Xác định mồi bẫy thích hợp và xác định môi trường chọn lọc thích hợp trong phân lập tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ NÔNG NGIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VIỆN BẢO VỆ THỰC VẬT Chuyên đề Xác định mồi bẫy thích hợp xác định môi trường chọn lọc thích hợp phân lập tác nhân gây bệnh thối đen ca cao Thuộc: Đề tài độc lập cấp Nhà nước Mã số: ĐTĐL.2011- G/63 Chủ trì đề tài: ThS Nguyễn Hồng Tuyên Hà nội, 2012 Đặt vấn đề 1.1 Tính cấp thiết chuyên đề Việt nam đất nước với hai vùng khí hậu khác biệt, vùng khí hậu cận nhiệt đới thuộc phía Bắc đèo Hải Vân với mùa khác rõ rệt, vùng khí hậu nhiệt đới phía Nam có mùa mùa mưa mùa khô Những rặng núi Miền Trung Miền Bắc Việt nam làm tăng thêm đa dạng vùng khí hậu cho phép nhiều loài trồng khác phát triển toàn quốc Vùng khí hậu cận nhiệt đới phía Bắc tiếp giáp với dãy núi cho phép tăng trưởng phát triển trồng nhiệt đới ôn đới vùng lân cận Các vùng khác Việt Nam đem lại khí hậu thích hợp cho sinh trưởng phát triển loài Phytophthora, nấm Phytophthora nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế lớn cho nhiều loại trồng khác toàn quốc Bệnh Phytophthora báo cáo nguyên nhân gây bệnh cháy lá, sùi thân, thối nõn, thối thối rễ nhiều loại trồng ăn quả, rau, lấy gỗ trồng nông nghiệp khác, gây giảm lớn suất thiệt hại kinh tế đáng kể Bệnh sương mai cà chua khoai tây nấm Phytophthora infestans gây bệnh trồng vùng đồng sông Hồng Tất giống cà chua bị nhiễm bệnh dẫn đến giảm 30% - 70% suất Các nhà khoa học Việt Nam gặp nhiều khó khăn phân lập bệnh nấm Phytophthora gây nên Phytophthora dễ bị cạnh tranh nhiều loại nấm khác mô bệnh đặc điểm môi trường nhân tạo nấm Phytophthora mọc chậm so với loại nấm khác, mà hoá chất sử dụng cho môi trường chọn lọc khó tìm để mua Việc nghiên cứu sử dụng mồi bẫy môi trường thông dụng có cho thêm chất kháng sinh, số thuốc diệt nấm khác cạnh tranh môi trường phân lập làm tăng khả phân lập nấm Phytophthora Tuy nhiên loài nấm Phytophthora có đặc điểm riêng nên loài có phương pháp phân lập khác Việc phân lập thành công tạo nguồn gen để nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái nghiên cứu khác nấm Phytophthora từ làm sở cho nghiên cứu biện pháp phòng trừ bệnh có hiệu Vì vậy, xin thực chuyên đề: “Xác định mồi bẫy thích hợp xác định môi trường chọn lọc thích hợp phân lập tác nhân gây bệnh thối đen ca cao” 1.2 Tổng quan tài liệu trong, nước 1.2.1 Hoá chất chọn lọc dùng môi trường phân lập Một nguyên lý phân lập chọn lọc sử dụng nhiều hoá chất môi trường để ngăn cản phát triển nấm vi khuẩn tạp nhiễm không ảnh hưởng tới phát triển nấm Phytophthora Trước năm 1960, loại hoá chất chọn lọc khác dùng môi trường phân lập có để lựa chọn Axít hoá môi trường PDA có độ pH với 25% axit lactic (khoảng giọt đĩa môi trường) để diệt phát triển vi khuẩn phương pháp thích hợp cho phân lập nhiều loại nấm thường hiệu để phân lập chọn lọc hầu hết loại nấm Phytophthora, nảy mầm bào tử thường giá trị pH thấp Môi trường kháng sinh chọn lọc môi trường nước agar (WA) môi trường sử dụng có hiệu để hạn chế phát triển vi khuẩn Sử dụng tế bào Van Tiegham, tế bào buộc sợi nấm Phytophthora mọc bề mặt agar, hướng tới giải phóng sợi nấm khỏi vi khuẩn vi khuẩn phát triển nhanh chìm ngập sâu Trước năm 1960, phương pháp phân lập nấm Phytophthora sử dụng vật liệu bẫy (Các mô dễ nhiễm bệnh) để bẫy nấm từ mô bệnh từ đất môi trường nước agar (WA) môi trường agar yếu hạn chế Những sáng kiến đem lại Eckert, J.W thực thử nghiệm liên tục hợp nhiều loại hoá chất chống lại nhiều vài loại nấm khác Ông ghi nhận môi trường cho kháng sinh có loài Phytophthora Pythium mọc tốt, ngược lại vài loại nấm đất khác không mọc 1.2.1.1 Pimaricin Việc khám phá kháng sinh đặc hiệu kháng nhiều loại nấm khác như: pimaricin, nystatin làm thay đổi phương pháp phân lập nấm Phytophthora khuyến khích nghiên cứu toàn giới môi trường chọn lọc để phân lập nấm Phytophthora loại bỏ phát triển vi khuẩn loại nấm khác Môi trường Eckert Tsao sử dụng môi trường nghèo dinh dưỡng như: bột ngô agar (cornmeal agar) kết hợp với pimaricin (chất kháng nấm ) lượng (100µg/ ml) penicillin lượng (50µg/ml) để ngăn cản phát triển vi khuẩn gram dương polymyxin lượng (50µg/ml) để ngăn cản phát triển vi khuẩn gram âm Thông thường gọi môi trường 3P phân lập mô bệnh nhiễm, không phân lập nấm từ đất mô bệnh cũ Còn có vài tài liệu cho môi trường 3P môi trường chọn lọc với lượng pimaricin (100µg/ ml) ức chế nảy mầm bào tử Haas, 1964 phát sử dụng môi trường với liều lượng pimaricin thấp (2µg/ ml) phân lập nấm P sojae (P megasperma var sojae) từ đất Tiếp theo báo cáo Tsao, 1983 pimaricin 10 µg/ ml cho phép bào tử vài loại nấm Phytophthora từ mẫu đất nảy mầm, ngược lại dùng với lượng pimaricin cao 100 µg/ml ngăn cản bào tử nảy mầm Theo Larkin et al., 1995 tỷ lệ nảy mầm hậu bào tử nấm P parasitica bào tử nang P palmivora môi trường bột ngô agar kết hợp với pimaricin với liều lượng 1,5 ; 3; 12 µg/ml cao môi trường bột ngô agar không kết hợp với pimaricin Ở liều lượng 25 , 50 600 µg/ml giảm tỷ lệ nảy mầm 20 – 30% so với đối chứng Trong điều kiện mô bệnh mới, liều lượng pimaricin lớn 10µg/ ml sợi nấm không bị ức chế phát triển Các mô bệnh cũ nguồn từ đất, nguồn chủ yếu tồn dạng bào tử nang, bào tử hậu, du động bào tử, liều lượng pimaricin dùng để phân lập phải thấp 10 µg/ml Nhiều báo cáo cho liều lượng µg/ml hiệu 10 µg/ml 1.2.1.2 Nystatin Mặc dù pimaricin kháng sinh chọn lọc, nystatin kháng sinh đặc hiệu, có hoạt động tương tự pimaricin hiệu có phạm vi hoạt động hẹp (Tsao, 1983) Nystatin sử dụng thay pimaricin vài môi trường, đặc biệt vài khu vực giới nơi mà pimaricin sẵn Cả hai loại kháng sinh pimaricin nystatin không hoạt động ánh sáng đĩa môi trường phải đặt điều kiện tối (Ploetz and Parrado, 1988) 1.2.1.3 PCNB (100 µg/ ml) PCNB thuốc trừ nấm đất với độ tan nước thấp, kết hợp với môi trường Tsao (Tsao Ocana, 1969) thuốc diệt nhiều loại nấm không diệt Phytophthora Pythium Đặc biệt PCNB dùng để sử lý hạt chống lại Rhizoctonia môi trường chọn lọc để phân lập nấm Fusarium (Kerr, 1963) PCNB khử phát triển nhiều loại nấm không diệt Phytophthora Pythium Ví dụ PCNB có hiệu cao phân lập nấm P parasitica var nicotianae P cinnamomi từ đất (Jeffers Martin, 1986) 1.2.1.4 Benomyl thuốc trừ nấm (Tên thương phẩm Benlat) có khả thấm sâu di chuyển lên cây, thường sử dụng thay bổ sung cho pimaricin, liều lượng 10 - 25 µg/ml (Follin, 1971; Schmitthenner, 1973; Papavizas et al., 1981; George Miholland, 1986b) Nó khử nhiều loại nấm đất (nhưng không diệt Phytophthora) Nó có phổ hẹp so với pimaricin Ở liều lượng benomyl 10µg/ml bị ảnh hưởng nhẹ đến phát triển nấm P fragariae bị ức chế mạnh liều lượng 100 µg/ml Môi trường nước V8 kết hợp với benomyl phân lập nấm P cactorum nhờ ngăn cản vi sinh vật khác (Harris Bielenin, 1986) Benomyl thuốc trừ nấm chọn lọc có khả diệt nhiều loại nấm không diệt loại nấm thuộc zygomycetes (Ví dụ như: Mortierella, Mucor, Rhizopus) loại họ Porosporae thuộc nấm bất toàn như: Alternaria, Bipolaris, Drechslera, Stemphylium số loại khác (Bollen Fuchs, 1970; Edgington et al., 1971) Nó không kháng khuẩn Benomyl hòa tan nước, có thuận lợi không bị phân huỷ hoạt tính điều kiện nhiệt độ cao, cho vào môi trường để hấp dạng bột thấm nước dung dịch bột thấm nước(Masago et al., 1977) 1.2.1.5 Iprodione thuốc trừ nấm – ergosterol (C28H440), liều lượng 100 400 µg/ml có khả ức chế phát triển nấm Pythium proliferum, nấm không nhạy cảm với chất hymexazol, thuốc trừ nấm tương đối độc với loài Pythium độc với loài Phytophthora Ví dụ: môi trường P10VPH P10 ARPH (H hymexazol liều lượng 50 µg/ml , R rifampicin liều lượng 10 µg/ml A ampicillin liều lượng 250 µg/ml) cộng với iprodione làm tăng tỷ lệ phân lập nấm P cinnamomi từ bơ bị bệnh (Solel Pinká, 1984) Tuy nhiên ipodione sử dụng không hiệu để phân lập số loại nấm Phytophthora khác 1.2.1.6 Vancomycin môi trường chọn lọc (P 10VP) Tsao Ocana, 1969 thay cho polymyxin penicillin phổ hoạt động rộng chống lại hai loại vi khuẩn nhuộm gram dương gram âm Môi trường khử trùng làm nguội nhiệt độ 45 – 480C trước hoà lẫn hoá chất vào đổ đĩa sạch, nhiều loại kháng sinh bị hỏng hấp nhiệt độ 1210C 1.2.1.7 Axít Gallic (425µg/ml) làm giảm kích thước khuẩn lạc nấm không thuộc Pythiaceous mọc nhanh môi trường sử dụng để phân lập Phytophthora (Flowers Hendrix, 1969) Axít Gallic không ức chế nảy mầm du động bào tử nấm P fragariae (George Milholland, 1986b) Tuy nhiên axit Gallic không sử dụng rộng rãi lâu dài (Tsao, 1983) mà thị trường có sẵn P10VP (Tsao Ocana, 1969) P10 ARP (Kannwischer and Mitchell, 1978) 1.2.1.8 Một số chất kháng sinh (ampicillin, penicillin, rifampicin) Sự lựa chọn kháng sinh thích hợp liều lượng dùng quan trọng phân lập có chọn lọc Tsao, 1983 đưa hầu hết kháng sinh kháng khuẩn phù hợp cho phân lập loài Phytophthora như: ampicillin, penicillin, rifampicin (hoạt động khống chế vi khuẩn gram âm) vancomycin (hoạt động diệt vi khuẩn gram dương gram âm) Theo báo cáo Masago et al., 1977 sử dụng rifampicin (10 µg/ml) kết hợp ampicillin (500 µg/ml) Kannwischer Mitchell (1978) thay vancomycin môi trường Tsao Ocana (1969) rifampicin (10µg/ml) ampicillin (250µg/ml) cho phân lập nấm P parasitica var nicotianae từ đất Jeffers Martin, 1986; Pittis Colhoun, 1984 trích dẫn rifampicin ampicillin hẳn vancomycin Việc có nên không nên thay vancomycin rifampicin ampicillin tốt để phân lập tất Phytophthora từ đất câu hỏi có nhiều tranh cãi Trong vài nguồn từ đất vancomycin có hiệu (P.H Tsao, unpublished) Rifampicin ampicillin giá rẻ vancomycin (Jeffers Martin, 1986) Nghiên cứu tổng hợp Jeffers Martin, 1986 ảnh hưởng môi trường bột ngô agar bổ sung với kháng sinh khác cho phân lập phát triển vài loài nấm Phytophthora từ nguồn đất đồng ruộng giảm liều lượng pimaricin từ 10 xuống µg/ml, cộng với hymexazol 50µg/ml thay vancomycin ampicillin (250µg/ml ) rifampicin (10µg/ml) tăng số lượng đơn vị khuẩn lạc (cfu) P cinnamomi lần P parasitica var.nicotianae 2,9 lần Sự kết hợp ampicillin rifampicin thay cho vancomycin (200µg/ml) giảm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn tạp nhiễm từ 43 xuống phân lập nguồn bệnh từ đất vườn Rifampicin (10µg/ml) giảm khoảng nửa nảy mầm du động bào tử phát triển ống mầm nấm Phytophthora, hợp chất ngăn cản hoàn toàn tạp nhiễm vi khuẩn (George Milholland, 1986b) Phân lập nấm P infestans từ mô bệnh, đặc biệt mô bệnh cũ luôn gặp khó khăn Hohl (1991a) báo cáo phân lập nấm P infestans từ mô bệnh môi trường lúa mạch đen (pH 5.5) chứa griseofulvin (20 µg/ml), nystatin (19 µg/ml), benlate (10µg/ml), methoxypurine (5µg/ml), penicillin G (48µg/ml), nalidixic acid (5µg/ml), neomycine (30µg/ml) 8-azoguanine (40 µg/ml) (Hohl 1991a) Môi trường nuôi cấy cho phép tỷ lệ mọc isolate nấm P.infestans 42 -56% (So sánh với môi trường lúa mạch đen kháng sinh) không mọc Mucor mucedo, Trichoderma viridans, Trichoderma alba, Fusarium spp, Acremonium, Byssochlamys nivea loài Pythium Drenth et al (1995) sử dụng môi trường lúa mạch đen chứa ampicillin (200 µg/ml), fenpliclonil (10µg/ml), pimaricin (10 µg/ml) rifampicin (30 µg/ml) 1.2.1.9 Rose bengal (60µg/ml) sử dụng môi trường phân lập để hạn chế phát triển vi khuẩn (Hendrix Kuhlman, 1965) Mặc dù hỗn hợp chất kháng khuẩn, gây độc cho nảy mầm bào tử nấm Phytophthora Rose bengal đặc biệt ức chế nảy mầm bào tử nấm Phytophthora sử dụng kết hợp với streptomycin Theo Papavizas et al (1981) độ độc rose bengal lớn sử dụng kết hợp với benomyl hymexazol Rose bengal có lợi sử dụng so với chất kháng sinh có sẵn như: ampicillin, rifampicin vancomycin (Donald C.Erwin Olaf K.Ribeiro, 1996) Mặc dù chất kháng sinh streptomycin, chlortetracycline, oxytetracycline, tetracycline, neomycin chloramphenicol thông thường sử dụng nhiều môi trường chọn lọc để phân lập nhiều loại nấm, chúng lại thường kìm hãm phát triển nhiều loại nấm Phytophthora nhiều so với loại nấm thích hợp đề cập (Dhingra Sinclair, 1985) 1.2.1.10 Streptomycin kháng sinh phổ rộng kìm hãm phát triển vi khuẩn nhuộm gram âm gram dương, gây độc hầu hết loại nấm Phytophthora (Tsao, 1983), không lựa chọn tốt cho môi trường chọn lọc Streptomycin kìm hãm phát triển nấm P trophthora P heveae kìm hãm chút nấm P capsici, P cinnamomi P parasitica (Eckert Tsao, 1962) Streptomycin kìm hãm hoàn toàn phát triển nấm P infestans (Ersek, 1975) vài loài nấm Phytophthora khác (Cohen Perl, 1973) Streptomycin liều lượng 10 – 50 µg/ml môi trường dung dịch hạt lúa mì, hoàn toàn ức chế phát triển nấm P infestans, nhiên môi trường để sau ngày sử dụng, mọc giảm nửa Khi streptomycin cộng vào để lây nhiễm bào tử nang du động bào tử, ngăn cản hình thành vết bệnh khoai tây không tác động sau xuất nhiễm bệnh Streptomycin sử dụng với thận trọng môi trường phân lập (Cohen Perl, 1973) Sợi nấm Phytophthora nhiều thành viên khác Oomycetes bắt giữ streptomycin nhanh loại nấm khác Sự hấp thu lớn - lần loài nấm Phytophthora Pythium thành viên Mucorales, Cuninghamella echinulata Điều kết hoạt động hấp thu vách tế bào không kitin Phytophthora (Voros, 1965) 1.2.1.11 Chloramphenicol Mặc dù Chloramphenicol báo cáo có hiệu số môi trường, gây độc cho phát triển sợi nhiều loài nấm Phytophthora (Tsao, 1983) Vì vậy, không lựa chọn thích hợp cho môi trường chọn lọc Chloramphenicol liều lượng 1µg/ml môi trường nhân tạo làm giảm phát triển 28 isolate nấm P cinnamomi 11 – 75% so với đối chứng chloramphenicol Sự phát triển tia isolate bị ức chế hoàn toàn liều lượng 25 µg/ml bị ức chế 70 – 80% µg/ml (Leary et al 1982) Tuy nhiên, số báo cáo lại cho thấy chloramphenical 10 µg/ml (Shew Benson, 1982) 30 µg/ml (Sneh Katz, 1988) có chức môi trường chọn lọc có hiệu Hollomon (1965) sử dụng chloroamphenicol (50 µg/ml ) để phân lập nấm P infestans từ khoai tây Rahimian Mitchell (1988) sử dụng chloramphenicol để phân lập P cactorum từ đất Theo báo cáo Ersek (1975), chloramphenicol 100, 200 400 µg/ml làm tăng độc tính phát triển sợi nấm không độc với nảy mầm bào tử nang du động bào tử nấm P infestans hai môi trường lát mỏng khoai tây 1.2.1.12 Hymexazol ức chế phát triển nhiều loài nấm Pythium, loài nấm tồn đất vùng xung quanh rễ hầu hết Chúng thường hạn chế nảy mầm gây chết con, vài trường hợp gây chết trưởng thành Hợp chất kháng nấm pimaricin benomyl sử dụng môi trường phân lập nấm Phytophthora khả ức chế nấm Pythium, nấm Pythium trở ngại lớn trình phân lập Phytophthora khả mọc chúng môi trường nhanh loài Phytophthora Kết quả, khuẩn lạc Phytophthora bị mọc chùm lên mờ Pythium Năm 1977, thuốc trừ nấm hymexazol thương mại hoá Tachigaren, xác định có nhiều độc tính nhiều loài Pythium vài loài Phytophthora (Masago et al.1977) Mặc dù hymexazol hoá chất chọn lọc có hiệu cho phân lập số loài Phytophthora, có độc tính cao với số loài Phytophthora định ngược lại không kìm hãm tất loài Pythium Ví dụ, hymexazol không ức chế phát triển nấm Pythium proliferum (Solel Pinkas, 1984) Pythium vexans (Tsao Guy, 1977) Chỉ có 12 loại Pythium phân lập từ đất rừng bị kìm hãm hymexazol (E.M.Hansen et al., 1979) E.M.Hansen et al., 1979 tiếp tục nghiên cứu sử dụng hymexazol để phân lập từ đất rừng, kết cho thấy kìm hãm phát triển nấm Phytophthora lateralis Phytophthora cactorum số nấm khác Phytophthora Hymexazol kìm hãm mạnh phát triển nấm P infestans, P phaseoli, P porri, P syringae, làm chậm phát triển nấm P hibernalis P lateralis, nhẹ mọc P fragariae P ilicis kìm hãm không nhiều nấm P cactorum P pseudotsugae (Ho, 1987) 1.2.2 Một số môi trường đặc hiệu để phân lập nấm Phytophthora 1.2.2.1 Môi trường 3-P Medium Môi trường Agar bột ngô (17g/lít) hấp 121 0C để nguội khoảng 450C bổ sung với pimaricin (100ppm), penicillin (50ppm) polymyxin (50 ppm) Đĩa bảo quản lạnh điều kiện tối pimaricin nhậy cảm với ánh sáng Đây môi trường chọn lọc sử dụng pimaricin kháng nấm có hiệu phân lập mô bệnh chứa loài Phytophthora tồn dạng sợi nấm, không từ mẫu đất bệnh chứa nấm Phytophthora tồn dạng bào tử Sử dụng pimaricin (100ppm) liều lượng cao ức chế bào tử nảy mầm (Tsao, 1983) 1.2.2.2 Môi trường P10VP (Tsao Ocana, 1969) Môi trường Agar bột ngô (17g/lít) hấp 121 0C để nguội khoảng 450C bổ sung với liều lượng thấp pimaricin (10ppm), vancomycin (200ppm) pentacholoronitrobenzene (100ppm) đĩa giữ tối Pimaricin nhậy cảm với ánh sáng Môi trường có hiệu phân lập mô bệnh từ đất mô giảm liều lượng pimaricin không ức chế nảy mầm bào tử Hymexazol (25-50mg/lit) cho vào sau hấp để diệt vài loài Pythium (Masago et al.,1977; Tsao Guy, 1977) 1.2.2.3 Môi trường sử dụng Hymexazol để phân lập Phytophthora loại bỏ Pythium (Masago et al.,1977) Môi trường PDA (1%agar) cộng thêm benomyl (10ppm), pentachloronitrobenzene (25ppm), nystatin (25ppm), ampicillin (500ppm), rifampicin (10ppm), hymexazol (25-50 ppm) Hymexazol khử nhiều loài tất loài Pythium Nhiều loài Pythium có khả kháng, vài loài nhậy cảm phân lập môt trường chứa hymexazol Môi trường bột ngô V8 tốt môi trường PDA 1.2.2.4 Môi trường P10ARP (Kannwischer Mitchell, 1978) P5ARP (Papavizas et al., 1981; Jeffers Martin, 1986) Môi trường bột ngô sau hấp khử trùng để nhiệt độ hạ xuống 45 0C cộng thêm với pimaricin (10ppm), ampicillin (250ppm), rifampicin (10ppm) pentachloronitrobenzene (100ppm) Jeffers Martin (1986) sử đổi Môi trường P10ARP giảm pimaricin từ 10 ppm xuống ppm để phân lập P cactorum (P5ARP) Thêm rifampicin để khử vi khuẩn gram dương môi trường chọn lọc P10ARP P5ARP để phân lập hầu hết loài Phytophthora Hymexazol cộng 25 – 50 ppm sau hấp khử trùng để khử vài loài Pythium (Masago et al.,1977; Tsao Guy, 1977) mà không ảnh hưởng đến loài Phytophthora mục tiêu 1.2.2.5 Môi trường sử dụng Benomyl (Sneh Katz, 1988) Benomyl diệt nhiều loại nấm (Sneh, 1972a; McIntosh, 1975) Bổ sung thành môi trường chọn lọc tổng hợp gồm: benomyl (25ppm), pentachloronitrobenzene (30ppm), penicillin (60ppm), chloramphenicol (30ppm), penicillin (60ppm), polymyxin (50ppm) hymexazol (25ppm) để phân lập P nicotianae P citrophthora từ đất có múi Chloramphenicol polymyxin không kháng sinh thích hợp George Milholland (1986b), bổ sung vào môi trường đậu hà lan gồm benomyl (10ppm), pimaricin (10ppm), rifampicin (10ppm) hymexazol (50ppm) để phân lập P fragariae từ mô Papavizas et al (1981), bổ sung vào môi trường bột ngô (Chuẩn pH 4.0) gồm benomyl (25ppm), pimaricin (5ppm), vancomycin (200ppm), penicillin (100ppm), pentachloronitrobenzene (100ppm) hymexazol (20ppm) để phân lập P capsici từ đất 1.2.2.6 Môi trường sử dụng Chloramphenicol PBNC (Rahimian Mitchell, 1988), môi trường nước V8 yếu (40ml/lít) đệm với CaCO3 (0,6g/lít) bổ sung với yeast extract (0,2 g/lít), Sucrose (1,0 g/lít), cholesterol (0,01 ml) N, N-dimethylformamide agar (20g/lít) cộng thêm benlate (50% benomyl) (20µg/ml), pentachloronitrobenzene (27µg/ml), neomycin sulfate (100µg/ml) chloramphenicol (10µg/ml) dùng để phân lập vài loài Phytophthora Chloramphenicol neomycin độc với số loài Phytophthora, có hiệu để phân lập hầu hết loài Phytophthora Môi trường PCH (Shew Benson, 1982), môi trường tổng hợp gồm (g/lít) KH2PO4 (1,0g/lít), MgSO4 7H2O (0,5g/lít), KCl (0,5g/lít), CaCl2 H2O (0,01g/lít), FeSO4 H2O (0,02g/lít), thiamine-HCl (0,001g/lít), yeast extract (0,3g/lít), NaNO3 (1,0g/lít), glucose (15,0g/lít), pentachloronitrobenzene (35,0g/lít), chloramphenicol (0,01 ml ethanol) hymexazol (50,0g/lít), sử dụng để phân lập P cinnamomi 1.2.3 Một số phương pháp phân lập sử dụng mồi bẫy nấm Phytophthora sử dụng loại mồi bẫy khác nhau: ký chủ, vỏ quả… Hầu hết loài Phytophthora thường khó phân lập từ mô bị thối rữa từ đất, phương pháp bẫy sử dụng gần nửa kỷ để hỗ trợ cho việc phân lập Về nguyên tắc phương pháp bẫy lợi dụng tính gây bệnh chọn lọc loài Phytophthora mô ký chủ sống, ký chủ coi môi trường chọn lọc, vết bệnh nấm Phytophthora gây phân lập môi trường nhân tạo chọn lọc Đặc điểm vết bệnh táo nấm Phytophthora gây nên thường rắn, cứng dễ nhận biết, vết hoại Pythium vi khuẩn gây nên thường thối mềm, nhũn Một số ký chủ sử dụng để bẫy nấm Phytophthora: táo, ca cao xanh, lê, bơ, chanh, cánh hoa cẩm chướng, thông, mẩu đậu tương, đậu lupin Kỹ thuật bẫy lợi dụng gây bệnh loài nấm Phytophthora ký chủ mô ký chủ, sản sinh nhanh bào tử nang du động bào tử đất mô bệnh, du động bào tử bơi hướng tới nguồn dinh dưỡng rễ mô Du động bào tử di chuyển bám dính vào vị trí hấp dẫn vị trí đặc biệt trước chúng bọc bào nang Khả bám dính lên bề mặt đặc điểm đặc trưng nấm Phytophthora Nấm Phytophthora phát triển nhanh mồi bẫy giúp tăng hiệu phân lập (Erwin, D.C and Riberrio O.K,1996) Phân tích nấm Phytophthora từ đất bệnh cách pha loãng bình thuỷ tinh cốc nhựa, sử dụng mồi bẫy ký chủ, loại lát mỏng tờ giấy thả lên mặt nước Tỷ lệ nước pha loãng đất lớn gấp lần, mục đích để pha loãng tạp chất có đất như: phân bón, thuốc sinh học…những chất gây độc cho nấm Phytophthora Sử dụng 1/3 – 1/2 mồi bẫy thả mặt nước đặc điểm du động bào tử bơi lên cư trú bề mặt nước (Carlile, 1983) Sau lưu giữ vài ngày, mồi bẫy thả mặt nước thường biến màu nâu Khử trùng bề mặt mồi bẫy chất tẩy hypochlorite natri 70% ethanol, cắt rìa mô bị bệnh đặt môi trường chọn lọc sẵn môi trường chọn lọc đặt môi trường WA Mặc dù phương pháp sử dụng mồi bẫy mẩu ký chủ sử dụng rộng rãi, báo cáo gần sử dụng mồi bẫy nấm P.parasitica mầm táo có hiệu cao so với táo lê (Jeffers Aldwinckle, 1987) Mặc dù nước tự thích hợp cho hình thành bào tử nang, thiếu thông khí nước làm hạn chế hình thành bào tử nang (Duniway, 1975) Duniway đề xuất phân lập nấm Phytophthora từ dung dịch đất bệnh sử dụng mồi bẫy mô phải thả mặt nước, mồi bẫy bị ngập nước hạn chế hình thành bào tử nang du động bào tử, mẫu đất có độ ẩm cao mức trung bình trước cho ngập nước cốc làm tăng phân lập nấm Phytophthora phương pháp bẫy P.sojae sản sinh bào tử nang du động bào tử sau đất thu hong khô không khí, làm ẩm trở lại đặt nhiệt độ phòng – tuần, cuối đổ ngập nước Phương pháp làm tăng sản sinh bào tử nang đất ẩm sau phân lập mẩu đậu tương thả bẫy dung dịch đất Khi mẩu thả dung dịch đất khoảng thời gian ngắn (Khoảng giờ) tỷ lệ phân lập nấm P.Sojae thường xuyên so với loài Pythium, thả mồi bẫy (mẩu đậu) lâu dung dịch đất loài Pythium tìm thấy mồi bẫy (Canaday Schmitthenner, 1982) Hầu hết báo cáo khác khuyến cáo đặt mẩu nước khoảng thời gian dài (24 đến 48 giờ) trước chuyển chúng lên môi trường đặc hiệu Miếng bạch đàn đặt dung dịch đất 24 trước chuyển chúng lên môi trường đặc hiệu để phân lập P.cinnamomi (Erwin, D.C and Riberrio O.K, 1996) 1.2.4 Phân lập nấm Phytophthora từ mô Chuẩn bị cẩn thận giúp cho việc phân lập nấm Phytophthora từ mô bị bệnh thành công Tuy sử dụng môi trường chọn lọc việc khử trùng bề mặt không cần thiết Đặt rễ, thân rửa (Không khử trùng bề mặt) vào hố nông chứa nước ao, dung dịch muối khoáng, nước triết đất nước khử trùng để xác định rõ phát nấm Phytophthora Nếu bào tử nang xuất sau 24 – 48 giờ, chuyển lên môi trường đặc hiệu Mặc dù triệu chứng không luôn đáng tin cậy, hầu hết tất mô bệnh quả, vỏ có màu nâu, nâu tía đen, phụ thuộc vào độ rộng sắc tố mô chủ Mô bị nhiễm bệnh thường rắn không mềm Mô bệnh mềm thường bị gây hại loài vi khuẩn, Rhizopus Pythium Môi trường P10VP P10ARP hai môi trường hiệu dùng để phân lập trực tiếp nấm Phytophthora phương pháp đặt mô lên đĩa môi trường Đĩa chứa môi trường cần phải bảo quản ủ bóng tối Pimaricin bị phân huỷ ánh sáng (Andre Drenth and Barbara Sendall, 2004) Nội dung phương pháp nghiên cứu 2.1 Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu ảnh hưởng loại mồi bẫy khác - Khả ức chế số thuốc hoá học nấm phụ sinh phân lập nấm Phytophthora - Khả ức chế số thuốc kháng khuẩn vi khuẩn tạp nhiễm phân lập nấm Phytophthora 2.2 Phương pháp thí nghiệm 2.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy * Nước agar (WA): + agar: 20g + Nước: l * Môi trường PSM - Thành phần: + Cà rốt 20g + Khoai tây 20g + Agar 12g + Nước cất 1000ml Và hoá chất: Pimaricin(10ppm), Rifampicin(50ppm), Hymexazol(50ppm) - Cách nấu môi trường: + Đun khoai tây cà rốt đến nhừ sau chiết lấy dịch nước, cho thạch vào khuấy đều, đem hấp khử trùng Sau hấp xong để môi trường nguội đến khoảng 55oC, cho dung dịch hoá chất sau vào + Pimaricin 0,4ml hoà vào hộp nhựa nhỏ chứa 6,7ml nước cất vô trùng, hộp nhựa cần bọc kín( hoá chất tiếp xúc với ánh sáng bị phân huỷ hiệu lực) + Rifampicin 0,05g hoà vào hộp nhựa chứa 6,7ml nước cất vô trùng + Hymexazol 0,05g hoà vào hộp nhựa chứa 6,7ml nước cất vô trùng Sau đổ môi trường xong , giữ đĩa môi trường điều kiện tối để tủ lạnh * Môi trường PDA(Potato Dextrose Agar) - Thành phần: +Khoai tây 200g +Đường Glucose 20g +Agar 20g +Nước cất 1000ml Cách làm: khoai tây rửa sạch, thái mỏng, đem đun sôi 700 – 800ml nước khoảng 20- 25 phút Dùng vải lọc để loại bỏ cặn bã, sau cho đủ nước(1000ml) Cho đủ lượng đường khuấy nhẹ cho tan, sau cho thạch vào khuấy đũa thuỷ tinh tan hết Môi trường cho vào bình tam giác lọ có bọc giấy bạc đem hấp vô trùng nồi hấp1210C 30 phút Để môi trường nguội 60-650C đem rót vào đĩa petri (dầy 5mm) * Môi trường CMA(Corn Meal Agar) - Thành phần: +Bột ngô 30g +Agar 17g +Nước cất 1000ml Cách làm môi trường PDA * Môi trường PCA(Potato Carrot Agar) - Thành phần: +Khoai tây 20g + Cà rốt 20g +Agar 20g + Nước cất 1000ml Cách làm môi trường PDA * Môi trường CA(Cà rốt Agar) - Thành phần: + Cà rốt + Agar + Nước cất 200g 20g 1000ml * Môi trường V8Juice- Agar - Thành phần: + V8Juice 200ml + CaCO3 3g + Agar 15g + Nước cất 1000ml Thành phần V8juice lon 330 ml gồm nước cà chua cô đặc, hỗn hợp cô đặc cuả loại rau: cà rốt, rau diếp, mùi tây, cần tây, củ cải, ngũ cốc, muối, vi ta C, hương liệu khác - Cách làm: cho 200ml V8Juice vào cốc(1000ml) sau cho thêm nước vào để đủ 1000ml Cho vào cốc 3g CaCO 3, sau khuấy máy khuấy từ 10 phút Cho thạch vào khuấy tan hết Môi trường cho vào bình tam giác lọ có bọc nút kín đem hấp vô trùng nồi hấp 121 0C thời gian 30 phút, để môi trường nguội đến 60 –650C, đem rót vào đĩa petri 2.2.2 Phương pháp phân lập Phytophthora trực tiếp từ mẫu bệnh - Rửa mẫu bệnh vòi nước - Lựa chọn mô bệnh điển hình, tươi, mới, bệnh nhẹ - Cắt mô bệnh thành miếng có kích thước 1x1cm Miếng cắt phải có mô bệnh mô khoẻ Khử trùng bề mặt cồn 70 15 - 20 giây, sau rửa nước cất vô trùng - Thấm khô miếng cắt giấy thấm vô trùng, dùng dao khử trùng cắt vết bệnh thành miếng nhỏ 5x5mm - Đặt mảnh mô vào môi trường nghèo dinh dưỡng (WA, CA) - Khi nấm phát triển dài ra, cách mô bệnh – cm, lấy phần đầu sợi nấm cấy truyền sang môi trường thích hợp PDA, CMA, CA 2.2.3 Phương pháp phân lập Phytophthora từ phận bị nhiễm bệnh sử dụng mồi bẫy vỏ (Một số loại như: đu đủ, cacao, táo, lê …thường phải xanh) + Chọn mô nằm ranh giới mô bệnh mô khoẻ + Thanh trùng bề mặt ethanol 70% 0,5% sodium hypochlorite khoảng 30 – 60 giây Rửa với nước cất lau khô giấy khử trùng + Cắt mô thành miếng nhỏ (< mm) + Thanh trùng bề mặt trái cây, rạch chèn mô bệnh trùng vào + Bọc trái mồi bẫy vào túi ni lon để nhiệt độ phòng + Kiểm tra túi ủ hàng ngày, sau 2, ngày thấy vết thương biến màu nâu lan rộng chứng tỏ có bị nhiễm Phytophthora + Cắt khúc nhỏ rìa thương tổn, cho vào đĩa agar chuẩn bị sẵn 2.2.4 Ảnh hưởng loại mồi bẫy khác đến khả phân lập TT Công thức thí nghiệm Quả ca cao xanh Quả táo tây Quả đu đủ xanh Quả lê xanh 2.2.5 Khả ức chế số thuốc hoá học nấm phụ sinh phân lập nấm Phytophthora 2.2.5.1 Khả ức chế thuốc Ben lat 80WP - Công thức thí nghiệm: Ben lat 80WP liều lượng 40µg/ml Ben lat 80WP liều lượng 30µg/ml Ben lat 80WP liều lượng 20 µg/ml Ben lat 80WP liều lượng 10µg/ml MT V8 (không có thuốc) - Phương pháp tiến hành: Môi trường V8 nấu, để nguội môi trường khoảng 45 – 500C, cho thuốc Ben lat 80WP liều lượng khác vào môi trường, sau đổ hộp petri Sử dụng đục lỗ kích thước 0.3 cm để đục nguồn nấm Phytophthora cấy truyền sang hộp petri - Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu phân lập 2.2.5.2 Khả ức chế thuốc Tachigaren 30L (Hymexazol 30%) - Công thức thí nghiệm: Tachigaren 30L liều lượng 0.5 µl/ml Tachigaren 30L liều lượng 0.4 µl/ml Tachigaren 30L liều lượng 0.3 µl/ml Tachigaren 30L liều lượng 0.2 µl/ml MT V8(không có thuốc) - Phương pháp tiến hành: Môi trường V8 nấu, để nguội môi trường khoảng 45 – 500C, cho thuốc Tachigaren 30L liều lượng khác vào môi trường, sau đổ hộp petri Sử dụng đục lỗ kích thước 0.3 cm để đục nguồn nấm Phytophthora cấy truyền sang hộp petri - Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu phân lập 2.2.6 Khả ức chế số thuốc kháng khuẩn vi khuẩn tạp nhiễm phân lập nấm Phytophthora Thuốc kháng sinh RH (hoạt chất Rifampicin 150mg) - Công thức thí nghiệm: Thuốc RH liều lượng 50 µg/ml Thuốc RH liều lượng 40 µg/ml Thuốc RH liều lượng 30 µg/ml Thuốc RH liều lượng 20 µg/ml Thuốc RH liều lượng 10 µg/ml Đối chứng (MT V8 không thuốc) - Phương pháp tiến hành: Môi trường V8 nấu, để nguội môi trường khoảng 45 – 500C, cho thuốc RH liều lượng khác vào môi trường, sau đổ hộp petri Sử dụng đục lỗ kích thước 0.3 cm để đục nguồn nấm Phytophthora cấy truyền sang hộp petri - Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu phân lập Kết nghiên cứu thảo luận 3.1 Phân lập tác nhân gây bệnh thối đen ca cao 3.1.1 Ảnh hưởng loại mồi bẫy khác đến khả phân lập Nấm Phytophthora thường mọc chậm môi trường, dễ bị cạnh tranh loài nấm khác Khả phân lập trực tiếp từ mô bệnh khó thành công Áp dụng biện pháp dùng mồi bẫy để xác định mẫu bệnh có xuất nấm Phytophthora mồi bẫy sử dụng làm nguyên liệu để phân lập Nghiên cứu vật liệu bẫy thích hợp nấm Phytophthora gây thối đen ca cao, loại mồi bẫy ca cao xanh, đu đủ xanh, táo tây, lê xanh sử dụng thí nghiệm Kết ghi nhận bảng Bảng Ảnh hưởng vật liệu bẫy đến khả phân lập nấm Phytophthora gây thối đen ca cao (Viện BVTV - 2012) TT Vật liệu bẫy Tỷ lệ mồi bẫy nấm Phytophthora(%) Tỷ lệ mồi bẫy phân lập Phytophthora (%) Quả ca cao xanh 78,0 26,0 Quả táo tây 24,0 10,0 Quả đu đủ xanh 22,0 8,0 Quả lê xanh 14,0 4,0 Sử dụng mồi bẫy ca cao xanh cho tỷ lệ bẫy nấm Phytophthora sp cao 78%, cho tỷ lệ phân lập cao 26% Các loại khác bẫy nấm Phytophthora sp cho tỷ lệ thấp nhiều Phương pháp bẫy lợi dụng tính gây bệnh chọn lọc loài Phytophthora mô ký chủ sống, ký chủ coi môi trường chọn lọc, vết bệnh nấm Phytophthora gây phân lập môi trường nhân tạo chọn lọc Đặc điểm vết bệnh vật liệu bẫy (các loại quả) nấm Phytophthora gây nên thường rắn, cứng dễ nhận biết, vết hoại Pythium vi khuẩn gây nên thường thối mềm, nhũn 3.1.2 Khả ức chế số thuốc hoá học nấm phụ sinh mô bệnh a Khả ức chế thuốc Ben lat 80WP Theo Papavizas et al (1981); George Miholland (1986b) cho thấy: Benomyl thuốc trừ nấm khử nhiều loại nấm đất (nhưng không diệt Phytophthora), nhiên loài nấm Phytophthora khác nhau, liều lượng dùng có ảnh hưởng đến khả phát triển chúng tùy theo loài Việc tìm hiểu nồng độ thuốc cho phù hợp để vừa không ức chế phát triển nấm Phytophthora gây bệnh thối đen cao cao, lại có hiệu ức chế loại nấm khác quan trọng Thuốc Benlat 80WP có hoạt chất Benomyl 95% với nồng độ khác sử dụng thí nghiệm Trong công thức có sử dụng thuốc kháng sinh Rifampicin 30µg/ml môi trường V8 Bảng Ảnh hưởng thuốc Benlat 80WP đến khả phân lập nấm Phytophthora sp gây bệnh thối đen ca cao (Viện BVTV - 2012) TT Công thức thí nghiệm Ben lat 80WP liều lượng 40µg/ml Ben lat 80WP liều lượng 30µg/ml Ben lat 80WP liều lượng 20 µg/ml Ben lat 80WP liều lượng 10µg/ml MT V8 (không có thuốc) CV (%) Tỷ lệ phân lập (%) Phytophthora Fusarium sp Nấm khác sp 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 45,0 40,0 20,0 40,0 15,0 53,3 31,7 0,0 68,3 31,7 28,7 18,8 16,3 Kết (bảng 2) cho thấy thuốc Ben lat 80WP có khả ức chế số nấm phụ sinh mô bệnh, đặc biệt nấm Fusarium sp., tạo điều kiện cho nấm Phytophthora có khả mọc môi trường cao Ben lat 80WP liều lượng 20µg/ml cho tỷ lệ phân lập đạt cao 40,0 % Liều lượng Ben lat 80WP liều lượng cao 30 – 40 µg/ml, thuốc ức chế phát triển nấm Fusarium đồng thời ức chế phát triển nấm Phytophthora Ở liều lượng 10µg/ml có khả ức chế thấp nấm Fusarium, số lượng mẫu bị tạp nấm Fusarium nhiều, khả phân lập nấm Phytophthora thấp đạt 15,0% Trong điều kiện phân lập trực tiếp từ mô bệnh sử dụng thuốc Ben lat 80WP kết hợp với số hoá chất khác tăng hiệu phân lập cao b Khả ức chế thuốc Tachigaren 30L (Hymexazol 30%) Thuốc Tachigaren 30L (hoạt chất Hymexazol 30%) công ty Sankyo Agroco với giá thành rẻ dễ tìm kiếm tiến hành thí nghiệm khả phân lập nấm Phytophthora gây bệnh mủ cao su Thuốc Tachigaren 30L với nồng độ khác sử dụng thí nghiệm, công thức có sử dụng thuốc kháng sinh Rifampicin 30µg/ml môi trường V8 Tachigaren 30L có khả ức chế số vi sinh vật tạp nhiễm (bảng 12), đặc biệt nấm Pythium sp mô bệnh Tuy nhiên ca cao bị thối đen khả tạp nhiễm nấm Pythium thấp Thuốc Tachigaren 30L liều lượng 0.3 µl/ml cho tỷ lệ phân lập nấm Phytophthora sp 18,3%, Tachigaren 30L liều lượng 0.5 µl/ml khả phân lập nấm Phytophthora, liều lượng cao ức chế hoàn toàn nấm Pythium, đồng thời sợi nấm Phytophthora bị ức chế hoàn toàn nên không mọc Tachigaren 30L liều lượng 0.2 µl/ml thấp nên số mẫu bị tạp nhiễm nhiều, số mẫu phân lập nấm Phytophthora 5,0% Bảng Ảnh hưởng thuốc Tachigaren 30L đến khả phân lập nấm Phytophthora sp gây thối đen ca cao (Viện BVTV - 2012) TT Công thức thí nghiệm Tachigaren 30L liều lượng 0,5 µl/ml Tachigaren 30L liều lượng 0,4 µl/ml Tachigaren 30L liều lượng 0,3 µl/ml Tachigaren 30L liều lượng 0,2 µl/ml Tỷ lệ phân lập (%) Phytophthora sp Pythium sp Nấm khác 0,0 0,0 0,0 10,0 0,0 31,7 18,3 0,0 50,0 5,0 10,0 85,0 11,7 29,8 88,3 5,7 MT V8(không có thuốc) 0,0 CV(%) 19,4 Ghi chú: Tachigaren 30L với hoạt chất Hymexazol 30% 3.2.3 Khả ức chế thuốc kháng sinh RH vi khuẩn tạp nhiễm phân lập nấm Phytophthora Một khó khăn lớn phân lập tạp nhiễm vi khuẩn mô bệnh môi trường, việc nghiên cứu số môi trường có chứa loại chất kháng sinh hạn chế phát triển vi khuẩn tạp nhiễm cần thiết Một số kết nghiên cứu tác giả giới khẳng định lựa chọn kháng sinh thích hợp liều lượng dùng quan trọng phân lập nấm Phytophthora có chọn lọc Tsao, 1983 đưa hầu hết kháng sinh kháng khuẩn phân lập loài Phytophthora như: streptomycin, rifampicin, vancomycin…., nhiên loài phù hợp với loại kháng sinh liều lượng khác Theo Masago et al (1977), Rifampicin kháng sinh có khả ức chế vi khuẩn tạp nhiễm Hiện môi trường PSM môi trường chọn lọc cho phân lập nấm Phytophthora có chứa chất kháng sinh Rifampicin kết hợp với thuốc diệt nấm Hymexazol Pimaricin Thuốc kháng lao RH dạng viên nén có chứa hoạt chất Rifampicin 150mg công ty dược phẩm Minh Tiến, sử dụng để tìm hiểu khả ức chế thuốc với vi khuẩn tạp nhiễm trình phân lập nấm Phytophthora gây bệnh thối đen ca cao Thí nghiệm tiến hành với liều lượng khác môi trường phân lập V8 Bảng Ảnh hưởng thuốc kháng sinh RH đến khả phân lập nấm Phytophthora gây thối đen ca cao (Viện BVTV - 2012) TT Công thức thí nghiệm Thuốc RH liều lượng 50 µg/ml Thuốc RH liều lượng 40 µg/ml Thuốc RH liều lượng 30 µg/ml Thuốc RH liều lượng 20 µg/ml Thuốc RH liều lượng 10 µg/ml Đối chứng (MT V8 không thuốc) CV (%) Tỷ lệ phân lập (%) 13,3 35,0 71,7 41,7 6,7 0,0 8,4 Kết (bảng 4) cho thấy thuốc RH có khả ức chế vi khuẩn tạp nhiễm môi trường cho khả phân lập nấm Phytophthora cao Tuy nhiên khả phân lập nấm Phytophthora liều lượng khác Thuốc RH liều lượng 40 - 50 µg/ml có khả ức chế hoàn toàn vi khuẩn tạp nhiễm, ức chế phần phát triển sợi nấm Phytophthora nên cho khả phân lập mẫu bệnh thấp (13,3 – 35,0%) Thuốc RH liều lượng 20 - 30 µg/ml có khả ức chế hoàn toàn vi khuẩn tạp nhiễm, số mồi bẫy phân lập đạt cao nhất: 41,7 – 71,7%, liều lượng sợi nấm Phytophthora phát triển tốt Thuốc RH liều lượng 10 µg/ml không ức chế hoàn toàn vi khuẩn tạp nhiễm, số mồi bẫy bị vi khuẩn mọc lấn át chiếm tỷ lệ cao, khả phân lập thấp nhiều (6,7%) Kết luận đề nghị 4.1 Kết luận Sử dụng mồi bẫy ca cao xanh cho tỷ lệ bẫy nấm Phytophthora sp cao 78%, cho tỷ lệ phân lập cao 26,0% Ben lat 80WP liều lượng 20µg/ml cho tỷ lệ phân lập nấm Phytophthora đạt cao 40,0 % Thuốc Tachigaren 30L liều lượng 0,3 µl/ml cho tỷ lệ phân lập nấm Phytophthora sp cao 18,3% Thuốc RH liều lượng 20 - 30 µg/ml có khả ức chế hoàn toàn vi khuẩn tạp nhiễm, số mồi bẫy phân lập đạt cao nhất: 41,7 – 71,7% 4.2 Đề nghị Phương pháp nghiên cứu tham khảo cho nghiên cứu phân lập nấm Phytophthora gây hại phận mặt đất loại trồng khác Người viết báo cáo Chủ nhiệm đề tài TS Phạm Ngọc Dung ThS Nguyễn Hồng Tuyên [...]... thối đen quả ca cao, các loại mồi bẫy là quả ca cao xanh, quả đu đủ xanh, quả táo tây, quả lê xanh được sử dụng trong thí nghiệm Kết quả ghi nhận ở bảng 1 Bảng 1 Ảnh hưởng của vật liệu bẫy đến khả năng phân lập nấm Phytophthora gây thối đen quả ca cao (Viện BVTV - 2012) TT Vật liệu bẫy Tỷ lệ mồi bẫy được nấm Phytophthora(%) Tỷ lệ mồi bẫy phân lập được Phytophthora (%) 1 Quả ca cao xanh 78,0 26,0 2 Quả. .. 3 Quả đu đủ xanh 22,0 8,0 4 Quả lê xanh 14,0 4,0 Sử dụng mồi bẫy quả ca cao xanh cho tỷ lệ bẫy nấm Phytophthora sp cao nhất là 78%, cho tỷ lệ phân lập cao nhất là 26% Các loại quả khác cũng bẫy được nấm Phytophthora sp nhưng cho tỷ lệ thấp hơn nhiều Phương pháp bẫy lợi dụng tính gây bệnh chọn lọc của loài Phytophthora đối với mô ký chủ còn sống, các cây ký chủ này sẽ được coi là môi trường chọn lọc, ... loại mồi bẫy khác nhau đến khả năng phân lập Nấm Phytophthora thường mọc chậm trên môi trường, do vậy dễ bị cạnh tranh bởi các loài nấm khác Khả năng phân lập trực tiếp từ mô bệnh rất khó thành công Áp dụng biện pháp dùng mồi bẫy để xác định được mẫu bệnh có xuất hiện nấm Phytophthora và mồi bẫy sẽ được sử dụng làm nguyên liệu để phân lập Nghiên cứu vật liệu bẫy thích hợp đối với nấm Phytophthora gây thối. .. được sử dụng để tìm hiểu khả năng ức chế của thuốc với vi khuẩn tạp nhiễm trong quá trình phân lập nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao Thí nghiệm được tiến hành với 5 liều lượng khác nhau trên môi trường phân lập V8 Bảng 4 Ảnh hưởng của thuốc kháng sinh RH đến khả năng phân lập nấm Phytophthora gây thối đen quả ca cao (Viện BVTV - 2012) TT 1 2 3 4 5 6 Công thức thí nghiệm Thuốc RH liều lượng... pháp tiến hành: Môi trường V8 được nấu, để nguội môi trường khoảng 45 – 500C, cho thuốc RH ở các liều lượng khác nhau vào môi trường, sau đó đổ ra hộp petri Sử dụng đục lỗ kích thước 0.3 cm để đục nguồn nấm Phytophthora đã được cấy thuần truyền sang hộp petri - Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu phân lập được 3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 3.1 Phân lập tác nhân gây bệnh thối đen quả ca cao 3.1.1 Ảnh hưởng... cắt vết bệnh thành các miếng nhỏ 5x5mm - Đặt các mảnh mô cây vào môi trường nghèo dinh dưỡng (WA, CA) - Khi nấm đã phát triển dài ra, cách mô bệnh 1 – 2 cm, lấy phần đầu sợi nấm cấy truyền sang môi trường thích hợp như PDA, CMA, CA 2.2.3 Phương pháp phân lập Phytophthora từ bộ phận của cây bị nhiễm bệnh bằng sử dụng mồi bẫy vỏ quả (Một số loại quả như: đu đủ, cacao, táo, lê …thường phải xanh) + Chọn mô... được thấp hơn rất nhiều (6,7%) 4 Kết luận và đề nghị 4.1 Kết luận Sử dụng mồi bẫy quả ca cao xanh cho tỷ lệ bẫy nấm Phytophthora sp cao nhất là 78%, cho tỷ lệ phân lập cao nhất là 26,0% Ben lat 80WP liều lượng 20µg/ml cho tỷ lệ phân lập nấm Phytophthora đạt cao nhất là 40,0 % Thuốc Tachigaren 30L liều lượng 0,3 µl/ml cho tỷ lệ phân lập được nấm Phytophthora sp cao nhất là 18,3% Thuốc RH liều lượng 20... gây bệnh thối đen quả cao cao, lại có hiệu quả ức chế các loại nấm khác là rất quan trọng Thuốc Benlat 80WP có hoạt chất Benomyl 95% với 5 nồng độ khác nhau được sử dụng trong thí nghiệm Trong các công thức đều có sử dụng thuốc kháng sinh Rifampicin 30µg/ml trong môi trường V8 Bảng 2 Ảnh hưởng của thuốc Benlat 80WP đến khả năng phân lập nấm Phytophthora sp gây bệnh thối đen quả ca cao (Viện BVTV -... và không mềm Mô bệnh mềm thường bị gây hại bởi các loài vi khuẩn, Rhizopus hoặc Pythium Môi trường P10VP và P10ARP là hai môi trường hiệu quả nhất dùng để phân lập trực tiếp nấm Phytophthora bằng phương pháp đặt mô cây lên đĩa môi trường Đĩa chứa các môi trường này cần phải được bảo quản và ủ trong bóng tối vì Pimaricin bị phân huỷ dưới ánh sáng (Andre Drenth and Barbara Sendall, 2004) 2 Nội dung và. .. mô bệnh và môi trường, việc nghiên cứu một số môi trường có chứa các loại chất kháng sinh hạn chế sự phát triển của vi khuẩn tạp nhiễm là rất cần thiết Một số kết quả nghiên cứu của các tác giả trên thế giới đã khẳng định sự lựa chọn kháng sinh thích hợp và liều lượng dùng là quan trọng trong sự phân lập nấm Phytophthora có chọn lọc Tsao, 1983 đã đưa ra hầu hết các kháng sinh kháng khuẩn đều có thể phân ... thiết chuyên đề Việt nam đất nước với hai vùng khí hậu khác biệt, vùng khí hậu cận nhiệt đới thuộc phía Bắc đèo Hải Vân với mùa khác rõ rệt, vùng khí hậu nhiệt đới phía Nam có mùa mùa mưa mùa... -56% (So sánh với môi trường lúa mạch đen kháng sinh) không mọc Mucor mucedo, Trichoderma viridans, Trichoderma alba, Fusarium spp, Acremonium, Byssochlamys nivea loài Pythium Drenth et al (1995)... dãy núi cho phép tăng trưởng phát triển trồng nhiệt đới ôn đới vùng lân cận Các vùng khác Việt Nam đem lại khí hậu thích hợp cho sinh trưởng phát triển loài Phytophthora, nấm Phytophthora nguyên