenol từ lá vúsữa

1.3 Ý nghĩa của đề tài

Làm cơ sở cho việc tìm nguồn thu hợp chất polyphenol, sảnxuất các sản phẩm kháng khuẩn, kháng oxy hóa và bổ sung thêmnguyên liệu cho các quá trình khai thác sử dụng sau này

Chương 2 TỔNG QUAN2.1 Giới thiệu về cây vú sữa

Cây vú sữa (Chrysollyum cainito) là một loại thực vật thuộc họ

hồng xiêm (Sapotaceae), trước đây được coi thuộc bộ thị(Ebenales) Cây vú sữa có nguồn gốc ở đảo Antilles và châu Mỹnhiệt đới, được du nhập vào nước ta hàng trăm năm trước Một sốnước trồng vú sữa như: Campuchia, Thái Lan, Philippines,Australia

2.1.3 Đặc điểm về hình thái [18, 21]

Lá của vú sữa là thường xanh, mọc so le, hình ôvan đơn, mépliền, dài 5–15 cm; mặt dưới bóng như màu vàng khi nhìn từ xa Cáchoa nhỏ màu trắng ánh tía và có mùi thơm ngát Cây vú sữa là loạicây lưỡng tính (tự thụ phấn)

Quả của vú sữa tròn, có lớp vỏ màu tía hoặc nâu ánh lục khichín, thường có màu xanh lục xung quanh đài hoa, với kiểu hìnhsao trong cùi thịt Có một vài giống cho quả màu trắng ánh xanh

lục Vỏ nhiều latex (nhựa mủ) và không ăn được Các hạt dẹt cómàu nâu nhạt và cứng Nó ra quả quanh năm sau khi đạt đến 7năm tuổi trở lên.

Lớp cùi thịt của quả ăn được và rất ngon, dùng làm các móntráng miệng Vú sữa có vị ngọt, hay được phục vụ dưới dạng tươihoặc làm lạnh (khoảng 10-15 °C) Lá của vú sữa được dùng ở một

số khu vực làm dạng như chè và người ta coi nó có tác dụng chốngcác bệnh đái đường và thấp khớp Vỏ cây được coi là có chứa chất

bổ và có tác dụng kích thích, nước sắc vỏ cây được dùng để chống

ho Loại quả vỏ màu tía có lớp vỏ dày hơn và cùi thịt đặc hơn cònloại quả vỏ màu nâu-lục có vỏ mỏng và nhiều cùi thịt nhão

Cây vú sữa được trồng bằng cách chiết nhánh hoặc tháp cây.Cây có tốc độ sinh trưởng Nhanh Phù hợp với: điều kiện nhiệt đớinhiệt độ 22-340C, chỉ ra hoa tốt trong điều kiện có hai mùa mưanắng phân biệt và không chịu được gió to do cây có tán lá dày và

rễ nông, đất phù sa ven sông, đất thịt nhẹ, thoát nước tốt, ít chua,

pH 5,5-6,5, cao độ không quá 400m

Hình 2.1 Cây, hoa và quả Chrysollyum Cainito

(Nguồn www.cantho.gov.vn)

2.1.4 Thành phần hóa học

Lá vú sữa cho phản ứng dương tính với các nhóm chất như:sapofenin, tannin, anthraquinone, cardiac glycoside Không chứaalkaloids, reducing sugar (đường khử) và saponin

2.1.5 Công dụng và dược tính [27]

Trái vú sữa có hương vị giữa trái vải và trái hồng, ngoài việccung cấp khoảng 67,2 Kcal/100 gr còn có nhiều vitamin A, B1, B2,B3 và C, nhất là glucid, calcium, sắt, chất xơ, protein và lipid (dầuacid malic), có thể sử dụng tươi hoặc làm nguyên liệu trong nhiềuloại cocktail Theo tự điển cây thuốc Việt Nam của tác giả Võ VănChi, lá vú sữa có tác dụng tan máu ứ, hoạt huyết, tiêu sưng (khángviêm), giảm đau và chữa đau dạ dày Vỏ vú sữa có thể dùng để sắcnước uống, giảm ho, đau dạ dày và phục hồi sức khỏe

nhóm này mà các tính chất lý hoá học hoặc hoạt tính sinh học thayđổi.

2.2.2 Phân loại [4, 26]

Dựa theo số lượng nhóm hydroxyl mà người ta phân biệt thành:

- Nhóm phenol đơn giản: gồm các chất được cấu tạo từ 1 vòng

benzen và 1 hay nhiều nhóm OH, được phân thành các: monophenol; di phenol (pyrocatechin, rezoxyn ); tri phenol (pyrogalon,oxy hydroquinon )

- Nhóm hợp chất phenol phức tạp (polyphenol):trong thành phầncấu tạo, ngoài vòng benzen còn có dị vòng mạch nhánh, đượcphân thành các nhóm: monome và polymer

+ Monome hay polyphenol đơn giản: được chia thành

• Nhóm C6 – C1 (axit phenol cacbonic): trong cấu trúc phân tử cóthêm nhóm cacbonyl, thường gặp ở hạt nảy mầm

• Nhóm C6 – C3 ( axit cumaric, axit cafeic): có gốc cacbonyl đượcnối với nhân benzen qua hai nguyên tử cacbon, thường gặp ở thựcvật bậc cao

• Nhóm C6 – C3– C6: gọi là các Flavonoid và được chia thành các

nhóm phụ như flavon, flavonol (sắc tố vàng), antoxyanidin (sắc tốxanh, đỏvà tím), catechin (không màu)

+ Nhóm hợp chất polyphenol polymer: được chia thành cácnhóm phụ như Tanin, Lignin, Axit Humic…

Hình 2.2 Một số cấu trúc hóa học của hợp chất polyphenol

2.2.4 Chức năng [5, 11]

Các hợp chất polyphenol chiếm một vị trí quan trọng trong đờisống của thực vật,

chúng tham gia vào nhiều quá trình sinh lý và sinh hoá quantrọng; vào các quá trình

trao đổi chất dưới nhiều hình thức khác nhau như quá trình hô hấp

tế bào (vận chuyển

H + trong quá trình photphoryl hoá oxy hoá ), quá trình quanghợp, điều hòa sinh

trưởng phát triển của thực vật…

Các hợp chất polyphenol có khả năng cao trong việc chống oxyhóa, kháng sinh, viêm nhiễm và ngăn ngừa ung thư

- Sản phẩm sữa chua thử nghiệm có bổ sung polyphenol

- Polyphenol trong trà Ôlong qua có khả năng thúc đẩy sự hoạt độngcủa các enzym có chức năng phân giải triglyceride do đó rất cóhiệu quả trong ngăn chặn và kiểm soát chứng béo phì

- Thực phẩm chức năng chứa flavonoid của polyphenol giúp phòngchống xơ cứng động mạch

- Epigallocatechin gallat (EGCG) có hoạt tính chống lại bệnh HIV vàcác loại ung thư ớ các tuyến thiền liệt, lá lách… vì vậy nó được bổsung vào rất nhiều loại thực phẩm đồ uống…

Trong mỹ phẩm, polyphenol được bổ sung vào các sản phẩmnhư: kem đánh răng, kem dưỡng da, sữa tắm…Hiện nay,polyphenol đang được nghiên cứu để sản xuất các loại thuốcchống ung thư, ngăn ngừa quá trình oxy hóa…

2.3 Giới thiệu các chủng vi khuẩn và nấm sử dụng trong thí nghiệm

2.3.1 Staphylococcus aureus (S aureus) [3, 19]

Staphylococcus có nguồn gốc từ tiếng la tinh, trong đó Staphylo

nghĩa là chùm nho và coccus nghĩa là hạt.

Phân loại khoa học của Staphylococcus aureus:

- Hình thái: Staphylococcus aureus là vi khuẩn gram dương, hình

cầu, đường kính 0,5-1,5µm, đứng riêng lẻ hay thành chùm nhưchùm nho Đây là loại vi khuẩn không di động, không sinh bào tử,thường cư trú trên da và màng nhày của người và động vật máunóng

- Tính chất: S aureus là những vi khuẩn hiếu khí hoặc kị khí tùy ý, có

cả sự trao đổi chất và lên men, phản ứng catalase dương tính, sửdụng nhiều loại cacbohydrat khác nhau tạo acid lactic nhưng không

sinh hơi S aureus sản sinh ra độc tố đường ruột enterotoxin, bền

nhiệt, không bị phân hủy ở 1000C trong 30 phút S aureus sinh

trưởng tốt nhất từ 30-370C, pH gần trung tính

- Phân bố: S aureus cư trú trên người và động vật, có trong sữa bò

bị bệnh, thịt heo tươi, trong đất, vết thương mưng mủ Nguồn gâybệnh chủ yếu là: thịt heo, bành mì, trứng, thịt gà…

- Phân loại:

+ Dựa vào kháng nguyên: hiện tượng ngưng kết với huyết

thanh đỏ, chia thành 18 type huyết thanh của S aureus.

+ Dựa vào phage: chia thành các nhóm I, II, III và IV

2.3.2 Escherichia coli (E coli) [2, 19]

Vi khuẩn Escherichia coli trước đây gọi là Bacterium coli

commune hay Bacilus coli communis lần đầu tiên được phân lập từphân của trẻ em bị tiêu chảy năm 1885 và được đặt theo tên củabác sĩ nhi khoa Đức Theo Dor Escherich (1857-1991)

Phân loại khoa học của Escherichia coli:

- Hình thái: Escherichia coli là trực khuẩn gram âm ngắn, 2 đầu tròn,

kích thước 2-3µm, đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi ngắn Phầnlớn có khả năng di động nhờ lông xung quanh thân, nhưng một số

chủng không có khả năng di động E coli không sinh bào tử, có thể

có giáp mô

- Tính chất: E coli là vi khuẩn hiếu khí tùy ý, lên men sinh hơi các

loại đường lactose, fructose, glucose, levulose, galactose, xylose và

mannitol Hầu hết chủng E coli đều lên men lactose nhanh và sinh hơi, đây là điểm quan trọng để phân biệt E coli và Samonella E.

Urea âm tính E coli sản sinh độc tố đường ruột Enterotoxin và độc

tố tế bào Verotoxin E coli có thể sinh trưởng 5-400C, pH 5,5-8, tối

ưu là 370C và pH 7,2-7,4

- Phân bố: ở điều kiện bình thường, E coli khu trú ở phần sau của

ruột, ít khi có ở dạ dày hay phần đầu ruột non động vật

- Phân loại: E coli được chia thành các kiểu huyết thanh (serotype)

khác nhau dựa vào cấu trúc kháng nguyên thân O, kháng nguyêngiáp mô K, kháng nguyên lông H và kháng nguyên bám dính F

2.3.3 Bacillus subtilis (B subtilis) [8, 19]

Bacillus subtilis ban đầu được đặt tên là Vibrio subtilis khi nó

được phát hiện vào năm 1835 bởi Christian Gottfried Ehrenberg Nó

được đổi tên thành Bacillus subtilis vào năm 1872 bởi Ferdinand

Hình 2.5 Vi khuẩn Bacillus subtilis

(Nguồn:

www.bacteriainphotos.com)

Đặc điểm:

- Hình thái: Bacillus subtilis là trực khuẩn gram dương nhỏ, hai đầu

tròn, kích thước 0,5-0,8µm x 1,5-3µm, đứng đơn lẻ hay thành chuỗingắn Vi khuẩn có khả năng di động nhờ lông

- Tính chất: B subtilis là vi khuẩn hiếu khí hay kị khý tùy ý, sinh bào

tử, lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose,mannitol, saccharose, xylose, arabinose Trong các thử nghiệm sinh

hóa, B subtilis cho kết quả dương tính với VP, catalase, amylase,

citrate, NH3, casein; âm tính với Indol, H2S B subtilis có thể sản

sinh nhiều enzyme, nhưng quan trọng nhất là amylase và protease

thuộc hệ thống men tiêu hóa B subtilis làm hư hỏng, ôi thiu thức

ăn

- Phân bố: B subtilis được phân bố hầu hết trong tự nhiên, phần lớn

cư trú trong đất, cỏ khô…

2.3.4 Aspergillus oryzae (A oryzae) [8, 20]

Phân loại khoa học của Aspergillus oryzae:

Đặc điểm:

- Hình thái: Nấm mốc Aspergillus oryzae có màu vàng hoa cau, sợi

nấm phá triển rất mạnh (chiều ngang 5-7µm), có vách ngăn chiasợi nấm thành nhiều tế bào (nấm đa bào), phát triển thành từngđám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty

- Tính chất: A oryzae là loài nấm hoàn toàn hiếu khí, dị dưỡng, khi

có đủ oxy thì phát triển rất mạnh Điều kiện thuận lợi cho nấm pháttriển: độ ẩm môi trường 45% cho việc hình thành bào tử, 55-60%cho việc sinh tổng hợp enzyme, pH 5,5-5,6, độ ẩm không khí 85-

95% A oryzae sinh sản vô tính bằng mẫu sợi hoặc bằng bào tử

đính Nấm cho ra 3 loại enzyme chính là amylase, protease và cácenzyme oxy hóa khử như glucooxidase

- Phân bố: A oryzae phân bố rất rộng rãi, có thể tìm thấy chúng

trong đất, đậu phộng, thóc, gạo, giày da, sơn, dược liệu

- Phân loại: Họ nấm Aspergillus có thể lên đến 200 loài, trong đó có

khoảng 20 loài gây hại cho con người

2.3.5 Phytophthora capsici (P capsici) [8, 20]

Phân loại khoa học của Phytophthora capsici:

- Hình thái: Sợi nấm không vách ngăn, đơn bào, kích thước khôngđều Túi bào tử có hình trứng và hình quả chanh, trên đầu có nuốmhoặc không có nuốm, không màu, trong suốt Bào tử hình cầu hoặchình thận, có hai lông roi, di chuyển rất nhanh trong nước.

- Tính chất: Phytophthora capsici không phải là nấm thực mà là vi

sinh vật giống nấm, ngày nay được xếp vào giới Chromalveolata

Các thể phân lập của P capsici có khả năng lưỡng tính, tức là

chúng có khả năng sinh ra cả cấu trúc đực và cái hoặc các bọc giao

tử (Galindo & Gallegly 1960) Phương thức sinh sản của các loài

Phytophthora quyết định khả năng phát dịch Khi gặp điều kiện môi

trường bất lợi, P capsici bảo tồn bằng bào tử vách dày (như vào tử

trứng và bào tử hậu) Bào tử noãn (bào tử trứng) có thể hoạt độngnhư một cấu trúc cho phép tồn tại trong một thời gian dài khikhông có sự hiện diện của cây ký chủ và có thể duy trì sự nhiễmbệnh vào mô cây ký chủ trong điều kiện nóng khô Điều kiện thíchhợp cho sự phát triển của nấm là 25-300C, pH 6-7

- Phân bố: Phytophthora phân bố với phạm vi rộng lớn trên thế giới,

đặc biệt ở các vùng nhiệt đới ẩm, gây nhiều dịch bệnh nghiêmtrọng : đen vỏ ca cao, thân và trái đu đủ, thối rễ và tàn lụi trên camquýt, chết nhanh dây tiêu

- Phân loại: Chi Phytophthora có trên 60 loài đã được mô tả, trong đó

nhiều loài gây ra những dịch bệnh nghiêm trọng - điển hình nhưbệnh mốc sương mai (hay tàn lụi muôn) trên khoai tây đã gây ranạn đói ở Châu Âu những năm 1840, nguyên nhân do

Phytophthora infestans (Bourke 1964).

2.3.6 Sclerotium rolfsii (S rolfsii) [8, 20]

Phân loại khoa học của

Sclerothium rolfsii:

- Giới: Fungi

- Ngành: Basidiomycota

- Tính chất: Sclerotium rolfsii không hình thành nên từ sinh sản vô tính và bào tử S rolfsii gây bệnh trên nhiều loại cây trồng, bao

gồm cả rau, trái cây, và các loại cây cảnh Nó là tác nhân gây bệnhchủ yếu của đậu phộng Các dấu hiệu của sự nhiễm bệnh là các sợitrắng phát phát triển thành hình quạt dưới thân cây, lá cây, đấthoặc bề mặt của quả Nấm gây bệnh thối rễ, củ…

- Phân bố: S rolfsii phân bố ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và

vùng ôn đới ấm áp khác, đặc biệt là miền Nam nước Mỹ, Trung vàNam Mỹ, Tây Ấn, Đông Nam Á… Mầm bệnh hiếm khi xuất hiện ởnơi có nhiệt độ trung bình mùa đông xuống thấp dưới 00C

đôi ở vòng ngoài nên mang điện tích âm và có khả năng oxy hóacác tế bào, các phân tử, nguyên tử khác Các gốc tự do có thể liênquan đến nhiều phản ứng trong các mô sống với vai trò như nhữngchất trung gian có hoạt tính mạnh trong thời gian ngắn, ví dụ nhưtrong hiện tượng quang hợp.

Hình 2.9 Gốc tự do

(Nguồn: www.khoahoc247.com)

- Denham haram là người đầu tiên đề xuất học thuyết gốc tự

do trong những năm 1950 và mở rộng vào những nam 1970.+ Lý thuyết gốc tự do ban đầu chỉ đề cập đến gốc tự do nhưsuperoxide (O-

2)

+ Lý thuyết gốc tự do được mở rộng bao gồm các tác hại oxy hóa từcác loại phản ứng oxy hóa khác Reactive oxygen species (ROS)như hydrogen peroxide (H2O2) hoặc Peroxynitrite (OONO-)…

- Lý thuyết ty thể của sự lão hóa (Mitochondrial Theory of Aging) lầnđầu tiên được đề xuất vào năm 1978 và lý thuyết gốc tự do ty thểcủa sự lão hóa (Mitochondrial Free Radical Theory of Aging) đượcgiới thiệu vào 1980

+ Ty lạp thể là nơi sản sinh ra các ROS

+ Các ROS oxy hóa DNA, protein và các thành phần khác của

ty thể

+ Các tổn thương đó lại tạo ra các ROS

+ Một vòng luân hồi của tress oxy hóa

Bảng 2.1 Các gốc tự do trong cơ thể sinh học

O2-, superoxide

anion Ophản ứng oxy hóa tự nhiên trong cơ thể và2 bị mất một electron, hình thành từ các

chuỗi vận chuyển electron

H2O2, hydrogen

peroxide Mất 2 electron, hình thành từ sự biến đổiO2- hoặc trực tiếp từ O2

OH, hydroxyl Mất 3 electron, hình thành bởi phản ứng

radical Fenton hoặc sự phá hủy cấu trúc của

acid Hình thành từ Hperoxide hóa 2O2 do tủy xương bị

NO3-, peroxynitride Hình thành do phản ứng nhanh giữa O2- và

Do hai nguyên nhân: nội sinh và ngoại sinh

- Nguyên nhân do nội sinh: do các hoạt động tự nhiên trong cơ thểnhư hô hấp và chuyển hóa trong cơ thể, tổn thương tế bào, stress…

- Nguyên nhân do ngoại sinh: do các ảnh hưởng từ môi trường bênngoài cơ thể như ô nhiễm môi trường, ánh sáng mặt trời, thuốc, visinh vật, thuốc lá, rượu bia…

Hình 2.10 Những tác nhân gây ra gốc tự do

(Nguồn: www.medlatec.vn)

2.4.1.3 Cơ chế tác động của gốc tự do [16]

- Làm tổn thương hoặc chết tế bào

+ Oxy hóa màng tế bào

+ Oxy hóa các cấu trúc nội bào

- Làm hư hại các DNA

- Gây sung, viêm

- Liên kết ngang (Crosslinks) với các phân tử protein, lipide gây thoáihóa, biến tính, mất chức năng tự nhiên

- Phản ứng dây chuyền oxy hóa gia tăng các ROS

2.4.1.4 Tác hại của gốc tự do [4, 16]

- Chúng có thể gây ra tổn thương cho tất cả các chất liệu và môtrong cơ thể Mô mỡ là nơi bị tổn thương sớm nhất và thường gặpnhất, vì đó là loại mô có xu hướng đặc biệt dễ bị oxy hóa Gốc tự dogây ra một chuỗi phản ứng liên tục xảy ra trên các chất mỡ vàchúng chỉ có thể bị chặn đứng bởi chất chống oxy hóa

- Các gốc tự do có thể gây tổn hại cho các acid nucleic cơ bản

- Gốc tự do còn làm tổn thương protein

H ình 2.11 Tác hại của gốc tự do

(Nguồn: www.sirinpharmacy.exteen.com)

2.4.2 Chất chống oxy hóa

2.4.2.1 Khái niệm [4]

Chất chống oxy hóa (antioxidant) là các hợp chất có khả nănglàm chậm lại, ngăn chặn hoặc đảo ngược quá trình oxy hóa các hợpchất có trong tế bào cơ thể

2.4.2.2 Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa [4, 24]

Chất chống oxy hóa có thể làm sạch các gốc tự do bằng cáchđưa vào các gốc tự do này một electron Khi một phân tử gốc tự donhận thêm một electron

từ phân tử chống oxy hóa,

chất chống oxy hóa cũng như các enzyme ngăn ngừa hiện tượngoxy hóa.

+ Acid ascorbic (Vitamin C): chất dinh dưỡng chủ yếu cho động vậtbậc cao và các loài khác Sự hiện diện của ascorbate có vai tròquan trọng cho những phản ứng trao đổi chất cho động vật, câytrồng và hoạt động bên trong của cơ quan con người

ra các gốc tự do thông qua các phản ứng Fenton

2Fe3+ + ascorbate → 2Fe2+ + Dehydroascorbate

2Fe2+ + 2H2O2 → 2Fe3+ + 2OH⋅ + 2OH

-+ Tocopherol (Vitamin E): Vitamin E là tên gọi chung cho một bộ támpolypherols liên quan và tocotrienols, đó là vitamin tan trong chấtbéo có tính chất chống oxy hóa Nó bảo vệ màng tế bào khỏi bị oxyhóa bằng cách phản ứng với gốc lipid được sản sinh trong phảnứng dây chuyền Từ đó loại bỏ các gốc tự do trung gian và ngănngừa các phản ứng lan truyền liên tục diễn ra

- Chất chống oxy hóa tổng hợp: các chất chống oxy hóa tổng hợpphải thỏa mãn các yêu cầu sau:

+ Không độc

+ Có hoạt tính chống oxy hóa cao ở nồng độ thấp

+ Có thể tập trung được trên bề mặt pha dầu

+ Bền trong các điều kiện kỹ thuật của quá trình sản xuấtCác chất chống oxy hóa tổng hợp hay dùng là: BHT (butylatedhydroxytoluen), BHA (butylated hydroxyanisole), tocopherol tổnghợp, dodecyl gallate… Chúng thường được sử dụng để bảo quảnthực phẩm, thức ăn động vật, bao bì thực phẩm, mỹ phẩm, sảnphẩm cao su…

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa bằng 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) [7, 16, 22]

- DPPH có công thức hóa học là C18H12N5O6, là một gốc tự do bền,dung dịch có màu tím, bước sóng hấp thụ cực đại tại 515 nm Các

chất có khả năng kháng oxy hóa sẽ trung hòa DPPH bằng cách chohydrogen, làm giảm độ hấp thụ tại bước sóng cực đại và màu củadung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt.

Hình 2.15 Gốc tự do DPPH và dạng ổn định của nó

(Nguồn: www.ncbi.nlm.nih.gov)

Hình 2.16 Cơ chế phản ứng của DPPH và chất chống oxy hóa

- Kết quả báo cáo bởi giá trị IC50 là nồng độ của dịch chiết khử được50% gốc tự do DPPH ở điều kiện xác định Giá trị IC50 càng thấp thìhoạt tính khử gốc tự do DPPH càng cao.

Công thức: IC (%) = x 100

Trong đó:

A0: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết

A : Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch chiết

2.5 Một số nghiên cứu liên quan

Duyilemi O.P and Lawl I.O (2009) khảo sát hợp chất hóa học thực

vật và khả năng kháng khuẩn của Chrysophyllum albidum (một chi

khác của cây vú sữa) - Nghiên cứu đánh giá sơ bộ sự hiện diện môt

số chất trong lá như: sapofenin, tannin, anthraquinone Dịch chiết

từ lá có hoạt tính kháng khuẩn mạnh, kháng được các loài vi

khuẩn: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella typhi,

Shigella spp.

XiaoDong Luo, Margaret J.Basile, and Edward j.Kennelly (2002)

-Nghiên cứu chất chống oxy hóa polyphenol từ quả Chrysophyllum

cainito Dịch chiết methanol từ trái vú sữa được thử nghiệm DPPH

có tính chống oxy hóa cao

Nicole Anzanelo Meira, Luiz Carlos Klein Jr, Lilian W Rocha,Zhelmy Martin Quintal, Franco Delle Monache, Valdir Cechinel Filhoand Nara Lins Meira Quintao (2013) – Khả năng kháng viêm củachiết xuất từ lá vú sữa ở chuột

P Pukklay, W Eiamsum-ang and W Watsai (2010) – Nghiên cứuhoạt tính sinh học và hàm lượng polyphenol tổng số từ vỏ và quả

Chrysophyllum cainito Hàm lượng polyphenol trong vỏ và quả Chrysophyllum cainito tương đối cao Dịch chiết polphenol từ vỏ và

quả có hoạt tính chống DPPH và khả năng kháng khuẩn cao