Nghiên cứu tác dụng chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men quả táo mèo (Docynia indica) (luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu tác dụng chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men quả táo mèo (Docynia indica) (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tác dụng chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men quả táo mèo (Docynia indica) (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tác dụng chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men quả táo mèo (Docynia indica) (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tác dụng chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men quả táo mèo (Docynia indica) (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tác dụng chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men quả táo mèo (Docynia indica) (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tác dụng chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men quả táo mèo (Docynia indica) (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tác dụng chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men quả táo mèo (Docynia indica) (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tác dụng chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men quả táo mèo (Docynia indica) (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tác dụng chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men quả táo mèo (Docynia indica) (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tác dụng chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men quả táo mèo (Docynia indica) (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tác dụng chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men quả táo mèo (Docynia indica) (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu tác dụng chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp trên ở người của dịch lên men quả táo mèo (Docynia indica) (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - Nguyễn Thị Minh Thƣ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG LẠI VI KHUẨN KHÁNG KHÁNG SINH (MORAXELLA CATARRHALIS) GÂY NHIỄM ĐƢỜNG HÔ HẤP TRÊN Ở NGƢỜI CỦA DỊCH LÊN MEN QUẢ TÁO MÈO (DOCYNIA INDICA) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2011 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP Ở NGƢỜI 1.2 Moraxella catarrhalis VÀ BỆNH VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP TRÊN 1.2.1 Đặc điểm hình thái nuôi cấy 1.2.2 Vai trò M.catarrhalis bệnh nhiễm khuẩn hô hấp 1.2.3 Tính kháng kháng sinh M catarrhalis 1.3 CHẤT KHÁNG SINH 10 1.3.1 Khái niệm 10 1.3.2 Chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn 11 1.3.3 Chất kháng khuẩn thực vật 14 1.3.4 Cơ chế kháng khuẩn 15 1.4 CÂY TÁO MÈO VÀ DỊCH CHIẾT TỪ QUẢ TÁO MÈO 16 1.4.1 Đặc điểm thực vật học 16 1.4.2 Sự phân bố 17 1.4.3 Tác dụng dƣợc lý 17 14.4 Thành phần hóa học 18 1.4.5 Tình hình nghiên cứu táo mèo 18 Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 19 2.1 NGUYÊN LIỆU 19 2.1.1 Nguồn giống 19 2.1.2 Hóa chất thiết bị 19 2.2 PHƢƠNG PHÁP 19 2.2.1 Phƣơng pháp lên men táo mèo 19 2.2.2 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn 19 2.2.3 Xác định hoạt tính kháng sinh enzym 20 2.2.4 Bảo quản giống 21 2.2.5 Xác định sinh khối phƣơng pháp đo mật độ quang học-OD 21 2.2.6 Xác định yếu tố ảnh hƣởng tới khả sinh trƣởng hoạt tính 21 kháng khuẩn vi khuẩn 2.2.7 Tách chiết hợp chất dịch lên men vi khuẩn giấm táo mèo 22 2.2.8 Khảo sát sơ thành phần hóa học dịch chiết táo mèo phân 25 đoạn kháng khuẩn Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 HOẠT TÍNH KHÁNG Moraxella catarrhalis CỦA DỊCH LÊN MEN 28 QUẢ TÁO MÈO 3.2 TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT 29 3.2.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật kháng Moraxella catarrhalis 29 3.2.2 Phân loại chủng vi khuẩn tuyển chọn 30 3.3 ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY THÍCH HỢP CHO SINH TRƢỞNG VÀ 32 HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN 3.3.1 Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy thích hợp 32 3.3.2 Nguồn cacbon thích hợp 33 3.3.3 Nguồn nitơ thích hợp 34 3.3.4 Lựa chọn pH nuôi cấy thích hợp 36 3.3.5 Lựa chọn nhiệt độ thích hợp 37 3.3.6 Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp 38 3.3.7 Khả sinh enzym ngoại bào TM5.2 39 3.4 TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG KHUẨN TỪ DỊCH CHIẾT TÁO MÈO 39 VÀ DỊCH LÊN MEN VI KHUẨN 3.4.1 Khảo sát hệ dung môi rửa giải pha rắn hấp phụ 40 3.4.2 Tách chiết phân đoạn chất kháng khuẩn dịch lên men vi khuẩn 40 3.4.3 Tách chiết phân đoạn chất kháng khuẩn từ dịch chiết táo mèo 41 3.4.4 Sắc ký mỏng phân đoạn kháng khuẩn dịch lên men chủng 42 TM5.2 dịch chiết táo mèo 3.5 NGHIÊN CỨU SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO DỊCH LÊN 42 MEN, DỊCH CHIẾT TÁO MÈO VÀ CÁC PHÂN ĐOẠN 3.5.1 Sơ thành phần hóa học cao dịch chiết táo mèo phân đoạn 42 KẾT LUẬN 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC MỞ ĐẦU Nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp cấp bệnh lý có tỷ lệ tử vong đứng đầu số 10 bệnh lý nhiễm khuẩn nƣớc có thu nhập thấp Chƣơng trình toàn cầu phòng chống nhiễm khuẩn hô hấp cấp đƣợc WHO phát động, Việt Nam chƣơng trình đƣợc triển khai từ năm 1984 Kiểm soát phòng chống bệnh đƣợc ƣu tiên hàng đầu nƣớc phát triển có Việt Nam, nhƣng chịu tác động bất lợi phát triển lan truyền tình trạng kháng kháng sinh vi khuẩn gây bệnh Bệnh nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp cấp gồm nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp dƣới Tỷ lệ mắc bệnh nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp chiếm phần lớn so với bệnh hô hấp khác, bệnh thƣờng gặp, mắc hàng năm, theo mùa nhƣng gây nhiều biến chứng nặng nhƣ viêm tai giữa, viêm màng não, áp xe não, áp xe sau thành họng Khi mắc viêm đƣờng hô hấp lây nhiễm xuống đƣờng hô hấp dƣới gây viêm khí, phế quản viêm phổi nặng Có thể thấy bệnh gây ảnh hƣởng đáng kể đến sức khỏe đặc biệt với trẻ em, ngƣời già gây thiệt hại kinh tế Moraxella catarrhalis nguyên gây phần lớn trƣờng hợp mắc bệnh nhiễm khuẩn hô hấp, đặc biệt đƣợc coi nhƣ tác nhân gây bệnh viêm tai phổ biến thứ ba sau Streptococcus pneumoniae Haemophilus influenzae Trong M catarrhalis kháng lại hầu hết chất kháng sinh thuộc nhóm beta-lactam, nhạy cảm với cephalosporin hệ 2, ciprofloxacin thuộc họ quinolon Thực trạng kháng kháng sinh M catarrhalis nói riêng, vi khuẩn gây bệnh truyền nhiễm nói chung đem đến gánh nặng kinh tế, xã hội việc thay kháng sinh hệ cũ kháng sinh hệ đắt tiền Với phát triển ngành công nghệ sinh học đại đem lại triển vọng lớn cho Y học tìm kiếm thêm hợp chất tự nhiên hỗ trợ cho việc phòng điều trị bệnh Các hợp chất góp phần giảm tác dụng phụ không mong muốn hợp chất tổng hợp, giảm gánh nặng mặt kinh tế cho ngƣời bệnh xã hội Từ ngàn xƣa, ông cha ta lƣu truyền nhiều thuốc dân gian từ cây, cỏ chữa bệnh đƣờng hô hấp nhiều bệnh khác Hiện táo mèo sản phẩm chế biến từ táo mèo đặc biệt giấm táo mèo đƣợc lan truyền rộng rãi cộng đồng nhƣ thuốc chống béo phì, tăng cƣờng miễn dịch, kháng khuẩn, giảm chứng suy hô hấp Trên giới táo mèo phân bố Trung Quốc, Ấn Độ, Myanma, Việt Nam tập trung tỉnh Yên Bái, Sơn La, Lào Cai, Lai Châu Lâm Đồng Năm 2010 có nghiên cứu sơ với kết khả quan tác dụng kháng khuẩn, có M catarrhalis gây bệnh hô hấp dịch lên men táo mèo mở hƣớng nghiên cứu nhƣ định hƣớng ứng dụng dịch lên men táo mèo việc hỗ trợ nâng cao thể trạng cho ngƣời Với mục tiêu góp phần chứng minh làm sáng tỏ vai trò chủ đạo tác nhân có dịch lên men táo mèo theo kinh nghiệm dân gian, đặc biệt công dụng kháng vi khuẩn gây viêm đƣờng hô hấp kháng kháng sinh thông dụng, tiến hành thực đề tài: “ Nghiên cứu tác dụng chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp người dịch lên men táo mèo (Docynia indica)” Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP Ở NGƢỜI Nhiễm khuẩn hô hấp tình trạng phận thuộc máy hô hấp bị viêm nhiễm vi khuẩn virut gây Về phƣơng diện lâm sàng, nhiễm khuẩn hô hấp gồm hai loại: nhiễm khuẩn hô hấp nhiễm khuẩn hô hấp dƣới Nhiễm khuẩn hô hấp bệnh lý riêng biệt mà gồm nhiều bệnh lý (các bệnh tai mũi họng) nhƣ: + Viêm mũi + Viêm họng + Viêm amidan + Viêm tai + Viêm xoang Bệnh nhiễm khuẩn hô hấp dƣới đƣợc coi bệnh cảnh nặng nhƣng thực tế bệnh chiếm tỷ lệ thấp không dễ mắc Trong nhiễm khuẩn hô hấp chứng bệnh thƣờng gặp hàng năm, mắc tái diễn theo mùa, tái mắc nhiều lần năm, dễ gây biến chứng nặng nề chiếm tỷ lệ lớn so với bệnh hô hấp khác Theo thống kê tổ chức y tế Hoa Kỳ, trung bình ngƣời trƣởng thành bị viêm đƣờng hô hấp khoảng – lần năm số cao nhiều trẻ em, trẻ nhiễm đến 10 lần Mỗi năm Hoa Kỳ, nhiễm khuẩn hô hấp gây giảm khả làm việc 170 triệu ngày, 23 triệu ngày trẻ phải nghỉ học, 18 triệu ngày phải nghỉ làm Điều cho thấy dù loại bệnh đƣợc cho tự khỏi nhƣng chúng gây thiệt hại đáng kể không sức khỏe mà kinh tế xã hội Đối tƣợng mắc bệnh chủ yếu trẻ em Ƣớc tính toàn cầu năm có khoảng tỷ lƣợt trẻ bị bệnh nhiễm khuẩn hô hấp cấp, chiếm 15 -20% số tử vong độ tuổi dƣới Tại khu vực Đông Nam Á, có Việt Nam bệnh nguyên nhân cao (25%) gây tử vong trẻ, tiêu chảy sơ sinh kết hợp với bệnh khác, lại nguyên nhân khác [22] Ở trẻ em bệnh nhiễm khuẩn hô hấp gây biến chứng nặng viêm tai (29 – 50%), viêm xoang (5 – 10%) [38] Vi sinh vật gây bệnh thƣờng gặp virut (chiếm 80%) vi khuẩn (20%), cụ thể nhƣ sau: - Tác nhân virut gây bệnh gồm có: +) Rhinovirus picornavirut, phân lập đƣợc 110 serotyp- thƣờng gặp (khoảng 50%) +) Coronavirus: 20-25% +) Orthomyxovirus: gây bệnh cúm +) Paramyxovirus : virut hợp bào, quai bị +) Adenovirus, thƣờng typ 1, 2, 3, 5, - Tác nhân vi khuẩn thƣờng gặp Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae Moraxella catarrhalis [24, 33,37] Ngoài vi khuẩn có vi khuẩn không điển hình nhƣ Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia pneumoniae Legionella pneumophila Bệnh nhiễm khuẩn hô hấp gia tăng gặp yếu tố thuận lợi nhƣ: + Theo lứa tuổi: chủ yếu trẻ em ngƣời già + Sức đề kháng yếu ngƣời: sinh non, suy dinh dƣỡng, + Điều kiện khí hậu, thời tiết: Việt Nam có khí hậu nóng ẩm tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật gây bệnh đƣờng hô hấp nói riêng bệnh nhiễm khuẩn nói chung phát triển Việt Nam đƣợc coi quốc gia có tỷ lệ bệnh nhiễm khuẩn cao nên việc điều trị phòng bệnh trở nên cần thiết + Do ô nhiễm môi trƣờng sống, đời sống kinh tế xã hội 1.2 Moraxella catarrhalis VÀ BỆNH VIÊM ĐƢỜNG HÔ HẤP TRÊN 1.2.1 Đặc điểm hình thái nuôi cấy Moraxella catarrhalis lần đƣợc mô tả vào năm 1896, gọi Micrococcus catarrhalis sau đổi thành Neisseria catarrhalis đến năm 1984 đổi Moraxella (Branhamella) catarrhalis thuộc chi Moraxella, họ Moraxellaceae [27] Đây vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, dạng song cầu khuẩn, sống cộng sinh đƣờng hô hấp trên, số có pili lông nhung giúp cho chúng bám vào ống hô hấp [38] Không sống cộng sinh bình thƣờng hệ hô hấp mà M catarrhalis tác nhân gây bệnh quan trọng đƣờng hô hấp ngƣời [36] Quá trình phân lập M catarrhalis đƣợc tiến hành theo tiêu chuẩn WHO: Bệnh phẩm lấy từ vùng họng bệnh nhân, tiến hành nhuộm Gram cuối đem nuôi cấy môi trƣờng thạch máu 5% thạch sôcola với điều kiện 370C + CO2 5% [38] 1.2.2 Vai trò Moraxella catarrhalis bệnh nhiễm khuẩn hô hấp Nhiều nghiên cứu giới nƣớc M catarrhalis tác nhân gây bệnh quan trọng đƣờng hô hấp  Các nghiên cứu giới: Trên giới có nhiều nghiên cứu M catarrhalis nguyên nhân phổ biến gây bệnh viêm đƣờng hô hấp M catarrhalis vi khuẩn cộng sinh phổ biến vòm họng trẻ em [41], nghiên cứu 120 trẻ sơ sinh cho thấy 66% trẻ tuổi mang vi khuẩn, tăng lên đến 77,5% trẻ hai năm tuổi, điều cho thấy trẻ em có nguy cao bị bệnh đƣờng hô hấp, đặc biệt hô hấp [20] Những nghiên cứu khác cho thấy 48,9% gặp trẻ độ tuổi từ 3-12 [32] 54% trẻ dƣới tuổi [22] Tuy nhiên ngƣời lớn tỷ lệ thấp với 1% 561 ca phụ nữ tuổi lao động nhập viện [32], 5,8% ngƣời lớn khỏe mạnh tăng đến 26,5% ngƣời có độ tuổi 60 [48] tăng cao vào mùa đông Timothy [47] đƣa biểu lâm sàng dịch tễ học M catarrhalis, đặc biệt liên quan bệnh viêm tai trẻ em bệnh COPD ngƣời lớn, hai bệnh truyền nhiễm phổ biến gây M catarrhalis Viêm tai bệnh hay gặp thời thơ ấu ngƣời lý phổ biến mà trẻ em đƣợc kê đơn kháng sinh, trung bình khoảng 80% trẻ em năm đầu đời mắc bệnh Trong M catarrhalis chiếm 15-20% nguyên nhân gây đợt bệnh viêm tai cấp tính, nguy hiểm với trẻ em không phát điều trị kịp thời M catarrhalis nguyên nhân gây loạt bệnh hô hấp khác nhƣ: viêm xoang cấp, viêm vòm họng, viêm phế quản mãn tính Catlin [26] chứng cho thấy M catarrhalis gây bệnh nhiễm trùng máu, viêm màng não, viêm nội tâm mạc Đặc biệt báo cáo tổng hợp lại bệnh viêm phổi, viêm tai AIDS M catarrhalis nguyên nhân thƣờng gặp gây nhiễm trùng máu [44] Nhiễm trùng bệnh viện vấn đề đƣợc quan tâm M catarrhalis đƣợc xác định vi khuẩn bị lây truyền, khu phòng tải bệnh nhân tháng mùa đông  Các nghiên cứu Việt Nam Việt Nam với đặc điểm khí hậu nóng ẩm, năm gần lại chịu tác động mạnh biến đổi khí hậu tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật gây bệnh phát triển Trên giới, Việt Nam quốc gia có tỷ lệ bệnh nhiễm khuẩn cao nhất, nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp chiếm tỷ lệ cao Ngay từ năm 1984 chƣơng trình chống nhiễm khuẩn hô hấp cấp thức bắt đầu Việt Nam, có nhiều nghiên cứu bệnh hô hấp xác nhận M catarrhalis tác nhân gây bệnh chủ yếu Tại bệnh viện Bạch Mai vào năm 1987 [17] xác nhận tỷ lệ M catarrhalis chiếm 3,5%, đến năm 1998 Lê Bá Nhàn cộng nghiên cứu bệnh nhiễm khuẩn đƣờng hô hấp dƣới trẻ em phƣờng Kim Long, thành phố Huế phân lập đƣợc M catarrhalis với tỷ lệ 19,2% Nghiên cứu Đào Đình Đức cộng [8] bệnh viện Bạch Mai năm (1990-1994) cho thấy chủng vi khuẩn gây nhiễm bệnh hô hấp với tỷ lệ trung bình 2,2% Tại trạm y tế phƣờng Huế thành phố Hà Nội, năm 1991 phân lập Chủng nghiên cứu đƣợc nuôi cấy môi trƣờng LB với nguồn cacbon khác là: tinh bột tan, glucoza, lactoza, bột ngô nhằm xác định nguồn cacbon chủng TM5.2 có khả sử dụng mạnh thích hợp qua mật độ tế bào hoạt tính kháng khuẩn Kết cho thấy nguồn cacbon thích hợp tinh bột Bảng 3.5: Ảnh hưởng nguồn cac on đến khả sinh t ưởng hoạt tính kháng khuẩn TM5.2 HTKK Nguồn (D- pH trước pH sau OD Tinh bột tan 1,873 20 Glucoza 7,5 1,274 14 Lactoza 7,2 0,87 10 Bột ngô 7 0,95 cacbon d,mm) 20 15 OD 10 pH HTKK Tinh bột tan Glucoza Bột ngô Lactoza Hình 3.3: Ảnh hưởng nguồn cacbon lên khả sinh t ưởng hoạt tính kháng khuẩn TM5.2 3.3.3 Nguồn nitơ thích hợp 34 Tiếp tục tiến hành khảo sát sinh trƣởng hoạt tính kháng khuẩn chủng TM5.2 nguồn nitơ khác là: NaNO2, NaNO3, (NH4)2SO4, peptone, thu đƣợc kết nhƣ sau: Bảng 3.6: Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh t ưởng HTKK HTKK (D- Nguồn nitơ pH trước pH sau OD Pepton 7,1 1,170 18 Cao nấm men 7,3 1,354 19 (NH4)2SO4 7 0,59 10 NaNO3 6,8 0,65 11 NaNO2 6,9 0,597 10 20 18 16 14 12 10 d,mm) OD pH HTKK Hình 3.4: Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh t ưởng hoạt tính kháng khuẩn TM5.2 Kết luận chủng TM5.2 có khả sinh trƣởng tốt nguồn nitơ hữu cơ, đặc biệt sinh trƣởng mạnh có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nguồn nitơ từ cao nấm men 35 3.3.4 Lựa chọn pH nuôi cấy thích hợp Vi khuẩn TM5.2 đƣợc nuôi cấy lắc 220 vòng/phút, 28- 300C ngày với dải pH từ đến Sau thu dịch nuôi cấy đem xác định OD, pH sau nuôi hoạt tính kháng khuẩn Kết bảng 3.7: Bảng 3.7: Ảnh hưởng pH an đầu đến sinh t ưởng, hoạt tính kháng khuẩn TM5.2 HTKK (D- pH ban đầu pH sau nuôi cấy OD 6,4 0,804 11 6,8 1,05 16 7,3 1,815 21 7,5 1,19 20 0,935 15 d,mm) 25 20 OD 15 pH sau 10 HTKK 5 Hình 3.5: Ảnh hưởng pH an đầu đến sinh t ưởng hoạt tính kháng khuẩn TM5.2 36 Từ kết thấy chủng TM5.2 có khả sinh trƣởng tốt, hoạt tính kháng khuẩn mạnh pH trung tính kiềm Trong pH thích hợp cho chủng vi khuẩn sinh trƣởng kháng khuẩn M catarrhalis 3.3.5 Lựa chọn nhiệt độ thích hợp Vi khuẩn đƣợc nuôi cấy lắc 220 vòng/phút, mức nhiệt độ khác nhau: 200, 300, 400, 500, 600C Sau ngày thu dịch nuôi cấy xác định OD, hoạt tính kháng khuẩn Kết thu đƣợc bảng 3.8 cho thấy chủng TM5.2 sinh trƣởng thích hợp nhiệt độ 20- 400C, sinh trƣởng hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhiệt độ 300C Bảng 3.8: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh t ưởng hoạt tính kháng khuẩn TM5.2 Nhiệt độ (0C) OD HTKK pH sau nuôi cấy 20 0,785 15 7,5 30 1,804 21 40 0,612 15 6,8 50 0,025 + 60 0 25 20 OD 15 pH 10 HTKK 20 30 40 50 37 60 Hình 3.6: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh t ưởng hoạt tính kháng khuẩn TM5.2 3.3.6 Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp Vi khuẩn đƣợc nuôi cấy lắc 220 vòng/phút với điều kiện nuôi cấy tối ƣu lựa chọn nhƣ trên, tiến hành nuôi cấy 120h Cứ 12h lấy mẫu lần đem xác định pH sau nuôi cấy, OD, hoạt tính kháng khuẩn Kết 72h thời gian nuôi cấy thích hợp để thu nhận dịch có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất, thời điểm 60h vi khuẩn sinh trƣởng mạnh có hoạt tính kháng khuẩn mạnh Khả sinh trƣởng sinh chất kháng M catarrhalis giảm sau 72h nuôi cấy Bảng 3.9: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh t ưởng hoạt tính kháng khuẩn TM5.2 Thời gian Hoạt tính kháng khuẩn pH cuối OD 7,0 0,32 12 7,1 0,55 10 24 7,2 0,87 14 36 7,24 0,912 15 48 7,41 1,14 20 60 7,43 1,422 20 72 7,45 1,98 21 84 7,4 1,56 18 96 7,2 1,25 17 108 7,1 0,82 15 120 7,1 0,75 10 (giờ) 38 (D – d, mm) 25 20 15 OD pH 10 HTKK 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 Hình 3.7: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh t ưởng hoạt tính kháng khuẩn TM5.2 3.3.7 Khả sinh enzym ngoại bào TM5.2 Tiến hành nuôi cấy lắc chủng TM5.2 220 vòng/phút, 300C, sau ngày thu dịch đem xác định hoạt tính enzym ngoại bào: amylaza, proteaza, kitinaza, xenlulaza Kết thu đƣợc cho thấy chủng TM5.2 có khả sinh enzym ngoại bào Bảng 3.10: Khả sinh enzym ngoại bào Enzym Hoạt tính enzym (D-d, mm) Amylaza 18 Proteaza 20 Kitinaza 20 Xenlulaza 22 3.4 TÁCH CHIẾT CHẤT KHÁNG KHUẨN TỪ DỊCH CHIẾT TÁO MÈO VÀ DỊCH LÊN MEN VI KHUẨN 39 3.4.1 Khảo sát hệ dung môi rửa giải pha rắn hấp phụ Tiến hành khảo sát pha rắn hấp phụ lần lƣợt với chất florisil, silicagel hệ dung môi rửa giải nhằm tiến hành sắc ký cột đƣợc thử nghiệm:  n-Hexan, Cloroform, Ethylaxetat, n-Butanol  n-Hexan, Cloroform, Aceton, methanol  n-Hexan, n-Butanol, Aceton, Nƣớc Kết nghiên cứu sơ cho thấy chất hấp phụ silicagel hệ dung môi rửa giải n-Hexan, Cloroform, Aceton, methanol tách phân đoạn tƣơng đối tốt phù hợp Do ta khảo sát trình tách phân đoạn dịch chiết táo mèo dịch lên men cột sắc ký nhồi to 3.4.2 Tách chiết phân đoạn chất kháng khuẩn dịch lên men vi khuẩn Dịch lên men vi khuẩn, đƣợc bổ sung etanol 96% tạo thành hỗn hợp dịch (tỷ lệ dịch: etanol 1:1) Lắc 15 phút, ly tâm thu đƣợc dịch Dịch đƣợc đông khô để thu dạng cao Cao đƣợc đƣa lên cột sắc ký tách phân đoạn Trong trình phân đoạn có sử dụng sắc ký mỏng để theo dõi với hệ dung môi triển khai phù hợp Ta thu đƣợc 10 phân đoạn đem cô quay chân không riêng phân đoạn 400C để đuổi dung môi thử hoạt tính kháng vi khuẩn M catarrhalis Từ 10 phân đoạn kiểm tra cho thấy có phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn rõ ràng ký hiệu là: PĐ1 PĐ2 thể bảng sau: Bảng 3.11: Kết thử HTKK ph n đoạn tách từ dịch chiết lên men Mẫu thử HTKK ( D – d, mm) PĐ1 19,9 PĐ2 14,5 40 3.4.3 Tách chiết phân đoạn chất kháng khuẩn từ dịch chiết táo mèo 3.4.3.1 Hoạt tính kháng khuẩn cao dịch chiết táo mèo Dịch táo mèo đƣợc cô quay chân không thành cao sau lấy cao thử hoạt tính kháng khuẩn M catarrhalis mức nồng độ (mg/ml) khác nhau: 0,1; 1; 10; 100 mg/ml Kết thu nhận đƣợc nhƣ sau: Bảng 3.12: Kết thử hoạt tính kháng khuẩn M catarrhalis cao dịch chiết táo mèo nồng độ khác Nồng độ mẫu cao(mg/ml) HTKK (D-d, mm) 0,1 - - 10 - 50 12 100 22 Từ bảng kết thấy mẫu cao có tính kháng khuẩn cao nồng độ 100 mg/ml 3.4.3.2 Tách chiết ph n đoạn chất kháng khuẩn từ dịch chiết táo mèo Sau khẳng định cao dịch chiết táo mèo có hoạt tính kháng khuẩn, tiến hành đƣa cao lên cột sắc ký tách phân đoạn với chất hấp phụ hệ dung môi rửa giải nhƣ lựa chọn Các phân đoạn thu đƣợc ống nghiệm đem tiến hành kiểm tra sắc ký mỏng để thu gom phân đoạn có kết triển khai tƣơng tự hệ dung môi có kết giống Thu đƣợc 15 phân đoạn, cất chân không riêng phân đoạn 400C để đuổi dung môi phần lại đƣợc lấy đem thử hoạt tính kháng khuẩn M catarrhalis Cuối thu đƣợc phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn M catarrhalis ký hiệu : PĐ1, PĐ2, PĐ3 41 Bảng 3.13: Kết thử hoạt tính kháng khuẩn M catarrhalis ph n đoạn từ dịch chiết táo mèo Mẫu thử HTKS ( D – d, mm) PĐ1 27,5 PĐ2 26,1 PĐ3 18,0 3.4.4 Sắc ký mỏng phân đoạn kháng khuẩn dịch lên men chủng TM5.2 dịch chiết táo mèo Sau tiến hành triển khai sắc ký mỏng phân đoạn có tính kháng khuẩn thu đƣợc từ dịch lên men chủng TM5.2 hệ dung môi triển khai khác Nhận thấy:   Hệ triển khai tƣơng đối tốt phân đoạn gồm có: - Toluen- Etyl acetat- Aceton- Axit formic = 15: 2: 2: - TEAF - Tuluen: Ethylacetae: Acetone: Acid Focmic = 5:3:1:1 - Toluen: Ethylaxetat: axit focmic = 5:4:1 Dịch lên men chủng TM5.2: Phân đoạn tách đƣợc vết , phân đoạn tách đƣợc vết  Dịch chiết táo mèo: Phân đoạn tách đƣợc vết, phân đoạn có vết, phân đoạn có vết Từ kết thu đƣợc bƣớc đầu kết luận sơ phân đoạn kháng khuẩn thu đƣợc chứa nhiều chất khác 3.5 NGHIÊN CỨU SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO DỊCH CHIẾT TÁO MÈO VÀ CÁC PHÂN ĐOẠN 3.5.1 Sơ thành phần hóa học cao dịch chiết táo mèo phân đoạn Tiến hành thử định tính nhóm chất phản ứng đặc trƣng nhƣ trình bày chi tiết phần phƣơng pháp, bƣớc đầu kết bảng sau: 42 Bảng 3.14: Kết thử định tính nhóm hợp chất dịch chiết táo mèo ph n đoạn Nhóm chất Kết Thuốc thử Cao cồn PĐ1 PĐ2 PĐ3 Shinoda ++ ++ + + Diazo - + - - NaOH 10% ++ +++ ++ ++ H2SO4 ++ ++ + + - + - - Acetat chì ++ ++ + + Dragendorf ++ +++ + + +++ + + ++ Flavonoit Galatin/ Tannin Ankaloit Glycozit NaCl KellerKillian Ghi chú: + : Phản ứng dƣơng tính - : Phản ứng âm tính Kết cho thấy dịch chiết táo mèo nhƣ phân đoạn có nhóm chất: flavonoit, tannin, ankaloit, glycozit với hàm lƣợng khác Với thuốc thử (phƣơng pháp định tính) khác kết thu đƣợc khác nhau, ví dụ việc định tính nhóm flavonoit, dùng thuốc thử diazo NaOH 10% kết khác độ nhạy thuốc thử với nhóm chất khác 43 Kết định tính cho thấy phân đoạn 1(PĐ1) giàu nhóm flavonnoit ankaloit phân đoạn hai ba (PĐ2, PĐ3); phân đoạn lại giàu nhóm glycozit phân đoạn Kết thử hoạt tính kháng M catarrhalis (bảng 3.13) lại cho thấy HTKK phân đoạn cao Nhƣ hoạt tính kháng khuẩn chủng M catarrhalis liên quan đến hàm lƣợng có mặt số chất thuộc nhóm flavonoit ankaloit 44 KẾT LUẬN Sau tiến hành nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn Moraxella catarrhalis kháng kháng sinh gây viêm đƣờng hô hấp dịch lên men táo mèo, thu đƣợc số kết sau: Dịch lên men táo mèo có khả kháng M catarrhalis kháng kháng sinh pH nồng độ chất dịch ảnh hƣởng đến hoạt tính kháng M catarrhalis Phân lập, tuyển chọn đƣợc chủng TM5.2 từ dịch lên men táo mèo có hoạt tính kháng khuẩn M catarrhalis mạnh ổn định Chủng TM5.2 thuộc loài Bacillus subtilis, chi Bacillus, có khả sinh trƣởng tốt môi trƣờng LB, nguồn cacbon tinh bột, nguồn nitơ cao nấm men, pH 7, nhiệt độ 300C, thời gian lên men thích hợp 48- 72 Tách chiết đƣợc phân đoạn có hoạt tính kháng M catarrhalis từ dịch lên men chủng TM5.2 Từ dịch chiết táo mèo tách chiết đƣợc phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn M catarrhalis Các phân đoạn có hoạt tính kháng M catarrhalis từ dịch lên men chủng TM5.2 dịch chiết táo mèo chứa nhiều chất khác Quả táo mèo, phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết táo mèo có đầy đủ nhóm chất nhƣ flavonoit, tannin, ankaloit, glycozit Hoạt tính kháng khuẩn chủng M catarrhalis phân đoạn kháng khuẩn thu đƣợc từ dịch chiết táo mèo liên quan đến hàm lƣợng có mặt số chất thuộc nhóm nhóm flavonoit ankaloit KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn khác dịch lên men táo mèo có khả kháng M catarrhalis kháng kháng sinh Nghiên cứu chất hóa học chất kháng M catarrhalis kháng kháng sinh thu đƣợc từ dịch lên men chủng TM5.2 từ dịch chiết táo mèo 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO I TÀI LIỆU VIỆT NAM Nguyễn Văn Bản (1996), Phân tích sàng lọc hóa thực vật, Tập II, tr 132-169 Nguyễn Đình Bảng (1992), “Vấn đề kháng sinh Tai Mũi Họng” , Chuyên đề Tai Mũi Họng, tr 20-24 Nguyễn Thị Ngọc Bích (2007), Nghiên cứu giá trị phương pháp cấy đờm tìm vi khuẩn chẩn đoán nguyên nhân nhiễm khuẩn hô hấp, Luận văn tốt nghiệp bác sỹ chuyên khoa II, Học viên Quân y Phạm Văn Ca (2005), “Tần suất bắt gặp Moraxella catarrhalis vi khuẩn gây bệnh mức độ kháng thuốc Việt Nam”, Tạp chí Y học dự phòng, 15(1), tr 55 – 59 Đinh Thị Kim Chung (2007), “Ảnh hƣởng số yếu tố tới trình lên men vang tóa mèo (Docynia indica)”, Tạp chí KH&CN, 45(2), tr 87 – 92 Danh lục loài Thực vật (2006), Tập II Bùi Xuân Đồng (2000), Vi nấm dùng công nghệ sinh học, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Đào Đình Đức, Lê Đăng Hà, Phạm Văn Ca (1996), Tình hình nhiễm khuẩn kháng kháng sinh số vi khuẩn gây bệnh bệnh viện Bạch Mai năm (1990-1994), Một số công trình nghiên cứu độ nhạy cảm vi khuẩn với thuốc khánh sinh (1994-1995), tr 30-32 Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sỹ sinh học 10 Nguyễn Minh Hải, Nguyễn Tiền (2007), “ Nghiên cứu nguyên vi khuẩn đờm tính nhạy cảm kháng sinh chúng đợt bùng phát COPD”, Tạp chí y học lâm sàng, 108 11 Trần Thị Thu Hằng (2009), Thuốc sử dụng hóa trị liệu, Dược lực học, Nxb Phƣơng Đông, tr 681 – 685 12 Phạm Thị Hóa, Lê Kim Phụng, Lƣơng Lệ Nhi (2010), Hợp chất thiên nhiên thuốc y học cổ truyền, Dược học cổ truyền, Bộ môn dƣợc học cổ truyền, tr 11 – 24 13 Nguyễn Hồng Lâm, (2009), Nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn Moraxella catarrhalis khả măng gây bệnh chúng bệnh viện Tai Mũi Họng Trung Ương từ tháng năm 2007 đến tháng năm 2008, Khóa luận tốt nghiệp, trƣờng Đại hoc Khoa Học Tự nhiên 14 Phạm Thùy Linh (2010), Nghiên cứu công nghệ sản xuất sử dụng chất diệt khuẩn sinh học (nicin enterocin) dùng bảo quản nông sản thực phẩm, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam 15 Nguyễn Thị Thanh Loan cộng (2011), “ Tác dụng chống béo phì giảm trọng lƣợng dịch chiết táo mèo Docynia indica (Wall.) Decne mô hình chuột béo phì thực nghiệm”, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, 27, tr 125 – 133 16 Đỗ Tất Lợi (2001), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học 17 Vũ Văn Ngũ (1987), Các tác nhân gây viêm cấp tính đường hô hấp trẻ em tuổi, Nxb Y học, tr 3-7 18 Nguyễn Phi Kim Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nxb ĐH Quốc gia TP Hồ Chí Minh 19 Đỗ Quyết (2010), “Nguyên nhân vi khuẩn giai đoạn đầu sau đợt bùng phát bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính”, Tạp chí y – dược học quân sự, 20 Vũ Thị Hạnh Tâm (2011), Nghiên cứu tác dụng hạ lipid đường huyết dịch chiết táo mèo (Docynia indica (Wall.) Dene) mô hình chuột thực nghiệm, Luận văn tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội 21 Hoàng Thị Minh Tân (2009), Nghiên cứu tách chiết số hợp chất tự nhiên từ táo mèo có tác dụng chống rối loạn trao đổi gluxit, lipid, Luận văn thạc sỹ sinh học 22 II 23 WHO (2008), Gánh nặng bệnh tật toàn cầu: cập nhật 2004 TÀI LIỆU TIẾNG ANH Akinjogunla, O.J and Eghafona, N.O (2011), “Prevalence, Haemolytic activities and flouroquinolones susceptibility profiles of Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae associated with acut otitis media”, Nature and Science, 9(6), pp 85 – 92 24 Austria R (1981), “Pneumococcus: The first one hundred years”, Rev Infect, 3, pp – 183 25 Borris, R.P (1996), “ Natural products research: perspective from a major pharmaceutical company”, J Ethnopharmacol, 51, pp 29 – 38 26 Catlin BW (1990), “Branhamella catarrhalis: an organism gaining respect as a pathogen”, Clinical Microbiology Reviews, 3, pp 293 – 320 ... chống lại vi khuẩn kháng kháng sinh (Moraxella catarrhalis) gây nhiễm đường hô hấp người dịch lên men táo mèo (Docynia indica) Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP Ở NGƢỜI Nhiễm. .. Nhiễm khuẩn hô hấp tình trạng phận thuộc máy hô hấp bị vi m nhiễm vi khuẩn virut gây Về phƣơng diện lâm sàng, nhiễm khuẩn hô hấp gồm hai loại: nhiễm khuẩn hô hấp nhiễm khuẩn hô hấp dƣới Nhiễm khuẩn. .. tác nhân có dịch lên men táo mèo theo kinh nghiệm dân gian, đặc biệt công dụng kháng vi khuẩn gây vi m đƣờng hô hấp kháng kháng sinh thông dụng, tiến hành thực đề tài: “ Nghiên cứu tác dụng chống