Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Mục Lục 1. Giới thiệu khái quát 1 1.1. Khái niệm 1 1.2. Quá trình hình thành và phát triển 1 2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột 2 3. Phân loại sắc ký 3 3.1. Sắc ký hấp phụ 3 3.2. Sắc kí trao đổi ion: 4 3.3. Sắc kí ái lực: 7 3.4. Sắc kí phân bố lỏnglỏng hay sắckí chiết: 8 3.5. Sắc kí rây phân tử hay sắc kí gel: 9 4. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ 9 4.1. Thời gian lưu thực t’r : Retention time 10 4.2. Hệ số dung lượng K’: Capacity Factor 11 4.3. Độ chọn lọc α 11 4.4. Số đĩa lý thuyết N 11 4.5. Độ phân giải R: (Resolution) 11 4.6. Hệ số không đối xứng T: ( Tailing factor) 12 5. Hệ thống HPLC 13 5.1. Bình đựng dung môi 13 5.2. Bộ khử khí Degasse 14 5.3. Bơm Cao áp 14 5.4. Bộ phận tiêm mẫu ( injection) 14 5.5. Cột sắc ký 14 5.6. Detector 14 5.7. Bộ phận ghi tín hiệu 15 5.8. In kết quả 15 6. Sắc kí lỏng ghép hai lần khối phổ: 15 7. Chọn điều kiện sắc ký 16 7.1. Lựa chọn pha tĩnh 16 7.2. Lựa chọn pha động 17 8. Kỹ thuật tiến hành sắc ký 18 8.1. Chuẩn bị dụng cụ và máy móc 18 8.2. Chuẩn bị dung môi pha động 19 8.3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC 19 8.4. Cách đo HPLC 19 9 . Ứng dụng của phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao 20 9.1. Định tính và khử độ tinh khiết 20 9.2. Sắc ký điều chế 20 9.2.1. Phương pháp chuẩn ngoại 20 9.2.2. Phương pháp chuẩn nội (internal standard method) 20 9.2.3. Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic (area normalisation) 20 9.3. Một số ứng dụng khác 20 9.3.1. Ứng dụng HPLC trong phân tích mẫu tại CASE 20 9.3.2. Ứng dụng trong dược liệu 21

Mục Lục LỜI MỞ ĐẦU Các tế bào sống chứa hàng trăm loại hợp chất hóa học khác Các hợp chất bao gồm đại phân tử protein, acid nucleic, lipid,… hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ Những hợp chất có diện số lượng nhỏ, dạng vết (enzyme) hay số lượng nhiều (các protein cấu tạo) Người ta muốn biết thành phần hóa học tế bào, nhằm hiểu rõ quy trình biến đổi nó, qua giúp sống ngày thêm tốt đẹp Muốn vậy, người ta phải tìm cách tách riêng chúng để xác định cấu trúc hóa học Từ kỹ thuật tách riêng hợp chất đời, sắc ký phương pháp hữu hiệu để tách chất khỏi hỗn hợp, hỗn hợp phức tạp thành phần khác hàm lượng hỗn hợp dịch chiết từ hợp chất từ cỏ Từ đời (1903) nhiều kỹ thuật sắc ký cải tiến thiết bị phương pháp phát phát triển áp dụng thực tế để phân tích định tính, định lượng chiết tách chất dù có màu hay không, dù trọng lượng phân tử nhỏ hay lớn Nhưng phân tử sinh học muôn hình vạn trạng với trọng lượng phân tử lớn nhỏ khác nhau, tính phân cực nhiều hay khác nên có nhiều kĩ thuật sắc ký khác Sắc ký lỏng hiệu cao phương pháp ứng dụng nhiều nhiều năm gần Nó áp dụng để tách nhận dạng xác định hàng loạt hợp chất mà số phương pháp trước gặp nhiều khó khăn hợp chất không bền với nhiệt, hợp chất có tính chất hóa học tương tự Phương pháp HPLC có nhiều ưu điêm mà phương pháp khác như: xác định đồng thời nhiều chất, tốn mẫu, thao tác đơn giản… Qua đề tài này, nhóm sâu phân tích nhằm giúp thầy bạn hiểu rõ phương pháp đại 1 Giới thiệu khái quát 1.1 Khái niệm HPLC chữ viết tắt chữ đầu tiếng Anh phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography),trước gọi phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) Phương pháp đời từ năm 1967-1968 sở phát triển cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện phương pháp HPLC ngày phát triển đại hoá cao nhờ phát triển nhanh chóng ngành chế tạo máy phân tích Hiện áp dụng lớn nhiều nghành kiểm nghiệm đặc biệt ứng dụng cho nghành kiểm nghiệm thuốc Và công cụ đắc lực phân tích thuốc đa thành phần cho phép định tính định lượng Sắc ký lỏng hiệu cao phương pháp chia tách pha động chất lỏng pha tĩnh chứa cột chất rắn phân chia dạng tiểu phân chất lỏng phủ lên chất mang rắn, hay chất mang biến đổi liên kết hoá học với nhóm chức hữu Quá trình sắc ký lỏng dựa chế hấp phụ, phân bố, trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử) 1.2 Quá trình hình thành phát triển Ra đời từ năm 1967-1968 nhiên vào cuối năm 1970, sắc ký lỏng hiệu cao trở thành thuật ngữ phổ biến hơn(prefered), nhấn mạnh chia cắt có hiệu đạt (the effective separations achieved) Thực ra, cột vật liệu đệm (packing materials) cung cấp hiệu suất cao áp suất vừa phải (moderate) ( áp lực cao liên quan đến dòng lưu lượng (gravity-flow) sắc ký lỏng) HPLC áp dụng cho phân tích hợp chất mà tan chất lỏng dùng pha động Mặc dù sử dụng thường xuyên kỹ thuật phân tích, HPLC dùng chế độ chuẩn bị(preparative mode) Có nhiều ưu điểm HPLC vượt qua sắc ký lỏng cột cổ điển áp suất thấp: - Tốc độ (nhiều phân tích hoàn thành 30 phút hơn) - Một loạt pha tĩnh.Cách giải cải thiện - Độ nhạy lớn (Nhiều máy dò tận dụng) - Mẫu dễ phục hồi (easy sample recovery)(cần sử dụng chất rửa giải (less eluent volume to remove)) Ứng dụng HPLC vào phân tích thực phẩm bắt đầu vào cuối năm 1960, việc sử dụng tăng lên với phát triển vật liệu đóng cột mà tách loại đường (separate sugars) Sử dụng HPLC để phân tích đường có hiệu kinh tế kết việc tăng giá đường năm 1970, thúc đẩy nhà sản xuất nước giải khát dùng syrup bắp có hàm lượng fructose cao thay cho đường Kiểm tra hàm lượng chất tạo HPLC đảm bảo chất lượng sản phẩm tốt Những ứng dụng thực phẩm đầu vào(early food) khác bao gồm phân tích dư lượng thuốc trừ sâu rau quả, acid hữu cơ, lipid, acid amin, độc tố ( độc tố nấm mốc(aflatoxins) đậu phộng), vitamin HPLC tiếp tục ứng dụng vào chất này, nhiều hơn, thực phẩm liên quan đến kỹ thuật phân tích ngày Nguyên tắc trình sắc ký cột Pha tĩnh yếu tố quan trọng định chất trình sắc ký lọai sắc ký - Nếu pha tĩnh chất hấp phụ ta có Sắc ký hấp phụ pha thuận pha đảo - Nếu pha tĩnh chất trao đổi Ion ta có Sắc ký trao đổi ion - Nếu pha tĩnh chất Lỏng ta có Sắc ký phân bố hay sắc ký chiết - Nếu pha tĩnh Gel ta có Sắc ký Gel hay Rây phân tử Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích khỏi cột, cần có pha động Như nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C… Vào cột phân tích, kết chất A, B, C Sẽ tách khỏi sau qua cột Quyết định hiệu tách sắc ký tổng hợp tương tác F Chất phân tích A+B+C Pha động Pha tĩnh Tổng tương tác định chất rửa giải khỏi cột trước tiên lực lưu giữ cột nhỏ (F1) ngược lại Đối với chất,sự lưu giữ qui định lực F1,F2,F3.Trong F1 F2 giữ vai trò định, F3 yếu tố ảnh hưởng không lớn Ở F1 lực giữ chất phân tích cột, F2 lực kéo pha động chất phân tích khỏi cột Như với chất khác F1 F2 khác Kết chất khác di chuyển cột với tốc độ khác tách khỏi khỏi cột (như hình đây) F F Hình 1:Phần minh hoạ trình tách chất A B trongcột tách sắc ký Phân loại sắc ký Theo chế tách sắc ký người ta phân loại sau: 3.1 Sắc ký hấp phụ Quá trình sắc ký dựa hấp phụ mạnh,yếu khác pha tĩnh chất tan rửa giải (phản hấp phụ) pha động để kéo chất tan khỏi cột.Sự tách hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học chất hấp phụ Trong trường hợp có loại hấp phụ: - Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP - HPLC): Pha tĩnh phân cực,pha động không phân cực - Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC): Pha tĩnh không phân cực,pha động phân cực Loại sắc ký áp dụng thành công để tách hỗn hợp chất có tính chất gần tương tự thuộc loại không phân cực,phân cực yếu hay trung bình vitamin,thuốc hạ nhiệt, giảm đau Hiện sử dụng loại sắc ký này, chủ yếu sắc ký hấp phụ pha đảo (RP) Trong dược điển USP tra cứu cột có giá trị tương ứng sau: - L1: RP 18 kích thước hạt tương ứng từ - 10 µm - L7: RP kích thước hạt tương ứng từ - 10 µm - L3: Si 60 kích thước hạt tương ứng từ - 10 µm Và số loại cột khác cột Diol, cột NH2,CN 3.2 Sắc kí trao đổi ion: Sự trao đổi ion gắn kết có tính chất thuận nghịch phân tử có mang điện tích Trong sắc ký cột nhồi , pha tĩnh R có gắn thêm nhóm chức G mang điện tích Giả sử cho ngang qua cột hỗn hợp mẫu chất ban đầu có chứa nhiều lọai chất tan (solute) khác nhau, chất tan có mang điện tích ngược dấu với điện tích nhóm chức, thí dụ chất tan S, chất tan đuổi đối ion hC chỗ vào, để gắn vào pha tĩnh, chất tan bị giữ lại cột, chất khác hỗn hợp mẫu chất ban đầu không bị giữ lại nên khỏi cột Kỹ thuật tách riêng hợp chất S khỏi hỗn hợp ban đầu RG- + S+ > RG-S+ + C+ Hoặc RG+ +S- -> RG+S- + C Trong đó: R pha tĩnh hay gọi nhựa (resin), G nhóm chức mang điện tích cố định pha tĩnh hay gọi nhóm chức họat động nhựa C đối ion G S chất hữu có mang điện tích trái dấu với G Các loại hạt nhựa trao đổi ion: nhựa polystyren, silicagel, polymer carbohydrate • Các bước sắc ký trao đổi ion: - Nhồi nhựa trao đổi ion vào cột: Giữ cột thẳng đứng giá, khóa vòi bên cột Nhựa trao đổi ion đã cân dung dịch đệm, lượng nhựa thể tích dung môi cho rót nhựa dễ dàng vào cột, không tạo bọt khí nằm giữ hạt nhực Để yên 5-10 phút cho hạt nhựa lắng xuống, rót đầy cột dung dịch đệm, mở khóa hạt nhựa lắng xuống Khi nhồi cột hoàn tất, cần cân cột chách cho dung dịch đệm chày qua cột, cuối kiểm tra pH dung dịch chảy khỏi cột - Nạp mẫu chất lên đầu cột: dung dịch mẫu lọc suốt trước nạp vào cỗt, lọc tờ giấy lọc hay ngang qua lớp celite Lượng mẫu tùy vào lượng nhựa khả trao đổi nhựa Điều quan trọng tất cấu tử quan trọng mẫu chất hấp thu hết vào nhựa, tức ý số lượng mẫu thể tích mẫu Để nạp mẫu lên cột: mở khóa để hạ mức dung dịch đệm xuống vừa sát mức nhựa đầu cột, khóa lại Dùng pipet hút đặt dung dịch mẫu lên đầu cột, mở khóa cho dung dịch mẫu hút vào lớp nhựa đầu cột Để yên 10-20 phút mẫu chất tiếp xúc cân với nhựa - Khi tất mẫu gắn lên đầu cột nhựa, cho vài ml dung dịch đệm ban đầu chảy qua, nối cột với bình cung cấp dung dich giải ly - Giải ly cách tắng dần nồng độ dung dịch giải ly: hỗn hợp mẫu gắn vào nhựa trao đổi ion dung dịch đệm có nồng độ thấp Để tách mẫu chất khỏi nhựa thường, cần phải gia tăng lực ion dung dịch đệm cách cho thêm NaCl Khi có thêm NaCl dung dịch đệm, ion dung dịch đệm cạnh tranh với hỗn hợp mẫu chất, để giành lấy nhóm chức họat động cảu nhựa, đẩy hợp chất khỏi nhựa, theo dòng chảy khỏi cột • Trong phương pháp sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh hạt mang sẵn điện tích định, hạt tương tác với phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng Cụ thể, hạt mang điện âm (như cột carboxymethylcellulose (CM-cellulose)), tiến trình gọi sắc ký trao đổi ion dương, tương tác với phân tử mang điện tích dương Ngược lại, hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAEcellulose)), gọi sắc ký trao đổi ion âm, tương tác với phân tử mang điện tích âm Vì thế, protein dấu với cột chạy khỏi cột protein trái dấu bị giữ lại cột Để phóng thích protein này, ta tăng nồng độ ion pha động, ion phân tử protein tương tác với hạt mang điện tích Ví dụ, sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác dung dịch tách giải ion natri tranh bám vào cột với protein có điện tích dương, đó, protein mang điện tích dương phóng thích cột theo độ lớn điện tích • Phép sắc kí trao đổi ion protein: Tại điểm pH trừ điểm đẳng điện, protein có mang điện tích tương ứng với điểm pH Dựa vào điện tích thực chúng điểm pH định, ta phân tách hỗn hợp protein Phương pháp gọi phương pháp sắc ký trao đổi ion Trong phương pháp này, pha tĩnh hạt mang sẵn điện tích định, hạt tương tác với phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng Cụ thể, hạt mang điện âm (như cột carboxymethylcellulose (CM-cellulose)), tiến trình gọi sắc ký trao đổi ion dương, tương tác với phân tử mang điện tích dương Ngược lại, hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)), gọi sắc ký trao đổi ion âm, tương tác với phân tử mang điện tích âm Vì thế, protein dấu với cột chạy khỏi cột protein trái dấu bị giữ lại cột Để phóng thích protein này, ta tăng nồng độ ion pha động, ion phân tử protein tương tác với hạt mang điện tích Ví dụ, sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác dung dịch tách giải ion natri tranh bám vào cột với protein có điện tích dương, đó, protein mang điện tích dương phóng thích cột theo độ lớn điện tích Hình 1: minh họa sắc ký trao đổi ion Hình 2: minh họa chế protein hệ sắc ký trao đổi ion (a) Những hạt mang điện tích dương trao đổi ion âm với dung dịch đệm Protein tích điện âm ion dương tương tác với (b) Khi protein gắn với hạt, protein thay ion âm tương tác với hạt hạt thay ion dương tương tác với protein 3.3 Sắc kí lực: Đây phương pháp hiệu ứng dụng rộng rãi việc tinh protein Kỹ thuật dựa lực cao nhiều protein với nhóm hóa học chuyên biệt Ví dụ, concanavalin A, loại protein thực vật, tinh cho qua cột mang phân tử glucose liên kết cộng hóa trị Concanavalin A gắn vào cột có lực cao với glucose, protein khác không Concanavalin A tách giải khỏi cột ta cho thêm dung dịch glucose đậm đặc vào Phân tử đường dung dịch gắn với Concanavalin A thay phân tử glucose nối với cột Hình 3: minh họa cho chế tinh Concanavalin A sắc ký lực Sắc ký lực công cụ hữu hiệu việc tách yếu tố phiên mã, protein điều hòa biểu gen thông qua việc gắn đặc hiệu với trình tự DNA Hỗn hợp protein thấm qua cột có chứa trình tự DNA đặc hiệu gắn vào thể mang; protein có lực cao với trình tự DNA bắt vào trình tự giữ lại Trong thí dụ này, yếu tố phiên mã phóng thích rửa cột với dung dịch có hàm lượng muối cao Ngoài ra, người ta dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên kháng thể để tinh kháng nguyên hay kháng thể Nhìn chung, sắc ký lực dùng để tách protein vốn có khả nhận biết nhóm X nối cộng hóa với nhóm hay chất dẫn xuất gắn cột, sau nạp hỗn hợp protein vào cột, cột rửa lại để loại bỏ protein không tạo nối, cuối tách giải protein mục tiêu dung dịch X với nồng độ cao hay thay đổi điều kiện để làm giảm lực liên kết Sắc ký lực phương pháp tinh hiệu tương tác protein phân tử dùng mồi bắt protein có độ chuyên biệt cao Sắc kí phân bố lỏng-lỏng hay sắckí chiết: Sự phân biệt sắc kí phân bố lỏng-lỏng phân bố thông thường chỗ sắc kí phân bố lỏng-lỏng gọi sắc kí chiết, pha tĩnh chất lỏng pha động chất lỏng, phân bố chất phân tích hai pha lỏng giống trình chiết, phân bố nói chung phân chia chất phân tích vào hai pha không cần xét tới lỏng hay rắn 3.4 10 Điểm khác sắc kí phân bố lỏng-lỏng sắc kí hấp phụ chỗ: sắc kí phân bố lỏng-lỏng có đường đẳng nhiệt tuyến tính khoảng nhiệt độ lớn , phương pháp có độ nhạy cao có nhược điểm pha tĩnh không bền vững, tượng trôi pha tĩnh làm cho độ lặp lại bị giảm 3.5 Sắc kí rây phân tử hay sắc kí gel: Pha tĩnh chất rắn có diện tích bề mặt lớn, xốp, có đường lòng chất rắn, gọi mao quản có kích thước cỡ phân tử Các phân tử chất phân tích thấm vào chất mức độ khác tùy theo kích thước chúng Các chất phân tích có kích thước lớn sâu vào pha tĩnh được, bị rửa giải nhanh phân tử chất phân tích có kích thước nhỏ phân bố sâu vào pha tĩnh bị rửa giải chậm Thứ tự rửa giải chất có kích thước nhỏ sau ngược lại Thời gian lưu chất tỉ lệ nghịch với kích thước phân tử chúng Tuy nhiên chất phân tích có tương tác với pha tĩnh Như phép sắc kí tách theo hay nhiều chế khác Các đại lượng đặc trưng sắc ký đồ 11 Hình 2:Kết trình tách chất Detector phát ghi thành sắc ký đồ T0 : Thời gian lưu chết t’r1 : Thời gian lưu thực chất A t’r2 : Thời gian lưu thực chất B tr1 : Thời gian lưu chất A tr2 : Thời gian lưu chất B Từ thông số đỉnh (peak) đây, nhiều đại lượng đặc trưngvề lý thuyết đưa để đánh giá trình sắc ký Dưới số đại lượng thường dùng thực tế cách thay đổi đại lượng có lợi cho trình phân tích sắc ký 4.1 Thời gian lưu thực t’r : Retention time Thời gian lưu chất thời gian tính từ bơm mẫu vào cột chất khỏi cột đạt giá trị cực đại Thời gian lưu chất địnhvà chất khác thờigian lưu khác điều kiện sắc ký chọn Vì thời gian lưu đại lượng để phát định tính chất Thời gian lưu phụ thuộc vào yếu tố : - Bản chất sắc ký pha tĩnh - Bản chất, thành phần, tốc độ pha động - Cấu tạo chất phân tử chất tan - Trong số trường hợp thời gian lưu phụ thuộc vào pH pha động Trong phép phân tích t r nhỏ tách kém, t r lớn peak bị doãng độ lặp lại peak kém, thời gian phân tích dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác hao tốn dung môi,hoáchất, độ xác phép phân tích Để thay đổi thời gian lưu dựa vào yếu tố trình bày 12 4.2 Hệ số dung lượng K’: Capacity Factor Hệ số dung lượng chất cho biết khả phân bố chất hai pha cộng với sức chứa cột tức tỷ số lượng chất tan trongpha tĩnh lượng chất tan pha động thời điểm cân K’ = ( tR– t0)/t0 Nếu K’ nhỏ tR nhỏ tách Nếu K’ lớn peak bị doãng Trong thực tế K’ từ 1- tối ưu 4.3 Độ chọn lọc α Độ chọn lọc α cho biết hiệu tách hệ thống sắc ký, chất A, B có K’A K’B khác có khả tách, mức độ tách biểu thị Độ chọn lọc α α = K’B/ K’A Với điều kiện K’B> K’A với α khác khả tách rõ ràng 4.4 Số đĩa lý thuyết N Số đĩa lý thuyết đại lượng biểu thị hiệu cột điều kiện sắc ký định Mỗi đĩa lý thuyết cột sắc ký giống lớp pha tĩnh có chiều cao H Tất nhiên lớp có tính chất động tức khu vực hệ phân tách mà cân nhiệt động học thiết lập nồng độ trung bình chất tan pha tĩnh pha động Bề dày H phụ thuộc vào nhiều yếu tố: - Đường kính độ hấp phụ hạt pha tĩnh - Tốc độ độ nhớt (độ phân cực)của pha động - Hệ số khuyếch tán chất cột Vì với điều kiên sắc ký xác định chiều cao H định chất phân tích số đĩa lý thuyết cột xác định Số đĩa lý thuyết N tính theo công thức sau: N = 5,54 (tr / W0,5)2 Trong đó: tR: Thời gian lưu chất phân tích W0,5: Độ rộng điểm 1/2 Peak Trong thực tế N nằm khoảng 2500 đến 5500 vừa đủ 4.5 Độ phân giải R: (Resolution) Độ phân giải đại lượng biểu thị độ tách chất khỏi trênmột điều kiện sắc ký cho Độ phân giải peak cạnh phải tính theo công thức sau: 13 R= 2( t’RB - t’RA)/ (WA + WB) Trong thực tế peak cân đối (Gass) độ phân giải tối thiểu để peak tách R=1,0.Trong phép định lượng R=1,5 phù hợp  Nếu R nhỏ peak chưa tách hẳn, việc tính toán diện tích peak không xác,lúc phải tìm cách tăng R theo cách sau: - Làm thay đổi K’ cách thay đổi lực rửa giải pha động (Thay đổi độphân cực RP - HPLC, thay đổi cường độ ion IE - HPLC ) - Làm tăng số đĩa lý thuyết cột cách dùng cột dài cột có kích thước nhỏ - Làm tăng độ chọn lọc α cách dùng cột khác phù hợp với trình tách thay đổi thành phần pha động  Nếu R lớn thời gian phân tích lâu, tốn nhiều pha động, độ nhạy Để khắc phục ta thay đổi hệ pha động hay dùng chương trình Gradient dung môi Tuy nhiên trình chạy sắc ký dùng chương trình dung môi số pha động có tỷ lệ thay đổi kéo theo thay đổi đường làm ảnh hưởng lớn đến thời gian lưu diện tích peak ta phân tích Trong thực tế nên hạn chế sử dụng chương trình Gradient dung môi mà chủ yếu phải tìm hệ pha động rửa giải phù hợp, đáp ứng yêu cầu trình phân tích 4.6 Hệ số không đối xứng T: ( Tailing factor) Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng peak sắc ký đồ thu T tính tỷ số độ rộng nửa peak điểm 1/10 chiều cao peak: Peak dạng đối xứng hình Gauss thực tế khó đạt phải quan tâm đến hệ số không đối xứng T  Khi T ≤ 2.5 phép định lượng chấp nhận  Khi T > 2.5 điểm cuối peak khó xác định,vì phép định lượng cần phải thay đổi điều kiện sắc ký để làm cho peack cân đối theo cách sau: - Làm giảm thể tích chết tức đoạn nối từ cột đến Detector - Thay đổi thành phần pha động cho khả rửa giải tăng lên - Giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột cách pha loãng mẫu hay giảm thể tích tiêm mẫu 14 Hệ thống HPLC Máy HPLC gồm phận tóm tắt sơ đồ sau: Trong đó: 1- Bình chứa dung môi pha động 2- Bộ phận khử khí 3- Bơm cao áp 4-Bộ phận tiêm mẫu (bằng tay hay Autosample) 5-Cột sắc ký (Pha tĩnh) (để môi trường hay bể điều nhiệt) 6- Detector (nhận tín hiệu) 7-Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận tín hiệu xử lý liệu điềukhiển hệ thống HPLC 8- In liệu 5.1 Bình đựng dung môi Hiện máy HPLC thường có đường dung môi vào đầu bơm cao áp.Cho phép sử dụng bình chứa dung môi lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn tổng tỉ lệ dung môi đường 100 % Tuy nhiên theo kinh nghiệm sử dụng đường dung môi lúc mà sử dụng tối đa 3và đường hệ pha động pha trộn đồng hơn, hệ pha động đơn giản để trình rửa giải ổn định Hiện đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải Gradient dung môi theo thời gian công tác xây dựng tiêu chuẩn Lưu ý : - Tất dung môi dùng cho HPLC phải dung môi tinh khiết cóghi rõ nhãn dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích - Tất hóa chất dùng để pha mẫu vàpha hệ đệm phải sử dụng hóa chất tinh khiết phân tích 15 Nhằm mục đích tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo peak tạp trình phân tích 5.2 Bộ khử khí Degasse Mục đích khử khí nhằm loại trừ bọt nhỏ sót lại dung môi pha động Nếu trình phân tích mà dung môi pha động sót bọt khí số tượng sau sảy ra: - Tỷ lệ pha động đường dung môi lấy không làm cho thời gian lưu peak thay đổi - Trong trường hợp bọt nhiều, khử khí loại trừ hết bơm không hút dung môi (bị e), áp suất không lên máy sắc ký ngừng hoạt động Trong trường hợp nêu cho kết phân tích sai 5.3 Bơm Cao áp Mục đích để bơm pha động vào cột thực trình chia tách sắc ký Bơm phải tạo áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI 250 at đến - 500 at (1at=0.98 bar) bơm phải tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 9.999ml/phút (hiện có nhiều loại Pump có áp suất cao lên đến 1200 bar) Máy sắc ký lỏng thường có áp suất tối đa 412 bar Tốc độ dòng 0.1-9.999 ml/phút Tốc độ bơm định theo thông số cài đặt Hiện bơm có pistone để thay phiên đẩy dung môi liên tục 5.4 Bộ phận tiêm mẫu ( injection) Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương phápkhông ngừng dòng chảy Với dung tích đường cong kín (loop) 5-100 µl Có cách lấy mẫu vào cột: Bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm tay) tiêm mẫu tự động (Autosample) 5.5 Cột sắc ký Cột chứa pha tĩnh coi trái tim hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Cột pha tĩnh thông thường làm thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10-30cm, đường kính 1-10mm, hạt chất nhồi cỡ Ф= 5-10 µm (ngoài có số trường hợp đặc biệt kích thước kích cỡ hạt ) Với chất nhồi cột cỡ Ф = 1.8-5 µm dùng cột ngắn (3-10 cm) nhỏ (đường kính 1-4.6 mm) loại cột có hiệu tách cao Chất nhồi cột tùy theo lọai cột kiểu sắc ký (trong dược điển USP 23,24 có tiêu chuẩn hóa lọai cột) Thông thường chất nhồi cột Silicagel (pha thuận) Silicagel Silan hóa bao lớp mỏng hữu (pha đảo), người ta dùng loại hạt khác như: Nhôm Oxit, Polyme xốp, chất trao đổi ion Đối với số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao thấp nhiệt độ phòng cột đặt phận điều nhiệt (Oven column) 16 5.6 Detector Là phận Phát chất chúng khỏi cột cho tín hiệu ghi sắc ký đồ để định tính định lượng Tùy theo tính chất chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại Detector thích hợp phải thoả mãn điều kiện vùng nồng độ định chất phân tích A=k.C Trong : A tín hiệu đo C Nồng độ chất phân tích k số thực nghiệm Detector chọn Tín hiệu là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất Trên sở người ta chế tạo lọai Detector sau: - Detector quang phổ tử ngoại 200-380 nm để phát UV - Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV - VIS): 190-900 nm để phát chất hấp thụ quang, loại thông dụng - Detector huỳnh quang đến phát chất hữu phát huỳnh quang tự nhiên dẫn chất có huỳnh quang Là loại Detector có độ chọn lọc cao - Loại đại có Detector Diod Array, ELSD (Detector tán xạ bay hơi) Detector có khả quét chồng phổ để định tính chất theo độ hấp thu cực đại củacác chất Ngoài có số loại Detector khác : - Detector điện hóa: Đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng ) - Detector chiết suất vi sai: Detector khúc xạ (thông thường dùng cho đo chất đường) - Detector đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt 5.7 Bộ phận ghi tín hiệu Để ghi tín hiệu phát Detector truyền sang Trong máy hệ cũ sử dụng máy ghi đơn giản vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích peak, chiều cao Các máy hệ dùng phần mềm chạy máy tính lưu tất thông số, phổ đồ thông số peak tính đối xứng, hệ số phân giải trình phân tích đồng thời xử lý, tính toán thông số theo yêu cầu người sử dụng như: nồng độ, RSD, 5.8 In kết Sau phân tích xong mẫu ta in kết phần mềm tính toán giấy để hoàn thiện hồ sơ Sắc kí lỏng ghép hai lần khối phổ: 17 Sắc ký ghép khối phổi hay tên tiếng Anh Liquid chromatography–mass spectrometry (LC-MS/ HPLC-MS) kỹ thuật hóa học mà gắn kết tiềm phân tích lý học sắc ký lỏng (hay HPLC) với khả phân tích khối (mass analysis) chế khối phổ (mass spectrometry) Thiết bị LC-MS kỹ thuật đầy tiềm sử dụng nhiều ứng dụng có độ nhạy tính chọn lọc cao Nhìn chung ứng dụng có định hướng phát chung xác định chất hóa học có mặt chất hóa học khác (trong hợp chất phức tạp) Hệ thống chuẩn bị công việc LC-MS dùng làm tính khiết khối nhanh chất chiết xuất tự nhiên phân tử quan trọng với thực phẩm, dược phẩm, hóa chất nông nghiệp ngành công nghiệp khác Hạn chế LC-MS phân tích/sàng lọc thuốc nước tiểu thường khó phân biệt chất chuyển hóa đặc biệt với nhau, đặc biệt với hydrocodone chất chuyển hóa Phân tích nước tiểu LC-MS dùng để phát phân loại đặc biệt cho thuốc Tuy nhiên, sắc ký khí (Gas chromatography_GC-MS) nên sử dụng phát thuốc đặc hiệu chất chuyển hóa yêu cầu Được ứng dụng trong: - Phân tích đánh giá chất lượng thuốc (thuốc giả thuốc chất lượng) - Nghiên cứu phân tích kháng thuốc điều trị - Phân tích đánh giá dược động học súc vật thực nghiệm thử thuốc Chọn điều kiện sắc ký Muốn có kết tách tốt ta phải tìm điều kiện sắc ký tốt cho hỗn hợp mẫu Các điều kiện bao gồm:  Pha tĩnh: - Loại pha tĩnh - Kích thước cột  Pha động : - Thành phần tỷ lệ, pH, tốc độ dòng, nhiệt độ chương trình rửa giải Isocratic - Thành phần tỷ lệ, pH, tốc độ dòng, nhiệt độ chương trình dung môi chương trình rửa giải Gradient - Hệ thống trang bị: • Loại Detector • Van tiêm mẫu, thể tích tiêm • Hệ đường dẫn - Các yếu tố khác: nhiệt độ, độ nhạy detector bước sóng phân tích 7.1 Lựa chọn pha tĩnh Dựa vào tài liệu, dược điển, thành phần tính chất chất có mẫu phân tích ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp Thông thường dùng hai loại cột pha thuận (NP), cột pha đảo (RP) Ngoài dùng số loại cột khác cột CN, cột NH2, 18 - Cột pha thuận (NP): Silicagel trung tính • Pha tĩnh:Cột loại cột dùng để tách chất không phân cực hay phân cực Trên bề mặt hoạt động có chứa nhóm OH phân cực ưa nước Ví dụ: cột Lichrosorb Si 40,Si 60 Cấu tạo cột sau: • Pha động: dùng cho loại dung môi không phân cực hay phân cực như: Methanol, Benzen, Acetonitril, Chlorofoc - Cột pha đảo (RP): (Silicagel Alkyl hóa): Dùng để tách chất không phân cực, phân cực, chất phân cực tạo cặp Ion Trên bề mặt hoạt động nhóm OH bị Alkyl hóa tức thay nguyên tử H mạch Carbon thẳng (C8 hay C18 tương đương RP hay RP 18) hay mạch Carbon vòng (Phenyl- tương đương cột Phenyl) phân cực hay phân cực Ví dụ cột Lichrosor -Lichrospher RP ODS, cột Nucleosil C18 • Pha Động: Pha động dùng loại dung môi có phân cực như: Methanol, Acetonitril, nước hay loại dung dịch đệm, hỗn hợp dung môi-đệm Sự tách chất nhồi loại cột có độ lặp lại cao ứng dụng chủ yếu phân tích dược phẩm Hiện sử dụng loại chủ yếu Hiện pha tĩnh Silicagel có hàng trăm chất khác tùy thuộc vào nhóm nguyên tử H, có lọai pha tĩnh oxit nhôm, chất hữu cao phân tử, mạch cacbon 7.2 Lựa chọn pha động Dựa vào tài liệu, dược điển, thành phần tính chất chất có mẫu phân tích ta lựa chọn pha động phù hợp trình rửa giải tách hoàn toàn chất có mẫu đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn peak trình bày, đồng thời phải có thời gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm dung môi, hóa chất, thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu hoạt động thiết bị Pha động làm thay đổi : - Độ chọn lọc α - Thời gian lưu - Hiệu tách cột - Độ phân giải - Tính đối xứng Peak Do đó, pha tĩnh chọn ta chọn pha động có thành phần 19 phù hợp ta có hiệu suất tách sắc ký tốt hỗn hợp chất cần phân tích Chính pha động cần có cầu yêu cầu sau : - Pha động phải trơ với pha tĩnh có.Không làmcho pha tĩnh bị biến đổi hóa học (vd giá trị pH: 2.5< pH [...]... nhiều loại hợp chất khác nhau Tuy hiệu năng tách của sắc ký lỏng cao áp không cao bằng sắc ký khí nhưng khả năng phân tích của nó rộng hơn nhiều Có thể dùng sắc ký lỏng cao áp để phân tích các chất từ chất phân cực tới không phân cực, từ các chất bay hơi tới các chất không bay hơi, từ các chất trung tính tới các chất điện ly Tính linh hoạt của sắc ký lỏng cao áp cũng cao hơn các phương pháp khác nhờ các... có kích thước thay đổi từ 1 – 10 cm Trong quy mô công nghiệp, các cột sắc ký lỏng cao áp điều chế có thể có đường kính trong tới 100 cm So với sắc ký cột cổ điển, sắc ký lỏng cao áp có chi phí cao hơn nên thường chỉ sử dụng trong các trường hợp không tác được bằng các phương pháp sắc ký cột thông thường hay MPLC 23 KẾT LUẬN: Sắc ký là một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực trên thế... xác định các nguyên liệu khác pha trộn vào dược liệu, xác định các sản phẩm dược liệu nhái, giả mạo nhãn hiệu So với sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng cao áp có hiệu năng tách cao hơn nên cho các kết quả điểm chỉ chi tiết và nhiều giá trị hơn Khi kết hợp với các thiết bị quang phổ hiện đại, sắc ký lỏng cao áp cung cấp nhiều thông tin giá trị trong việc xác định các chất Nhiều nhà nghiên cứu hiện nay sử dụng... kiện sắc ký như : • Cấu hình máy • Tỷ lệ các dung môi pha động 21 • Bước sóng,thành phần mẫu, các thông số của quá trình phân tích yêu cầu 9 Ứng dụng của phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có 3 ứng dụng chính: 9.1 Định tính và khử độ tinh khiết Thời gian lưu của chất thử trên sắc đồ phải tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn đối chiếu tên sắc ký đồ 9.2 Sắc ký. .. Với hiệu năng tách cao, khả năng phân tích rộng như vậy, sắc ký lỏng cao áp hiện vẫn là lựa chọn ưu tiên trong phân tích hay điều chế các chất Sắc ký lỏng cao áp thường được sử dụng nhất trong định lượng riêng lẻ các chất trong hỗn hợp phức tạp của dịch chiết dược liệu khi so sánh diện tích đỉnh với chất chuẩn trong cùng điều kiện phân tích Với pha tĩnh ngày càng được hoàn thiện và đổi mới để nâng cao. .. lựa chọn điều kiện sắc ký là công việc hết sức cần thiết trong quá trình xây dựng chương trình sắc ký Chỉ khi lựa chọn điều kiện sắc ký tốt, phù hợp thì chúng ta mới có thể định tính, định lượng được các lọai thuốc đa thành phần một cách nhanh chóng và hiệu quả cao Tất nhiên phần lý thuyết nói rất nhiều về các phương pháp chọn điều kiện sắc ký tuy nhiên để chọn được chương trình sắc ký tốt đồi hỏi phải... đồ 9.2 Sắc ký điều chế Qua quá trình sắc ký, các chất được tách ra và dịch rửa giải được hứng riêng rồi cho bốc hơi dung môi thu lấy chất 9.3 Định lượng Sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng dụng rất lớn trong định lượng chất trong hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất Các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của một chất tỉ lệ với chiều cao hoặc điện tích pic của nó Một số... kiện phân tích Với pha tĩnh ngày càng được hoàn thiện và đổi mới để nâng cao hiệu năng tách, detectorngày càng nhạy, sắc ký cao ngày nay có thể dễ dàng phân tích các chất trong hỗn hợp ở mức ppm tới ppb, thậm chí ppt Sắc ký lỏng cao áp hiện nay cũng đang được quan tâm trong phân tích điểm chỉ các chất trong hỗn hợp Với sắc ký điểm chỉ, người ta có thể xác định nguốn gốc xuất xứ của dược liệu, phân biệt... lọc cao có thể phân tích các độc tố Mycotoxin trong thực phẩm, nguyên liệu chế biến và thức ăn gia súc như Aflatoxin, Orchatoxin, Zearalenone,… 9.3.2 Ứng dụng trong dược liệu Sắc ký lỏng cao áp có rất nhiều ứng dụng trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên nói chung và nghiên cứu dược liệu nói riêng Ưu điểm lớn nhất của sắc ký lỏng cao áp là có thể phân tích được rất nhiều loại hợp chất khác nhau Tuy hiệu. .. hoàn thiện hồ sơ 6 Sắc kí lỏng ghép hai lần khối phổ: 17 Sắc ký ghép khối phổi hay tên tiếng Anh là Liquid chromatography–mass spectrometry (LC-MS/ hoặc HPLC-MS) là một kỹ thuật hóa học mà gắn kết tiềm năng phân tích lý học của sắc ký lỏng (hay HPLC) với một khả năng phân tích khối (mass analysis) của cơ chế khối phổ (mass spectrometry) Thiết bị LC-MS là một kỹ thuật đầy tiềm năng sử dụng trong nhiều