Sự tạo mô sẹo và dịch treo tế bào từ cây sưa (Dalbergia Tonkinensis Prain) In Vitro

Header Page of 258 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Võ Dương Thanh SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ DỊCH TREO TẾ BÀO TỪ CÂY SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN) IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2013 Footer Page of 258 Header Page of 258 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Võ Dương Thanh SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ DỊCH TREO TẾ BÀO TỪ CÂY SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN) IN VITRO Chuyên ngành : SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số : 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS BÙI TRANG VIỆT TS LÊ THỊ TRUNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2013 Footer Page of 258 Header Page of 258 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: Thầy PGS.TS Bùi Trang Việt tận tình hướng dẫn, giảng dạy, bồi dưỡng kiến thức, đóng góp nhiều ý kiến quý báu tạo điều kiện tốt để em hoàn thành luận văn Cô TS Lê Thị Trung giảng dạy, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm, động viên giúp đỡ em trình học tập làm luận văn Cô TS Dương Thị Bạch Tuyết, cô TS Nguyễn Thị Mong, cô TS Trần Thanh Hương, Thầy PGS.TS Bùi Văn Lệ, Thầy TS Đỗ Minh Sĩ, cô TS Trần Lê Bảo Hà, Thầy PGS.TS Nguyễn Minh Công giảng dạy cho em kiến thức bổ ích Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, Khoa sinh học môn Sinh lý Thực vật tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian học tập làm luận văn trường Các Thầy, Cô hội đồng dành thời gian đọc đóng góp nhiều ý kiến cho luận văn em Em Hồ Thị Mỹ Linh nhiệt tình hướng dẫn cho em mượn dụng cụ; hoá chất để thực thí nghiệm Các anh chị chuyên ngành sinh học thực nghiệm khóa 20, bạn khóa 21, khóa 22 em học viên phòng môn Sinh lý Thực vật BGH tập thể giáo viên trường THPT Phú Quốc tạo điều kiện, giúp đỡ để em có thời gian hoàn thành chương trình học Cảm ơn tất người thân, người bạn bên cạnh tôi, dõi theo động viên em suốt trình học tập Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn ba mẹ anh chị,cả cu Bin yêu thương, động viên tạo điều kiện tốt cho hoàn thành chương trình học tập Một lần nữa, xin chân thành biết ơn! TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2013 Võ Dương Thanh Footer Page of 258 Header Page of 258 MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục hình Danh mục bảng MỞ ĐẦU Chương1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Sự phân bố 1.1.3 Đặc điểm sinh học 1.1.4 Giá trị 1.1.5 Tình trạng 1.1.6 Những nghiên cứu Sưa 1.2 Sự phát sinh hình thái thực vật 1.2.1 Khái niệm phát sinh hình thái thực vật 1.2.2 Sự phát sinh quan phát triển phôi hợp tử 1.2.2.1 Mô phân sinh chồi phát triển chồi 1.2.2.2 Mô phân sinh rễ hình thành rễ 1.2.2.3 Sự phát triển phôi hợp tử 1.2.3 Cơ sở phân tử phát sinh quan phát sinh phôi 10 1.3 Sự phát sinh hình thái thực vật in vitro 12 1.3.1 Sự tạo mô sẹo 13 1.3.2 Sự tạo dịch treo tế bào 14 1.3.3 Sự phát sinh quan 15 1.3.4 Sự phát sinh thu nhận phôi thể hệ 16 Footer Page of 258 Header Page of 258 1.4 Vai trò chất điều hòa tăng trưởng thực vật 18 1.4.1 Auxin 18 1.4.2 Cytokinin 22 1.4.3 Sự kết hợp auxin cytokinin nuôi cấy in vitro 24 1.4.4 Gibberelline 25 1.4.5 Abscissic acid (ABA) 27 1.4.6 Etylene 28 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29 2.1 Vật liệu 29 2.1.1 Vật liệu dùng nuôi cấy 29 2.1.2 Vật liệu sinh trắc nghiệm 29 2.2 Phương pháp 29 2.2.1 Nuôi cấy tạo Sưa in vitro 29 2.2.2 Sự tạo mô sẹo 30 2.2.2.1 Sự tạo mô sẹo từ Sưa in vitro 30 2.2.2.2 Sự tăng trưởng mô sẹo 31 2.2.3 Sự phát sinh quan từ mô sẹo 32 2.2.4 Quan sát hình thái giải phẫu 33 2.2.5 Đo cường độ hô hấp 33 2.2.6 Đo cường độ quang hợp 33 2.2.7 Đo hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật 33 2.2.7.1 Ly trích 33 2.2.7.2 Phân đoạn đo hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh 35 2.2.8 Áp dụng kết thay đổi hoạt tính chất điều hoà tăng trưởng thực vật trình tạo mô sẹo 36 2.2.9 Sự tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo 37 2.2.9.1 Khảo sát khối lượng mô sẹo ảnh hưởng đến tạo dịch treo tế bào Sưa in vitro 37 Footer Page of 258 Header Page of 258 2.2.9.2 Khảo sát nồng độ chất điều hoà tăng trưởng thực vật ảnh hưởng đến trình tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo Sưa in vitro 38 2.2.10 Phân tích số liệu 38 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Kết 39 3.1.1 Nuôi cấy tạo Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) in vitro 39 3.1.2 Sự tạo mô sẹo 39 3.1.2.1 Sự tạo mô sẹo từ Sưa in vitro 39 3.1.2.2 Sự tăng trưởng mô sẹo 55 3.1.2.3 Quan sát hình thái giải phẫu mô sẹo 57 3.1.2.4 Sự thay đổi cường độ hô hấp mẫu cấy trình tạo mô sẹo 64 3.1.2.5 Sự thay đổi hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trình tạo mô sẹo 65 3.1.2.6 Áp dụng kết thay đổi hoạt tính chất điều hoà tăng trưởng thực vật trình tạo mô sẹo 66 3.1.3 Sự phát sinh quan 67 3.1.3.1 Sự phát sinh quan từ mô sẹo 67 3.1.3.2 Hình thái giải phẫu khối mô sẹo trình phát sinh quan 70 3.1.3.3 Sự thay đổi cường độ quang hợp trình phát sinh quan mô sẹo 73 3.1.3.4 Sự thay đổi cường độ hô hấp trình phát sinh hình thái mô sẹo 74 3.1.3.5 Sự thay đổi hoạt tính CĐHTTTV trình phát sinh quan 75 3.1.4 Sự tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo Sưa in vitro 76 3.1.4.1 Ảnh hưởng khối lượng mô sẹo đến tạo dịch treo tế bào Sưa in vitro 76 Footer Page of 258 Header Page of 258 3.1.4.2 Ảnh hưởng nồng độ chất điều hoà tăng trưởng thực vật đến trình tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo Sưa in vitro 78 3.2 Thảo luận 81 3.2.1 Sự tạo Sưa in vitro 81 3.2.2 Sự tạo mô sẹo 81 3.2.3 Sự tăng trưởng mô sẹo 82 3.2.4 Những biến đổi hình thái giải phẫu trình hình thành mô sẹo 82 3.2.5 Sự thay đổi cường độ hô hấp trình tạo mô sẹo 83 3.2.6 Vai trò chất điều hoà tăng trưởng thực vật nội sinh trình tạo mô sẹo 83 3.2.7 Áp dụng kết thay đổi hoạt tính chất điều hoà tăng trưởng thực vật trình tạo mô sẹo 84 3.2.8 Sự phát sinh quan từ mô sẹo 84 3.2.9 Những biến đổi hình thái giải phẫu trình phát sinh quan từ mô sẹo 84 3.2.10 Sự thay đổi cường độ hô hấp quang hợp trình phát sinh quan từ mô sẹo 85 3.2.11 Vai trò chất điều hoà tăng trưởng thực vật nội sinh trình phát sinh quan từ mô sẹo 85 3.2.12 Sự tạo dịch treo tế bào 85 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 87 4.1 Kết luận 87 4.2 Đề nghị 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO 88 PHỤ LỤC 95 Footer Page of 258 Header Page of 258 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4- dichlorophenoxyacetic acid ABA : abscissic acid BA : N6-Benzyladenine CĐHTTTV : chất điều hoà tăng trưởng thực vật DNA : deoxyribonucleic acid GA : gibberelline GA : gibberellic acid IAA : indol acetic acid IBA : indolbutyric acid IUCN : International Union for Conservation of Nature and Natural Resources Footer Page of 258 MS : Murashige Skoog NAA : α-napthalenacetic acid RNA : ribonucleic acid TDZ : thidiazuron VU : Vulnerable (bị đe doạ, nguy cấp) Header Page of 258 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình1.2 Sơ đồ tổng quát vùng mô phân sinh Hình 1.3 Sự tổ chức vùng phát sinh hình thái để tạo mô phân sinh rễ Hình 1.4 Sự thành lập rễ (với AIA 10-6 M) mô sẹo (với 2,4-D 10-6) từ mảnh Sansevieria (Bùi Trang Việt 2000) 13 Hình 1.5 Các giai đoạn thu nhận phôi thể hệ 17 Hình 1.6 Cấu trúc phân tử số chất điều hoà tăng trưởng thực vật nhóm auxin 19 Hình 1.7 Cấu trúc phân tử số chất điều hoà tăng trưởng thực vật nhóm cytokinin 23 Hình 1.8 Cấu trúc phân tử số chất điều hoà tăng trưởng thực vật nhóm gibberelline 26 Hình 1.9 Cấu trúc phân tử abscissic acid 27 Hình 1.10 Cấu trúc phân tử etylene 28 Hình 2.2 Mẫu cấy Sưa tuần tuổi để tạo mô sẹo 30 Hình 2.3 Sơ đồ li trích cô lập chất điều hoà tăng trưởng thực vật nội sinh 34 Hình 2.4 Mẫu cấy Sưa tuần tuổi để tạo mô sẹo 36 Hình 3.1 Cây Sưa nảy mầm in vitro sau tuần môi trường MS 39 Hình 3.2 Các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro môi trường MS sau tuần, không hình thành mô sẹo 40 Hình 3.3.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l 40 Hình 3.4.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l BA 0mg/l 41 Hình 3.5.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 0mg/l 41 Footer Page of 258 Header Page 10 of 258 Hình 3.6.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt trụ hạ diệp non Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l BA 0,5 mg/l 42 Hình 3.7.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt trụ hạ diệp non Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l BA 1mg/l 42 Hình 3.8.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt trụ hạ diệp non Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l BA 0,5mg/l 43 Hình 3.9.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l BA 1mg/l 43 Hình 3.10.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 0,5mg/l 44 Hình 3.11.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt trụ hạ diệp non Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 1mg/l 44 Hình 3.12.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l 45 Hình 3.13.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 2mg/l 46 Hình 3.14.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l 46 Hình 3.15.Mô sẹo phát triển từ mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần nuôi cấy môi trường MS có bổ sung Footer Page 10 of 258 Header Page 98 of 258 82 thân non (trụ hạ diệp) (Dalbergia tonkinensis Prain in vitro) Điều ghi nhận Barringtonia racemosa (Behbahani et al 2007), Vải (Litchi chinensis Sonn) (Puchooa 2004) Dalbergia sissoo Roxb (Josh et al 2003) 3.2.3 Sự tăng trưởng mô sẹo Sự thay đổi trọng lượng tươi khô mô sẹo từ mẫu cấy thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitrotrên môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 1mg/l biểu diễn dạng đồ thị hình chữ S (Hình 3.30) với: Pha luỹ thừa, trọng lượng tươi khô mô sẹo tăng nhanh sau tuần, đạt đỉnh tuần thứ nuôi cấy Pha tĩnh: giai đoạn tăng trưởng tế bào chậm dần sau tuần thứ giảm sinh khối tuần thứ Mô sẹo có nguồn gốc từ mẫu cấy thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau tuần môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 1mg/l chuyển vào môi trường có thành phần tương tự thành phần môi trường tạo mô sẹo Sự thay đổi tọng lượng tươi khô biểu diễn dạng đồ thị đường cong tăng trưởng hình chữ S (Hình 3.31) với: Pha luỹ thừa, trọng lượng tươi khô mô sẹo tăng nhanh sau tuần, đạt đỉnh tuần thứ nuôi cấy Pha tĩnh: giai đoạn tăng trưởng tế bào chậm dần sau tuần thứ giảm sinh khối tuần thứ Sựu tăng trưởng tế bào chậm dần ngưng tăng trưởng thường yếu tố dinh dưởng bị cạn dần, môi trường trở thành độc sản phẩm tiết tế bào (Mai Trần Ngọc Tiếng 2001) 3.2.4 Những biến đổi hình thái giải phẫu trình hình thành mô sẹo Sự tạo mô sẹo thực vật nuôi cấy in vitro xảy trình: phản phân hoá tế bào nhu mô, phân chia tế bào tượng tầng, xáo trộn mô phân sinh sơ khởi Lát cắt ngang mẫu cấy thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro sau ngày môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 1mg/l cho thấy tạo mô sẹo từ phản phân hoá tế bào nhu mô phân chia tế bào tượng tầng (Hình 3.33), tiếp phân chia không định hướng nhóm tế bào để hình thành khối mô sẹo (Hình 3.34 3.5) Footer Page 98 of 258 Header Page 99 of 258 83 Trên môi trường MS bổ sung 2,4-D riêng rẽ, tế bào mô sẹo có hình dạng không ổn định có xu hướng kéo dài ( Hình 3.36, 3.37 3.38) Trên môi trường MS có bổ sung kết hợp 2,4-D với BA có diện tế bào mô sẹo hình cầu (những tế bào có khă sinh phôi) (Hình 3.39, 3.40, 3.41, 3.42, 3.43 3.44) Các tế bào mô sẹo hình cầu diện môi trường MS + 2,4-D 3mg/l + BA 1mg/l ổn đinh (Hình 3.44) Những ghi nhận cho thấy, để tạo mô sẹo từ Sưa cần phải kết hợp axin cytokinin, nồng độ tỉ lệ tối ưu mô sẹo tạo tốt nhất, với tế bào có hình cầu ổn đinh 3.2.5 Sự thay đổi cường độ hô hấp trình tạo mô sẹo Cường độ hô hấp trình tạo mô sẹo từ mẫu cấy thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro tăng dần từ tuần thứ 1, cao tuần thứ sau giảm dần tuần thứ 4, giảm mạnh tuần thứ (Hình 3.45) Cường độ hô hấp thể nhu cầu lượng trình phân chia tế bào, tế bào phân chia có cường độ hô hấp cao tế bào phân hoá (Mai Trần Ngọc Tiếng 2001) Điều cho thấy hoạt động biến dưỡng gia tăng nhằm đáp ứng nhu cầu lượng trình phân chia tế bào Nhu cầu gia tăng rõ rệt sau tuần, thời điểm cường độ hô hấp mô sẹo cao 3.2.6 Vai trò chất điều hoà tăng trưởng thực vật nội sinh trình tạo mô sẹo Trong trình tạo mô sẹo từ mẫu cấy thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro, hoạt tính auxin nội sinh tăng dần từ tuần thứ đến tuần thứ sau giảm dần, hoạt tính cytokinin không nhận thấy thay đổi Sự cân hai kiểu hormone auxin cytokinin yếu tố kiểm soát phát triển (Bùi Trang Việt 2000) Sự gia tăng hoạt tính auxin đồng thời với gia tăng mô sẹo cho thấy auxin ảnh hưởng mạnh đến trình phát triển mô sẹo Hoạt tính auxin tăng cung cấp từ môi trường tác động auxin từ môi trường làm gia tăng tổng hợp auxin nội sinh Sự thay đổi hoạt tính gibberelline không nhiều, điều cho thấy gibberelline có ảnh hưởng trình phát triển mô sẹo Footer Page 99 of 258 Header Page 100 of 258 84 Ngược lại với auxin, hoạt tính tương đương với chất cản ABA gia tăng mạnh tuần thứ thứ 5, vào giai đoạn mô sẹo tăng trưởng chậm giảm ABA xem hormone hoá già, hoá già quan gắn liền với gia tăng hoạt tính ABA 3.2.7 Áp dụng kết thay đổi hoạt tính chất điều hoà tăng trưởng thực vật trình tạo mô sẹo Sự gia tăng trọng lượng tươi mô sẹo theo thời gian môi trường tăng nồng độ hormone ngoại sinh môi trường nuôi cấy tạo mô sẹo.Kết phù hợp với thay đổi hoạt tính auxin trình tạo mô sẹo (Bảng 3.4, Hình 3,46) Kết lần cho thấy xuxin có vai trò quan trọng tạo mô sẹo Sưa phối hợp với cytokinin 3.2.8 Sự phát sinh quan từ mô sẹo Khi chuyển mô sẹo từ môi trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l BA 1mg/l sang môi trường thay đổi auxin ( từ 2,4-D sang NAA) giảm chất điều hoà tăng trưởng thực vật mô sẹo không phát triển chết (Hình 3.48) tăng sinh mạnh (Hình 3.49) Nhưng chuyển sang môi trường môi trường thay đổi auxin ( 2,4-D sang NAA) giảm nồng độ auxin (NAA 0,1mg/l) đồng thời tăng nồng độ BA (2, 3mg/l) mô sẹo cảm ứng hình thành sơ khởi quan sau tuần (Hình 3.50), phát triển thành quan chồi phôi sau tuần (Hình 3.51, 3.52) Những kết cho thấy, phát sinh quan từ mô sẹo Sưa in vitro cần phải có phối hợp auxin cytokinin với tỉ lệ định Tỉ lệ auxin/cytokinin xác định chương trình phát sinh hình thái (rễ hay chồi) (George et al 2008) 3.2.9 Những biến đổi hình thái giải phẫu trình phát sinh quan từ mô sẹo Lát cắt qua khối mô sẹo sau tuần nuôi cấy tạo quan môi trường MS có bổ sung 2,4-D 0,1mg/l BA 3mg/l cho thấy có diện cấu trúc sơ khởi quan chồi (Hình 3.53) Những cấu trúc sơ khởi quan chồi phát triển hoàn thiện dần theo thời gian (Hình 3.54, 3.55, 3.56 3.57 ) Footer Page 100 of 258 Header Page 101 of 258 85 3.2.10 Sự thay đổi cường độ hô hấp quang hợp trình phát sinh quan từ mô sẹo Trong trình phát sinh quan từ mô sẹo ởSưa, cường độ quang hợp hô hấp mẫu cấy tăng theo thởi gian Kết cho thấy hoạt động biến dưỡng gia tăng nhằm đáp ứng nhu cầu lượng trình phân chia biệt hoá tế bào 3.2.11 Vai trò chất điều hoà tăng trưởng thực vật nội sinh trình phát sinh quan từ mô sẹo Các bước phát triển thể thực vật kết loạt phản ứng biến dưỡng Các hoạt động biến dưỡng chịu chi phối CĐHTTTV sinh trình (Taiz and Zeiger 2002) Trong tạo chồi từ mô sẹo Dalbergia tonkinensis Prain in vitro môi môi trường MS + 2,4-D 0,1mg/l + BA 3mg/l, hoạt tính cytokinin tăng mạnh tuần thứ giảm xuống tuần thứ tăng nhẹ tuần thứ Trong hoạt tính auxin thấp tuần thứ tăng mạnh tuần thứ giảm nhẹ tuần thứ Điều cho thấy tương quan auxin cytokinin phát sinh phát triển quan thực vật Sự kết hợp auxin cytokinin môi trường nuôi cấy với tỉ lệ định có vai trò biệt hóa tạo mô sẹo, hình thành quan chồi, rễ … cho loại thực vật định Auxin ảnh hưởng lên hoạt động cytokinin tế bào cách điều hòa xuôi trình tổng hợp phát huy thoái hóa cytokinin (Kiss et al 1992) 3.2.12 Sự tạo dịch treo tế bào Mô sẹo từmẫu cấy thân non (trụ hạ diệp) Sưa in vitro môi trường MS có bổ sung 2.4-D 3mg/l BA 1mg/lsau tuần lạo mô mềm, dễ tách rời, vật liệu thích hợp cho tạo dịch treo tế bào đường tạo mô sẹo Sau tuần nuôi cấy môi trường lỏng lắc, tế bào dịch treo gồm nhóm tế bào, hay tế bào riêng rẽ Footer Page 101 of 258 Header Page 102 of 258 86 Từ kết cho thấy,khả tách rời tạo nhóm tế bào dịch treo tỉ lệ với khối lượng mô sẹo chuyển vào môi trường tạo dịch treo (2,0 gam 1,0 gam mô sẹo chuyển vào môi trường tạo dịch treo khả tách rời tạo nhóm tế bào dịch treo tốt hơn) Tuy nhiên độ màu sắc dịch treo tỉ lệ nghịch với khối lượng mô sẹo chuyển vào môi trường (dịch treo tạo từ 500 mg mô sẹo có màu sắc độ tốt dịch treo tạo từ 2,0 gam 1,0 gam mô sẹo) Và tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo Sưa in vitro tạo môi trường lỏng lắc, có thành phần môi trường giống với thành phần môi trường tạo mô sẹo Footer Page 102 of 258 Header Page 103 of 258 87 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết thu nhận được, rút kết luận sau: Phôi Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) (bỏ tử diệp) phát triển tốt môi trường MS điều kiện in vitro Môi trường MS có bổ sung 2.4-D 3mg/l BA 1mg/l môi trường thích hợp cho cảm ứng tạo mô sẹo tăng trưởng mô sẹo từ Sưa in vitro Cường độ hô hấp mô sẹo tăng ương ứng với tăng trưởng mô sẹo theo thời gian Mô sẹo hình thành quan môi trường MS có bổ sungNAA 0,1mg/l BA (2, 3mg/l) sau tuần nuôi cấy Dịch treo tạo chuyển mô sẹo vào môi trường lỏng lắc có thành phần tương tự môi trường tạo mô sẹo 4.2 Đề nghị Trong tương lai, có điều kiện nghiên cứu, tiếp tục tìm hiểu ảnh hưởng CĐHTTTV khác lên khả tạo sẹo, dịch treo tế bào, khả phát sinh quan từ mô sẹo dịch treo tế bào thu nhận hợp chất thứ cấp từ Sưa tự nhiên Footer Page 103 of 258 Header Page 104 of 258 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng việt Bộ khoa học công nghệ Việt Nam 1996, Sách đỏ Việt Nam, Phần II, Nxb Khoa học tự nhiện Công nghệ, Hà Nội Đỗ Văn Bản, Nguyễn Văn Hưng, Nguyễn Hào Hiệp 2009 “Cấu tạo gỗ Sưa Dalbergia tonkinensis Prain” , Khoa học lâm nghiệp, (số4), tr.1130 -1131 Võ Văn Chi 1999 Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, 1252-1255 Võ Văn Chi 2003, Từ điển thực vật thông dụng, tập 1, NXB Khoa học Kỹ thuật Vũ Thị Thu Hiền, Lưu Đàm Cư Đinh Thị Phòng 2009 Xác định trình tự đoạn gen tRNA – Leu cho hai loài gỗ Sưa (Dalbergia tonkinensis) gỗ Trắc đỏ (Dalbergiacochinchinensis ) phục vụ việc phân loại mẫu vật bảo tàng thiên nhiên Việt Nam Tạp chí Cộng nghệ Sinh học 7(4) 471-477 Nguyễn Như Khanh 2007 Sinh học phát triển thực vật NXB giáo dục Dương Công Kiên 2002 Nuôi cấy mô thực vật NXB giáo dục Nguyễn Đức Lượng Lê Thị Thuỷ Tiên 2006 Công nghệ tế bào NXB Đại Học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh Trang 77-130 Mai Trần Ngọc Tiếng, Nguễn Thị Ngọc Lang, Đặng Vĩnh Thanh, Nguyễn Du Sanh, Bùi Trang Việt 1980 Kích Thích Tố Giâm Cành Phần II – Cơ chế tạo rễ bất định Thông báo Khoa học, Đại học Tổng hợp TP Hồ Chí Minh, Số 4, 93-98 10 Mai Trần Ngọc Tiếng 2001 Thực vật cấp cao NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM 11 Trần Anh Tuấn, Nguyễn Tiến Đạt, Nguyễn Hoài Nam, Nguyễn Quang Hưng, Trần Minh Hợi, Trần Huy Thái, Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm 2009 Tạp chí Hoá học, T.47(6), tr 716-719 12 Nguyễn Bá Tư, Đặng Ngọc Minh Nhân giống Trắc đỏ (Dalbergia tonkinensis prain) phương pháp giâm hom tỉnh Quảng Bình IV-O-1.7 13 Bùi Trang Việt 2000 Sinh lí thực vật đại cương Phần II – Phát triển NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM Footer Page 104 of 258 Header Page 105 of 258 89 14 Bùi Trang Việt 2002 Sinh lí thực vật đại cương Phần I – Dinh dưỡng NXB Đại học Quốc gia Tp HCM 15 Bùi Trang Việt 2003 Sinh phôi thể hệ thực vật Giáo trình cao học sinh lí thực vật 16 Bùi Trang Việt, Phan Ngô Hoang, Nguyễn Thị Huệ, Trần Thanh Hương, Trịnh Cẩm Tú, Trần Thị Bích Trinh, Đòan Thị Phương Thùy, Cao Minh Phương 2004 Vai trò auxin cytokinin trình sinh phôi thể hệ khoai tây, lúa chuối Tạp chí KHKT nông lâm nghiệp số 2/2004: 64-67 17 Trần Vinh 2007 Cây Sưa loài quý Báo Thông Tin Khoa Học Kĩ Thuật Nông Lâm Nghiệp, số  Tài liệu tiếng nước 18 Abeles F.B., Morgan P.W., Saltveit M.E 1992 Role and physiogical effects of ethylen in plant physiology: Dormancy growth and development Ethylen in biology Academic Press San Diego 120-176 19 Bajaj S and Rajam M.V 1996 Polyamine Accumulation and Near Loss of Morphogenesis In Long – Callus Culture of Rice Plant Physiol 112:1343-1348 20 Behbahani M., Ali A.M and Muse R Plant regeneration from an explants of Barringtonia racemosa Journal Of Medicinal Plants Research pp 103 – 108, December 2007 21 Bhojwani S.S and Soh W.Y 2001 Current Trends in The Embryos of Angiosperms Kluwer Academic Publishers Netherlands 533p 22 Binzel M.L., Shakhla N., Joshi S and Shakhla D 1996 In vitro regeneration in chili pepper (Capsicum annuum L.) from “half-seed explants” Plant Growth Regulat 20: 287-293 23 Bögre L and Beemster G 2008 Plant Growth Signaling Springer-Verlag Berlin Heidelberg Publisher 380p Footer Page 105 of 258 Header Page 106 of 258 90 24 Brown D.C.W., Finstad KI and Watson E.M 1995 Somatic embrogenesis in Herbaceous Dicots In: Thorpe T.A (Ed) In vitro Embryogenesis in Plants Kluwer Academic Publishers 345-415 25 Bui Trang Việt 1994 Ultilisation de systèmes cellulaires en vue de l’introgression de gènes d’intérêt agronomique pour amélioration des bananiers Thèse Doctorat Biologie moléculaire et cellulaire végétale 26 Carles C.C and Flecher J.C 2003 Shoot apical meristem maintenance: the art of a dynamic balance Trends in Plant Science 8(8): 394-401 27 Chakrabarty D., Yu K.W., Paek K.Y 2003 Detection of DNA methylation changes during somaic embryogenesis of Siberian ginseng (Eleuterococcus senticosus) Plant Science 165: 61-68 28 Chugh A and Khurana P 2002 Gene expression during somatic embryogenesis – recent advances Current Science 83(6): 715-730 29 Davies P.J 1995 Plant Hormones Kluwer Academic Publishers 833p 30 Dwartan D.I., Tautorus T.E and Thorpe T.A 1995 Somatic embryogenesis in woody plants In: Thorpe T.A (Ed) In vitro embryogenesis in plants Kluwer Academic Publisher 471-538 31 Edwin F.G (1996), “Plant propagation by tissue culture”, Part 2: In practice Exegetics Limited, 613 – 936 32 Evans D.A., Sharp W.R., Ammirato P.V and Yamada Y 1983 Handbook of Plant Cell Culture Macmillan 227p 33 Evert R.F 2006 Esau’s Plant Anatomy Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development John Wiley & Sons, Inc 601p 34 Feraru E and Friml J 2008 PIN Polar Targeting Plant Physiol 147: 1553-1559 35 Frank M., Guivarch A Krupkova E., Lorenz-Meyer I., Chriqui D and Schmulling 2002 Tumorous shoot development (TSD) genes are required for co-ordinated plant shoot development The Plantn Journal 29 (1):73-85 Footer Page 106 of 258 Header Page 107 of 258 91 36 George E.F., Hall M.A and De Klerk G.J 2008 Plant Propagation by Tissue Culture Vol (1): The Background Springer Publisher 501p 37 Gilroy S and Masson P.H 2008 Plant Troisms Blackwell Publishing 207p 38 Groβ-Hardt R and Laux T 2003 Stem cell regulation in the shoot meristem Journal of 17 Cell Science 116: 1659-1666 39 Hatanaka J., Arakawa O., Yasuda T., Ushida N and Yamaguchi I 1991 Effect of plant growth regulators on somatic embryogenesis in leaf cultures of Coffea canephora Plant Cell Rep., 10, 179-182 40 Hobbie L.J 2007 Auxin Encyclopedia of auxin John Wiley and Son 9p 41 Hughes M.A 1996 Plant Molecular Genetics Addison Wesley Longman Ltd 236p 42 Jenik P.D and Barton K.M 2005 Surge and destroy: the role of auxin in plant embryogenesis Development 132 (16): 3577-3585 43 Josh M S., Bisht P., Sharma V.K and Uniyal D.P Studies on effect of nutrient media for clonal propagation of superior phenotypes of Dalbergia sissoo Roxb Through tissue culture Slvae Gentica 52, 3-4 (2003) 44 Karp G 1999 Cell and Molecular Biology Concepts and experiments John Wiley & Son, Inc 816p 45 Kiss J., Heszky L.E., Kiss E and Gyulai G 1992 High efficiency adventive embryogenesis on somatic embryos of anther, filament and immature proembryo origin in horse – chetnut (Aesculus hippocastanum L.) tisseue culture Plant Cell, Tissue and Organ Organ Culture 30, pp 59-64 46 Kuroha T., Kato H., Asami T., Yoshida F., Kamada H., and Satorh S (2002),A trans-zeatin riboside in root xylem sap negatively regulates adventitious root formation on cucumber hypocotyls, Journal ofExperimental botany 53, 378, 2193-2200 47 Litwack G 2005 Plant hormore Vitamins and Hormone Elsevier Inc 72: 544p Footer Page 107 of 258 Header Page 108 of 258 92 48 Lui Z.H., Wang W.C and Yen Y.S 1998 Effect of hormone treatment on root formation and indole-3-acetic acid and polyamine levels of Glycine max, Bot, Bull, Acad Sin 39: 113-118 49 Machakova I., Zazimalova E., George E.F 2008 Plant growth regulators I: introduction; Auxin, their Analogues and Inhibitor Plant Propagation by Tissue Culture 3rd Edition, Volume The Background, 185-197 50 Merkle S.A., Parrott W.A and Flinn B.S 1995 Morphogenic aspects ofsomatic embryogenesis In: Thorpe T.A (Ed) In vitro Embryogenesis in Plant Klants Kluwer Academic Publishers 155-204 51 Neuman K.C., Preece J.E., Van Sambeek JW and Gaffney G.R 1993 Somatic embryogenesis and callus production from cotyledon explants of Eastern black walnut Plant Cell, Tissue and Organ Cculture 32, 9-18 52 Norgaad J.V and Krogstrup P 1991 Cytokinin induced somatic embryogenesis from immature embryos of Abies nordmanniana L.K., Plant Cell Rep 9, 509513 53 Puchooa D 2004 In vitro regeneration of lychee (Litchi chinensis Sonn) African Journal of Biotechnology, Vol 3(11): 576-584, November 2004 54 Rebuillat J., Dievart A., Verdei J.L., Escoute J., Giese G., Breitler J.C.,Gantet P., Espeout S., Guiderdoni E & Pesrin C 2009 Molecular Genetics of Rice Root Development Rice (2): 15-24 55 Reinhardt D., Frenz M., Mandel T and Kuhlemeier C 2003 Microsurgical and laser ablation analysis of interactions between the zones and layers of the tomato shoot meristem Development 130:4073-4083 56 Rogosic J., Estell R., Skobic D., Martinovic A., Maric S 2006 Role ofspecies diversity and secondary compound complamentarity on diet selactin mediterranean shrubs by goat J Chem Ecol, vol 32, pp 1279-1287 57 Sankhla D., Davis T.D and Shankhla N 1993 Effect of gibberellin biosynthesis inhibitors on shoot regeneration from hypocotyls explants of Albizzia julibrissin Plant Cell Reports Volume 13, Number Footer Page 108 of 258 Header Page 109 of 258 93 58 Saxena P.K, Malik KA and Gill R 1992 Induction by thidiazuron of somatic embryogenesis in intact seedlings of peanut, Planta 187, 421-424 59 Scanlon M.J 2003 The polar auxin transport inhibitor N-1-Napthylphthalamic acid disrupts leaf initiation, Knox Protein regulation, and formation of leaf margrins in maize Plant physiol 133: 597-605 60 Scheres B., Wolkenfelt H., Willemsen V., Terlouw M., Lawson E., Dean C., Weisbeek P 1994 Embryonic origin of the Arabidopsis primary root and root meristem initials Development 120: 2475-2487 61 Schuller A., Reuther G and Geier T 1989 Somatic embryogenesis from seed explant of Abies alba Plant Cell, Tissue and Organ Culture 17, 53-58 62 Sharma P and Rajam M.V 1995 Genotype, explant and position effects on organogenesis and embryogenesis in eggplant (Solanum melongenaL.) J Exp Bot 46: 135-141 63 Tahir M and Stasolla C 2006 Shoot apical development during in vitroembryogenesis Can J Bot 84: 1650-1659 64 Taiz and Zeiger 2005 Plant Physiology The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc 65 Waisel Y., Eshel A., Kafkafi U 2002 Plant root – the hidden half Marcel Dekker Inc 1136p 66 Weijers D and Jürgens G 2005 Auxin and embryo axis formation: the ends in sight? Current Opinion in Plant Biology 8: 32-37 67 Yokota T., N Murofushi & N Takahashi 1980 Molecular aspects of plant hormones Pp 113-201 in Encyclopedia of plant physiology, (J MacMillan, ed.) Springer New York 68 Zhong, H., Srinivasan, C and Sticklen, M.B (1991) Plant regeneration via somatic embryogenesis in creeping bentgrass (Agrostis palustris Huds.) Plant Cell Reports 10, 453–456 Footer Page 109 of 258 Header Page 110 of 258 94 69 Zhou J.Y., Ma H., Guo and Luo F.X and Luo X.T 1994 Effect of thidiazuron on somatic embryogenesis of Cayratic japonica Plant Cell, Tissue and Organ Culture 36, 73-79 Footer Page 110 of 258 Header Page 111 of 258 95 PHỤ LỤC Phụ lục Môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) Khoáng đa lượng Hàm lượng (mg/l) NH NO 1650 KNO 1900 CaCl 2H2O 440 MgSO 7H2O 370 KH PO 170 Khoáng vi lượng H BO 6,20 MnSO 4H O 22,30 ZnSO 7H2O 8,60 KI 0,83 Na MoO 2H2O 0,25 CuSO 5H O 0,025 CoCl 6H O 0,025 Fe-EDTA FeSO 7H O Na EDTA 27,80 37,30 Vitamin Morel Meso-inosito 100 Pirydoxine (B6) Biotin (H) Nicotinic acid(P.P) Thiamin –HCl(B1) Pantotate Calci pH 5,7 Agar 8g/l Footer Page 111 of 258 Header Page 112 of 258 96 Phụ lục Hình Hình Cây sưa tự nhiên (a) Cây Sưa tháng tuổi (http://www.vatgia.com/raovat/2753/4831718/giongcay-sua-do.html) (b) Cây Sưa trưởng thành 150 tuổi (http://vtc.vn/394-289630/phong-su-khampha/chuyen-quanh-cay-sua-tri-gia-ca-chuc-ty-dong-o-bac-ninh.htm) Hình Mô sẹo Sưa tăng trưởng sau tuần môi trường MS có bổ sung 2.4-D 3mg/l BA 1mg/l Footer Page 112 of 258 ... sung vào môi trường tạo mô sẹo từ Sưa in vitro 37 Bảng 2.4 Nồng độ chất điều hoà tăng trưởng thực vật bổ sung vào môi trường tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo từ Sưa in vitro 38 Bảng 3.1 Sự. .. đến trình tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo Sưa in vitro 78 3.2 Thảo luận 81 3.2.1 Sự tạo Sưa in vitro 81 3.2.2 Sự tạo mô sẹo 81 3.2.3 Sự tăng trưởng mô sẹo ... 258 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Võ Dương Thanh SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ DỊCH TREO TẾ BÀO TỪ CÂY SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN) IN VITRO Chuyên ngành : SINH HỌC THỰC NGHIỆM