Nghiên cứu tuyển chọn và sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng trichoderma phòng trừ tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao

Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA MÔI TRƯỜNG Trần Thị Thúy NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VÀ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ĐƠN DÒNG NẤM ĐỐI KHÁNG TRICHODERMA PHÒNG TRỪ TÁC NHÂN GÂY BỆNH THỐI ĐEN QUẢ CA CAO LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội – 2013 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA MÔI TRƯỜNG Trần Thị Thúy NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VÀ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ĐƠN DÒNG NẤM ĐỐI KHÁNG TRICHODERMA PHÒNG TRỪ TÁC NHÂN GÂY BỆNH THỐI ĐEN QUẢ CA CAO Chuyên ngành: Khoa học Môi trường Mã số: 60440301 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM NGỌC DUNG PGS.TS ĐỒNG KIM LOAN Hà Nội - 2013 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS PHẠM THỊ NGỌC DUNG PGS.TS ĐỒNG KIM LOAN tận tình hướng dẫn, dạy giúp đỡ em suốt trình thực đề tài hoàn thành luận văn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cán phòng thí nghiệm môn Bệnh Trồng, Viện Bảo vệ Thực vật - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Chủ nhiệm thành viên tham gia đề tài “Nghiên cứu tác nhân gây bệnh thối đen ca cao giải pháp khoa học cơng nghệ phòng trừ bệnh”, mã số ĐTĐL.2011G/63 giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em thực đề tài, giúp em hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn thầy, cô Khoa Môi trường trường Đại học Khoa học Tự nhiên tận tình truyền đạt kiến thức suốt năm học vừa qua Với vốn kiến thức mà em tiếp thu trình học tập hành trang quý báu để em hồn thành tốt cơng việc sau Cuối em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân bạn bè, người động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện vật chất tinh thần cho em suốt thời gian học tập làm luận văn EM XIN TRÂN TRỌNG CẢM ƠN Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2013 Học viên TRẦN THỊ THÚY Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Nấm đối kháng Trichoderma spp 1.1.1 Đặc điểm sinh học sinh thái nấm Trichoderma spp 1.1.2 Cơ chế tác động nấm Trichoderma spp lên tác nhân gây bệnh trồng 1.1.3 Khả phòng trừ nấm Trichoderma spp loài nấm gây bệnh trồng 1.1.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất, sử dụng chế phẩm nấm Trichoderma phòng trừ bệnh hại trồng 1.1.5 Một số loại vi sinh vật đối kháng chế phẩm sinh học sử dụng vi sinh vật đối kháng để tiêu diệt nấm bệnh nghiên cứu sử dụng 12 1.2 Nghiên cứu tác nhân gây bệnh thối đen ca cao 14 1.2.1 Tình hình thiệt hại bệnh thối đen ca cao gây nên 14 1.2.2 Đặc điểm sinh học sinh thái nấm Phytophthora palmivora 15 1.2.3 Chu kỳ phát triển bệnh 17 1.2.4 Sự vận chuyển mầm bệnh 17 1.2.5 Nghiên cứu phòng trừ sinh học bệnh thối đen ca cao 18 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 22 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Phương pháp lấy mẫu 22 2.2.2 Phương pháp thực nghiệm phòng thí nghiệm 23 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 29 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Kết phân lập nấm Phytophthora sp gây thối đen ca cao 30 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 3.2 Phân lập nấm Trichoderma sp vùng trồng ca cao tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nơng 31 3.3 Khả đối kháng nấm Trichoderma sp nấm Phytophthora gây thối đen ca cao 33 3.3.1 Khả ký sinh nấm Trichoderma sp 33 3.3.2 Khả sinh kháng sinh bay nấm Trichoderma sp 34 3.4 Nghiên cứu số đặc điểm hình thái, sinh học sinh thái nấm Trichoderma sp 36 3.4.1 Đặc điểm hình thái nấm Trichoderma sp môi trường nhân tạo 36 3.4.2 Đặc điểm sinh thái nấm Trichoderma sp 37 3.5 Nghiên cứu điều kiện tối ưu để sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm Trichoderma sp đối kháng với nấm Phytophthora palmivora gây thối đen ca cao 43 3.5.1 Nghiên cứu thành phần chất môi trường nhân sinh khối nấm Trichoderma sp 44 3.5.2 Nghiên cứu lượng nước môi trường nhân sinh khối nấm Trichoderma sp 45 3.5.3 Nghiên cứu xác định thông số kỹ thuật tối ưu lên men nhân sinh khối nấm Trichoderma (ánh sáng, chế độ cấp khí) 50 3.6 Đánh giá sức sống nấm Trichoderma sp sau bảo quản sản phẩm nhân sinh khối 54 3.7 Sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm Trichoderma sp 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 Kết luận 58 Kiến nghị 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADCI/VOCA Tổ chức hợp tác phát triển nông nghiệp trợ giúp quốc tế a, b, c, d Phân lớp sai khác công thức CMA Môi trường gồm bột ngô (60g), Agar (20g) Cs Cộng CV Độ biến động (%) Czapek Môi trường tổng hợp bao gồm Saccharose (30g), NaNO3 (3g), K2HPO4 (1g), MgSO4 (0,5g), KCl (0,5g), FeSO4 (0,1g), 1000ml nước IRRISTAT Phần mềm thống kê nông nghiệp P Phytophthora PDA Môi trường nuôi cấy gồm khoai tây (200g), đường dextro (20g), Agar (20g), 1000ml nước PTNT Phát triển nông thôn sp Một loài spp Nhiều loài T Trichoderma VSV Vi sinh vật Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Lượng phân bón cho ca cao trồng năm 19 Bảng 3.1 Ảnh hưởng vật liệu bẫy đến khả bẫy nấm Phytophthora gây thối đen ca cao 30 Bảng 3.2 Nguồn Trichoderma thu thập từ tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk Đăk Nông 31 Bảng 3.3 Nguồn Trichoderma có triển vọng thu thập tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk Đăk Nơng 32 Bảng 3.4 Khả ký sinh dòng nấm đối kháng Trichoderma sp nấm Phytophthora palmivora gây thối đen ca cao 33 Bảng 3.5 Khả ức chế nấm Phytophthora palmivora chất kháng sinh bay dòng nấm Trichoderma sp 35 Bảng 3.6 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng tới phát triển nấm Trichoderma sp có triển vọng 38 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ tới sinh trưởng, phát triển nấm Trichoderma sp có triển vọng 39 Bảng 3.8 Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến sinh trưởng phát triển nấm Trichoderma sp có triển vọng 40 Bảng 3.9 Ảnh hưởng pH đến phát triển nấm Trichoderma sp có triển vọng 41 Bảng 3.10 Định tính hoạt độ enzyme nấm đối kháng Trichoderma sp có triển vọng 42 Bảng 3.11 Ảnh hưởng môi trường nhân nuôi đến khả nhân sinh khối nấm Trichoderma sp 44 Bảng 3.12 Ảnh hưởng lượng nước đến khả nhân sinh khối nấm Trichoderma sp môi trường gạo 46 Bảng 3.13 Ảnh hưởng lượng nước đến khả nhân sinh khối nấm Trichoderma sp môi trường bột ngô 48 Bảng 3.14 Ảnh hưởng lượng nước đến khả nhân sinh khối nấm Trichoderma mơi trường thóc 50 Bảng 3.15 Ảnh hưởng chế độ đậy nút kín đảo trộn đến khả nhân sinh khối nấm Trichoderma 51 Bảng 3.16 Ảnh hưởng chế độ buộc nút hở đảo trộn cấp khí đến khả nhân sinh khối nấm Trichoderma sp 52 Bảng 3.17 Ảnh hưởng ánh sáng đến khả nhân sinh khối nấm Trichoderma sp 54 Bảng 3.18 Ảnh hưởng phương pháp bảo quản sản phẩm nhân sinh khối đến sức sống nấm Trichoderma 55 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình thái nấm Trichoderma sp Hình 1.2 Sơ đồ chu trình sống nấm Phytophthoro spp 16 Hình 1.3 Hình thái học Phytophthora palmivora Hàng túi noãn hình cầu với túi đực amphigynous bọc bào tử hình trứng với cuống ngắn 16 Hình 3.1 Đồ thị thể tỷ lệ phân lập nguồn nấm Trichoderma từ đất tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nông 31 Hình 3.2 Nấm Trichoderma sp đối kháng với nấm Phytophthora palmivora 34 Hình 3.3 Hiệu ức chế giống Trichoderma phân lập nấm Phytophthora palmivora 35 Hình 3.4 Các giai đoạn phát triển sau nuôi cấy nấm Trichoderma sp môi trường 37 Hình 3.5 Định tính hoạt độ enzyme nấm đối kháng Trichoderma sp 43 Hình 3.6 Ảnh hưởng mơi trường nhân ni nấm Trichoderma 45 Hình 3.7 Ảnh hưởng lượng nước đến khả nhân sinh khối nấm Trichoderma môi trường gạo 47 Hình 3.8 Ảnh hưởng lượng nước đến khả nhân sinh khối nấm Trichoderma môi trường bột ngô 49 Hình 3.9 Bảo quản chế phẩm Trichoderma túi hút chân khơng 56 Hình 3.10 Bảo quản chế phẩm Trichoderma túi không hút chân không 56 Hình 3.11 Quy trình sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma sp 57 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 MỞ ĐẦU Cây ca cao (Theobroma cocoa L) có nguồn gốc từ lưu vực sông Amazon Nam, Trung Mỹ tầng thấp cánh rừng mưa nhiệt đới Từ 500 năm trước, ca cao trồng rộng rãi nhiều vùng Trung Mỹ, Đông Phi, Tây Phi lan đến nước Đông Nam Á Năm 2002, riêng mức tiêu thụ hạt ca cao giới đạt tỷ USD, nhu cầu tăng thời gian tới tăng nhanh thị trường Châu Á [1, 14, 12] Cây ca cao trồng trồng chương trình giữ gìn sinh thái, tạo cảnh quan cho vùng đất trống, đồi trọc, đem lại hội tốt để cải thiện đời sống, tăng thu nhập cho người nông dân sản xuất nhỏ nghèo Theo Ross Jaaz (trưởng đại diện ADCI /VOCA), 80 % ca cao giới sản xuất từ mảnh đất nhỏ 1ha [12] Bệnh thối đen ca cao (black pod) bệnh phổ biến gây hại nghiêm trọng vùng trồng ca cao giới, ảnh hưởng trực tiếp đến suất chất lượng hạt ca cao, nấm Phytophthora palmivora gây Bệnh gây hại khơng từ giai đoạn non chín, mà hại thân, cành Nấm Phytophthora palmivora gây hại không phận sinh mà có khả tồn đất hạn chế sinh trưởng trồng lại đất trồng ca cao trước bị bệnh Ước tính thiệt hại loại bệnh gây lớn từ 10 % đến 30 % lên đến 90 - 100 %, phụ thuộc vào vị trí địa lý, giống trồng trọt, chủng gây bệnh điều kiện môi trường vùng (Keane, 1992) [49] Ở Việt Nam, ca cao du nhập trồng thử từ năm cuối thập niên 50 kỷ 20 Các khu vực trồng phát triển ca cao Việt Nam bao gồm Tây Nguyên, Nam Trung Bộ, miền Đông Miền Tây Nam Bộ [1, 12] Khi hình thành vùng sản xuất ca cao hàng hố tập trung gặp phải vấn đề nhiều loài dịch hại quan trọng phát triển nhanh gây hại nặng, làm giảm suất, chất lượng ca cao Bệnh thối đen ca cao bệnh gây hại ca cao giới Việt Nam Để phát triển sản xuất ca cao có hiệu quả, Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 bền vững cần phải có biện pháp phòng trừ bệnh hại nghiêm trọng này, có bệnh thối đen ca cao [25, 27] Ở Việt Nam, việc ứng dụng biện pháp sinh học phòng trừ bệnh nấm Phytophthora gây nên nghiên cứu số đối tượng như: hồ tiêu, sầu riêng, cà chua, khoai tây, ca cao chưa đề cập nghiên cứu Vì việc nghiên cứu chế phẩm sinh học có tác dụng tiêu diệt nấm gây bệnh thối đen ca cao quan trọng, vừa có tác dụng nâng cao suất trồng đồng thời bảo vệ mơi trường [7, 17] Trong thực tế dòng nấm đối kháng Trichoderma ứng dụng để tiêu diệt số loại bệnh hại trồng có nhiều chế phẩm sinh học tạo cho hiệu cao Nấm Trichoderma đối kháng với nấm gây bệnh trồng thông qua nhiều chế bao gồm ký sinh, tạo chất kháng sinh enzyme phân hủy vách tế bào nấm bệnh Việc nghiên cứu phân lập lựa chọn chủng nấm Trichoderma có khả đối kháng, tiêu diệt nấm bệnh cao cần thiết , góp phần nâng cao hiệu phòng trừ, an tồn với mơi trường sức khỏe người [13] Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn đó, khn khổ luận văn thực hiện: “Nghiên cứu tuyển chọn sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng Trichoderma phòng trừ tác nhân gây bệnh thối đen ca cao” Nội dung nghiên cứu bao gồm: - Phân lập chủng nấm Trichoderma spp từ đất nấm Phytophthora palmivora từ mẫu bệnh thối đen ca cao lấy số vùng trồng ca cao tỉnh Đăk lăk, Đăk Nơng Bình Phước - Xác định khả đối kháng nấm Trichoderma sp nấm Phytophthora gây bệnh thối đen ca cao - Nghiên cứu số đặc điểm hình thái, sinh học sinh thái nấm Trichoderma sp tuyển chọn - Nghiên cứu điều kiện tối ưu để sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng Trichoderma sp có khả đối kháng nấm Phytophthora sp gây thối đen ca cao Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 Chế độ khí mơi trường nhân sinh khối có ảnh hưởng đến q trình phát triển nấm Trichoderma Thí nghiệm nhân ni nấm Trichoderma trường hợp yếm khí tiến hành cách đậy nút nhựa kín có đảo trộn để tạo độ tơi xốp, kết thể bảng 3.15 Bảng 3.15 Ảnh hưởng chế độ đậy nút kín đảo trộn đến khả nhân sinh khối nấm Trichoderma Chỉ tiêu Nguồn nấm Tr-tv Tr-H Cơng thức thí nghiệm Số bào tử/g Ngày xuất bào tử (sau cấy) CT19 CT20 CT21 33 x 104 a 43 x 104 a 96 x 104 b 5-6 5-6 5-6 CT22 CV (%) CT19 273 x 104 c 12,9 30 x 104 a 5-6 CT20 53 x 104 a 5-6 CT21 106 x 104 b 5-6 CT22 266 x 104 c 5-6 CV (%) 17,0 5-6 (Viện Bảo vệ Thực vật, 2013) Ghi chú: - Các chữ khác a, b, c, d sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 CV: Độ biến động (%) Kết cho thấy nấm Trichoderma sp phát triển điều kiện thiếu khí, tất cơng thức có đảo trộn để tạo độ thơng thống, khơng có cấp khí bên ngồi vào nấm phát triển Mật độ bào tử đạt 105 - 106 bào tử/g Việc đảo liên tục không tốt cho phát triển nấm, đảo trộn ngày/1 lần cho mức bào tử đạt cao (266 x 104 bào tử/g) Q trình sản xuất nhân sinh khối nấm Trichoderma khơng khuyến cáo đậy nút kín 51 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 b Buộc nút hở đảo trộn cấp khí Thí nghiệm cho thấy nấm Trichoderma khơng phát triển thích hợp mơi trường yếm khí, việc cấp khí cho mơi trường lên men nhân sinh khối quan trọng, nhiên để xác định chế độ cấp khí thích hợp tiến hành thí nghiệm buộc nút hở đảo trộn với mức đảo trộn khác mơi trường thóc, kết thể bảng 3.16 Bảng 3.16 Ảnh hưởng chế độ buộc nút hở đảo trộn cấp khí đến khả nhân sinh khối nấm Trichoderma sp Chỉ tiêu theo dõi Nguồn nấm Tr-tv Tr-H Công thức thí nghiệm Số bào tử/g Ngày xuất bào tử (sau cấy) CT23 x 108 a 3–4 CT24 32 x 108 c 3–4 CT25 55 x 108 d 3-4 CT26 35 x 10 c 3–4 CT27 25 x 108 b 3–4 CT28 x 108 a 3-4 CV (%) 11,3 CT23 x 108 a 3–4 CT24 34 x 108 c 3–4 CT25 54 x 108 d 3–4 CT26 37 x 10 c 3-4 CT27 25 x 108 b 3–4 CT28 x 108 a 3–4 CV (%) 7,1 (Viện Bảo vệ Thực vật, 2013) Ghi chú: - Các chữ khác a, b, c, d sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 CV: Độ biến động (%) 52 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 Buộc nút hở mục đích để cấp khí cho mơi trường nhân sinh khối, nhiên phía mơi trường nhân sinh khối phải cấp khí cách lắc đảo trộn mơi trường Khi lắc đảo trộn, tạo độ thơng thống, giúp cho bào tử sợi nấm lan sâu vào môi trường nhân sinh khối Tuy nhiên đảo trộn liên tục ngày/ lần hạn chế phát triển nấm Trichoderma, theo nghiên cứu thời gian hình thành bào tử nấm Trichoderma mơi trường PDA cho thấy phải ngày xuất bào tử môi trường, đảo trộn liên tục cắt đứt sợi, phá vỡ trình hình thành bào tử nấm, bào tử nấm khơng hình thành nhiều hạn chế phát tán mọc lan môi trường Ở công thức Buộc nút hở + Đảo trộn cấp khí lần sau ngày 10 ngày (CT25) cho mật độ bào tử đạt cao (54 x 108 bào tử/g), sau ngày bào tử hình thành bề mặt môi trường nhân sinh khối (mặt môi trường nhân sinh khối có màu xanh), đảo nhẹ tạo độ xốp cho mơi trường giúp cho bào tử nấm phát tán cho tồn mơi trường sinh khối, đến 10 ngày sau đảo lại lần nhằm giúp cho bào tử bám bề mặt thóc, phát triển đến mức tối đa sau 15 ngày nuôi cấy, hồn thiện chu trình nhân ni nấm mơi trường nhân sinh khối 3.5.3.2 Nghiên cứu chế độ ánh sáng ảnh hưởng đến khả phát triển nấm môi trường nhân sinh khối Để xác định chế độ ánh sáng thích hợp cho phát triển nấm Trichoderma, thí nghiệm tiến hành chọn mơi trường nhân sinh khối mơi trường thóc đặt điều kiện ánh sáng khác nhau, theo dõi phát triển nấm môi trường, kết thể bảng 3.17 53 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 Bảng 3.17 Ảnh hưởng ánh sáng đến khả nhân sinh khối nấm Trichoderma sp Nguồn nấm Tr-tv Tr-H Cơng thức thí nghiệm CT29 CT30 CT31 CV (%) CT29 CT30 CT31 CV (%) Chỉ tiêu theo dõi Ngày xuất bào Số bào tử/g tử (sau cấy) 25 x 108 a 3-4 54 x 10 b 3–4 29 x 10 a 3-4 24,2 3-4 27 x 10 a 3-4 58 x 10 b 3-4 31 x 10 a 3-4 18,3 3-4 (Viện Bảo vệ Thực vật, 2013) Ghi chú: - Các chữ khác a, b, c, d sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 CV: Độ biến động (%) Chế độ ánh sáng không ảnh hưởng nhiều đến trình phát triển nấm Trichoderma, điều kiện ánh sáng nấm phát triển tốt Tuy nhiên công thức có sai khác có ý nghĩa xử lý thống kê Công thức 12 sáng + 12 tối (CT30) cho lượng bào tử cao đạt 54 – 58 x 108 bào tử/g, công thức khác cho lượng bào tử thấp từ 25 – 31 x 108 bào tử/g 3.6 Đánh giá sức sống nấm Trichoderma sp sau bảo quản sản phẩm nhân sinh khối Đảm bảo sức sống nấm trình bảo quản chế phẩm quan trọng, giảm sức sống đưa đồng ruộng hạn chế hiệu phòng trừ bệnh Tiến hành bảo quản nấm túi nilon điều kiện hút chân không không hút chân không, đặt 280C, đánh giá sức sống nấm tháng sau bảo quản, kết thể bảng 3.18 54 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 Bảng 3.18 Ảnh hưởng phương pháp bảo quản sản phẩm nhân sinh khối đến sức sống nấm Trichoderma Số khuẩn lạc nấm Trichoderma (CFU/g) TT Thời gian bảo quản (tháng) Bảo quản túi nilon Bảo quản túi hút chân không nilon thường 1 55 x 108 b 54 x 108 c 2 50 x 108 ab 50 x 108 c 3 49 x 108 ab 49 x 108 c 4 51 x 108 ab 42 x 108 bc 5 49 x 108 ab 36 x 108 b 6 46 x 108 a 13 x 108 a CV (%) 9,3 14,0 (Viện Bảo vệ Thực vật, 2013) Ghi chú: - Các chữ khác a, b, c, d sai khác có ý nghĩa với P ≤ 0,05 CV: Độ biến động (%) Sau tháng bảo quản điều kiện 280C, phương pháp bảo quản nấm mọc tốt môi trường Tuy nhiên bảo quản túi nilon hút chân không tốt túi nilon thường, sau tháng bảo quản dạng túi nilon hút chân không mật độ bảo tử không giảm so với sau1tháng bảo quản, khơng có sai khác xử lý thống kê Sau tháng bảo quản túi nilon thường mật độ bào tử giảm đi, có sai khác so với sau 1-3 tháng bảo quản Sau tháng mật độ bào tử có giảm so với sau tháng, nhiên mật độ bào tử lớn 46x108 CFU/g bảo quản túi nilon có hút chân khơng 13x108CFU/g bảo quản túi nilon không hút chân không nên sử dụng bình thường Tuy nhiên để đảm bảo hiệu phòng trừ chế phẩm cần nghiên cứu thêm ảnh hưởng thời gian bảo quản đến mật độ bào tử nấm Trichoderma sp từ đưa hướng dẫn bảo quản sử dụng chế phẩm cụ thể 55 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 Hình 3.9 Bảo quản chế phẩm Hình 3.10 Bảo quản chế phẩm Trichoderma túi hút chân không Trichoderma túi không hút chân không 3.7 Sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm Trichoderma sp Nấm Trichoderma nuôi môi trường PDA dùng làm nguồn để nhân sinh khối Bào tử nấm Trichoderma dùng làm nguồn nhân sinh khối chuyển vào môi trường nhân sinh khối thóc, gạo ngơ Mơi trường nhân sinh khối hấp khử trùng 45 phút 1210C với tỷ lệ nước gạo 250g:150ml tỷ lệ thóc nước 200g:250ml, tỷ lệ ngơ nước 250g:150ml Sau nguồn nấm Trichoderma nuôi cấy điều kiện tốt đậy nút hở đảo trộn lần sau ngày 10 ngày, điều kiện ánh sáng xen kẽ 12 sáng 12 tối nhiệt độ phòng vòng 15 ngày Sau 15 ngày ni cấy, nấm Trichoderma phơi bóng râm khơ Chế phẩm sau đóng gói túi nilon, hút chân không bảo quản nhiệt độ 280C Quy trình sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng Trichoderma nêu cụ thể hình 3.11 56 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 Nấm Trichoderma nuôi cấy giữ nguồn mơi trường PDA Mơi trường nhân sinh khối thóc, gạo ngô cho vào túi nilon bổ sung nước với lượng thích hợp sau hấp khử trùng 45 phút 1210C Bào tử nấm Trichoderma tách khỏi bề mặt PDA cấy vào môi trường nhân sinh khối sau hấp để nguội Lắc nhẹ túi nilon để đảo trộn, đảm bảo bào tử nấm phân bố môi trường nhân sinh khối túi nilon để hở Nấm Trichoderma ni cấy điều kiện nhiệt độ phòng, đảo trộn sau ngày, sau 10 ngày nuôi cấy Thời gian nuôi cấy 15 ngày Chế phẩm phơi bóng râm khơ Chế phẩm đóng gói túi nilon, hút chân không bảo quản điều kiện nhiệt độ 280 C Hình 3.11 Quy trình sản xuất chế phẩm nấm Trichoderma sp 57 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau thời gian nghiên cứu đề tài tuyển chọn dòng Trichoderma (Tr-tv Tr-H) có hoạt độ enzyme Cellulase, Chitinase, β-Glucanase cao, có hiệu đối kháng cao (85,8 - 95,3%) với nấm Phytophthora gây bệnh thối đen ca cao điều kiện phòng thí nghiệm Nấm Trichoderma sp tuyển chọn phát triển thích hợp mơi trường PDA, sau ngày đường kính đạt 8,0 – 8,3 cm, nhiệt độ thích hợp từ 25 - 300C, tốc độ tăng trưởng đạt 2,3 – 2,9 cm/ngày.đêm, mật độ bào tử cao (34 48 x 108 bào tử/ ml) Điều kiện ánh sáng xen tối thuận lợi cho nấm Trichoderma sinh trưởng phát triển, pH thích hợp từ – Trên loại môi trường gạo, thóc, bột ngơ, gạo trộn bột ngơ dòng nấm Trichoderma (Tr-tv Tr-H) phát triển tốt Tùy theo mục đích sử dụng để chọn mơi trường nhân ni thích hợp Điều kiện tối ưu để sản xuất chế phẩm đơn dòng là: Mơi trường gạo với lượng 250g gạo + 150ml nước cho mật độ bào tử cao (40 - 44 x 108 bào tử/g), môi trường bột ngô với lượng 250g bột ngô + 150 ml nước, nấm phát triển tốt cho lượng bào tử cao (18 – 19 x 108 bào tử/g) Trên mơi trường thóc với lượng 200g thóc + 250ml nước, đạt mật độ bào tử cao (54 x 108 bào tử/g) bào tử nấm xuất sau - ngày nuôi cấy Nấm Trichoderma sp phát triển tốt điều kiện sử dụng túi nilon buộc nút hở + Đảo trộn cấp khí lần, sau ngày 10 ngày ánh sáng cần 12 sáng + 12 tối, cho mật độ bào tử đạt cao (54 – 58 x 108 bào tử/g) Chế phẩm nấm Trichoderma sp.được bảo quản điều kiện mát (280C) đóng túi nilon hút chân khơng Việc ứng dụng chế phẩm sinh học vào phòng trừ bệnh hại trồng vừa góp phần nâng cao suất trồng đồng thời bảo vệ môi trường Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu, thử nghiệm đánh giá chế phẩm đồng ruộng để đưa kết luận chắn góp phần giảm thiểu gây hại bệnh thối đen ca cao hoàn thiện hệ thống quản lý bệnh hại tổng hợp cho ca cao 58 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT ACRI, 1997 Ca cao trồng có triển vọng phát triển nơng nghiệp bền vững Việt Nam 38 trang Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn, 1999 Đầu tư dự án phát triển giống ca cao (giai đoạn 1999 - 2000) Số 5685 QĐ/BNN - XDCB Ngày 30/12/1999 Dương Minh, Tô Huỳnh Như, Trần Thị Cẩm Nhụy Nguyễn Hoàng Phúc (2011), “Khảo sát khả tiết Cellulase chủng nấm Trichoderma thu thập đồng sơng Cửu Long”, Trường đại học Cần Thơ, Tạp chí khoa học 2011 (17a), 282-285 Hoàng Thị Hoài (2011), Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ số vi sinh vật đối kháng, phòng trừ nấm gây bệnh trồng Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Nông nghiệp I, ngành bảo vệ thực vật Hồng Châu (2009), Ứng dụng chế phẩm Trichoderma, Trạm khuyến nông Tân Trụ, trang Ngô Vĩnh Viễn, Phạm Ngọc Dung, Nguyễn Thị Ly, Lê Thu Hiền cộng (2007), “Phương pháp phân lập nấm Phytophthora từ đất, rễ phận bị bệnh”, Tuyển tập kết Khoa học Công nghệ nông nghiệp 2006 – 2007, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Nhà xuất Nông nghiệp, p 236 – 249 Nguyễn Hồng Tuyên, Phạm Thị Ngọc Dung cộng (2012 – 2013), Nghiên cứu tác nhân gây bệnh thối đen ca cao giải pháp khoa học công nghệ phòng trừ bệnh, mã số ĐTĐL.2011-G/63 Viện Bảo vệ Thực vật 59 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 Nguyễn Minh Châu (2009), Sử dụng nấm Trichoderma để phòng trừ sâu bệnh cho vườn ăn quả, Viện ăn Miền Nam, nguồn tin thông xã, tr.2 Nguyễn Thị Chắt, Đào Thị Lam Hương (1995), “ Kết số thí nghiệm thực nghiệm nhân giống vơ tính ca cao”, Kỷ yếu kết 10 năm nghiên cứu khoa học (1983 - 1993), Viện Nghiên cứu Cà phê Trang 598 - 610 10 Nguyễn Văn Tuất Lê Văn Thuyết (2001), Sản xuất chế biến sử dụng thuốc bảo vệ thực vật thảo mộc sinh học, Nhà xuất nông nghiệp, 56tr 11 Nguyễn Văn Tuất Lê Văn Thuyết (2001), Sản xuất chế biến sử dụng thuốc bảo vệ thực vật thảo mộc sinh học, Nhà xuất nông nghiệp, 56tr 12 Nguyễn Văn Uyển, 1999 Hướng dẫn kỹ thuật trồng ca cao Nhà Xuất Nơng nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh, 110 trang 13 Nguyễn Văn Uyển, Nguyễn Tài Sum, 1996 Cây ca cao giới triển vọng Việt Nam Nhà xuất nông nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh, 183 trang 14 Nguyễn Văn Viên, Nguyễn Thị Tú, Bùi Văn Công (2012), “Nghiên cứu sản xuất sử dụng chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma viride phòng trừ số bệnh nấm hại vùng rễ Khoai Tây, Lạc, Đậu Tương” , Tạp chí khoa học phát triển, Tập 10, số 1, tr.95 - 102 15 Phạm Hồng Đức Phước (2003) Kỹ thuật trồng ca cao Việt Nam Nhà Xuất Nông nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh, 73 trang 16 Phạm Hồng Đức Phước, 2005 Báo cáo kết khảo nghiệm dòng ca cao nhập nội tỉnh phía Nam, 28 trang 17 Phạm Hồng Đức Phước, Nguyễn Thị Mỹ Nguyệt, 1999 Nhân giống vơ tính cho cacao phương pháp ghép Tập san KHKT Nông Lâm Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Số tháng 9/1999, trang 48 - 50 18 Phạm Ngọc Dung, Hà Viết Cường, Lê Đình Thao, Hà Giang, Trần Thị Như Hoa, Nguyễn Hồng Tuyên, Nguyễn Thúy Hạnh (2012), “Nghiên cứu sử dụng nấm đối kháng Trichoderma asperellum phòng trừ nấm Phytophthora 60 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 spp gây bệnh cao su” Tạp chí bảo vệ thực vật, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, số 12 19 Phạm Ngọc Dung, Hà Viết Cường, Nguyễn Văn Tuất (2009), “Phân tích chuỗi Internal Transcribed Spacer (ITS) nấm Phytophthora tropicalis gây bệnh chết nhanh hồ tiêu Việt Nam ”, Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nông thôn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, số 4, p 17 – 21 20 Phạm Ngọc Dung, Lê Đình Thao, Nguyễn Hồng Tun, Đồn Thị Thanh, Nguyễn Văn Liêm, Nguyễn Thúy Hạnh (2011), “Cải tiến môi trường phân lập nấm Phytophthora spp gây bệnh ca cao”, Tạp chí bảo vệ thực vật, số 21 Phạm Ngọc Dung, Ngô Vĩnh Viễn, Nguyễn Văn Tuất, Nguyễn Thị Ly, Trần Ngọc Khánh, Hồ Gấm, Nguyễn Quang Tuấn (2008), “ Một số kết phòng trừ bệnh chết nhanh gây hại hồ tiêu Đăk Nông”, Tạp chí Bảo vệ thực vật, Bộ Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, ISSN: 0868-2801, số 3, p 17 - 23 22 Trần Kim Loang, Lê Đình Đơn, Tạ Thanh Nam, Ngô Thị Xuân Thịnh, Nguyễn Thị Tiến Sĩ, Trần Thị Xê (2008), “Phòng trừ bệnh nấm Phytophthora hồ tiêu chế phẩm sinh học Trichoderma (TrichoVTN) Tây Nguyên”, Kết nghiên cứu khoa học năm 2008, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Nhà xuất Nông nghiệp, tr 307-315 23 Trần Kim Loang, Vũ Văn Tố, Hà Thị Mão (2001), Điều tra xác định thành phần sâu bệnh hại ca cao tỉnh Đăk Lăk, Kết nghiên cứu khoa học năm 2000 - 2001 Buôn Ma Thuột, trang 144 - 155 24 Trần Thị Thuần, Nguyễn Thị Ly, Phạm Ngọc Dung (2004), “Nghiên cứu sử dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ nhóm nấm tồn đất gây hại trồng”, Tạp chí bảo vệ thực vật 25 Trần Thu Hà, Phạm Thanh Hòa (2012), “Khả đối kháng nấm Trichoderma với nấm bệnh hại trồng Scleroitum rolfsii điều kiện invitro”, Tạp chí khoa học, Đại học Huế, tập 75A, số 6, (2012), tr 49 – 55 26 Trịnh Đức Minh cộng (2000), Kết nhân giống vơ tính ca cao (Theobroma cacao) phương pháp ghép, Báo cáo khoa học Tiểu ban 61 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 Trồng trọt Bảo vệ thực vật Hội đồng Khoa học Công nghệ Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Tháng 9/2000 27 Trịnh Đức Minh, Nguyễn Thị Chắt cộng (1998), “Kết chọn đầu dòng nhân vơ tính ca cao Viện Nghiên cứu Cà phê”, Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Quản lý kinh tế, Nông nghiệp Công nghiệp thực phẩm, số 6, trang 237 - 240 28 Viện Qui hoạch Thiết kế nông nghiệp, 1998 Tổng quan phát triển ca cao Việt Nam TIẾNG ANH 29 Anandaraj M and Sarma Y R (2003), The potential of PGPRS in disease management of spice crops, International PGPR Workshop, Calicut, India 30 Aravind, R., Kumar, A., Eapen, S.J., Ramana, K.V (2009), Endophytic bacterial flora in root and stem tissues of black pepper (Piper nigrum L.) genotype: isolation, identification and evaluation against Phytophthora capsici, Indian Institute of Spices Research, Calicut, Kerala, India, p.1 31 Aryantha, I.P., Cross, R and Guest, D.I (2000), “Suppression of Phytophthora cinnamomi in potting mixes amended with uncomposted and composted animal manures”, Phytopathology, 90: p 775 - 782 32 Bekele F., End M J and Eskes A B.(2003) Proceeding of the international workshop on cocoa Breeding for improved production systems 198 p 33 Broadley, R.H (1992), Protect your avocados, Brisbane, Australia, Queensland Department of Primary Industries 34 Cohen,Y and Coffey, M.D.(1986), “Systemic fungicides and the control of Oomycetes”, Annual Review of Phytopathology, 24, 311 - 338 35 Diby, P and Sarma, Y.R (2006), “Antagonistic effects of metabolites of Pseudomonas fluorescens strains on the different growth phases of Phytophthora capsici, foot rot pathogen of black pepper (Piper nigrum L.)”, Arch Phytopathol Plant Protect., 39, p 113–118 36 Diby, P., Saju, K.A., Jisha, P.J., Sarma, Y.R., Kumar, A and Anandajai, M (2003), “Mycolytic enzymes produced by Pseudomonas fluorescens and 62 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 Trichoderma spp against Phytophthora capsici, the foot rot pathogen of black pepper (Piper nigrum Linn.)”, Soil Biology and Biochemistry 37 Diby, P., Sarma, Y.R., Sinivasan, V and Anandaraj, M (2005b), “Pseudomonas fluorescens mediated vigour in black pepper (Piper nigrum L.) under green house cultivation” Ann Microbiol., 55, p 171–174 38 Drenth, A and Guest, D.I (2004), Diversity and Management of Phytophthora in Southeast Asia, Australian Centre for International Agricultural Research Canberra, 235 pp 39 Drenth, A and Sendall, B (2004), “Isolation of Phytophthora from infected Plant Tisue and soil, and Principles of Species Identification” In “Diversity and Management of Phytophthora in Southeast Asia”, Australian Centre for International Agricultural Research Canberra, pp 94 – 102 40 Duncan, J., and Cooke, D (2002) Identifying, diagnosing and detecting Phytophthora by molecular methods Mycologist, Vol.16, Part 2: 59-66 41 Dutta, P and Das, B.C (1999), “Control of Rhizoctonia solani in soybean ( Glycine max) by farmyard manure culture of Trichoderma harzianum” Indian Journal of Agricultural Sciences, p.596-598 42 Ebon, A.H., Lu, A.T.T and Tiong, R.H.C (1978), Early growth result of cocoa on some Sarawak soil Proc Int Conf Cocoa Coconuts, Kuala Lumpur, pp: 224 – 242 43 Erwin, D.C and Riberrio O.K (1996), “Phytophthora diseases worldwide”, St Paul, Minnessota, USA, American Phytopathological Society Press, 562 pp 44 Freeman, G.H (1964), Present nursery and establishment methods for cocoa in Western Nigeria Ann Rep W Afr Cocoa Res Inst (Nigeria), pp 13 -14 45 Fulton, R.H (1989), The cacao disease trilogy: black pod, Monilia pod rot and witch broom Plant Dis, 73: 601 – 603 46 Galindo, J.J (1992), “Prospects for biological control of cacao”, In: Cocoa pest and disease management in Southeast Asia and Australasia, Rome, FAO Plant Production and Protection, p 112 47 Guest, D.I., Pegg, K.G.and Whiley, A.W.(1995), “Control of Phytophthora 63 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 diseases of tree crops using trunk-injected phosphonates”, Horticultural Reviews, 17, p 299 - 330 48 Jackson, G.V.H and Newhook, F.J (1978), Sources of Phytophthora palmivora inoculum in Solomon Island cocoa plantations Trans.Br.Mycol.Soc 71: 239 – 249 49 Jollès Muzzarelli (1999), Chitin and chitinases, Basel, Boston, Berlin, Birkhauser Switzerland, p.38 - 68 50 Keane, P.J (1992), Disease of pest and cocoa: an overview In: Keane, P.J and Putter, C.A., ed., Cocoa pest and disease management in Southeast Asia and Australia, Rome, Italya, Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO Plant Production and Protection Paper No.112 51 Konam, J.K and Guest, D.I (2004), “Role of Flying beetles (Coleoptera: Scolytidae and Nitidulae) in the spread of Phytophthora pod rot of cocoa in Papua New Guinea”, Australasian Plant Pathology, in press 52 Kyung Seok Park, et al (2007), “Induced systemic Resistance by Bacillus vallismortis EXTN-1 suppressed bacterial wilt in tomato caused by Ralstonia solanacearum”, Plant Pathology, J.23 (1), 2007 53 Lee, B.S and Lum, K.Y (2004), Phytophthora Diseases in Malaysia, Malaysian Agricultural Research and Development Institute, GPO Box 12301, 50774 Kuala Lumpur, Malaysia 54 Lutz, A., Menge, L.A and Bender,G (1989), “Phytophthora root rot in citrus: can it be controlled by manipulation of irrigation practices”, California Grower, 13, p - 10 55 Medeiros, A.G (1976), Sporulation of Phytophthora palmivora (Butl.) Butl In relation to epidemiology and chemical control of black pod disease PhD thesis, University of California, Riverside, California, USA Cited in Pereira 56 Morris, P.F and Gow, N.A.R (1993), “Mechanism of electrotaxis of zoospore of phytopathogenic fungi”, Phytopathology, 83, p 877-882 57 Pokou, N.D., N’Goran, J.A.K., Kebe, I., Eskes, A., Tahi, M and Sangare, A (2008), Levels of resistance to Phytophthora pod rot in cocoa accessions 64 Luận văn Thạc sỹ Trần Thị Thúy – KHMTK19 selected on-farm in Côte d’Ivoire Centre National de Recherche Agronomique (CNRA), 01 BP 1740 Abidjan 01, Côte-d’Ivoire, 27 :302 – 309 58 Purwantara, A (1987), Penyebab penyakit Phytophthora pada tanaman kakao di Jawa In: Proceedings of the Indonesia Plant Pathology Society Conference 1987, Surabaya, 283 – 290 59 Purwantara, A (2003), Eoidemiology and control of Phytophthora diseases of cocoa in Java, Indonesia Paper presented at International Congress of Plant Pathology, at Christchurch, New Zealand Paper number 28.1 60 Tan, K.S.R (2000), “Effect of fertiliser on the susceptibility of durian and papaya towards Phytophthora palmivora” BSc (Honours) thesis, School of Botany 61 Tran Ha, Ficke, A., Asiimwe, T., Hoăfte, M and Raaijmakers, J.M (2007), “Role of cyclic lipopeptide massetolide A in biological control of Phytophthora infestans and in colonization of tomato plants by Pseudomonas fluoresens”, New Phytol., 175, p 731–742 65 ... thực hiện: Nghiên cứu tuyển chọn sản xuất chế phẩm đơn dòng nấm đối kháng Trichoderma phòng trừ tác nhân gây bệnh thối đen ca cao Nội dung nghiên cứu bao gồm: - Phân lập chủng nấm Trichoderma. .. NHIÊN KHOA MÔI TRƯỜNG Trần Thị Thúy NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VÀ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ĐƠN DÒNG NẤM ĐỐI KHÁNG TRICHODERMA PHÒNG TRỪ TÁC NHÂN GÂY BỆNH THỐI ĐEN QUẢ CA CAO Chuyên ngành: Khoa học Môi trường... khả phòng trừ bệnh thối đen cao cao 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu khả đối kháng nấm Trichoderma phân lập hình thái, điều kiện phân lập tuyển chọn nấm Phytophthora gây bệnh thối đen ca cao