Đánh giá cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 mang gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - NGÔ ĐÌNH HƢNG Tên đề tài: ĐÁNH GIÁ CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN THẾ HỆ T1 MANG GEN SSIV TĂNG CƢỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên nghành: Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012-2016 THÁI NGUYÊN, 2016 i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM - - NGÔ ĐÌNH HƢNG Tên đề tài: ĐÁNH GIÁ CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN THẾ HỆ T1 MANG GEN SSIV TĂNG CƢỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên nghành: Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012-2016 Giảng viên hƣớng dẫn: TS Phạm Bích Ngọc : ThS Lƣơng Thị Thu Hƣờng THÁI NGUYÊN, 2016 ii LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực tập tốt nghiệp Viện Công nghệ Sinh học–Viện Hàn Lâm Khoa Học Công nghệ Việt Nam, cán kỹ thuật nhân viên viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện giúp đỡ nhiều để hoàn thành tốt khoá luận Nhân dịp này, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đó‖ Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa toàn thể thầy, cô giáo khoa CNSH – CNTP Đặc biệt, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ngƣời hƣớng dẫn đề tài TS.Phạm Bích Ngọc Ths Lƣơng Thị Thu Hƣờng tận tình hƣớng dẫn để hoàn thành tốt khoá luận Đồng thời xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn Lâm Khoa Học Công Nghệ Việt Nam hợp tác giúp đỡ bố trí thí nghiệm, theo dõi thu thập số liệu làm sở cho khóa luận Một lần xin đƣợc gửi tới thầy giáo, cô giáo bạn bè lời cảm ơn sâu sắc, lời chúc sức khoẻ điều tốt đẹp Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Ngô Đình Hƣng iii MỤC LỤC Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầ u Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa ho ̣c 2.2 Tình hình sản xuất sắn giới 2.3 Tình hình sản xuất tiêu thụ sắn Việt Nam 2.4 Tinh bột 13 2.4.1 Cấu tạo 13 2.4.2 Cấu trúc tinh thể 14 2.4.3 Nghiên cứu sinh tổng hợp tinh bột gen liên quan 16 2.4.4 Cơ chế phân hủy tinh bột gen liên quan 19 2.4.5 Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải biến trình trao đổi tinh bột 20 2.4.6 Nghiên cứu trình sinh tổng hợp tinh bột sắn 21 Phần ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị phạm vi nghiên cứu 24 3.1.1 Vật liệu ( Đối tƣợng ) 24 3.1.2 Hóa chất, thiế t bi ̣nghiên cƣ́u 24 3.1.3 Phạm vi nghiên cứu 25 3.2 Điạ điể m và thời gian nghiên cƣ́u 25 3.3 Nô ̣i dung nghiên cƣ́u 25 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 3.4.1 Đánh giá phân ly gen chuyển môi trƣờng có chất kháng sinh chọn lọc 25 3.4.2 Phân tích dòng chuyển gen phƣơng pháp PCR 26 3.4.2.1 Tách chiết DNA tổng số 26 iv 3.4.2.2 Kiểm tra có mặt gen SSIV PCR 27 3.4.2.3 Phƣơng pháp điện di gel agarose 28 3.4.4 Đánh giá khả tích lũy tinh bột phƣơng pháp Iod 29 3.4.5 Phân tích tinh bột với thuốc thử Anthrone 29 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Kết đánh giá phân ly gen chuyển môi trƣờng có chất kháng sinh chọn lọc 31 4.2 Kết tách DNA tổng số dòng chuyển gen hệ T1 32 4.3 Kết PCR kiểm tra chuyển gen hệ T1 34 4.4 Kết kiểm tra T1 mang gen SSIV 35 4.5 Kết dựng đƣờng chuẩn 36 4.6 Kết định lƣợng hàm lƣợng tinh bột 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 Kết luận 39 Kiến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Diện tích, suất sản lƣợng sắn giới, năm 1995 – 2011 Bảng 2.2 Diện tích, suất, sản lƣợng sắn Việt Nam giai đoạn 1995 - 2014 11 Bảng 2.3 Trồng săn theo khu vực, năm 2012 12 Bảng 3.1 Danh mục thiết bị sử dụng 24 Bảng 3.2 Thành phần môi trƣờng nuôi cấy chọn lọc thuốc chuyển gen 26 Bảng 3.3 Thành phần tham gia PCR 27 Bảng 3.4 Cặp mồi sử dụng để PCR 28 Bảng 3.5 Chu trình nhiệt cho PCR 28 Bảng 4.1 Kết phân tích kháng kanamicine thuốc chuyển gen T1 lần lƣợt mang cấu trúc SSIV 31 Bảng 4.2 Kết đo Nanodrop 33 Bảng 4.3 Định lƣợng tinh bột 37 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cây sắn ( Nguồn www.asiacreative.vn ) Hình 2.2 Diễn biến sản lƣợng sắn giới giai đoạn 2005-2010 Hình 2.3 Diễn biến diện tích sản lƣợng sắn Việt Nam giai đoạn 2001-2011 (Nguồn: TCTK 2012) Hình 2.4 Dạng Amylopectin tinh bột 16 Hình 2.5 Dạng Amylose tinh bột 16 Hình 2.6 Quá trình sinh tổng hợp tinh bột enzym liên quan 17 Hình 4.1 Kết điện di DNA tổng số 33 Hình 4.2 Kết PCR dòng thuốc chuyển gen 34 Hình 4.3 Kết nhuộm thuốc với dung dịch lugol 35 Hình 4.4 Đƣờng chuẩn tinh bột 36 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii DNA Deoxyribonucleic acid SS Starch synthase GBSS Granule-bound starch synthase SBE Starch branching enzyme Npt Neomycin phosphotransferase Hpt Hygromycin phosphotransferase FAO Food and agriculture organization GUS β-1,4-glucuronidase M6P Manose-6-phosphate PMI Phosphomanose isomerase PCR Polymerase chain reaction A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens E.coli Escherichia coli dNTP Deoxynucleoside triphosphate A Adenine T Thymine C Cytosine G Guanin EtBr Ethidium Bromid Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Sắn (Manihot esculenta Crantz) lƣơng thực hàng năm Củ sắn có tỷ lệ chất khô 38 – 40%, tinh bột 16 – 32%, giàu vitamin C, calcium, vitamin B chất khoáng, nghèo chất béo, muối khoáng, vitamin nghèo đạm Trong đó, tinh bột glucan không tan, đƣợc cấu thành từ hai chuỗi polymer bao gồm tiểu phần glucose, amylopectin amylose Ở thực vật bậc cao, tinh bột đƣợc tổng hợp plastid, cacbohydrate dự trữ chủ yếu, tinh bột đóng vai trò quan trọng suốt chu kỳ sống thực vật Cây sắn đƣợc trồng 100 năm có khí hậu nhiệt đới cận nhiệt đới thuộc ba châu lục: châu Á, châu Phi châu Mỹ La tinh Sắn đƣợc trồng chủ yếu hộ nông dân nhỏ.Sắn đƣợc sử dụng vào nhiều mục đích khác Củ sắn cung cấp nguyên liệu thô cho chế biến thức ăn cho gia súc làm tinh bột quy mô lớn nhỏ Tinh bột sắn thành phần quan trọng chế độ thức ăn tỷ ngƣời giới hang hóa xuất có giá trị để chế biến bột ngọt, bánh kẹo, mì ăn liền, ván ép, bao bì, màng phủ sinh học, phụ gia dƣợc phẩm Đặc biệt thời gian tới, sắn nguyên liệu cho nghành công nghiệp chế biến nhiên liệu sinh học Sắn loại lƣơng thực quan trọng nƣớc phát triển, sản lƣợng hàng năm giới khoảng 200 triệu tấn.Năm 2013, sắn tiếp tục đở mở rộng sản xuất Ở châu Phi sản xuất 147 triệu sắn năm, sắn chiếm tỷ trọng cao cấu lƣơng thực lục địa với mức tiêu thụ bình quân khoảng 96kg/ngƣời/năm Về mức độ tiêu thụ, Cộng Hòa Dân Chủ Congo nƣớc sử dụng sắn nhiều với 391kg/ngƣời/năm Đối với tinh bột sắn, năm Nam Phi cần nhập khoảng 15 nghìn tấn.Tinh bột sắn đƣợc sử dụng chế biến thực phẩm, dƣợc phẩm sản xuất giấy tùng tông Trong năm 2013, kim nghạch nhập tinh bột sắn Nam Phi đặt 7,4 triệu USD Theo đó, Thái Lan nƣớc nhập chính sang Nam Phi, đạt 5.9 triệu USD Tiếp theo Việt Nam đạt 1.6 triệu USD, chiếm khoảng 21.6% thị phần Sắn, hay tên gọi khác củ khoai mì, đƣợc trồng phổ biến Việt Nam từ lâu đƣợc xem lƣơng thực thức ăn gia súc quan trọng sau lúa ngô Sắn chủ yếu dùng để xuất (48,6%), dùng làm thức ăn gia súc (22,4%), chế biến thủ công (16,8%), có 12,2% dùng tiêu thụ tƣơi Bắt đầu từ năm 2000, sắn đƣợc chuyển đổi từ lƣơng thực sang công nghiệp Sắn có ƣu điểm phù hợp với hộ nông dân nghèo nhỏ nhƣ: dễ trồng, thích hợp với nhiều loại đất, chịu đƣợc đất đai nghèo dinh dƣỡng điều kiện khô hạn Tại Việt Nam, sắn đƣợc canh tác phổ biến hầu hết tỉnh từ Bắc đến Nam Diện tích trồng nhiều sắn vùng Đông Nam Bộ, vùng Tây Nguyên, vùng núi trung du phía bắc, vùng ven biển nam Trung Bộ vùng ven biển bắc Trung Bộ Thông thƣờng, sắn đƣợc trồng vụ vào khoảng từ tháng đến tháng thu hoạch sau khoảng 7-10 tháng tùy thuộc điều kiện vùng Chính giá trị kinh tế, tầm quan trọng nên có nhiều nghiên cứu sắn chuyển: Giống sắn SVN3 (KM325) kết chọn dòng tự phối đời ba tổ hợp lai SC5 x SC5 theo hƣớng tạo dòng đơn bội kép kỹ thuật CIAT nhóm nghiên cứu sắn Trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hố Chí Minh Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam chọn tạo khảo nghiệm, khoai mì chuyển gen kháng African cassava mosaic virus, sắn có gen IPT tạo cytokine, xây dựng quy trinhg biến nạp gen bar – gen kháng thuốc diệt cỏ vào khoai mì phƣơng pháp bắn gen - Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên, ĐHQG-HCM,…Ngoài nhiều nghiên cứu chuyển gen thực vật mang gen liên quan đến trình sinh tổng hợp tích lũy tinh bột sắn Vì vậy, đề xuất tiến hành nghiên cứu đề tài: “ ĐÁNH GIÁ CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN THẾ HỆ T1 MANG GEN SSIV TĂNG CƢỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT ” 29 Bƣớc 3: Nhuộm gel: gel đƣợc lấy từ khuôn, ngâm khoảng 1020 phút dung dịch nƣớc có chứa EtBr, quan sát dƣới ánh sáng tử ngoại máy soi DNA, ảnh đƣợc chụp máy soi gel 3.4.4 Đánh giá khả tích lũy tinh bột phương pháp Iod Để đánh giá, so sánh sơ hàm lƣợng tinh bột dòng thuốc chuyển gen dòng WT, sử dụng phƣơng pháp nhuộm iodine với quy trình nhƣ sau: Bƣớc 1: Thu độ tuổi dòng thuốc chuyển gen Bƣớc 2: Nhúng lần lƣợt vào nƣớc sôi, giữ khoảng phút Bƣớc có tác dụng phá hủy thành tế bào, giúp thuốc nhuộm thẩm thấu nhanh vào tế bào Bƣớc 3: Chiết diệp lục cách nhúng cồn 80oC sôi Bƣớc 4: Rửa nƣớc để loại bỏ cồn dƣ Bƣớc 5: Tiến hành nhuộm với dung dịch nhuộm (0,2% I2; 0,4% KI) 3.4.5 Phân tích tinh bột với thuốc thử Anthrone Hòa tan Anthrone axit sulfuric đƣợc sử dụng cho định lƣợng khác carbohydrate, xác định hàm lƣợng thành phần đƣờng biết đến thông qua màu sắc loại đƣờng khác Phƣơng pháp anthrone đƣợc sử dụng rộng rãi sử dụng để xác định tinh bột đƣờng hòa tan thực vật Dựng đƣờng chuẩn hòa tan Bƣớc 1: Hòa loãng tinh bột thành nồng độ khác từ dung dịch gốc (0,1 – mg/ml) Bƣớc 2: Thủy phân tinh bột với HCl 18% 100oC vòng 30 phút theo tỷ lệ 500 ul tinh bột/ 2500 ul HCl 18% Bƣớc 3: Dịch thủy phân đƣơc điều chỉnh đến tổng thể tích 5ml với dH2O 30 Bảng 3.6 Các thành phần tham gia dựng đƣờng chuẩn Nồng độ Thể tích TB chuẩn (µl) dH2O(µl) TB Thể tích HCl (µl) 0.1 50 450 2500 0.2 100 400 2500 0.4 200 300 2500 0.6 300 200 2500 0.8 400 100 2500 500 2500 Blank 0 500 2500 Thu tinh bột hòa tan Bƣớc 1: Nghiền nhỏ mẫu máy nghiền mẫu Mẫu đƣợc sử dụng 10mg mẫu khô chuyển vào ống eppendort 2ml Bƣớc 2: Rửa mẫu aceton cho 2ml vào ống Ly tâm 10000 v/p phút đổ dịch, bƣớc lặp lại khoảng lần Bƣớc 3: Rửa mẫu cồn sôi 80o, rửa lần, làm tƣơng tự nhƣ với aceton Bƣớc 4: Hòa tan phần xác ly tâm HCl 50% Bƣớc 5: Hòa lấy 5ml dịch chiết đổ vào ống nghiệm, đem thủy phân 30 phút 100oC Sau đo mẫu, thành phần gồm: Anthrone: 1ml H2O deion: 50µl Dịch thành phần: 200µl Hỗn hợp đun 10 phút 31 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết đánh giá phân ly gen chuyển môi trƣờng có chất kháng sinh chọn lọc Trong trình tạo chuyển gen, trình gắn kết DNA vào genome thực vật bất định, nhƣ số lƣợng copy đƣợc gắn kết vào hệ gen thực vật không xác định Tuy nhiên, việc đảm bảo số lƣợng copy gen định độ ổn định tính di truyền trình tạo giống chuyển gen Do đó, việc phân tích di truyền chuyển gen góp phần xác định di truyền gen ngoại lai sang hệ tiếp theo, đảm bảo gắn kết ổn định vào hệ gen thực vật nhƣ xác định số lƣợng copy dòng chuyển gen phƣơng pháp đƣợc thực dựa quy luật phân li Mendel Nếu gen chuyển vào nằm nhiễm sắc thể (Thể dị hợp tử) thi T0 tự thụ phấn tỷ lệ phân li gen hay tỷ lệ mang gen/cây không mang gen hệ T1 3:1 Còn gen nằm hai nhiễm sắc thể khác tỷ lệ phân li 15:1 tƣơng tự trƣờng hợp gen nằm n nhiễm sắc thể tỷ lệ phân ly (3:1)n Với mục đích lựa chọn đƣợc thể đồng hợp tử với độ ổn định di truyền cao bƣớc lựa chọn dòng T0 có tỷ lệ phân li 3:1 T1 Sau đó, T1 tiếp tục đƣợc tự thụ phấn phân tích di truyền hệ T2 Nếu phân li tiếp tục tạo thành tỷ lệ 3:1 mẹ T1 dị hợp tử Ngƣợc lại, T2 cho kết toàn chuyển gen t1 đồng hợp tử Nhƣ đồng hợp tử lựa chọn từ hệ T2 trở Thí nghiệm đánh giá di truyền đƣợc tiến hành cách gieo hạt 11 dòng thuốc T1 chuyể n gen đĩa nh ựa đựng môi trƣờng MS Sau non mọc cao khoảng 1cm ta tiến hành cấy chuyển sang bình tam giác 500 ml chứa môi trƣờng MS có bổ sung kanamycine 50mg/l Mỗi dòng chuyển 120 160 đặt 40 cây/ bình tam giác Sau đến tuần 32 quan sát đánh giá số lƣợng sống sót môi trƣờng có chứa Kanamicine, có kết bảng 4.1 Bảng 4.1 Kết phân tích tính kháng kanamicine thuốc chuyển gen T1 lần lƣợt mang cấu trúc SSIV Dòng Tổng số Cây kháng Cây mẫn cảm Tỷ lệ 120 89 31 3:1 11 160 104 56 - 12 120 67 53 - 15 120 83 37 3:1 16 160 145 15 - 24 160 120 40 3:1 31 160 84 76 - 32 160 76 84 - 37 120 82 38 3:1 10 39 120 76 34 - 11 40 160 112 48 3:1 STT Tên SSIV 4.2 Kết tách DNA tổng số dòng chuyển gen hệ T1 Điện di gel agarose công cụ đƣợc sử dụng rộng rãi quan trọng để phân tích phân tử sinh học Agarose chất chiết xuất từ loài rong biển, agarose có cấu trúc polymer thẳng, đƣợc tạo từ đơn vị lập lại agarobiose Hiện ngƣời ta chế tạo nhiều agarose để phân tích DNA ARN nhƣ agarose tan nhiệt độ thấp, agarose đƣợc sử dụng để phân tích đoạn DNA nhỏ ( 10-500bp ) 33 S5 S11 S12 S15 S16 S24 S31 S32 S37 S39 S40 M Hình 4.1 Kết điện di DNA tổng số Từ kết ảnh điện di hình 4.1, nhận thấy băng DNA tổng số thu đƣợc cho thấy đa phần băng tập trung, không xuất vệt sáng phía sau kéo dài Điều cho thấy mẫu DNA tách chiết đƣợc không bị đứt gãy, có độ nguyên vẹn cao, không lẫn protein, loại RNA tạp chất khác Sau tách chiết DNA tổng số tiến hành đo Nanodrop để kiểm tra nồng độ nhƣ độ tinh DNA Kết đo nanodrop bảng 4.2 Bảng 4.2 Kết đo Nanodrop STT Dòng số Độ hấp thụ A260 Hàm lƣợng (ng/µl) S5 2,05 1127 S11 1,79 1724 S12 2,09 943 S15 1,97 1221 S16 2,05 841 S24 1,82 1722 S31 2,09 870 S32 1,9 1575 S37 2,07 1060 10 S39 2,05 1127 11 S40 2,08 1578 34 Kết bảng 4.2 cho thấy 11 mẫu DNA tổng số có hàm lƣợng giao động từ 841-1724ng/µl Tỷ lệ OD260nm/OD280nm 11 mẫu DNA tổng số nằm khoảng 1,8-2,2 Bên cạnh đó, mẫu tách chiết có nồng độ cao, đủ hàm lƣợng sử dụng cho phản ứng PCR kiểm tra có mặt gen SSIV dòng chuyển gen 4.3 Kết PCR kiểm tra chuyển gen hệ T1 DNA tổng số sau tách chiết từ thuốc chuyển gen hệ T1 mang gen SSIV đƣợc tiến hành PCR với cặp mồi đặc hiệu để kiểm tra gen Sản phẩm PCR đƣợc điện di gel Agarose 0,8% kết đƣợc thị nhƣ hình dƣới - + M S5 S11 S12 S15 S16 S24 S31 S32 S37 S39 S40 Hình 4.2 Kết PCR dòng thuốc chuyển gen Marker : 5µl Đối chứng (+): pBT- MeSSiv Kết cho thấy 11 dòng S5, S11, S12, S15, S16, S24, S31, S32, S37, S39, S40 sau PCR với cặp mồi đặc hiệu băng nhất, không xuất bang phụ Dựa vào thang DNA chuẩn, thấy kích thƣớc sản phẩm PCR khoảng 1000bp tƣơng đƣơng với kích thƣớc gen SSiv Ta thấy gen SSiv tồn thuốc hệ T1 không bị sau đƣa môi trƣờng 35 4.4 Kết kiểm tra tích lũy tinh bột ở dòng chuyển gen T1 Sau xác định gen SSIV tồn thuốc chuyên gen hệ T1, xác định biểu gen phƣơng pháp nhuộm dung dịch lugol lên thuốc S5 S11 S12 S15 S16 S24 S31 S32 S37 S39 S40 WT Hình 4.3 Kết nhuộm thuốc với dung dịch lugol Tinh bột có phân tử amilozo có cấu trúc theo kiểu dạng xoắn, vòng xoắn đƣợc giữ vựng nhờ có liên kết hidro nhóm OH Khi 36 nhuộm dung dịch lugol lên thuốc nhiệt độ phòng, mạch phân tử amilozo không phân nhánh xoắn thành dạng hình trụ Các phân tử iod len vào, nằm phía ống trụ tạo thành hợp chất có bọc màu xanh tím tất màu bị hấp thụ có ánh sang xanh tím không bị hấp thụ nên ta thấy màu xanh tím màu xanh tím đậm lƣợng tinh bột tham nhiều Ngoài ra, amylopectin có khả hấp thụ iod bề mặt nhánh Ta thấy thuốc chuyển sang màu xanh tím sau nhuộm với dung dịch lugol hình 4.3 Tất dòng có màu xanh tím đậm nhiều so với đôi chứng WT, dòng có phần màu xanh tím đậm, có phần màu xanh tím nhạt Chứng tỏ thuốc chuyển gen SSIV có hàm lƣợng tinh bột tích lũy cao so với chƣa đƣợc chuyển gen Gen SSIV hoạt động, biểu tăng cƣờng sinh tổng hợp tinh bột tốt thuốc hệ T1, hàm lƣợng tinh bột không đƣợc phân bố đồng bề mặt thuốc trình làm thí nghiệm chƣa tẩy hết diệp lục Có thể thấy phƣơng pháp đơn giản nhƣng hữu hiệu để bƣớc đầu sàng lọc, lựa chọn dòng chuyển gen tiềm để tiếp tục thực phép phân tích định lƣợng phức tạp chính xác 4.5 Kết dựng đƣờng chuẩn Phƣơng pháp dựng đƣờng chuẩn cho phép phân tích hàng loạt mẫu, dung dịch không đòi hỏi phải tuân theo định luật Beer cách nghiêm ngặt Dƣới hình ảnh kết sau dựng đƣờng chuẩn Hình 4.4 Đường chuẩn tinh bột 37 Kết dựng đƣơng chuẩn với R2= 0,9934 thể độ xác cao từ làm sở để đánh giá chính xác định lƣợng hàm lƣợng tinh tinh bột, giảm thiểu sai số làm thí nghiệm 4.6 Kết định lƣợng hàm lƣợng tinh bột Đánh giá định lƣợng tinh bột cần thiết sau đánh giá tổng quan khả sinh tổng hợp tinh bột gen SSIV thuốc lá, giúp ta đánh giá chính xác hàm lƣợng tinh bột có thuốc chuyển gen hệ T1 so với thuốc không chuyển gen Trong điều kiện in vitro, non đƣợc cung cấp đầy đủ dinh dƣỡng ánh sáng Do vậy, đánh giá tích lũy tinh bột in vitro không phù hợp, môi trƣờng nuôi cấy in vitro có bổ sung đƣờng, nên kết thu đƣợc không xác Để đánh giá, so sánh sơ hàm lƣợng tinh bột dòng thuốc chuyển gen dòng đối chứng WT tiến hành nhuộm iodine Thông thƣờng, trồng điều kiện nhà lƣới không cần thiết phải chiết lƣợng đƣờng tự khỏi mẫu nồng độ đƣờng tự thấp (0,1-0,5%) Để kết đƣợc xác tiến hành trồng tất mẫu tủ nuôi cấy để đảm bảo thống điều kiện nhƣ thời gian chiếu sáng, nhiệt độ, độ ẩm…, sau tiến hành thu độ tuổi dòng chuyển gen WT độ tuổi, thời gian (nhiệt độ 27oC, độ ẩm 70%, điều kiện chiếu sáng/tối 16/8 h) Bảng 4.3 Kết định lƣợng tinh bột Số dòng Giá trị OD S5 S11 S12 S15 S16 S24 S31 S32 S37 S39 S40 WT 0,358 0,198 0,116 0,107 0,220 0,349 0,133 0,256 0,142 0,196 0,186 0,133 Hàm lƣợng tinh bột 0,671 0,373 0,222 0,205 0,414 0,653 0,253 0,481 0,270 0,370 0,351 0,253 Tinh bột (mg/g mẫu khô ) 67,106 37,334 22,171 20,506 41,402 65,257 25,314 48,060 26,979 36,964 35,115 25,314 Tỷ lệ tăng so với đối chứng (%) 65,092 47,482 87,582 81,007 63,553 157,787 89,851 6,574 46,021 38,716 38 Dựa vào bảng, ta thấy đƣợc hàm lƣợng tinh bột, tinh bột (mg/g mẫu khô ), phần trăm dòng hầu nhƣ cao mẫu đối chứng WT Tuy nhiên, dòng S12, S15, S31 lại thấp mẫu đối chứng Vậy ta kết luận đa phần thuốc chuyển gen SSIV có hàm lƣợng tinh bột cao chƣa chuyển gen nhƣng lƣợng tinh bột dòng không đồng đều, số dòng có hàm lƣợng tinh bột thấp đôi chứng khả sinh trƣởng lại khác yếu tố nhƣ dinh dƣỡng, độ ẩm, …tác động đến khả tổng hợp tinh bột Điều giải thích vị trí gen chuyển đƣợc tích hợp genome chủ khác dẫn đến sai khác hoạt động gen chuyển, ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp tích lũy tinh bột Bên cạnh đó, yếu tố ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển nhƣ điều kiện chiếu sáng, nhiệt độ, độ ẩm, chế độ dinh dƣỡng ảnh hƣởng đến đồng hóa tinh bột Kết cho phép khẳng định dòng thuốc chuyển gen SSiv có mức độ tích lũy tinh bột cao đối chứng không chuyển gen 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.Kết luận Đã đánh giá phân ly 11 dòng thuốc T1 chuyển gen SSIV môi trƣờng có bổ sung kháng sinh chọn lọc Đã phân tích có mặt gen đích SSIV 11 dòng thuốc chuyển gen phƣơng pháp PCR Đánh giá đƣợc tăng cƣờng tổng hợp tinh bột dòng thuốc chuyển gen hệ T1 so với dòng đối chứng không chuyển gen 2.Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch synthase IV nhằm tăng cƣờng tích lũy tinh bột vào sắn 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Hoàng Kim, Trần Ngọc Quyền, Nguyễn Thị Thủy 1990 Chọn tạo giống khoai lang, sắn thích hợp với vùng sinh thái nông nghiệp Miền Nam Bộ Nông nghiệp Công nghiệp Thực phẩm Tạp chí hàng tháng khoa học, kỹ thuật quản lý kinh tế; số năm 1990, trang 538-544 Tổng cục Thống kê, 2013 Diện tích, suất, sản lƣợng sắn Việt Nam phân theo địa phƣơng năm 2011 Ngày tháng năm 2013 Hoàng Kim, 2013a Báo cáo Tổng kết Dự án: Xây dựng mô hình sản xuất sắn theo hƣớng bền vững tỉnh Đắc Lăk Tài liệu kèm băng DVD tờ Quy trình kỹ thuật canh tác sắn, Sở Nông nghiệp &PTNT Đăk Lak, 68 trang Nguyễn Văn Tiễn, Trần Ngọc Ngoạn, Đặng Thị Ngoan, Nguyễn Thế Hùng, Nguyễn Hữu Hồng 1994 Các biện pháp canh tác đất dốc, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Hoàng Kim Phạm Văn Biên, 1995 Cây sắn Nhà Xuất Nông nghiệp TP Hồ Chí Minh Tiếng Anh FAOSTAT, 2013a Diện tích, suất sản lƣợng sắn giới Ngày 10 tháng 03 năm 2013 Hoang Kim, Nguyen Van Bo, Reinhardt Howeler and Hernan Ceballos 2008b Current Situation of Cassava in Vietnam and the selection of cassava doubled haploid (DH) lines derived from CIAT Paper presented at ―Cassava meeting the challenges of the new millennium‖ hosted by IPBO- Ghent University, Belgium 21-25 July 2008 Bùi Bá Bổng 2012 45th Anniversary of CIAT: Welcome from Vietnam 41 Zeeman, Samuel C (2010) Starch: Its Metabolism, Evolution, and Biotechnological Modification in Plants Annual Review of Plant Biology 61(1) 10 Hoang Kim, Pham Van Bien, Tran Ngoc Quyen, Tran Ngoc Ngoan, Trinh Phuong Loan and Kazuo Kawano (2005) Cassava breeding and varietal dissemination in Vietnam from 1975 to 2000 Proceeding of Annual Report of CIAT 11 Tuong Van Nguyen (2008) Genetic engineering of grain sorghum (Sorghum bicolour (L.) Moench) for nutritional quality improvement Thesis submitted in requirement for Doctoral in Applied Biological Siences 12 Wattebled F, Dong Y, Dumez S, Delvall'e D, Planchot R, et al 2005 Mutants of Arabidopsis lacking a chloroplastic isoamylase accumulate phytoglycogen and an abnormal form of amylopectin Plant Physiol 138:184-95 13 Wattebled F, Planchot V, Dong Y, Szydlowski N, Pontoire B (2008) Further evidence for the mandatory nature of polysaccharide debranching for the aggregation of semicrystalline starch and for overlapping functions of debranching enzymes in Arabidopsis leaves Plant Physiol 148:1309-23 14 Zeeman, Samuel C (2010) Starch: Its Metabolism, Evolution, and Biotechnological Modification in Plants Annual Review of Plant Biology 61(1) 15 Munyaradzi V Masona, Nigel J Taylor, A Ian Robertson & Claude M Fauquet (2001) Transferring a cassava (Manihot esculenta Crantz) genetic engineering capability to the African environment: Progress and prospects Euphytica 120: 43—48 16 Krit Raemakers, Marianne Schreuder, Luc Suurs, Heleen FurrerVerhorst Jean-Paul Vincken, Nick de Vetten, Evert Jacobsen and Richard G.F Visser (2005) Improved cassava starch by antisense inhibition of granule-bound starch synthase I Molecular Breeding 16: 163-172 42 17 Zhao, Shan-Shan (2011) Development of waxy cassava with different Biological and physico-chemical characteristics of starches for industrial applications Biotechnology and Bioengineering 18 Uzoma Ihemere, Diana Arias-Garzon, Susan Lawrence and Richard Sayre (2006) Genetic modification of cassava for enhanced starch production Plant Biotechnology Journal 4: 453-465 19 Jun Yang, Dong An, Peng Zhang (2011) Expression Profiling of Cassava Storage Roots Reveals an Active Process of Glycolysis/Gluconeogenesis Journal of Integrative Plant Biology 53 (3) 193-211 20 Kazuo Kawano 2009 Cassava and Vietnam: Now and Then 21 Kazuo Kawano 2001 The role of improved cassava cultivars in generating income for better farm management In: R.H Howeler and S.L Tan (Eds.) Cassava’s Potential in the 21st Centery: Present Situation and Future Research and Development Needs Proc 6th Regional Workshop, held in Ho Chi Minh city, Vietnam Feb 21-25, 2000 p 5-15 22 Tran Vien Thong, 2011, Results production of cassava in Tay Ninh 2000-2011 Orientation for 2012-2015 Paper presented at IFAD/ICRISAT Project Final Meeting ―Harnessing water–use efficient bio-energy crops for enhancing livelihood opportunities of smallholder farmers in Asia, Africa and Latin America" Tay Ninh cassava field trips, 15 April 23 Claude M.Fauquest 2008 Cassava: A Gift to the World and a Challenge for Scientists Paper presented at ―Cassava meeting the challenges of the new millennium‖ hosted by IPBO- Ghent University, Belgium 21-25 July 2008 24 Hoang Kim, Le Huy Ham, Manabu Ishitani, Hernan Ceballos, Nguyen Van Bo, Tran Ngoc Ngoan, Kazuo Kawano, Reinhardt Howeler, Rod Lefroy, Nguyen Phuong, Hoang Long, Nguyen Thi Le Dung, Tran Cong 43 Khanh, Vo Van Quang, Dao Trong Tuan, Nguyen Minh Cuong, Nguyen Van Vu and Nguyen Van Dong 2013b Vietnam cassava breeding overview: the broad perspective Presentation to Kickoff Meeting of a Cooperative Research Project under the East Asia Joint Research Program (e-ASIA JRP) at AGI, Hanoi on Jan.8 and 9, 2013 [...]... cây thuố c lá chuyể n gen thế hê ̣ T 1 mang gen SSIV 1.3 Yêu cầ u - Tìm hiểu đƣợc cách đánh giá cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 mang gen SSIV tăng cƣờng sinh tổng hợp tinh bột - Nắm bắt đƣợc các phƣơng pháp đánh giá cây thuốc lá chuyển gen 4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa ho ̣c Gen SSIV là gen mã hóa cho enzyme starch synthase liên quan sinh tổng hợp tinh bột Cây thuốc lá chuyển gen. .. tham gia vào sinh tổng hợp tinh bột hay dự trữ vì thế việc có mặt của nó không ảnh hƣởng đến 21 việc tích tụ tinh bột trong quá trình phát triển của cây Khi hạt xay ra đƣợc làm nóng trong nƣớc để dính hóa tinh bột thì amylase chịu nhiệt sẽ bắt đầu chuyển đổi tinh bột thành dạng có thể lên men [21] 2.4.6 Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp tinh bột ở sắn Nhiều gen liên quan tới sinh tổng hợp tinh bột.. . đến hai gen mã hóa enzyme ADP-glucose pyrophosphorylase, là m nhiệm vụ xúc tác quá trình tổng hợp ADP - glucose và gen GBSS II (granule-bound synthetase), gen tổng hợp tinh bột chủ yếu có thể chuyển hóa ADP glucose thành amylose Các gen trên đã đƣợc phân lập dựa vào các gen tƣơng ứng ở khoai tây Ngoài ra, các gen khác liên quan tới sinh tổng hợp tinh bột nhƣ BE với vai trò tổng hợp amylopectin Gen ADP-glusose... programmable Thermal controller, MJ Research, Inc) 25 3.1.3 Phạm vi nghiên cứu Đánh giá sự di truyền ổn định của gen chuyển SSIV và sự tăng cƣờng tích lũy tinh bột ở lá các dòng cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T1 3.2 Điạ điể m và thời gian nghiên cƣ́u Điạ điể m: Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viê ̣n C ông nghê ̣ sinh ho ̣c – Viê ̣n Hàn Lâm Khoa Học và Công N ghê ̣ Viê ̣t Nam – 18 Hoàng Quốc... cắt chuyển sang môi trƣờng ra rễ, bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l 26 Bảng 3.2 Thành phần môi trường nuôi cấy và chọn lọc cây thuốc lá chuyển gen Tên môi trƣờng Thành phần môi trƣờng MS + 0,1mg/l IBA + 30g/l sucrose Ra rễ + 8g/l agar + kanamycin 50mg/l, pH= 5,8 3.4.2 Phân tích các dòng chuyển gen T1 bằng PCR 3.4.2.1 Tách chiết DNA tổng số Tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá cây thuốc lá chuyển. .. NanoDrop để kiểm tra độ tinh sạch DNA và nồng độ DNA 27 3.4.2.2 Phương pháp PCR kiểm tra sự có mặt của gen SSIV PCR là kỹ thuật phổ biến và đơn giản nhất để bƣớc đầu sàng lọc các dòng cây chuyển gen Kết quả của phản ứng cho phép khẳng định sự tồn tại hay không của gen chuyển trong genome của cây kiểm tra Trong nghiên cứu này, các dòng thuốc lá chuyển gen với mỗi cấu trúc gen SSIV đƣợc thu lá để phân tích... synthase liên quan sinh tổng hợp tinh bột Cây thuốc lá chuyển gen SSIV, thế hệ T1 đƣợc kiểm tra, đánh giá khả năng tăng cƣờng, tích lũy tinh bột Kết quả của của khóa luận là cơ sở đánh giá vai trò của gen SSIV phục vụ cho công tác cải tiến giống sắn nói riêng và cây trồng nói chung 2.2 Tình hình sản xuất cây sắn trên thế giới Sắn là cây lƣơng thực có sản lƣợng 252,20 triệu tấn) đứng hàng thứ năm sau... gen chuyển trên môi trường có chất kháng sinh chọn lọc Nội dung 2: Phân tích các dòng cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR Nội dung 3: Đánh giá khả năng tích lũy tinh bột ở lá 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1 Đánh giá sự phân ly của gen chuyển trên môi trường có chất kháng sinh chọn lọc Các cây con T1 trong phòng thí nghiệm để giữ dòng phát triển hoàn chỉnh từ 3-4 lá thật chuyển sang bầu đất chứa giá. .. Hình 2.4 Dạng Amylopectin của tinh bột Hình 2.5 Dạng Amylose của tinh bột 2.4.3 Nghiên cứu quá sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan Quá trình tổng hợp tinh bột α-1,4 glucan bao gồm ba bƣớc quan trọng xảy ra trong lục lạp và thể vô sắc: i) cung cấp glucose-6-phosphate (Glc-6-P) vào trong các thể lạp, ii) tổng hợp ADP-glucose (ADPG) từ Glc-1-P, và iii) tổng hợp tinh bột từ ADPG Nói một cách ngắn... cây, bao gồm các nhân tố điều khiển trao đổi chất tinh bột, cấu trúc tinh bột và các con đƣờng phân hủy tinh bột khác nhau Xuất phát từ cơ sở trên, những gen liên quan tới quá trình sinh tổng hợp tinh bột sẽ đƣợc nghiên cứu trong đề tài này ở đối tƣợng cây sắn ở Việt Nam là gen SSIV (Starch synthase IV) để cải tạo cây sắn theo hƣớng tăng năng suất tinh bột 24 Phần 3 ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP