Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Mục Lục 1. Giới thiệu khái quát 1 1.1. Khái niệm 1 1.2. Quá trình hình thành và phát triển 1 2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột 2 3. Phân loại sắc ký 3 3.1. Sắc ký hấp phụ 3 3.2. Sắc kí trao đổi ion: 4 3.3. Sắc kí ái lực: 7 3.4. Sắc kí phân bố lỏnglỏng hay sắckí chiết: 8 3.5. Sắc kí rây phân tử hay sắc kí gel: 9 4. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ 9 4.1. Thời gian lưu thực t’r : Retention time 10 4.2. Hệ số dung lượng K’: Capacity Factor 11 4.3. Độ chọn lọc α 11 4.4. Số đĩa lý thuyết N 11 4.5. Độ phân giải R: (Resolution) 11 4.6. Hệ số không đối xứng T: ( Tailing factor) 12 5. Hệ thống HPLC 13 5.1. Bình đựng dung môi 13 5.2. Bộ khử khí Degasse 14 5.3. Bơm Cao áp 14 5.4. Bộ phận tiêm mẫu ( injection) 14 5.5. Cột sắc ký 14 5.6. Detector 14 5.7. Bộ phận ghi tín hiệu 15 5.8. In kết quả 15 6. Sắc kí lỏng ghép hai lần khối phổ: 15 7. Chọn điều kiện sắc ký 16 7.1. Lựa chọn pha tĩnh 16 7.2. Lựa chọn pha động 17 8. Kỹ thuật tiến hành sắc ký 18 8.1. Chuẩn bị dụng cụ và máy móc 18 8.2. Chuẩn bị dung môi pha động 19 8.3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC 19 8.4. Cách đo HPLC 19 9 . Ứng dụng của phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao 20 9.1. Định tính và khử độ tinh khiết 20 9.2. Sắc ký điều chế 20 9.2.1. Phương pháp chuẩn ngoại 20 9.2.2. Phương pháp chuẩn nội (internal standard method) 20 9.2.3. Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic (area normalisation) 20 9.3. Một số ứng dụng khác 20 9.3.1. Ứng dụng HPLC trong phân tích mẫu tại CASE 20 9.3.2. Ứng dụng trong dược liệu 21

Mục Lục

LỜI MỞ ĐẦU

Các tế bào sống chứa hàng trăm loại hợp chất hóa học khác nhau Các hợp chất này bao gồm những đại phân tử như protein, acid nucleic, lipid,… cũng như các hợp chất có trọng lượng phân tử nhỏ Những hợp chất trên có hiện diện ở số lượng nhỏ, dưới dạng vết (enzyme) hay ở số lượng nhiều (các protein cấu tạo) Người ta muốn biết các thành phần hóa học của tế bào, nhằm hiểu rõ các quy trình biến đổi căn bản của nó, qua đó giúp cuộc sống ngày càng thêm tốt đẹp Muốn vậy, người ta phải tìm cách tách riêng chúng để xác định cấu trúc hóa học Từ đó kỹ thuật tách riêng các hợp chất ra đời, trong đó sắc ký là phương pháp hữu hiệu nhất để tách các chất ra khỏi một hỗn hợp, ngay cả những hỗn hợp phức tạp về thành phần và khác nhau về hàm lượng trong hỗn hợp như dịch chiết từ các hợp chất từ cây cỏ

Từ khi ra đời (1903) cho tới nay rất nhiều kỹ thuật sắc ký cũng như các cải tiến về thiết bị và phương pháp phát hiện được phát triển và áp dụng trong thực tế để phân tích định tính, định lượng và chiết tách các chất dù có màu hay không, dù trọng lượng phân tử nhỏ hay lớn Nhưng vì các phân tử sinh học thì muôn hình vạn trạng với trọng lượng phân tử lớn nhỏ khác nhau, tính phân cực nhiều hay ít khác nhau nên có rất nhiều các kĩ thuật sắc ký khác nhau

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong nhiều năm gần đây Nó được áp dụng để tách nhận dạng và xác định hàng loạt các hợp chất mà một số phương pháp trước đây gặp nhiều khó khăn như các hợp chất không bền với nhiệt, các hợp chất có tính chất hóa học tương tự nhau Phương pháp HPLC cũng có nhiều ưu điêm mà các phương pháp khác không có như: xác định đồng thời được nhiều chất, tốn ít mẫu, thao tác đơn giản… Qua đề tài này, nhóm sẽ đi sâu phân tích nhằm giúp thầy và các bạn hiểu rõ hơn về phương pháp hiện đại này

1 Giới thiệu khái quát

1.1 Khái niệm

HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography),trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)

Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều nghành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho nghành kiểm nghiệm thuốc Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử)

1.2 Quá trình hình thành và phát triển

Ra đời từ năm 1967-1968 tuy nhiên vào cuối những năm 1970, sắc ký lỏng hiệu năng cao trở thành thuật ngữ phổ biến hơn(prefered), nhấn mạnh sự chia cắt có hiệu quả đạt được (the effective separations achieved) Thực ra, cột mới hơn và vật liệu đệm (packing materials) cung cấp hiệu suất cao tại áp suất vừa phải (moderate) ( mặc

dù áp lực cao vẫn liên quan đến dòng lưu lượng (gravity-flow) sắc ký lỏng) HPLC có thể được áp dụng cho sự phân tích bất kì hợp chất nào mà tan được trong chất lỏng có thể được dùng như là pha động Mặc dù được sử dụng thường xuyên nhất như kỹ thuật phân tích, HPLC cũng có thể được dùng trong chế độ chuẩn bị(preparative mode) Có nhiều ưu điểm của HPLC vượt qua sắc ký lỏng cột cổ điển áp suất thấp:

- Tốc độ (nhiều phân tích có thể hoàn thành trong 30 phút hoặc ít hơn)

- Một loạt các pha tĩnh.Cách giải quyết được cải thiện

- Độ nhạy lớn hơn (Nhiều máy dò có thể được tận dụng)

- Mẫu dễ phục hồi (easy sample recovery)(cần sử dụng ít chất rửa giải hơn (less eluent volume to remove))

Ứng dụng của HPLC vào phân tích thực phẩm bắt đầu vào cuối những năm

1960, và việc sử dụng nó được tăng lên cùng với sự phát triển của vật liệu đóng cột mà

2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và lọai sắc ký

- Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có Sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo

- Nếu pha tĩnh là chất trao đổi Ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion

- Nếu pha tĩnh là chất Lỏng thì ta có Sắc ký phân bố hay sắc ký chiết

- Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có Sắc ký Gel hay Rây phân tử

Cùng với pha tĩnh để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần có một pha động

Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C… Vào cột phân tích, kết quả các chất A, B, C Sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác

Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ trên cột là nhỏ nhất (F1) và ngược lại

Đối với mỗi chất,sự lưu giữ được qui định bởi 3 lực F1,F2,F3.Trong đó F1 và F2 giữ vai trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn

Ở đây F1 là lực giữ chất phân tích trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột

Như vậy với các chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột (như hình dưới đây)

Chất phân tích A+B+C

FF

F

Hình 1:Phần minh hoạ quá trình tách các chất A và B trongcột tách sắc ký

- Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP - HPLC): Pha tĩnh phân cực,pha động không phân cực

- Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC): Pha tĩnh không phân cực,pha động phân cực

Loại sắc ký này được áp dụng rất thành công để tách hỗn hợp các chất có tính chất gần tương tự nhau và thuộc loại không phân cực,phân cực yếu hay trung bình như

Sự trao đổi ion là sự gắn kết có tính chất thuận nghịch giữa các phân tử có mang điện tích Trong sắc ký cột nhồi , pha tĩnh R có gắn thêm nhóm chức G mang điện tích Giả sử cho đi ngang qua cột một hỗn hợp mẫu chất ban đầu có chứa nhiều lọai chất tan (solute) khác nhau, chất tan nào có mang điện tích ngược dấu với điện tích của nhóm chức, thí dụ chất tan S, chất tan sẽ đuổi đối ion hC ra thế chỗ vào, để gắn vào pha tĩnh, và như thế chất tan sẽ bị giữ lại trong cột, trong khi đó những chất khác của hỗn hợp mẫu chất ban đầu sẽ không bị giữ lại nên đi ra khỏi cột Kỹ thuật này tách riêng được hợp chất S ra khỏi hỗn hợp ban đầu.

RG- + S+ -> RG-S+ + C+

Hoặc RG+ +S- -> RG+S- + C

Trong đó: R là pha tĩnh hay gọi là nhựa (resin), G là nhóm chức mang điện tích được cố định trên pha tĩnh hay còn gọi là nhóm chức họat động của nhựa C là đối ion của G S là chất hữu cơ có mang điện tích trái dấu với G Các loại hạt nhựa trao đổi ion: nhựa polystyren, silicagel, polymer carbohydrate

• Các bước trong sắc ký trao đổi ion:

- Nhồi nhựa trao đổi ion vào cột: Giữ cột thẳng đứng trên giá, khóa vòi bên dưới cột Nhựa trao đổi ion đã đã được cân bằng trong dung dịch đệm, lượng nhựa và thể tích dung môi sao cho có thể rót nhựa dễ dàng vào cột, không tạo ra những bọt khí nằm giữ các hạt nhực Để yên 5-10 phút cho các hạt nhựa lắng xuống, rót đầy cột bằng dung dịch đệm, mở khóa để cho hạt nhựa lắng xuống Khi nhồi cột hoàn tất, cần cân bằng cột bằng chách cho dung dịch đệm chày qua cột, cuối cùng kiểm tra pH của dung dịch chảy ra khỏi cột

- Nạp mẫu chất lên đầu cột: dung dịch mẫu được lọc trong suốt trước khi nạp vào cỗt, lọc bằng tờ giấy lọc hay ngang qua một lớp celite Lượng mẫu tùy vào lượng nhựa cũng như khả năng trao đổi của nhựa Điều quan trọng nhất là làm sao để cho tất

cả các cấu tử quan trọng của mẫu chất được hấp thu hết vào nhựa, tức là chú ý số lượng mẫu hơn là thể tích của mẫu Để nạp mẫu lên cột: mở khóa để hạ mức dung dịch đệm xuống vừa sát mức nhựa ở trên đầu cột, khóa lại Dùng pipet hút và đặt dung dịch mẫu lên đầu cột, mở khóa cho dung dịch mẫu hút vào lớp nhựa ở trên đầu cột Để yên 10-20 phút để cho mẫu chất tiếp xúc cân bằng với nhựa

- Khi tất cả mẫu đã được gắn lên đầu cột nhựa, cho vài ml dung dịch đệm ban đầu chảy qua, nối cột với bình cung cấp dung dich giải ly

- Giải ly bằng cách tắng dần nồng độ dung dịch giải ly: hỗn hợp mẫu đang gắn vào nhựa trao đổi ion trong dung dịch đệm có nồng độ thấp Để có thể tách mẫu chất

ra khỏi nhựa thường, cần phải gia tăng lực ion của dung dịch đệm bằng cách cho thêm NaCl Khi có thêm NaCl trong dung dịch đệm, ion của dung dịch đệm sẽ cạnh tranh với hỗn hợp mẫu chất, để giành lấy những nhóm chức họat động cảu nhựa, đẩy hợp chất ra khỏi nhựa, rồi theo dòng chảy đi ra khỏi cột

• Trong phương pháp sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAEcellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein

tương tác với các hạt mang điện tích Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích dương, do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích.

• Phép sắc kí trao đổi ion của protein:

Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều có mang một điện tích tương ứng với điểm pH đó Dựa vào điện tích thực của chúng tại một điểm

pH nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein Phương pháp này gọi là phương pháp sắc ký trao đổi ion Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích dương, do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích

Hình 1: minh họa sắc ký trao đổi ion

Hình 2: minh họa cơ chế giữa protein trong hệ sắc ký trao đổi ion.

(a) Những hạt mang điện tích dương sẽ trao đổi ion âm với dung dịch đệm Protein tích điện âm cũng ion dương tương tác với nó

(b) Khi protein gắn với hạt, protein thay thế những ion âm tương tác với hạt cũng như hạt thay thế những ion dương tương tác với protein

3.3 Sắc kí ái lực:

Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của nhiều protein với những nhóm hóa học chuyên biệt Ví dụ, concanavalin A, một loại protein thực vật, có thể được tinh sạch khi cho qua cột mang những phân tử glucose bằng liên kết cộng hóa trị Concanavalin A gắn vào cột bởi vì nó có ái lực cao với glucose, trong khi đó những protein khác thì không Concanavalin A có thể được tách giải khỏi cột khi ta cho thêm dung dịch glucose đậm đặc vào Phân tử đường trong dung dịch sẽ gắn với Concanavalin A thay thế những phân tử glucose nối với cột

Hình 3: minh họa cho cơ chế tinh sạch Concanavalin A bằng sắc ký ái lực

Sắc ký ái lực còn là một công cụ hữu hiệu trong việc tách các yếu tố phiên mã, những protein điều hòa sự biểu hiện gen thông qua việc gắn đặc hiệu với trình tự DNA Hỗn hợp protein thấm qua cột có chứa những trình tự DNA đặc hiệu được gắn vào thể mang; những protein có ái lực cao với trình tự DNA sẽ bắt vào các trình tự và được giữ lại Trong thí dụ này, yếu tố phiên mã sẽ được phóng thích khi rửa cột với dung dịch có hàm lượng muối cao Ngoài ra, hiện nay người ta dựa vào tính đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể để tinh sạch kháng nguyên hay kháng thể Nhìn chung, sắc ký ái lực có thể được dùng để tách một protein vốn có khả năng nhận biết một nhóm X bằng nối cộng hóa với nhóm này hay những chất dẫn xuất của nó được gắn trên một cái cột, sau đó nạp hỗn hợp protein vào cột, cột này sẽ được rửa lại để loại bỏ những protein không tạo được nối, cuối cùng là tách giải protein mục tiêu bằng dung dịch X với nồng độ cao hay thay đổi điều kiện để làm giảm lực liên kết Sắc ký ái lực là phương pháp tinh sạch hiệu quả nhất khi tương tác giữa protein và phân tử được dùng như mồi bắt protein có độ chuyên biệt cao

3.4 Sắc kí phân bố lỏng-lỏng hay sắckí chiết:

Sự phân biệt giữa sắc kí phân bố lỏng-lỏng và sự phân bố thông thường là ở chỗ sắc kí phân bố lỏng-lỏng còn được gọi là sắc kí chiết, pha tĩnh là chất lỏng pha động cũng là chất lỏng, sự phân bố chất phân tích giữa hai pha lỏng giống như quá trình chiết, còn sự phân bố nói chung là sự phân chia chất phân tích vào hai pha không cần xét tới lỏng hay rắn

Điểm khác nhau cơ bản giữa sắc kí phân bố lỏng-lỏng và sắc kí hấp phụ là ở chỗ: sắc kí phân bố lỏng-lỏng có đường đẳng nhiệt tuyến tính ở khoảng nhiệt độ lớn , phương pháp có độ nhạy cao nhưng có nhược điểm là pha tĩnh không được bền vững, hiện tượng trôi mất pha tĩnh làm cho độ lặp lại bị giảm.

3.5 Sắc kí rây phân tử hay sắc kí gel:

Pha tĩnh là các chất rắn có diện tích bề mặt lớn, xốp, có những đường đi trong lòng chất rắn, còn gọi là mao quản có kích thước cỡ phân tử Các phân tử chất phân tích có thể thấm vào chất đó ở mức độ khác nhau tùy theo kích thước của chúng Các chất phân tích có kích thước lớn không thể đi sâu vào pha tĩnh được, sẽ bị rửa giải nhanh còn các phân tử chất phân tích có kích thước nhỏ phân bố sâu vào pha tĩnh sẽ bị rửa giải chậm Thứ tự rửa giải là các chất có kích thước nhỏ đi ra sau và ngược lại Thời gian lưu của các chất tỉ lệ nghịch với kích thước phân tử của chúng Tuy nhiên chất phân tích có thể có tương tác với pha tĩnh Như vậy một phép sắc kí có thể tách theo một hay nhiều cơ chế khác nhau

4 Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ

Hình 2:Kết quả của quá trình tách các chất được Detector phát hiện ghi thành sắc ký

đồ

T0 : Thời gian lưu chết

t’r1 : Thời gian lưu thực chất A

t’r2 : Thời gian lưu thực chất B

tr1 : Thời gian lưu chất A

tr2 : Thời gian lưu chất B

Từ các thông số của các đỉnh (peak) trên đây, nhiều đại lượng đặc trưngvề lý thuyết được đưa ra để đánh giá một quá trình sắc ký Dưới đây là một số đại lượng thường dùng trong thực tế và cách thay đổi các đại lượng này có lợi cho quá trình phân tích sắc ký

4.1 Thời gian lưu thực t’r : Retention time

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ khi bơm mẫu vào cột cho đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại Thời gian lưu của mỗi chất là hằng địnhvà các chất khác nhau thì thờigian lưu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện sắc ký đã chọn

Vì vậy thời gian lưu là đại lượng để phát hiện định tính các chất

Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố :

- Bản chất sắc ký của pha tĩnh

- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động

- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan

- Trong một số trường hợp thời gian lưu còn phụ thuộc vào pH của

pha động

Trong một phép phân tích nếu tr nhỏ quá thì sự tách kém, còn nếu tr quá lớn thì peak bị doãng và độ lặp lại của peak rất kém, thời gian phân tích rất dài đồng thời kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi,hoáchất, độ chính xác của phép phân tích kém

Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố trên đã trình bày