Khảo sát và phân tích sự bài thải của chramphenicol bằng kỹ thuật LC MS MS trên tôm (penaeus monodon) được nuôi trong điều kiện thí nghiệm

ĐOÀN THANH NIÊN CỘNG SẢN HỒ CHÍ MINH BAN CHẤP HÀNH TP HỒ CHÍ MINH CÔNG TRÌNH Dự THI GIẢI THƯỞNG SINH VIÊN NGHIÊN cứu KHOA HOC - EURE’KA LẦN THỨ 11 NĂM 2009 KHẢO SÁT VÀ PHÂN TÍCH BÀI THẢI CHLORAMPHENICOL BẰNG KỸ THUẬT LC/MS/MS TRÊN TÔM sú (Penaeus monodon) ĐƯỢC NUÔI TRONG ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM LĨNH Vực NGHIÊN CỨU: Tự NHIÊN CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH TÁC GIẢ: Nguyễn Minh Triết Mẽi lò' eớnạ trình : MỤC LỤC Trang MỤC LỤC DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .3 DANH SÁCH CÁC BẢNG .4 DANH SÁCH CÁC HÌNH Chương MỞ ĐẦU Chương MỤC TIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1 Mục tiêu đề tài 2.2 Thời gian, địa điểm phương pháp tiến hành 2.2.1 Thời gian 2.2.2 Địa điểm 2.3 Vật liệu .9 2.3.1 Mẩu tôm 2.3.2 Hóa chất 12 2.3.3 Dụng cụ thiết bị 12 2.4 Phương pháp phân tích LC/MS/MS 12 2.4.1 Cách chuẩn bị mẫu phân tích 12 2.4.2 Điều kiện phân tích 13 2.4.3 Pha dung dịch chuẩn 14 2.4.4 Nguyên tắc định lượng CAP 15 2.4.5 Công thức tính toán nồng độ CAP có mẫu 15 2.4.6 Hiệu suất thu hồi quy trình chiết mẫu 16 2.4.7 LOD LOQ phương pháp 16 Chương KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 31 Trọng lượng mẫu tôm sú s au trình nuôi thí nghiệm 18 3.2 Xây dựng đường chuẩn CAP 19 3.3 Đánh giá hiệu thu hồi quy ữình chiết mẫu 21 3.4 LOQ phương pháp .23 3.5 Xác định thòi gian thải CAP tôm sú 23 3.6 Khảo sát nhỏ tình hình nhiễm CAP tôm khu vực huyện Thủ Đức 26 Chương KÉT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31 4.1 Kết luận 27 4.2 Đề nghị 27 TÀI LỆU THAM KHẢO 29 PHỤC LỤC DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CAP CLX Chloramphenicol Chợ Linh Xuân CTD Chợ Thủ Đức DC Đối Chứng H Giờ HPLC High Performance Liquid Chromatography GC/MS Gas Chromatography/Mass Spectrometry LC/MS/MS Liquid Chromatography/Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry LOD Limit of Detection LOQ MRPL Limit of Quantitation Minimum Require Performance Limit MeOH Methanol MS Mass Spectrometry ppm ppb part per million part per billion Rt Retention time ITC Total ion Chromatography DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Tốc độ dòng pha động trình sắc ký kháng sinh CAP 13 Bảng 3.1 Trọng lượng tôm thu thời điểm khác sau nuôi 18 Bảng 3.2 Thời gian lưu cường độ lon m/z 151,9 nồng độ chuẩn 19 Bảng 3.3 Cường độ lon m/z 151,9 mẫu thêm chuẩn 21 Bảng 3.4 Hiệu suất thu hồi quy trình chiết tách CAP từ mẫu tôm 22 Bảng 3.5 Nồng độ ữung bình CAP ưên tôm 24 Bảng 3.6 Kết phân tích CAP 25 mẫu tôm địa bàn quận Thủ Đức 26 DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ sơ ĐỒ Trang Hình 2.1 Ao dùng để nuôi tôm toong thí nghiệm 11 Hình 2.2 lon m/z 151,9 lon m/z 256,9 15 Hình 3.1 Phổ đồ lon định lượng m/z 151,9 nồng độ chuẩn 0,1 ppb 19 Hình 3.2 Đường chuẩn CAP 20 Hình 3.3 Phổ đồ lon định lượng m/z 151,9 mẫu thêm chuẩn 0,1 ppb 21 Hình 3.4 Đường chuẩn c AP mẫu tôm thêm chuẩn CAP 22 Hình 3.5 Tỷ lệ S/N chuẩn 0,1 ppb 23 Hình 3.6 Ln nồng độ CAP (ppb) theo thời gian 24 Sơ đồ 2.1 Quy trình nuôi tôm dùng làm mẫu thí nghiệm 11 Chương ĐẶT VẤN ĐÈ Kháng sinh Chloramphenicol trước trộn lượng nhỏ vào thức ăn cho tôm với mục đích kích thích khả sinh trưởng tôm nuôi Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh để lại tồn dư toong thịt tôm Qua hàng chục năm nghiên cứu nhà khoa học khẳng định người tiêu dùng tiêu thụ sản phẩm tôm có tồn dư CAP có tích lũy tồn dư kháng sinh cao, điều gây độc hại mãn tính cho người sử dụng Do đó, quan quản lý an toàn thực phẩm Mỹ, Châu Âu Việt Nam liệt CAP vào danh sách cấm sử dụng toong nuôi trồng, chế biến bảo quản tôm Tuy nhiên cần phải thấy Việt Nam quy định khắt khe cho hàng xuất khẩu, với hàng tiêu thụ nội địa việc kiểm tra quy trình nuôi, chế biến bảo quản bỏ ngỏ Vì vậy, tiến hành: Xây dựng quy trình định lượng dư lượng CAP Kiểm toa chất lượng 25 mẫu tôm địa bàn Thủ Đức Khảo sát thải tồn dư CAP nhằm xác định thời gian thải bán rã CAP (tj/2 CAP) toong tôm tù làm sở cho nhà quản lý người chăn nuôi toong quản lý, sử dụng kháng sinh họrp lý Sự thải Chloramphenicol khảo sát thịt tôm (Penaeus monodon) sau ngưng cho ăn kháng sinh thực điều kiện nuôi thí nghiệm có kiểm soát Tôm nuôi bốn ao: ao đối chứng ao cho ăn thức ăn có trộn CAP với nồng độ tính toán 2000 mg/kg Mầu tôm thu thời điểm khác nhau:l , giờ, 10 giờ, 20 giờ, 30 giờ, 60 giờ, 120 giờ) sau lần cuối cho ăn thức ăn có chúa kháng sinh Kết đạt được: Quy trình phân tích dư lượng CAP đạt giới hạn phát phương pháp 0,03 ng/g đáp ứng tốt giới hạn phát thị trường nhập Mỹ-EU-Nhật (0.3 ng/g) Quy trình thực hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ LC/MS/MS Thăm dò sơ cho thấy tôm tiêu thụ địa bàn Quận Thủ Đức không hoàn toàn kháng sinh Chloramphenicol (2/25 mẫu) Các mẫu phát nồng độ thấp (0,68 ppb 0,87 ppb ) Sau 60 kể tù ngưng cho ăn kháng sinh nồng độ CAP không xác định (b Rt-4.41 IỈ1Z - IM H» M r m m m i j j m BT _ _ - ! N —iảlll IL Hình 3.1 Phồ đồ lon định lượng m/z 151,9 nông độ chuẩn 0,1 ppb Hình 3.1 cho thấy cường độ ion định lượng (m/z = 151,9) CAP nồng độ chuẩn 0,1 ppb có thời gian lưu 4,41 phút Thực tế khỉ chứng chạy sắc ký nồng độ chuẩn từ 0,1 ppb đến ppb cho phổ đồ lon với củng thời gian lưu 4,41 cường độ lon m/z 151,9 gia tăng tuyến tỉnh theo nầng độ có hệ sấ tương quan R2 = 0,9998 Đồng thời không cỗ peak nhiễu thời điểm ttên (Xem thêm phần phụ lục) Bảng 3.2 Thời gian lưu cưởng độ lon m/z 151,9 nồng độ chuẩn CAP oa 0,3 0*4 0,5 4,41 4,41 4,41 4,41 4,41 4,41 4,41 3467,84 6148,30 8634,43 9734,18 c (ppb) 0,1 Rt Cường độ lon m/z 151,9 13874 24751 116290 20 Bàng 3.2 cho thấy gia tăng tuyến tính nồng độ chuẩn mà thực Tù cường độ lon m/z 151,9 nồng độ chuẩn thực hiện, dựng đường chuẩn hình 3.2 Phương trình đường chuẩn y = 22968x+ 1520,1 Đồng thời hệ số tương quang R2 = 0.9998 Tù phương trình đường chuẩn ta suy nồng độ CAP dịch chiết tù mẫu Ta thay nồng độ có tù dịch chiết mẫu vào công thức phần 2.4.5, từ suy nồng độ CAP thực có mẫu 3.3 Đánh giá hiệu thu hồi quy trình phân tích Sau có mẫu thêm chuẩn, tiến hành ly ữích CAP theo quy ữình trình bày phần 3.3.1 Tù chứng có cường độ lon m/z 15,9 mẫu thêm chuẩn 0,1 ppb, 0,2 ppb, 0,3 ppb, 0,4 ppb, 0,5 ppb 21 Hình 3.3 cho chóng ta thấy phẩ đồ lon định lượng mẫu thêm chuẩn 0,1 ppb có thời gian lưu củng thòi gian lưu chuẩn peak nhiễu củng thời điểm Các mẫu thêm chuẩn gia tăng tuyến tính cưởng độ lon m/z 151,9 Bẵng 3.3 Cường độ cửa Ion m/z 151,9 cửa mẫu dã thêm chuẩn Nồng đ$ chuẩn CÂP (ppb) Cưởng độ lon m/z 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 3392,89 5977,19 7111,15 11326,00 15356,00 151,9 Khỉ tiến hành so sánh kết cưởng độ Ion m/z 151,9 mẫu thêm chuẩn vởỉ cường độ lon m/z 151,9 chuẩn mà chung thục phần 3.2 cho thấy hiệu suất thu hầỉ quy ưỉnh chiết mẫu 22 Bảng 3.4 Hiệu suất thu hồi quy trình chiết tách CAP từ mẫu tôm Nong độ chuẩn (ppb) Cường độ lon m/z 151,9 Cường độ lon m/z trung bình cho 151,9 chạy chuẩn vào mẫu trắng chuẩn với methanol Hiệu suất thu hồi trung bình (n=3) 0,1 3232,68 3467,81 93,22 % 0,2 5405,98 6148,30 87,93 % 0,3 0,4 7793,12 11369,66 8634,43 9734,18 90,26 % 116,80 % 0,5 14562 13874 104,96 % Như bảng 3.4 cho thấy, hệ số thu hồi nồng độ tù 87,93% đến 116, 80 %, từ cho thấy quy trình ly trích mẫu đảm bảo độ tin cậy Đường chuẩn có phương trình đường chuẩn y’ = 29275x’ - 149,86 Hệ số tương quan phương trình R’ = 0,9599 23 3.4 LOQ phương pháp Như trình bày phần 2.4.7, để xác định LOQ phuong pháp, tnrởc hết chóng càn xác định LOD thiết bị Việc xác định LOD thiết bị tiến hành cách dùng nồng độ chuẩn 0,1 ppb để tìm tỷ lệ S/N = Hình 3.5 Tỷ lệ S/N chuẩn 0,1 ppb Như ttên hình 3.5, chóng ta thấy tỷ lệ S/N thiết bị 88 nông độ 0,1 ppb Đê đạt S/N = nồng độ 0,0034 ppb LOQ = 10 X LOD = 0,03 ppb Vậy LOQ phương pháp đạt 0,03 ppb, giới hạn đạt yêu cầu phân tỉch nước châu Âu, Mỹ (LOQ = 0,3 ppb) 3.5 Xác định thải CAP tôm sủ Sau khỉ cỗ mẫu tôm vào lúc giở , giờ, 10 giở, 20 giở, 30 giờ, 60 giở, 120 giở sau lần cho ăn cuổỉ có chứa kháng sinh CAP, Thực ly trích phần 2.4.1 chạy sắc ký phần 2.4.2 Kết nồng độ CAP thịt tôm sau thời gian thỉ nghiệm thể bảng 3.5 24 Bảng 3.5 Nồng độ trung bình CAP tôm Thời gian sau lần cho ăn cuối (giờ) Nồng độ CAP (n=6) 7,3 ± 1,1 10 20 4,4 ±2,1 2,9+ 0,6 1,6 ±0,3 30 0,6 ± 0,4 60 120 0,3 ± 0,2