Nghiên cứu tuyển chọn và sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng trichoderma phòng trừ tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao

Nghiên cứu tuyển chọn và sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng trichoderma phòng trừ tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao Nghiên cứu tuyển chọn và sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng trichoderma phòng trừ tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao Nghiên cứu tuyển chọn và sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng trichoderma phòng trừ tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao Nghiên cứu tuyển chọn và sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng trichoderma phòng trừ tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao Nghiên cứu tuyển chọn và sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng trichoderma phòng trừ tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao Nghiên cứu tuyển chọn và sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng trichoderma phòng trừ tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao Nghiên cứu tuyển chọn và sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng trichoderma phòng trừ tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao Nghiên cứu tuyển chọn và sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng trichoderma phòng trừ tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA MÔI TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU TU N HỌN V SẢN UẤT H PHẨM

Đ N NG NẤM ĐỐI KH NG TRI HO RMA PH NG TRỪ

T NH N G NH THỐI Đ N QUẢ A AO

Chuyên ngành: Khoa học Môi trường

Mã số: 60440301

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS PHẠM NGỌC DUNG PGS.TS ĐỒNG KIM LOAN

Hà Nội - 2013

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌ TỰ NHI N

KHOA MÔI TRƯỜNG

Trần Thị Thúy

NGHIÊN CỨU TU N HỌN V SẢN UẤT H PHẨM

Đ N NG NẤM ĐỐI KH NG TRI HO RMA PH NG TRỪ

T NH N G NH THỐI Đ N QUẢ A AO

Chuyên ngành: Khoa học Môi trường

Mã số: 60440301

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS PHẠM NGỌC DUNG PGS.TS ĐỒNG KIM LOAN

Hà Nội - 2013

và các giải pháp khoa học công nghệ trong phòng trừ bệnh”, mã số G/63 đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em thực hiện đề tài, giúp em hoàn thành luận văn này

ĐTĐL.2011-Em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong Khoa Môi trường trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình truyền đạt kiến thức trong suốt 2 năm học vừa qua Với vốn kiến thức mà em được tiếp thu trong quá trình học tập sẽ là hành trang quý báu để em có thể hoàn thành tốt công việc sau này

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn động viên, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong suốt thời gian học tập và làm luận văn

EM XIN TRÂN TRỌNG ẢM N

Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2013 Học viên

TRẦN THỊ THÚY

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

HƯ NG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Nấm đối kháng Trichoderma spp 3

1.1.1 Đặc điểm sinh học và sinh thái của nấm Trichoderma spp 3

1.1.2 Cơ chế tác động của nấm Trichoderma spp lên các tác nhân gây bệnh cây trồng 4

1.1.3 Khả năng phòng trừ của nấm Trichoderma spp đối với các loài nấm gây bệnh cây trồng 7

1.1.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất, sử dụng chế phẩm nấm Trichoderma phòng trừ bệnh hại trên cây trồng 8

1.1.5 Một số loại vi sinh vật đối kháng và chế phẩm sinh học sử dụng vi sinh vật đối kháng để tiêu diệt nấm bệnh được nghiên cứu và sử dụng 12

1.2 Nghiên cứu về tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao 14

1.2.1 Tình hình thiệt hại do bệnh thối đen quả ca cao gây nên 14

1.2.2 Đặc điểm sinh học và sinh thái của nấm Phytophthora palmivora 15

1.2.3 Chu kỳ phát triển bệnh 17

1.2.4 Sự vận chuyển của mầm bệnh 17

1.2.5 Nghiên cứu về phòng trừ sinh học bệnh thối đen quả ca cao 18

HƯ NG 2: ĐỐI TƯỢNG V PHƯ NG PH P NGHI N ỨU 22

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 22

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu 22

2.2.2 Phương pháp thực nghiệm trong phòng thí nghiệm 23

2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 29

HƯ NG 3 K T QUẢ NGHI N ỨU V THẢO LUẬN 30

3.1 Kết quả phân lập nấm Phytophthora sp gây thối đen quả ca cao 30

3.2 Phân lập nấm Trichoderma sp ở các vùng trồng ca cao của tỉnh Bình

Phước, Đăk Lăk, Đăk Nông 31

3.3 Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma sp đối với nấm Phytophthora gây thối đen quả ca cao 33

3.3.1 Khả năng ký sinh của nấm Trichoderma sp 33

3.3.2 Khả năng sinh kháng sinh bay hơi của nấm Trichoderma sp 34

3.4 Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh học và sinh thái của nấm Trichoderma sp 36

3.4.1 Đặc điểm hình thái của nấm Trichoderma sp trên môi trường nhân tạo 36

3.4.2 Đặc điểm sinh thái của nấm Trichoderma sp 37

3.5 Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm Trichoderma sp đối kháng với nấm Phytophthora palmivora gây thối đen quả ca cao 43

3.5.1 Nghiên cứu thành phần cơ chất của môi trường nhân sinh khối nấm Trichoderma sp 44

3.5.2 Nghiên cứu lượng nước trong môi trường nhân sinh khối nấm Trichoderma sp 45

3.5.3 Nghiên cứu xác định các thông số kỹ thuật tối ưu trong lên men nhân sinh khối của nấm Trichoderma (ánh sáng, chế độ cấp khí) 50

3.6 Đánh giá sức sống của nấm Trichoderma sp sau bảo quản sản phẩm nhân sinh khối 54

3.7 Sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm Trichoderma sp 56

K T LUẬN V KI N NGHỊ 58

1 Kết luận 58

2 Kiến nghị 58

T I LI U THAM KHẢO 59

DANH MỤC CHỮ VI T TẮT ADCI/VOCA Tổ chức hợp tác phát triển nông nghiệp và trợ giúp quốc tế

a, b, c, d Phân lớp sự sai khác giữa các công thức

CMA Môi trường gồm bột ngô 60g , gar 20g

Czapek Môi trường tổng hợp bao gồm Saccharose (30g), NaNO3 (3g),

K2HPO4 (1g), MgSO4 (0,5g), KCl (0,5g), FeSO4 (0,1g), 1000ml nước

IRRISTAT Phần mềm thống kê trong nông nghiệp

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Lượng phân bón cho ca cao mới trồng trong 2 năm đầu tiên 19

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của vật liệu bẫy đến khả năng bẫy nấm Phytophthora gây

thối đen quả ca cao 30

Bảng 3.2 Nguồn Trichoderma thu thập được từ 3 tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk

và Đăk Nông 31

Bảng 3.3 Nguồn Trichoderma có triển vọng đã thu thập được tại 3 tỉnh Bình

Phước, Đăk Lăk và Đăk Nông 32

Bảng 3.4 Khả năng ký sinh của các dòng nấm đối kháng Trichoderma sp đối với

nấm Phytophthora palmivora gây thối đen quả ca cao 33 Bảng 3.5 Khả năng ức chế nấm Phytophthora palmivora bằng chất kháng sinh

bay hơi của các dòng nấm Trichoderma sp 35

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới sự phát triển của nấm

vọng 41

Bảng 3.10 Định tính hoạt độ enzyme của nấm đối kháng Trichoderma sp có triển

vọng 42 Bảng 3.11 Ảnh hưởng của môi trường nhân nuôi đến khả năng nhân sinh khối của

nấm Trichoderma sp 44

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng nhân sinh khối của nấm

Trichoderma sp trên môi trường gạo 46

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng nhân sinh khối của nấm

Trichoderma sp trên môi trường bột ngô 48

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng nhân sinh khối của nấm

Trichoderma trên môi trường thóc 50

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của chế độ đậy nút kín và đảo trộn đến khả năng nhân sinh

khối của nấm Trichoderma 51

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của chế độ buộc nút hở và đảo trộn cấp khí đến khả năng

nhân sinh khối của nấm Trichoderma sp 52

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của ánh sáng đến khả năng nhân sinh khối của nấm

Trichoderma sp 54

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của phương pháp bảo quản sản phẩm nhân sinh khối đến

sức sống của nấm Trichoderma 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái nấm Trichoderma sp 4

Hình 1.2 Sơ đồ chu trình sống của nấm Phytophthoro spp 16

Hình 1.3 Hình thái học của Phytophthora palmivora Hàng dưới là túi noãn hình cầu với túi đực amphigynous và một bọc bào tử hình trứng với một cuống ngắn 16

Hình 3.1 Đồ thị thể hiện t lệ phân lập được nguồn nấm Trichoderma từ đất tại 3 tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nông 31

Hình 3.2 Nấm Trichoderma sp đối kháng với nấm Phytophthora palmivora 34

Hình 3.3 Hiệu quả ức chế của giống Trichoderma đã phân lập đối với nấm Phytophthora palmivora 35

Hình 3.4 Các giai đoạn phát triển sau nuôi cấy của nấm Trichoderma sp trên môi trường 37

Hình 3.5 Định tính hoạt độ enzyme của nấm đối kháng Trichoderma sp 43

Hình 3.6 Ảnh hưởng của môi trường nhân nuôi đối với nấm Trichoderma 45

Hình 3.7 Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma trên môi trường gạo 47

Hình 3.8 Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma trên môi trường bột ngô 49

Hình 3.9 Bảo quản chế phẩm Trichoderma trong túi hút chân không 56

Hình 3.10 Bảo quản chế phẩm Trichoderma trong túi không hút chân không 56

Hình 3.11 Quy trình sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma sp 57

MỞ ĐẦU

Cây ca cao (Theobroma cocoa L có nguồn gốc từ lưu vực sông mazon ở

Nam, Trung Mỹ trong tầng thấp của những cánh rừng mưa nhiệt đới Từ hơn 500 năm trước, ca cao đã được trồng rộng rãi ở nhiều vùng Trung Mỹ, Đông Phi, Tây Phi và lan đến các nước Đông Nam Á Năm 2002, chỉ riêng mức tiêu thụ hạt ca cao trên thế giới đạt 4 t USD, nhu cầu này sẽ tăng trong thời gian tới và tăng nhanh nhất ở thị trường Châu Á [1, 14, 12]

Cây ca cao hiện là cây trồng chính được trồng trong các chương trình giữ gìn sinh thái, tạo cảnh quan cho các vùng đất trống, đồi trọc, đem lại cơ hội tốt để cải thiện đời sống, tăng thu nhập cho người nông dân sản xuất nhỏ và nghèo Theo

Ross Jaaz (trưởng đại diện ADCI /VOCA), hơn 80 % ca cao trên thế giới được sản

xuất từ mảnh đất nhỏ dưới 1ha [12]

Bệnh thối đen quả ca cao (black pod) là bệnh phổ biến và gây hại nghiêm

trọng nhất đối với các vùng trồng ca cao trên thế giới, ảnh hưởng trực tiếp đến năng

suất và chất lượng hạt ca cao, do nấm Phytophthora palmivora gây ra Bệnh gây hại

không những trên quả từ giai đoạn còn non cho đến khi quả chín, mà còn hại cả trên

thân, cành và lá Nấm Phytophthora palmivora gây hại không chỉ trên các bộ phận

khi sinh mà còn có khả năng tồn tại trong đất và hạn chế sự sinh trưởng của cây con được trồng lại trên đất trồng ca cao trước đây đã bị bệnh Ước tính thiệt hại do loại bệnh này gây ra là rất lớn từ 10 % đến 30 % và có thể lên đến 90 - 100 %, phụ thuộc vào vị trí địa lý, giống trồng trọt, chủng gây bệnh và điều kiện môi trường từng vùng (Keane, 1992) [49]

Ở Việt Nam, cây ca cao được du nhập và trồng thử từ những năm cuối thập niên 50 của thế k 20 Các khu vực trồng và phát triển ca cao ở Việt Nam bao gồm Tây Nguyên, Nam Trung Bộ, miền Đông và Miền Tây Nam Bộ [1, 12]

Khi hình thành các vùng sản xuất ca cao hàng hoá tập trung gặp phải vấn đề

là nhiều loài dịch hại quan trọng phát triển nhanh và gây hại nặng, làm giảm năng suất, chất lượng quả ca cao Bệnh thối đen quả ca cao cũng là bệnh chính gây hại ca cao trên thế giới cũng như ở Việt Nam Để phát triển và sản xuất ca cao có hiệu quả,

bền vững cần phải có các biện pháp phòng trừ các bệnh hại nghiêm trọng này, trong

đó có bệnh thối đen quả ca cao [25, 27]

Ở Việt Nam, việc ứng dụng biện pháp sinh học trong phòng trừ bệnh do nấm

Phytophthora gây nên mới chỉ được nghiên cứu ở một số đối tượng như: hồ tiêu,

sầu riêng, cà chua, khoai tây, trên cây ca cao vẫn chưa được đề cập nghiên cứu Vì vậy việc nghiên cứu các chế phẩm sinh học có tác dụng tiêu diệt nấm gây bệnh thối đen quả ca cao là hết sức quan trọng, vừa có tác dụng nâng cao năng suất cây trồng đồng thời bảo vệ môi trường [7, 17]

Trong thực tế dòng nấm đối kháng Trichoderma đã được ứng dụng để tiêu

diệt một số loại bệnh hại cây trồng và đã có nhiều chế phẩm sinh học được tạo ra

cho hiệu quả cao Nấm Trichoderma đối kháng với nấm gây bệnh cây trồng thông

qua nhiều cơ chế bao gồm ký sinh, tạo ra chất kháng sinh và enzyme phân hủy vách tế bào của nấm bệnh Việc nghiên cứu phân lập lựa chọn những chủng nấm

Trichoderma có khả năng đối kháng, tiêu diệt nấm bệnh cao là hết sức cần thiết ,

góp phần nâng cao hiệu quả phòng trừ, an toàn với môi trường và sức khỏe của con người [13]

Xuất phát từ những yêu cầu thực ti n đó, trong khuôn khổ luận văn sẽ thực

hiện: “Nghiên cứu tuyển chọn và sản uất chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng

Trichoderma phòng trừ tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao” Nội dung

nghiên cứu bao gồm:

- Phân lập chủng nấm Trichoderma spp từ đất và nấm Phytophthora

palmivora từ mẫu bệnh thối đen quả ca cao lấy ở một số vùng trồng ca cao của tỉnh

Đăk lăk, Đăk Nông và Bình Phước

- Xác định khả năng đối kháng của nấm Trichoderma sp đối với nấm

Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao

- Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh học và sinh thái của nấm

Trichoderma sp đã tuyển chọn được

- Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối

kháng Trichoderma sp có khả năng đối kháng nấm Phytophthora sp gây thối đen

quả ca cao

Nấm Trichoderma có sợi nấm dạng bò lan, không màu hay sáng màu Sợi

nấm sinh trưởng, phát triển thành những tảng nấm nhỏ dạng gối phẳng, có cành bào

tử đơn bào không mầu Cành bào tử phân nhánh và các nhánh này thường mọc đối xứng nhau hoặc theo nhiều phía Trên cành bào tử thường có cuống đính bào tử Cuống đính bào tử hình chai Bào tử hình tròn hoặc hình trứng, sáng màu, có cấu tạo đơn bào Bào tử có thành dầy Kích thước bào tử thay đổi tùy loài phổ biến từ 3,0 µm đến 4,0 µm Đây là các nấm đối kháng sống trong đất Thường quan sát

thấy nấm Trichoderma tồn tại trong đất ở dạng sợi nấm hoăc bào tử Bào tử có rất

nhiều trong đất ẩm

Trên cùng một môi trường nuôi cấy, mỗi loài Trichoderma có hình dạng

khuẩn lạc khác nhau Đây là một trong những đặc điểm để nhận dạng và phân biệt

Khuẩn lạc Trichoderma phát triển rất nhanh và thành thục trong vòng 5 - 7 ngày

Trên môi trường PDA khi ủ ở nhiệt độ ở 250

C, khuẩn lạc nấm Trichoderma ban

đầu có màu trắng, sau chuyển sang màu xanh đậm hoặc xanh vàng khi có bào tử

xuất hiện Ở một số loài Trichoderma còn có khả năng tiết ra sắc tố có màu vàng trên môi trường PGA Một số loài Trichoderma còn tạo mùi đặc trưng như

Trichoderma viride tạo mùi dừa

Trichoderma có thể phát triển và hình thành bào tử trên môi trường có nhiều

cellulose như: bã đậu phụ, lõi ngô, cám gạo, thóc, bã bia Hầu hết các loài

thậm chí ở 400C Thủy phần của môi trường lên men xốp sinh khối của

Trichoderma thích hợp là 54 - 56 % pH thích hợp để nấm Trichoderma phát triển

là 5 - 6, khi pH > 6 sinh trưởng của nấm yếu, pH < 4 sinh trưởng của nấm rất yếu

Trong thời gian nhân nuôi, nấm Trichoderma cần có điều kiện thoáng khí vì

vậy sau khi vô trùng cần làm cho môi trường nhân nuôi xốp bằng cách lắc để chúng không kết lại thành mảng Nếu bị kết mảng bào tử hình thành rất ít thậm chí sợi nấm không lan vào được

và Botrytis cinerea Cơ chế trực tiếp liên quan đến hiệu quả đối kháng là sự cạnh

tranh, sinh kháng sinh và ký sinh

Tùy thuộc vào loài nấm Trichoderma mà tạo ra các loại kháng sinh khác nhau Nấm Trichoderma viride sinh ra kháng sinh: viridin, trichodermin,

xosukacylin, almatecin hoặc các vitamin, cacbonhydrat, nitơ nhờ vậy làm đất tốt

Các chất kháng sinh này có thể ở dạng bay hơi hoặc không bay hơi, khi tiết ra đều

ức chế sự phát triển của sợi nấm gây bệnh ở mức độ khác nhau

Nhiều nghiên cứu cho thấy Trichoderma có khả năng sản sinh các enzym

Chitinase và -glucanase với hàm lượng cao, đây là 2 enzym thủy phân vách tế bào của các loài nấm gây bệnh rất mạnh Theo Jollès và Muzzarelli, 1999, các loài nấm

mốc như Trichoderma, Gliocladium cho hàm lượng chitinase cao Chitinase giữ

vai trò chính trong hoạt động ký sinh của các loài nấm này với các loài nấm gây

bệnh cho cây trồng Nấm Trichoderma khi ký sinh nấm gây bệnh sẽ tiết ra hệ

enzyme phân hủy chitin của vách tế bào nấm gây bệnh bao gồm 6 enzyme: 2 enzyme -1,4-N-acetylglucosaminidase và 4 enzyme endochitinase Các chủng

nấm mốc Trichoderma, Aspergillus, Candida albicans, Sclerotium glucanicum có

khả năng sản sinh -glucanase cao, đặc biệt là nấm Trichoderma -glucanase của

Trichoderma giữ vai trò chính trong hoạt động ký sinh để đối kháng nấm gây bệnh

cây trồng -1,3-glucanase ở Trichoderma kìm hãm quá trình sinh tổng hợp glucan vách tế bào, ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh

-1,3-Tác động đối kháng của nấm Trichoderma đối với vi sinh vật gây bệnh cây

được thông qua bởi một số cơ chế sau đây:

- ơ chế ký sinh: Theo R.Weindling mô tả từ năm 1932 (Adams, 1990;

Snyder và cộng sự, 1976), tác giả gọi đó là hiện tượng "giao thoa sợi nấm" Trước

tiên sợi nấm Trichoderma vây xung quanh sợi nấm gây bệnh cây, sau đó các sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy các sợi nấm bệnh, cuối cùng mới thấy nấm

Trichoderma xuyên qua sợi nấm bệnh làm thủng màng ngoài của nấm bệnh, gây

nên sự phân hu các chất nguyên sinh bên trong sợi nấm bệnh

Những nghiên cứu chi tiết gần đây bằng kính hiển vi điện tử về vùng "giao

thoa sợi nấm" cho thấy cơ chế chính của hiện tượng ký sinh ở nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh là sự xoắn của sợi nấm Trichoderma quanh sợi nấm vật chủ, sau

đó xảy ra hiện tượng thủy phân thành sợi nấm vật chủ, nhờ đó mà nấm

Trichoderma xâm nhập vào bên trong sợi nấm vật chủ Điều này dẫn đến hiện

tượng chất nguyên sinh ở sợi nấm vật chủ bị phá hủy từng phần hoặc hoàn toàn Cuối cùng, nguyên sinh chất bị mất đi và sợi nấm vật chủ bị phá vỡ, giải phóng các

sợi nấm đang sinh sản của nấm Trichoderma Hiện tượng tan rã Kitin có ở vùng xung quanh nơi xâm nhập của nấm Trichoderma (Dubey, 1995; Inbar và cộng sự,

- ơ chế kháng sinh: Nấm Trichoderma có khả năng sinh ra một số kháng

sinh Khả năng sinh ra chất kháng sinh của các loài, các chủng là khác nhau giống

Một số chất kháng sinh do Trichoderma sinh ra bao gồm:

+ Gliotoxin: là chất kháng sinh được R.Weindling và O Emerson mô tả năm

1936 do nấm Trichoderma lignorum tạo thành Trichoderma sinh kháng sinh

Gliotoxin với điều kiện hàm lượng oxy phải cao Chất Gliotoxin được tích luỹ nhiều trong dịch môi trường Sự tích luỹ tối đa chất Gliotoxin thường ở giai đoạn

phát triển sớm của nấm Trichoderma Chất Gliotoxin có phổ tác động rộng lên

nhiều vi sinh vật: vi khuẩn, nấm (Ascochyta, pisi; Botrytis, R.solani)

+ Viridin: là chất kháng sinh thứ hai do nấm Trichoderma tạo thành trong

hoạt động sống của chúng (Bilai, 1974; Martin và cộng sự, 1975; Seiketov, 1982) Chất kháng sinh này được phát hiện vào năm 1945 Seiketov, 1982 Viridin độc hơn rất nhiều so với Gliotoxin và có hoạt tính chống nấm cao

Ngoài ra, đã xác định được một số chất kháng sinh khác do nấm

Trichoderma sinh ra như: chất kháng sinh U-21693 được Meyer phát hiện năm

1996 Năm 1975, ở Nhật Bản, các tác giả tsushi, Shunsuke đã phát hiện được 2

chất kháng sinh: Trichoderma và Dermadin có trong dịch nuôi cấy loài T.koningii

và T.aureoviride (Seiketov, 1982)

Nấm Trichoderma còn có khả năng sinh ra một số chất kháng sinh d bay

hơi có hoạt tính sinh lý cao Theo Hutchinson (1973) thì thành phần chính của những chất này là khí Cacbonic (CO2) và etanol (Seiketov, 1982)

- Tác động của men: Nhiều loài Trichoderma có khả năng sinh ra men phân

giải như men laminarinaza, chitinaza,… Score và cộng sự, 1994) Khi phát triển

ở trên thành tế bào nấm vật chủ thì nấm Trichoderma có thể tiết ra những loại men

gây suy biến thành tế bào nấm gây bệnh cho cây như men  -(1-3)-glukanase và chitinaza (Chet và cộng sự, 1981 và Jones &Watson, 1969-dẫn theo Martin và cộng

sự, 1985; Chet và cộng sự, 1981, 1983)

- ơ chế cạnh tranh: nấm Trichoderma có thể biểu hiện tính đối kháng

thông qua việc cạnh tranh với nấm gây bệnh cây về dinh dưỡng, nơi cư trú Nấm

Trichoderma thường định cư trước so với các nấm gây bệnh cây Do đó, chúng

chiếm các chỗ định cư cũng như dinh dưỡng của nấm gây bệnh (Green và cộng sự, 1996; Martin và cộng sự, 1985)

1.1.3 Khả năng phòng trừ của nấm Trichoderma spp đối với các loài nấm gây bệnh cây trồng [35, 40, 48]

Năm 1952, Wood thông báo về tính đối kháng của nấm Trichoderma

viride đối với nấm bệnh trên rau diếp là Botrytis cinerea Ngày nay, người ta còn

biết sử dụng nấm Trichoderma để bảo vệ cây trồng khỏi các bệnh nấm ở r như Pythium, Fusarium, Rhizoctonia; Phytophthora, và cả các bệnh ở các phần trên mặt đất như Botrytis cinerea)

Bliss 1959 ; Ohr và cộng sự 1973 , cung cấp bằng chứng thuyết phục nhất,

quần thể Trichoderma trong đất có khả năng phòng trừ nấm Armillaria mellea trên

đất đã được xử lý xông hơi bằng methyl bromide

Well và các cộng sự 1962) lần đầu tiên công bố sử dụng một số lượng lớn

Trichoderma được nuôi trồng trên môi trường rắn ra thử nghiệm ngoài đồng ruộng

để kiểm soát nấm Sclerotium rolfsii trên cà chua Barkman và Rodriguez Kabano

1975 nuôi trồng T.harzianum bằng phương pháp thương mại, các giá thể chứa

nấm được rải xuống đất dọc theo các hàng đậu với lượng 112 – 140 kg ha sau 70 -

100 ngày sau khi gieo đậu Với lượng 140 kg ha, T.harzianum có tác dụng phòng chống S.rolfsii và tăng năng suất lên trong khoảng 3 năm

Nấm Trichodema hamatum có rất nhiều trong đất hữu cơ tại vườn ươm ở Colombia có khả năng ngăn chặn nấm R.solani Chet và Baker, 1980; 1981 và

phân lập từ đất tại Mexico có khả năng ngăn chặn nhiều loại nấm đất Lumsden,

1977 Nhiệt độ và tia phóng xạ gamma không thể diệt nấm R.solani nhưng trong môi trường T.harzianum diệt được nấm này Nelson và cộng sự, 1983 , đây là vai trò chính của Trichoderma trong việc phòng trừ sinh học

1.1.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất, sử dụng chế phẩm nấm Trichoderma phòng trừ bệnh hại trên cây trồng

 Ở nước ngoài [35, 40, 48]

Cho tới nay có khoảng 30 nước đã có những nghiên cứu sử dụng nấm

Trichoderma để trừ bệnh hại cây trồng (Nga, Mỹ, Đức, Hunggari, Ấn Độ, Thái Lan,

Philippin… cho khoảng hơn 150 loài vi sinh vật gây bệnh trên hơn 40 loại cây

trồng Ở Nam Mỹ, người ta dùng nấm T.harzianum phòng trừ các nấm Pythium spp

và R solani gây bệnh chết héo đậu và củ cải (Chet và cộng sự,1981) Ở Ấn Độ, hiệu quả ức chế bệnh do R Solani gây trên khoai tây của nấm T harzianum đạt tới 89,1% Ở Thái Lan, sử dụng nấm T.viride phòng trừ bệnh thối thân cà chua do nấm

S.rolfsii: t lệ cây sống đạt 91,7%; trong khi đó ở đối chứng chỉ đạt 61,9% Ở

Philippin, nấm T.harzianum làm giảm đáng kể t lệ bị bệnh do nấm R.Solani ở đậu xanh: t lệ bị bệnh khi dùng T.harzianum là 14-19%; đối chứng là 79-86%

(Davide, 1991)

Nấm T.harzianum nuôi trồng trên môi trường rắn có tác dụng chống được các bệnh thối trắng trên hành Sclerotium cepivorum ở i cập bd-El và cộng sự,

1982 và ở Mỹ Papavizas và Lewis, 1982 ; bệnh trên dưa leo và bệnh trên cây bông

do Verticillium dahlia ở Liên xô Fedrorinchik và cộng sự, 1975 , bệnh chết rạp cây con do Rhizoctonia và bệnh tàn rụi S.rolfsii trên nhiều cây trồng ở Israel Chet và

cộng sự, 1982, Elad và cộng sự, 1982 và bệnh thối trái trên dưa leo Kommedahi và Windels, 1981 Hiệu quả phòng trừ sinh học của nấm nuôi trồng trên môi trường rắn phụ thuộc vào nhiệt độ, loại môi trường nuôi trồng và thời điểm cấy nấm vào đất

Elad và cộng sự, 1980 , t lệ cấy Trichoderma vào giá thể Elad và cộng sự, 1980,

Hadar và cộng sự, 1979 và mật độ của nấm gây bệnh trong đất

Theo Anderens và cộng sự (1983), Barros và cộng sự (1996), Dutta và cộng

giảm được 20-40% t lệ thối quả do nấm Botrytis cinerea, Alternaria tenuis Theo Dubos và cộng sự (1979) ở Pháp người ta đã thử nghiệm nấm Trichoderma viride

có hiệu quả phòng trừ bệnh thối xám quả nho giảm 70% so với đối chứng Theo

Sing R S (1995) thì nấm Trichoderma viride có thể ức chế sự phát triển của bệnh hại khoai tây do loài Rhizoctonia solani gây nên, hiệu quả ức chế tối đa là 83,4%

Theo Buimistru (1997), Elad và cộng sự (1980), Udaidulaev và cộng sự

(1979), Wu W S (1996) dùng chế phẩm Trichoderma sp có tác dụng phòng trừ

bệnh hại cây trồng, làm giảm t lệ cây bị bệnh rõ rệt, chế phẩm nấm đối kháng nấm

Trichoderma sp có thể giúp cây khỏe hơn, tăng sức đề kháng với vi sinh vật gây

bệnh, tác dụng kích thích sinh trưởng đối với cây

Theo Anderens và cộng sự (1983), Barros và cộng sự (1996) và Dutta và cộng

sự (1999), cho biết khi quả táo đươc xử lý chế phẩm Trichoderma viride đã làm giảm được 20-40% t lệ thối quả do nấm Botrytis cinerea, Alternaria tenuis Theo Dubos và cộng sự (1979) ở Pháp người ta đã thử nghiệm nấm Trichoderma viride có

hiệu quả phòng trừ bệnh thối xám quả nho giảm 70% so với đối chứng Theo Sing R

S (1995) thì nấm Trichoderma viride có thể ức chế sự phát triển của bệnh hại khoai tây do loài Rhizoctonia solani gây nên, hiệu quả ức chế tối đa là 83,4%

Theo Buimistru (1997), Elad và cộng sự (1980), Udaidulaev và cộng sự

(1979), Wu (1996) dùng chế phẩm Trichoderma sp có tác dụng phòng trừ bệnh hại

cây trồng, làm giảm t lệ cây bị bệnh rõ rệt, giúp cây sinh trưởng khỏe hơn, tăng sức đề kháng với vi sinh vật gây bệnh, tác dụng kích thích sinh trưởng đối với cây

Trichoderma là một trong những loại nấm có khả năng ức chế một số nấm

đặc biệt là các loài nấm đất như: Sclerotium rolfsii, Phytophthora, Fusarium,

Pythium, Rhizoctonia gây bệnh trên các loại cây họ đậu, cây ăn trái, cây hòa thảo,

cây công nghiệp và cây hoa cảnh Trichoderma không những tiêu diệt được nhiều

loài nấm bệnh gây hại cây trồng mà còn có tác dụng cải thiện cấu trúc và thành phần hóa học của đất, đẩy mạnh sự phát triển vi khuẩn nốt sần cố định đạm có ích trong đất và kích thích sinh trưởng phát triển của cây trồng Những chất kháng sinh

do chúng tiết ra còn có thể xâm nhập vào mô tế bào cây và làm tăng tính chống chịu bệnh của cây trồng (Biswas, 1999)

Theo Dutta và Das 1999 , đã thử nghiệm khả năng phòng trừ sinh học của

nấm Trichoderma harzianum bằng cách cho một số lượng lớn bào tử nấm này nuôi trồng trong môi trường rắn vào đất để kiểm soát nấm Rhizoctonia solani trên cây đậu tương Trichoderma harzianum khi bón vào đất với t lệ 1 : 10 theo thể tích đã ngăn chặn được bệnh ở thân và r do nấm Rhizoctonia solani gây hại đồng ruộng

Nghiên cứu của Diby và cộng sự, 2003 đã ghi nhận nấm Trichoderma

harzianum IISR - 1369, 1370 được phân lập từ vùng r của cây hồ tiêu có khả năng

kích thích sinh trưởng và hạn chế được bệnh chết nhanh cây hồ tiêu do nấm

Phytophthora capsici gây nên Khi sử dụng chế phẩm hỗn hợp giữa nấm Trichoderma harzianum IISR - 1369 với vi khuẩn Pseudomonas fluorescens IISR -

11 cho hiệu quả phòng trừ đạt 63%, cao hơn so với đối chứng là 36%

Hiện nay tại Mỹ, các chế phẩm PlantshieldTM và RootshieldTM từ loài

Trichoderma harzianum nòi T22 đã được khuyến cáo để sử dụng phòng trừ một số

bệnh do nấm Phytophthora, Pythium, Fusarium trên một số cây trồng Chế phẩm

được sử dụng bằng cách phun lên lá, tưới hay bón vào đất Promote Plus cũng là

một chế phẩm Trichoderma (Trichoderma koningii và Trichoderma harzianum) được khuyến cáo sử dụng tại đây để phòng trừ bệnh do nấm Rhizoctonia solani, một số loài Pythium, Phytophthora

 Ở trong nước [5, 7, 9, 17, 20, 21, 23, 24]

Trong những năm gần đây, tại Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu

thành công trong sử dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ một số bệnh hại cây trồng như: chế phẩm Trichoderma thử nghiệm trên cây rau tại huyện Củ Chi, TP Hồ Chí Minh của Viện Sinh học Nhiệt đới, chế phẩm Trichoderma thử

nghiệm trên cây xà lách xoong ở Vĩnh Long của Bộ môn Bảo vệ thực vật - Trường

Đại học Cần Thơ, chế phẩm Trichoderma sử dụng trên cây rau của Bộ môn Bảo vệ

thực vật - Trường Đại học Nông Lâm TP HCM Chế phẩm sinh học đa chức năng

MT1 của Viện Bảo vệ thực vật ứng dụng trong phòng trừ bệnh chết nhanh hồ tiêu

do nấm Phytophthora spp., chế phẩm Trichoderma spp phòng trừ bệnh thối quả ca cao do nấm Phytophthora palmivora của Viện Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên

Các kết quả nghiên cứu của Nguy n Văn Tuất và Lê Văn Thuyết, 2001 đã phát hiện những điểm kí sinh hoặc sự quấn của sợi nấm đối kháng lên sợi nấm bệnh, đôi khi dưới tác động của một số loại men được tiết ra từ nấm đối kháng còn thấy hiện tượng sợi nấm bị quăn lại, chết từng đoạn mà không cần có sự ký sinh trực tiếp Nhờ các men này các chất hữu cơ có trong đất được phân hủy nhanh hơn, làm tăng chất dinh dưỡng dưới dạng d hấp thu cho cây trồng, tạo điều kiện cho cây sinh trưởng và phát triển tốt

Tác giả Trần Thị Thuần và cộng sự (2004), đã tiến hành phân lập từ các

nguồn khác nhau và xác định khả năng ức chế của nấm Trichoderma đã thu thập, kết quả cho thấy các loài nấm Trichoderma có hiệu quả ức chế cao từ 67,7 - 85,5% đối với các nấm gây bệnh như Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Fusarium spp ,

Aspergillus spp

Theo tác giả Phạm Ngọc Dung và cộng sự (2008) nấm Trichoderma

hazianum có khả năng ức chế cao đối với sự phát triển của sợi nấm Phytophthora tropicalis, trên môi trường bằng phương pháp cấy đối xứng, sợi nấm Phytophthora

bị tiêu diệt sau 3 ngày nuôi cấy Cũng theo tác giả, một số chủng nấm Trichoderma

spp vừa có khả năng ức chế sự phát triển của sợi nấm, sự nảy mầm của bào tử

Phytophthora đồng thời có khả năng phân hủy tốt một số loại tàn dư thực vật, hữu

dụng trong quá trình ủ phân hữu cơ, cung cấp phân hữu cơ cho các vườn hồ tiêu

Theo Trần Kim Loang và cộng sự (2008), sử dụng chế phẩm Trico-VTN (gồm

Trichoderma virens và Trichoderma asperellum) với nồng độ 0,3 – 0,4% mỗi tháng một

lần, hạn chế được sự phát triển và gây hại của bệnh do nấm Phytophthora trên cây tiêu

và ca cao trong điều kiện vườn ươm Trên đồng ruộng xử lý chế phẩm Trico-VTN với lượng 10 – 15 g/gốc, xử lý 4 lần từ đầu mùa mưa, cách nhau 2 tháng, kết hợp với bón phân hữu cơ, phân bón lá, vệ sinh đồng ruộng và tiêu thoát nước có thể hạn chế sự phát triển và lây lan của bệnh chết nhanh hồ tiêu trên đồng ruộng

Theo Nguy n Minh Châu (2009), sử dụng nấm Trichoderma trộn với phân

hữu cơ bón vào đất, tưới nước giữ ẩm để phòng trừ một số bệnh thối r , vàng lá,

nứt gốc…cho vườn cây ăn quả khá tốt Các vườn ươm sử dụng nấm Trichoderma

phòng trừ được bệnh do nấm gây hại trên cây giống Phối trộn nấm Trichoderma với

phân chuồng hoai mục bón cho vườn cây theo định kỳ thì hiệu quả càng tăng lên

Hồng Châu, 2009 cho rằng nấm Trichoderma giúp thúc đẩy tiến trình phân

giải chất hữu cơ nhanh hơn được dùng để ủ phân chuồng, phân xanh sẽ rút ngắn

thời gian hoai mục Hiện nay, chủng Trichoderma do Trường Đại học Cần Thơ sản

xuất được nông dân sử dụng đánh giá có tác dụng rất tốt trong việc ngăn ngừa các

loại nấm hại như Fusarium, Rhizoctonia, Phytopthora gây bệnh trên cây có múi

và cây rau họ bầu, bí Vì vậy mà các chế phẩm có chứa Trichoderma ngày càng

được lưu hành, sử dụng nhiều hơn; đặc biệt các vườn trồng chanh ở Bến Lức hoặc các ruộng trồng dưa hấu ở Tân Trụ

Theo các tác giả Phạm Ngọc Dung và cộng sự (2012), sử dụng nấm đối kháng

Trichoderma Asperellum trong phòng trừ nấm Phytophthora spp gây hại trên cây

cao su đã được một nhóm tác giả thuộc Viện Bảo vệ Thực vật nghiên cứu Nhóm nghiên cứu đã lấy tổng số 80 mẫu đất thu thập được quanh vùng r của các cây lâu năm tại 3 tỉnh: Bình Phước, Đăk Lăk và Quảng trị, đã phân lập được 18 nguồn

Trichoderma sp, trong đó có 8 nguồn triển vọng có khả năng đối kháng với nấm

bệnh Trong điều kiện phòng thí nghiệm nấm Trichoderma Asperellum có khả năng phòng trừ bằng ký sinh sợi nấm đạt hiệu quả là 100% đối với nấm Phytophthora

Botryosa và nấm Phytophthora Citrophthora Khả năng phòng trừ bằng chất kháng

sinh bay hơi đạt hiệu quả là 84,8 – 93,4% đối với nấm Phytophthora Botryosa và đạt hiệu quả là 90,4 – 91,8% đối với nấm Phytophthora Citrophthora Các nguồn khác

có khả năng ức chế nhưng với hiệu quả thấp hơn 70,3 – 85,9) Nấm Trichoderma

asperellum có khả năng đối kháng cao với nấm Phytophthora spp gây bệnh trên cao

su bằng ký sinh trực tiếp sợi nấm và chất kháng sinh bay hơi Đồng thời nấm này có hoạt độ các enzyme phân giải như Cellulase, Chitinase, β-Glucanase cao

1.1.5 Một số loại vi sinh vật đối kháng và chế phẩm sinh học sử dụng vi sinh vật đối kháng để tiêu diệt nấm bệnh được nghiên cứu và sử dụng [13, 23, 21, 60]

Theo kết quả nghiên cứu của các tác giả Galindo 1992 , đã tiến hành nghiên

cứu nhiều thí nghiệm để kiểm tra khả năng phòng trừ sinh học đối với nấm P

palmivora ở cây ca cao bằng sử dụng các vi sinh vật đối kháng như Bacillus spp và Pseudomonas fluorescens cũng đã đem lại một số thành công

Các tác giả Diby và cộng sự (2006), cho rằng vi khuẩn đối kháng

Pseudomonas fluorescens có khả năng hạn chế sự phát triển của một số tác nhân gây

bệnh tồn tại trong đất Vi khuẩn này sản sinh các chất kích thích sinh trưởng như: gibberellin, cytokinin và axit acetic Các nguồn vi khuẩn này được nghiên cứu trong

phòng trừ bệnh do nấm Phytophthora capsici gây thối r cây hồ tiêu, hiệu quả phòng

trừ đạt 70% trong điều kiện phòng thí nghiệm Theo dõi sau 4 tháng cho hiệu quả kích thích sinh trưởng thân lá cây hồ tiêu tăng hơn 57,15% trong điều kiện nhà lưới

Theo Anandaraj và Sarma, 2003 , dòng P fluorescens IISR-51 có hiệu quả phòng trừ nấm P capsici tăng so với đối chứng là 51,6% và 38,9% đối với dòng P

fluorescens IISR-6, đối với đất không khử trùng xử lý P fluorescens với mật độ

104 CFU g, đối với đất đã khử trùng sử dụng P fluorescens với mật độ 107 CF/g

Theo Weller, D.M (2007), vi khuẩn Pseudomonas spp là các vi khuẩn

nhuộm gram âm, sinh trưởng mạnh ở vùng r của cây, có khả năng đối kháng với

các loại nấm có khả năng tồn tại trong đất Pseudomonas có nhiều dòng khác nhau,

tuỳ từng cây và các điều kiện sinh thái khác nhau mà nó có tính thích ứng riêng đối

với mỗi một loại tác nhân gây bệnh cây trồng Vi khuẩn Pseudomonas có một số

đặc tính: có khả năng nhân sinh khối nhanh trong điều kiện nhân tạo, kích thích hạt nảy mầm và hệ r cây phát triển, nâng cao hệ thống tự phòng bệnh của thực vật, có khả năng ức chế được sự phát triển của một sợi nấm của một số tác nhân gây bệnh tồn tại trong đất

Kết quả nghiên cứu của Aravind và cộng sự, 2009 cho thấy trong số 65 dòng

vi khuẩn đối kháng phân lập được đã tìm ra được 3 dòng: IISRBP 35, IISRBP 25,

IISRBP 17 có hiệu quả giảm bệnh P capsici gây hại hồ tiêu trên 70% trong thí nghiệm nhà lưới Trong đó IISRBP 35 là Pseudomonas aeruginosa, IISRBP 25 là

Pseudomonas putida, IISRBP 17 là Bacillus megaterium

Theo tác giả Kyung Seok Park và cộng sự (2007), sản phẩm EXTN-1 gồm

vi khuẩn đối kháng Bacillus vallismortis (dạng viên và dạng lỏng), nếu dạng viên

kết hợp với than bùn non Cơ chế tác động của EXTN-1:

- EXNT- 1 được phân tích bởi sự bài tiết vật chất hoá học của rất nhiều chủng loại Đặc biệt, chất kết hợp của 2 loại chất sau được coi là vật chất tăng cường kháng bệnh mạnh nhất: Cyclo dipeptide và Cyclo depsipeptide

- EXTN-1 chứa chất đạm phòng bệnh (Pr- protein): Pr- protein là một ví dụ

về sức đề kháng tiêu biểu nhất bởi chất đạm được phát hiện trong tế bào thực vật có khả năng ngăn ngừa dịch bệnh đã có mặt khi sử dụng EXTN-1 cho cây Các Pr- protein có sự hoạt động của kháng thể vi sinh vật (anti-microbial activity) có tác dụng ngăn cản men sinh vật gây bệnh thâm nhập vào thực vật Trong các loại Pr- protein thì Pr-1a là chất đạm có sức đề kháng tiêu biểu nhất

- Sức đề kháng vật lý của EXTN-1: thúc đẩy hình thành Callus, ngăn chặn lây

lan bào tử vi rút, vi khuẩn và nấm gây bệnh, phòng ngừa sự hình thành vi khuẩn gây bệnh phụ Tế bào hình thành Callus dầy và Ligin kết hợp lại làm cho cường độ

tế bào nâng cao sẽ chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn gây bệnh ở tế bào biểu bì Bản thân vật chất phát sinh trong quá trình hình thành Ligin có độc tính trong vi khuẩn gây bệnh và các bệnh lây nhi m kèm theo

Ở Việt Nam, tác giả Trần Hà và cộng sự 2008 xác định vi khuẩn

Pseudomonas fluorescens được phân lập từ vùng r của cây hồ tiêu ở Quảng Trị

bằng phương pháp PCR, kết quả nghiên cứu tính đối kháng cho thấy trong 5 dòng,

có 1 dòng P fluorescens SS101 có khả năng tiêu diệt được du động bào tử nấm

Phytophthora gây chết nhanh cây hồ tiêu trong vòng 60 giây, nghiên cứu khả năng

ức chế bệnh chết nhanh trong điều kiện nhà lưới cũng chỉ ra có hiệu quả giảm bệnh, theo dõi 60 ngày sau trồng ở công thức không xử lý t lệ bệnh là 40%, ở

công thức được xử lý P fluorescens SS101 chỉ là 10% Bên cạnh đó dòng P

fluorescent SS101 còn có khả năng kích thích sinh trưởng của cây hồ tiêu, t lệ r

mọc nhiều so với đối chứng

1.2 Nghiên cứu về tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao [52, 55, 58, 59]

1.2.1 Tình hình thiệt hại do bệnh thối đen quả ca cao gây nên [38, 44, 47,

49, 52, 57]

Ước tính thiệt hại hàng năm do loại bệnh thối đen quả ca cao gây ra trên thế giới là rất lớn làm giảm năng suất ca cao từ 10 % đến 30 % và có thể lên đến 90 -

100 %, phụ thuộc vào vị trí địa lý, giống trồng trọt, chủng gây bệnh và điều kiện môi trường từng vùng Keane, 1992 Một số quốc gia như Cameroon, Nigeria hay Ghana bệnh đã làm giảm gần 30 % sản lượng với t lệ quả bị bệnh từ 30 - 80% có khi lên tới 100% Còn tại Malaysia bệnh đã làm giảm sản lượng từ 5 - 70%, có những năm có thể giảm tới hơn 80% sản lượng ca cao Lee và Lum, 2004) Tại

Indonexia nấm Phytophthora đã tấn công trên 138 loài cây trồng, chỉ riêng loài P

palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao đã làm thiệt hại 26 - 56 % sản lượng ca cao

tại Java Purwantara, 1987 Tại Samoa, thiệt hại do bệnh thối đen quả ca cao cũng lên đến 60 - 80 %, tại Papua New Guinea là 5 - 39% (Purwantara, 2003) Tại đảo Solomon, bệnh thối thân hàng năm làm giảm 13% năng suất, cá biệt có những vùng

bị thiệt hại đến 40% năng suất McMahon và cộng sự, 2004) Chỉ riêng loài nấm

Phytophthora palmivora làm thiệt hại năng suất ca cao hàng năm lên đến 1 t đôla

Ở Việt Nam, t lệ bệnh thối đen ở quả ca cao ở Đăk Lăk trung bình lên đến

25 – 30%, có những vườn t lệ quả nhi m bệnh chiếm 65 – 70% và hầu như không cho thu hoạch Ở Bình Phước t lệ bệnh trung bình cũng chiếm khoảng 20 – 25 %,

có nhiều vườn cũng không cho thu hoạch (Kết quả điều tra sơ bộ của Viện Bảo vệ thực vật năm, 2010)

1.2.2 Đặc điểm sinh học và sinh thái của nấm Phytophthora palmivora [42]

Cho đến nay trên thế giới có 8 loài nấm Phytophthora gây hại trên cây ca cao là: P palmivora, P megakarya, P capsici, P katsurae, P citrophthora, P arecae,

P nicotianae và P megasperma Trong đó xuất hiện phổ biến nhất là loài P palmivora

Phytophthora palmivora có sợi nấm to nhỏ không đều, đường kính sợi từ

2-6 µm Cành bào tử phân sinh dài 120 - 150 µm Bào tử nang hình quả chanh, núm đỉnh rõ ràng, kích thước 29,3 - 49,4 µm Khi nảy mầm tạo nhiều du động bảo tử, có hai lông roi có khả năng bơi lội trong nước Trong điều kiện sống bất thuận nấm có khả năng sản sinh ra bào tử hậu hình tròn, rìa mép nhăn, vỏ dày 3 - 4 µm màu vàng nhạt Bào tử hữu tính (bào tử trứng hình tròn vỏ nhẵn, không màu đường kính 15 -

27 µm (Erwin và Riveiro, 1996

Trong điều kiện có nước và nhiệt độ thấp, bào tử tạo thành nhiều bào tử động nhanh chóng di chuyển theo nước xâm nhi m lây nhi m qua vết thương cơ giới và lỗ hở tự nhiên của cây Sợi nấm xuyên sâu vào các mô tế bào mạch libe, qua

mô phân sinh tới mạch gỗ Bệnh hại có thời kỳ tiềm dục từ 3-8 ngày

Nấm Phytophthora palmivora phát triển mạnh trong khoảng nhiệt độ từ 16

đến 32oC, độ ẩm không khí từ 80 đến 95 %, nhất là trong mùa mưa Tuy nhiên, ở nhiệt độ dưới 10oC hay trên 35oC nấm ngừng phát triển

Hình 1.2 Sơ đồ chu tr nh sống của nấm Phytophthoro spp

(Nguồn: rwin v iveiro

H nh 1.3 Hình thái học của Phytophthora palmivora H ng dưới túi noãn

hình cầu với túi đực amphigynous và một bọc bào tử hình trứng với một cuống ngắn H ng trên sự thay đổi trong hình dạng của các bọc bào tử

(Nguồn: rwin v iveiro

1.2.3 Chu kỳ phát triển bệnh [37, 54]

Nấm Phytophthora cơ bản là truyền qua đất, tuy nhiên Phytophthora

palmivora còn có khả năng xâm nhi m vào những bộ phận bên trên của cây ca cao

gây loét thân, cháy lá và thối quả Khi điều kiện môi trường thuận lợi mầm bệnh nguyên thu bắt đầu gây dịch bệnh Trong điều kiện nhiệt đới ẩm ướt, sự phát triển của

Phytophthora kéo dài liên tục suốt năm, có thể chu kỳ bệnh không bị gián đoạn

Ban đầu mầm bệnh nguyên thu của Phytophthora spp là những sợi nấm

và hậu bào tử tồn tại ở r , vỏ cây và quả bị nhi m bệnh trước đây Trong điều kiện thuận lợi mầm bệnh nguyên thu nảy mầm và bắt đầu xâm nhi m Nếu sự nhi m bệnh này phát triển thì việc nảy mầm của mầm bệnh thứ cấp được hình thành, đó là nguồn lan truyền của dịch bệnh T lệ phát sinh và lan truyền của mầm bệnh là cơ

sở quyết định sự nhi m bệnh mới Dịch bệnh bùng phát do sự gia tăng một cách nhanh chóng của mầm bệnh thứ cấp (Drenth và Guest, 2004)

Theo Drenth và cộng sự (2004) hầu hết các loài nấm Phytophthora đều là

những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng, nguyên nhân do nấm có khả năng tạo ra nhiều dạng bào tử, thời gian xâm nhi m vào mô cây ký chủ của bào tử nấm rất ngắn, chỉ trong vòng 3 - 5 ngày, nhiều loại thuốc trừ nấm không có tác dụng trong

phòng trừ và nấm phát triển mạnh trong điều kiện ẩm ướt

1.2.4 Sự vận chuyển của mầm bệnh [50]

Những đốm bệnh do Phytophthora có thể xâm nhi m trên những bộ phận

khác nhau của quả ca cao Đốm bệnh có thể bắt đầu từ cuống và loang xuống là do

sự tiếp xúc trực tiếp của quả với đốm bệnh loét ở thân, lá hoặc với những tổ kiến được tha từ đất bị tạp nhi m bệnh Mô bệnh hình thành tại đầu mút của quả là do mầm bệnh truyền qua nước từ nhựa quả hoặc nhựa gỉ của bệnh loét thân chảy xuống hoặc từ đất bắn vào những quả tiếp giáp với mặt đất Mô bệnh xuất hiện ở một phía của thân quả là do sâu gây hại hoặc qua vết thương cơ giới

Mầm bệnh lan truyền từ đất vào cây là kết quả tác động của con người, của mưa, của kiến, mối, sên và bọ cánh cứng Bọ cánh cứng truyền nấm bệnh là do khi

đẻ trứng ở những vỏ quả bị bệnh sẽ tiếp xúc với những đốm bệnh sau đó lại tiếp

xúc với quả không nhi m bệnh Khi chúng đục vào quả đã tạo điều kiện cho mầm bệnh xâm nhi m một cách d dàng Mầm bệnh thứ cấp còn có thể xâm nhi m qua

sự tiếp xúc trực tiếp với các công cụ lao động, nước mưa, côn trùng (Konam và Guest, 2004)

1.2.5 Nghiên cứu về phòng trừ sinh học bệnh thối đen quả ca cao

Nắm vững về các biện pháp canh tác cũng là khâu rất quan trọng trong các biện pháp phòng trừ tổng hợp bệnh, đặc biệt là các bệnh do nấm

Phytophthora gây nên.

1.2.5.1 Kiểm dịch thực vật, vệ sinh vườn ươm v vườn kinh doanh [32]

Theo Broadley 1992, kiểm dịch thực vật là biện pháp duy nhất ngăn chặn sự xâm nhập của một vật gây bệnh mới vào trong một vùng Ngăn chặn các động vật vào bằng cách dựng hàng rào, giảm thiểu sự di chuyển của các phương tiện xe cộ

và sự đi lại của con người trong khu vườn, rửa sạch đất ở xe cộ, ủng, và các dụng

cụ trước khi đem vào trong vườn, chỉ trồng những cây không bị bệnh và những cây

có tính kháng bệnh, và làm chuyển hướng dòng nước chảy từ các khu vườn lân cận

Tại các vườn ươm, các hỗn hợp làm bầu cây được hấp để tiêu diệt nguồn

bệnh Phytophthora và chỉ những nguồn cây không bị nhi m bệnh Phytophthora

mới được sử dụng Các khu vườn cũng cần được làm sạch không còn những mảnh

vụn cây trồng bị thối nát là những vật rất d bị nhi m bệnh Phytophthora

(Broadley, 1992)

1.2.5.2 Hệ thống thoát nước v tưới tiêu [42, 53]

Quản lý nguồn tưới và tiêu thoát nước đối với bệnh Phytophthora là biện

pháp quan trọng trong việc giảm thiểu tác hại của bệnh Việc tưới quá nhiều và mưa nhiều là nhân tố quan trọng nhất làm tăng mức độ gây hại và lây lan của các

bệnh do nấm Phytophthora Thời gian dư thừa nước, trong đất hoặc trên tán lá hoặc

trên hoa quả lại là môi trường cho bệnh phát triển vì chính trong khoảng thời gian

đó các chồi mầm mới sinh sôi nảy nở và nhi m bệnh (Erwin và Ribeiro, 1996) Ngoài ra, các du động bào tử, các túi bào tử và các hậu bào tử di chuyển được trong đất nhờ nước tưới, nước mưa chảy và đất trôi đi theo Vì vậy, cần phải xây dựng

các vườn cây trên khu đất có hệ thống thoát nước tốt và không bị ngập lụt, đất cần được rút hết nước sâu tới 1,5m Tạo thành các ụ đất xung quanh cây có thể làm tăng khả năng thoát nước (Broadley, 1992)

mang lại hiệu quả cao Lass, 1987 nhằm phòng trừ bệnh Phytophthora Ở Ghana để phòng chống bệnh Phytophthora người ta đã có nhiều chương trình

nghiên cứu để tạo ra những giống kháng hoặc chống chịu với bệnh thành công (Abdul-Karimu & Bosompem, 1994)

1.2.5.4.Các kỹ thuật về phân bón [30, 32, 41, 59, ]

Theo Ebon 1978 đã nghiên cứu và đưa ra lượng phân bón trong hai năm

đầu tiên được khuyến cáo như trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Lượng phân bón cho ca cao mới trồng trong 2 năm đầu tiên

Một số loại sầu riêng trồng ở vùng Bắc Queensland cho thấy việc sử dụng

quá nhiều phân vô cơ đã làm tăng bệnh hại trên cây ca cao do Phytophthora

palmivora gây ra, trong khi đó phân chuồng hoai và rác phủ cải thiện được tình

trạng sạch bệnh của cây Tan 2000 đã nghiên cứu về những tác động của phân vô

cơ lỏng và phân gà ủ hoai đối với sự phát triển của bệnh do Phytophthora

palmivora gây hại cây ca cao và sầu riêng Nghiên cứu kết luận rằng việc sử dụng

phân gà hoai giảm đáng kể tác hại và mức độ gây hại của bệnh so với việc sử dụng

phân vô cơ T lệ cây giống sầu riêng (12 tháng tuổi) trồng trên đất có nhi m P

palmivora nhưng được bổ sung hỗn hợp phân gà hoai đã sống sót là 100% và đồng

thời nguồn bệnh trong đất đã bị mất đi

Theo Aryantha và cộng sự, 2000, việc bổ sung thêm phân gà nguyên chất

hoặc phân gà đã pha trộn vào hỗn hợp bầu đã làm giảm đáng kể P cinnanomi và

ngăn chặn sự phát triển của bệnh trong các cây đậu con Tất cả các phân hữu cơ đều làm tăng chất hữu cơ ở trong đất, kích thích hoạt động sinh học và làm gia tăng số lượng các xạ khuẩn đối kháng, vi khuẩn huỳnh quang và nấm

1.2.5.6 Sự bổ sung chất hữu cơ v phủ đất [30]

Việc phủ đất giúp kích thích sự phát triển của r cây, làm tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng, làm giảm hiện tượng bay hơi các chất dinh dưỡng của đất, làm tăng khả năng giữ đất và nước, làm giảm việc nước chảy trên bề mặt, tạo điều kiện thoát nước tốt, ổn định nhiệt độ của đất và cung cấp một lượng chất dinh dưỡng lớn cho các vi khuẩn trong đất (Aryantha và cộng sự, 2000) Theo kết quả nghiên cứu của các tác giả Aryantha và cộng sự, (2000), Lazarovits và cộng sự, (2001), bổ sung các chất hữu cơ như: bột cỏ linh lăng, xơ bông, bột đậu tương, cây lúa mì, phân gà và phân u rê vào đất giúp kích thích sự phát triển của r cây, làm tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng, giảm hiện tượng bay hơi của đất, tăng khả năng giữ đất và nước, giảm việc nước chảy trên bề mặt, tạo điều kiện thoát nước tốt, ổn định nhiệt độ của đất và cung cấp một lượng chất dinh dưỡng lớn cho các vi khuẩn trong đất Các chất hữu cơ phân hu giải phóng ra amoniac và các axit hữu cơ d bay hơi

có thể diệt bệnh Phytophthora và chất hữu cơ còn lại kích thích các vi sinh vật cạnh

tranh đối kháng trong đất, vì vậy việc cung cấp thường xuyên chất hữu cơ cho vườn

cây có khả năng hạn chế bệnh do nấm Phytophthora gây nên

1.2.5.7 Biện pháp sử dụng thuốc hoá học phòng trừ Phytophthora [35, 42, 46]

a) Thuốc oóc đô

Hỗn hợp boóc đô đã được sử dụng thành công để phòng trừ rất nhiều bệnh

do các loài Phytophthora khác nhau gây ra Thuốc có tác dụng với bệnh trên tán lá,

nhưng các thành phần hoạt tính của nó d gây độc đối với một vài loại cây trồng và một số sinh vật phi mục đích Ngoài ra, Thuốc Boóc đô là một hỗn hợp giữa đồng sun phát với vôi, phải đọc kỹ hướng dẫn khi pha chế loại thuốc này, vì pha sai thuốc d bị kết tủa không có khả năng phòng trừ bệnh Tại các khu vực nhiệt đới có lượng mưa cao, thì thuốc d bị rửa trôi (Erwin và Ribeiro, 1996)

b) Phosphonates

Nhóm hoạt chất này có khả năng trừ bệnh do nấm Phytophthora Từ

“phosphonates” dùng để chỉ muối và các este của axit phốt pho ríc đã giải phóng ra các Anion phosphonates, dạng đặc trưng của phosphonates là Fosety-Al Trên thị trường hợp chất này được biết đến với tên thương mại là Aliette, đó là một hỗn hợp muối nhôm của Phosphonate (Cohen và Coffey, 1986)

Tính hiệu quả của các thuốc Phosphonates đối với các cây trồng hay các loài

Phytophthora thì khác nhau, có thể là do sự khác nhau về dạng hoặc mức độ tự

phòng vệ của các vật chủ (Guest và cộng sự, 1995) Mặc dù tác dụng kháng nấm của Phosphonates không bị giới hạn chỉ ở các noãn bào tử, nhưng sự thay đổi về

hiệu quả kháng nấm đối với một số loài Phytophthora của hoạt chất này vẫn không

thể giải thích được Chẳng hạn như, chất fosetyl-Al rất có tác dụng đối với bệnh

thối củ do Phytophthora infestans gây ra, nhưng lại vô hiệu trong việc phòng chống

bệnh rụng lá muộn ở khoai tây (Erwin và Ribeiro, 1996)

Các biện pháp phòng trừ sinh học đối với bệnh thối đen quả ca cao do nấm

Phytophthora palmivora gây ra chưa có công trình nào nghiên cứu cụ thể Do vậy,

cần nghiên cứu và đưa ra được các biện pháp phòng trừ tổng hợp bệnh trên theo hướng an toàn cho môi trường và con người

HƯ NG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯ NG PH P NGHI N ỨU

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng được nghiên cứu là nấm đối kháng Trichoderma được phân lập từ

mẫu đất trồng ca cao được thu thập từ 3 tỉnh Đăk Lăk, Đăk Nông và Bình Phước,

có khả năng phòng trừ bệnh thối đen quả cao cao

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu khả năng đối kháng của nấm Trichoderma đã phân lập về hình thái, điều kiện phân lập và tuyển chọn đối với nấm Phytophthora gây bệnh thối đen

ở quả ca cao

- Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối

kháng Trichoderma phòng trừ nấm Phytophthora palmivora

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu

+ Thu thập mẫu đất ở các vùng trồng ca cao của tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nông:

- Lấy đất quanh vùng r của các cây ca cao khỏe, sinh trưởng tốt ở trong vườn

- Lấy mẫu đất về bốn phía của cây, gạt nhẹ lớp đất mặt (10 – 15 cm sau đó lấy sâu xuống khoảng 20 – 25 cm

- Mỗi điểm chọn 3 cây, mỗi cây lấy 4 mẫu, mỗi mẫu khoảng 1 kg đất, trộn đều vào nhau, lấy ra 1 kg đất/cây Trộn đất ở 3 cây vào nhau, sau đó lấy 1kg/mẫu đất mang về phòng thí nghiệm

+ Thu thập mẫu bệnh thối đen ở các vùng trồng ca cao của tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nông:

- Thu thập tất cả các loại triệu chứng bệnh hại trên tất cả các bộ phận của cây

liên quan đến bệnh thối đen quả ca cao

- Các mẫu bệnh được đựng trong các túi xi măng, giấy báo để trong hộp xốp

lạnh Sau khi thu thập được gửi hoặc mang ngay về phòng thí nghiệm để giám định

- Cần ghi rõ các thông tin của mẫu:

+ Ngày, địa điểm thu mẫu, tên của chủ ruộng lấy mẫu

+ Cây trồng (giống, tuổi cây, lịch sử của cây, những cây trồng cùng)

+ Bộ phận cây bị hại

+ Đất đai đất đỏ, đất đồi, đồng bằng, thung lũng… , quản lý (phân bón, thuốc trừ sâu bệnh, vệ sinh đồng ruộng…

2.2.2 Phương pháp thực nghiệm trong phòng thí nghiệm

2.2.2.1 Phương pháp phân lập nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả

ca cao

- Phương pháp phân lập Phytophthora: Sử dụng mồi bẫy Phytophthora (Sử

dụng một số loại quả như: đu đủ, ca cao, táo, lê …thường phải xanh làm mồi bẫy)

từ đất quanh vùng r cây bị bệnh hoặc từ mô cây bệnh (Erwin and Riberrio, 1996)

- Bẫy Phytophthora từ đất quanh vùng r cây bị bệnh

+ Chọn đất ẩm trên bề mặt 5 cm của lớp đất dưới lớp rác lá, trong đó có r cây + Đục những lỗ nhỏ bán kính 2 cm trên vỏ trái ca cao xanh hoặc các trái cây khác + Nhét đất ẩm vào các lỗ vừa đục trên quả dùng làm mỗi bẫy

+ Bọc quả trong túi nilon và đặt trong điều kiện phòng

+ Kiểm tra quả hàng ngày nếu là bệnh do nấm Phytophthora gây ra thì phần

thương tổn màu nâu lan rộng nhưng không thối nhũn

+ Cắt khúc nhỏ ở rìa thương tổn, cho vào đĩa agar đã chuẩn bị sẵn để phân lập

- Bẫy Phytophthora từ mô cây bị bệnh thối đen quả ca cao

+ Chọn mô nằm ranh giới giữa mô bệnh và mô khoẻ

+ Thanh trùng bề mặt bằng ethanol 70% hoặc HgCl2 (1%) khoảng 30 - 60 giây Rửa sạch với nước cất và lau khô bằng giấy đã được khử trùng

+ Cắt khúc nhỏ ở rìa thương tổn, cho vào đĩa agar đã chuẩn bị sẵn để phân lập

2.2.2.2 Phân lập Trichoderma từ đất ở các vùng trồng ca cao

- Phân lập nấm Trichoderma theo phương pháp của Samuels (2004)

Các mẫu r và đất vùng r của ca cao thu thập trên đồng ruộng được rửa sạch qua vòi nước và khử trùng bề mặt bằng cồn 950 trong 30 giây sau đó rửa bằng cồn 750 trong 2 phút, cuối cùng rửa sạch lại 3 lần bằng nước cất khử trùng và cấy vào môi trường TME, CMA và PRBA Mẫu đất được pha loãng và cấy trên môi trường TME và PRBA Các mẫu cấy được ủ ở 250C sau đó được tách thuần trên

môi trường PDA

2.2.2.3 Xác định khả năng đối kháng của nấm Trichoderma sp đối với nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao

Khả năng đối kháng của nấm Trichoderma sp với nấm Phytophthora sp được

đánh giá theo phương pháp của Seiketov (1982), Bradshaw-Smith và cộng sự (1991) + Môi trường thí nghiệm: PDA

+ Phương pháp tiến hành: Cấy đối xứng hai bên

+ Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính ức chế của tản nấm Trichoderma sp đối với

Phytophthora sp

Kẻ một đường ở giữa đĩa petri phần đáy Cấy nấm Trichoderma và nấm

Phytophthora palmivora trên 2 điểm đối xứng nhau trên đường vừa kẻ Ủ ở nhiệt

độ phòng, theo dõi tốc độ sinh trưởng và phát triển của nấm Trichoderma và chủng nấm Phytophthora palmivora

Tìm hiểu khả năng ức chế của nấm Trichoderma sp đối với nấm gây bệnh

bằng chất kháng sinh bay hơi: dựng 2 đĩa có đường kính bằng nhau, trên môi

trường PDA, một đĩa cấy nấm gây bệnh, một đĩa cấy nấm Trichoderma sp., úp 2

đĩa vào nhau và giữ kín hộp đĩa Đối chứng là cặp Petri cấy nấm gây bệnh Theo

Nấm bệnh Phytophthora palmivora Nấm đối kháng

Trichoderma

dõi sự sinh trưởng, phát triển của từng loại nấm và khả năng ức chế nấm gây bệnh

bởi chất kháng sinh bay hơi do nấm Trichoderma sinh ra

2.2.2.4 Phương pháp nghi n cứu m t số đ c điểm h nh thái sinh học v sinh thái của nấm Trichoderma sp

+ Thí nghiệm ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy Trong điều kiện phòng

thí nghiệm, để nuôi cấy nấm Trichoderma có thể sử dụng các môi trường dinh

dưỡng tổng hợp lỏng hoặc rắn (có agar) hoặc các nguồn tự nhiên khác từ thực vật (các hạt ngũ cốc phế thải, kho dầu củ cải đường) Có thể nuôi cấy nấm

Trichoderma bằng phương pháp cấy chìm hoặc cấy trên bề mặt môi trường Các

nghiên cứu của chúng tôi được tiến hành theo phương pháp cấy nấm trên bề mặt môi trường có agar

Nấm Trichoderma sp được cấy trên một số môi trường nuôi cấy thích hợp với

nấm đối kháng như PD , CM , Chapek Sau đó được đặt ở điều kiện nhiệt độ: 250C

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện ánh sáng khác nhau đến sinh trưởng phát triển của nấm đối kháng: thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Seketov (1982) Thí nghiệm bao gồm các công thức: tối liên tục, sáng liên tục, 12 giờ sáng và 12 giờ tối

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của các độ pH môi trường nuôi cấy đến khả năng

phát triển của nấm Trichoderma sp.: các giá trị pH của môi trường nuôi cấy được

Hoạt độ các enzym chitanase, ß-glucanase và cellulase của nấm

Trichoderma được định tính bằng cách đo đường kính vòng phân giải trên môi

trường cảm ứng tổng hợp của từng loại enzym (Vi sinh vật học, Nguy n Đức Lượng, 2004)

Môi trường cảm ứng tổng hợp enzym chitinase và β-glucanase :

2.2.3.4 Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để sản xuất chế phẩm Trichoderma

sp đối kháng với nấm Phytophthora sp tác nhân chính gây bệnh thối quả ca cao

Phương pháp tiến hành: Áp dụng phương pháp nhân sinh khối nấm

Trichoderma của Papavizas và cộng sự (1984) có cải tiến (mỗi công thức làm nhắc

lại 3 lần) Nấm Trichoderma được nuôi cấy trên môi trường PDA 5 - 7 ngày Môi

trường nhân sinh khối được hấp khử trùng trong 45 phút ở 1210

C Cấy nấm

Trichoderma vào môi trường nhân sinh khối đặt ở điều kiện nhiệt độ phòng trong

Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy)

b) Nghiên cứu lượng nước trong môi trường nhân sinh khối nấm Trichoderma sp

Trichoderma tr n môi trường gạo

Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy)

Trichoderma tr n môi trường b t ngô

Công thức thí nghiệm

CT9: 250g ngô + 50ml nước

CT10: 250g ngô + 100ml nước CT11: 250g ngô + 150ml nước CT12: 250g ngô + 200ml nước CT13: 250g ngô + 250ml nước

Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy)

Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng nhân sinh khối của nấm Trichoderma tr n môi trường thóc

Công thức thí nghiệm

CT14: 200g thóc + 100ml nước CT15: 200g thóc + 150ml nước CT16: 200g thóc + 200ml nước CT17: 200g thóc + 250ml nước CT18: 200g thóc + 300ml nước

Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy)

c) Nghiên cứu xác định chế đ cấp khí trong lên men nhân sinh khối

Ảnh hưởng của chế độ đậy nút kín và cấp khí đến khả năng nhân sinh khối

của nấm Trichoderma

Công thức thí nghiệm

CT19: Đối chứng Đậy nút kín không đảo) CT20: Đậy nút kín + đảo trộn 1 ngày/1 lần CT21: Đậy nút kín + đảo trộn 2 ngày/1 lần CT22: Đậy nút kín + đảo trộn 3 ngày/1 lần

Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy)

Ảnh hưởng của chế độ buộc nút hở và cấp khí đến khả năng nhân sinh khối

của nấm Trichoderma

Công thức thí nghiệm

CT23: Buộc nút hở + Đối chứng không đảo

CT24: Buộc nút hở + Đảo trộn cấp khí 1 lần sau 3 ngày

CT25: Buộc nút hở + Đảo trộn cấp khí 2 lần sau 3 ngày và 10 ngày

CT26: Buộc nút hở + Đảo trộn cấp khí 3 lần sau 3 ngày, 8 ngày và 13 ngày

CT27: Buộc nút hở + Đảo trộn cấp khí 4 lần, 3 ngày/ lần

CT28: Buộc nút hở + Đảo trộn cấp khí liên tục, 1 ngày/ lần

Chỉ tiêu theo dõi: Số bào tử/g và ngày xuất hiện bào tử (sau cấy)