TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “Khảo sát ảnh hưởng của pH lên quá trình thủy phân protein của phụ phẩm ” được tiến hành tại phòng thí nghiệm Khoa Thủy sản Trường Đại học Nông lâm Tp.HCM, thời gian từ tháng 4 đến tháng 72015 với mục đích xem xét so sánh ảnh hưởng của pH lên hiệu suất thủy phân protein của phụ phẩm mực. Thí nghiệm nghiên cứu được bố trí với 4 nghiệm thức pH, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Tiến hành điều chỉnh pH bằng cách: xử lý với HCl và NaOH, quá trình thủy phân diễn ra ở nhiệt độ phòng. Các nghiệm thức khảo sát là pH=2, pH=5, pH=6, pH=8. Thời gian thủy phân là 10 giờ với nghiệm thức pH=2, pH=5, pH=8. Thời gian thủy phân là 28 giờ với nghiệm thức pH=6. Qua kết quả nghiên cứu có thể kết luận như sau: Thủy phân tự nhiên dưới tác dụng enzyme nội tại (pH=6), thời gian thủy phân tương đối dài, độ thủy phân cao nhất đạt được 16% sau 28 giờ thủy phân, dùng kiềm hay acid để thủy phân thì thời gian thủy phân ngắn hơn, thời gian thủy phân 10 giờ luôn cho hiệu suất thủy phân cao nhất ở tất cả các thời điểm. Nghiêm thức pH =2 cho hiệu suât thủy phân cao nhất (17,9%), tiếp đó là pH=8, pH=5, thấp nhất là pH=6. Hàm lượng lượng đạm amin đạt cao nhất (3,92gl), đạm amonia cao nhất (0,48gl) vào giờ thủy phân thứ 10 ở nghiệm thức pH=2.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA THỦY SẢN & KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA pH LÊN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN CỦA PHỤ PHẨM MỰC Sinh viên thực : Bùi Thị Hồng Trang Ngành : Công Nghệ Chế Biến Thủy Sản Niên khoá : 2011- 2015 Tháng năm 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA THỦY SẢN & KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA pH LÊN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN CỦA PHỤ PHẨM MỰC Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS Nguyễn Phúc Cẩm Tú Bùi Thị Hồng Trang Tp.Hồ Chí Minh, tháng năm 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy TS Nguyễn Phúc Cẩm Tú, tận tình hướng dẫn suốt trình viết khóa luận tốt nghiệp Tôi chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô Khoa thủy sản Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM tận tình truyền đạt kiến thức năm học tập Với vốn kiến thức tiếp thu trình học không tảng cho trình nghiên cứu khóa luận mà hành trang quí báu để bước vào đời cách vững tự tin Tôi chân thành cảm ơn thầy PGS – TS Lê Thanh Hùng, ThS Nguyễn Thị Thanh Trúc hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ suốt thời gian thực tập tốt nghiệp,các thầy cô, anh chị,các bạn cho phép tạo điều kiện thuận lợi để làm việc phòng thí nghiệm Cuối xin kính chúc quý Thầy, Cô dồi sức khỏe thành công nghiệp cao quý TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “Khảo sát ảnh hưởng pH lên trình thủy phân protein phụ phẩm ” tiến hành phòng thí nghiệm Khoa Thủy sản Trường Đại học Nông lâm Tp.HCM, thời gian từ tháng đến tháng 7/2015 với mục đích xem xét so sánh ảnh hưởng pH lên hiệu suất thủy phân protein phụ phẩm mực Thí nghiệm nghiên cứu bố trí với nghiệm thức pH, nghiệm thức lặp lại lần Tiến hành điều chỉnh pH cách: xử lý với HCl NaOH, trình thủy phân diễn nhiệt độ phòng Các nghiệm thức khảo sát pH=2, pH=5, pH=6, pH=8 Thời gian thủy phân 10 với nghiệm thức pH=2, pH=5, pH=8 Thời gian thủy phân 28 với nghiệm thức pH=6 Qua kết nghiên cứu kết luận sau: Thủy phân tự nhiên tác dụng enzyme nội (pH=6), thời gian thủy phân tương đối dài, độ thủy phân cao đạt 16% sau 28 thủy phân, dùng kiềm hay acid để thủy phân thời gian thủy phân ngắn hơn, thời gian thủy phân 10 cho hiệu suất thủy phân cao tất thời điểm Nghiêm thức pH =2 cho hiệu suât thủy phân cao (17,9%), tiếp pH=8, pH=5, thấp pH=6 Hàm lượng lượng đạm amin đạt cao (3,92g/l), đạm amonia cao (0,48g/l) vào thủy phân thứ 10 nghiệm thức pH=2 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu viết tắt Diễn giải DH : Độ thủy phân Naa : Nitơ acid amin NF : Nitơ foocmol NNH3: Nitơ amoniac NTS : Nitơ tổng số pHopt : pH tối thích pHth : pH thích hợp topt Nhiệt độ tối thích : DANH MỤC CÁC BẢNG TÊN BẢNG TRANG DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ TÊN HÌNH TRANG Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Đất nước Việt Nam có lợi có bờ biển dài, nhiều sông ngòi, ao hồ nên việc khai thác nuôi trồng thủy sản mở triển vọng lớn việc cung cấp thủy sản cho nhu cầu đời sống nhân dân, cho xuất phục vụ cho việc phát triển ngành thủy sản đặc biệt ngày nay, Việt Nam gia nhập tổ chức thương mại giới việc xuất mặt hàng thủy sản sang nước ngày mở rộng Cùng với phát triển mạnh mẽ đó, lượng lớn phế phụ phẩm bị thải đầu, da, xương, nội tạng…lượng phế phụ phẩm chưa xử lý thích hợp dẫn đến ô nhiễm môi trường gây lãng phí Trong phế phẩm nguyên liệu để sản xuất số chất có nhiều ứng dụng quan trọng đời sống Nhận thức điều đó, năm gần đây, việc tận dụng phụ phẩm từ nhà máy chế biến thủy sản để chế biến mặt hàng giá trị gia tăng quan tâm đầu tư doanh nghiệp chế biến thủy sản Tuy nhiên đối tượng chủ yếu chọn nghiên cứu cá, tôm…đối với mực ít, hàm lượng protein mực tương đối lớn (17-20%), tương đương với loài cá tôm khác, lượng phụ phẩm mực có khối lượng nhiều Theo hiệp hội chế biến xuất thủy sản Việt Nam (VASEP) nước có 200 nhà máy chế biến mặt hàng mực, bạch tuộc Theo số liệu Hải quan Việt Nam, XK mực bạch tuộc sang Hàn Quốc tháng đầu năm đạt giá trị 63,78 triệu USD, tăng 1,1% so với kỳ năm 2014 Hàn Quốc thị trường NK hàng đầu mực bạch tuộc, chiếm 40% tổng kim ngạch XK mực bạch tuộc nước ta với lượng lớn nguyên liệu đưa vào chế biến, nhà máy phải thải lượng lớn phụ phẩm, sản lượng mực nguyên liệu đạt 1.000.000 nhà máy chế biến phải thải môi trường hàng phụ phẩm ngày Với nguồn phụ phẩm hàng trăm cách giải ổn thỏa số lượng phụ phẩm khổng lồ doanh nghiệp chế biến chẳng môi trường bị ô nhiễm nghiêm trọng Thực tế khoảng năm trở lại đây, phụ phẩm thủy sản nói chung mực nói riêng (đầu, xương sống, ruột, kỳ vi, da, nội tạng…) tận dụng tối đa chế biến thành thức ăn công nghiệp phục vụ chăn nuôi nghiên cứu làm chế phẩm phục vụ ngành nuôi trồng thủy sản Cùng với phát triển mạnh mẽ ngành công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, lượng phế liệu từ mực tăng lên dẫn đến tồn nhiều vấn đề làm tăng chi phí xử lý nước thải, làm tăng ô nhiễm môi trường Lượng phế liệu mực thải từ qui trình sản xuất mực lớn, chiếm khoảng 40% nguyên liệu Hàm lượng protein phế liệu mực chiếm từ 72-77% thành phần chất khô Theo theo Takaoka, 1995 Meyers, 1989 (trích từ P Z Lian, 2005) thành phần protein mực có chứa betain, acid amin tự khoảng 1,5% peppid có trọng lượng phân tử thấp chất gây kích thích bắt mồi cho tôm Theo Jobling, 1998 hàm lượng protein phế liệu mực đủ cao cho trình thủy phân tạo peptid acid amin, có chứa hầu hết acid amin cần thiết cho phát triển tăng tỷ lệ sống cá nuôi Vì vậy, đem thủy phân lượng phế liệu để thu hồi nguồn chất dinh dưỡng sau bổ sung vào thức ăn cho tôm, cá nuôi nâng cao giá trị nguồn phụ phẩm có tác dụng giảm tải lớn cho trình xử lý nước thải, hạn chế ô nhiễm môi trường Hiện nay, có hai phương pháp thủy phân phổ biến nguồn phụ phẩm để thu hồi protein phương pháp hóa học phương pháp sinh học, tạo sản phẩm có nhiều công dụng giá trị dinh dưỡng cao (Min-Tian Gao ctv, 2005,) thủy phân enzyme nghiên cứu nhiều, hiệu thủy phân thể rõ ràng nên đề tài “Khảo sát ảnh hưởng pH đến hiệu suất trình thủy phân protein phụ phẩm mực ” hướng nghiên cứu thực hiện, làm sở so sánh hiệu suất thủy phân với phương pháp thủy phân enzyme 10 1.2.2 Vô hóa mẫu Cho vào bình Kjeldahl ml mẫu lỏng, 10 ml H2SO4 đậm đặc 0,5 g chất xúc tác vô hóa Tráng bình Kjeldahl lần nước cất, sau đem đun tủ hút độc (khoảng 0,5 đến giờ) đến dung dịch có màu suốt hay xanh lơ Để nguội, cho vào nước cất, dung dịch suốt hay có màu xanh lơ CuSO4 mẫu bị vô hóa hoàn toàn, dung dịch có hạt đen tiếp tục đun dung dịch ko màu đen 43 Song song với mẫu thử thật ta tiến hành mẫu thử không (thay lượng mẫu nước cất) để loại trừ sai số 1.2.3 Chưng cất Cho dung dịch vô hóa vào ống cất đạm hệ thống chưng cất đạm, tráng bình kjeldahl ba lần nước cất Làm kín hệ thống chưng cất chưng cất cho nước NH vào bình tam giác 250ml chứa 10 ml acid boric (đầu ống sinh hàn để ngập chìm vào dung dịch acid boric để NH không thoát ngoài) Sau hứng khoảng 100 ml dung dịch có màu xanh nước biển (thử cách dùng giấy quỳ nước tụ từ ống sinh hàn làm giấy quỳ chuyển sang màu xanh nước NH trình chưng cất chưa kết thúc, giấy quỳ không đổi màu chứng tỏ không NH3, trình chưng cất kết thúc) 1.2.4 Định phân Dung dịch sau chưng cất đạm có màu xanh nước biển đem chuẩn độ dung dịch H2SO4 0,05N chuẩn đến dung dịch màu xanh chuyển sang màu nâu đỏ kết thúc, đọc số ml H2SO4 0,05N chuẩn sử dụng 1.2.5 Tính kết Nitơ tổng số (g/l) = V: Số ml H2SO4 0,05 N chuẩn sử dụng cho mẫu thử thật 0,0014: Số gam nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1 N chuẩn P: Số ml mẫu mẫu đem phân tích N: Nồng độ dung dich H2SO4 dùng chuẩn độ 2.1 Định lượng đạm formol phương pháp chuẩn độ Nguyên lý Các acid amin dung dịch trung tính, hai nhóm chức acid (-COOH) (-NH2) trung hòa lẫn nhau, mà hai nhóm chức yếu, trình điện ly Khi gặp formol, nhóm –NH2 kết hợp với formol thành nhóm metylenic N=CH2 tính chất kiềm, tính acid nhóm COOH bật lên định phân chất kiềm Chú ý: Các muối amoni, thí dụ NH4Cl dung dịch trung tính, gặp formol làm dung dịch trở nên acid, định lượng chất kiềm, hình thành 44 hexametylen tetramin HCl, theo phản ứng: 4NH4Cl +6HCHO (NH4)2SO4 + 6HCHO (CH2)6N4 +6H2O + 4HCl (CH2)6N4 +6H2O + 2H2SO4 Nếu mẫu có acid amin nitơ formol nitơ amin Nếu mẫu có acid amin muối amoni, nitơ formol tổng nitơ acid amin nitơ amoniac Đây trường hợp acid yếu định lượng chất kiềm mạnh nên điểm tương đương phải pH kiềm (từ 8,1 trở lên) phản ứng kết thúc phenolphtalein chuyển sang màu đỏ tươi màu hồng (pH = 8,3) 2.2 Các bước tiến hành Chuẩn bị hóa chất Dung dịch chuẩn NaOH 0,25N Dung dịch formol trung tính: dung dịch formol 73 %, dùng NaOH chuẩn pH = 8,1 2.2.1 Định phân Hút xác ml mẫu cho vào ống li tâm 50ml, dùng NaOH điều chỉnh pH pH = 8,1 (lần 1) Cho vào cốc ml dung dịch formol chỉnh pH lên 8,1 khuấy khoảng phút Dùng NaOH 0,25 N (lần 2) chuẩn độ pH = Ghi kết thể tích NaOH dùng (lần 2) Song song với mẫu thử thật ta tiến hành mẫu thử không (thay lượng mẫu lượng nước cất ) để loại trừ sai số 2.2.2 Tính kết quả: Nitơ formol (g/l) = Trong đó: V: Số ml NaOH 0,25N chuẩn sử dụng cho mẫu thử thật N: Nồng độ dung dich NaOH dùng chuẩn độ 0,014: số gam nitơ ứng với ml NaOH 0,1N chuẩn P: số ml mẫu (mẫu dạng lỏng) đem phân tích Định lượng đạm ammonia phương pháp so màu Nguyên tắc: dùng bước sóng 640nm để xác định hàm lượng amonia 3.1 Dụng cụ: 45 Ống ly tâm polyethelen 50ml, bình định mức 100ml Dung dịch trích ly KCl 2M: hòa tan 150gKCl nước cất cho vào bình định mức 1lít định mức lên đế vạch 3.2 Tiến hành 3.2.1 Chưng cất: Cho vào bình hệ thống chưng cất ml mẫu + 5g xúc tác CuSO 4.5MgSO4.) Làm kín hệ thống chưng cất cho nước NH tạo thành NH4OH vào cốc chứa 10ml H2SO4 0,02N Tiến hành chưng cất thời gian phút, Sau lấy khoảng 50 ml dung dịch có màu xanh nước biển, tiến hành phản ứng so màu sau Hàm lượng đạm ammonia dịch mẫu không cao nên Nammonia xác định phương pháp so màu Đạm ammonia xác định phương pháp Phenate (Nguyễn Ngọc Hà ctv, Giáo trình Thực hành phân tích chất lượng nước) Do đặc tính dịch thủy phân có màu nên trước tiến hành phương pháp phenate mẫu dịch thủy phân phải tiến hành chưng cất trước so màu Quá trình chưng cất tiến hành: 5ml dịch mẫu thủy phân cho vào ống chưng cất + 0,5 gam (MgCO3)4Mg(OH)2.5H2O + giọt phenolphthalein pH = 8,1 với mục đích ổn định pH dịch thủy phân Trong môi trường kiềm yếu, đạm ammonia có dịch thủy phân giải phóng khí NH3 hấp thụ H2SO4 0,02N Hỗn hợp dung dịch thu sau trình chưng cất định mức thành 200ml, 50 ml dịch sau định mức giữ lại để tiến hành phân tích phương pháp phenate để xác định lượng N ammonia có dịch thủy phân Phương pháp phenate: Ammonia phản ứng với hypochlorite phenol với chất xúc tác sodium nitroprusside tạo thành phức indophenol có màu xanh, phức hấp thụ ánh sang tối đa bước sóng 640 nm Mẫu có độ đục hay mẫu có màu cần phải loại bỏ cách chưng cất lọc Đạm amin Đạm amin = đạm formol – đạm amonia PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH 46 Nghiệm thức 2.1 2.2 2.3 5.1 5.2 5.3 6.1 Thời gian ( giờ) 0h 2h 4h 6h 8h 10h 0h 2h 4h 6h 8h 10h 0h 2h 4h 6h 8h 10h 0h 2h 4h 6h 8h 10h 0h 2h 4h 6h 8h 10h 0h 2h 4h 6h 8h 10h 0h 4h 8h 12h 16h 20h 24h 28h Ammonia Amin Formol (g/l) (g/l) (g/l) 0,093 0,184 0,264 0,384 0,493 0,577 0,090 0,168 0,243 0,320 0,412 0,487 0,047 0,123 0,195 0,259 0,319 0,368 0,118 0,232 0,383 0,521 0,670 0,808 0,096 0,225 0,372 0,526 0,650 0,765 0,109 0,231 0,408 0,585 0,750 0,903 0,077 0,160 0,260 0,347 0,433 0,506 0,606 0,524 0,766 0,858 1,598 1,782 2,371 2,635 2,999 3,383 3,488 3,982 3,786 4,363 0,742 0,833 1,639 1,807 2,477 2,720 3,229 3,549 3,837 4,249 4,332 4,818 0,816 0,863 1,582 1,705 2,328 2,522 2,981 3,240 3,420 3,738 3,627 3,995 0,493 0,611 1,173 1,405 1,806 2,189 2,347 2,868 2,819 3,489 3,208 4,016 0,513 0,609 1,157 1,382 1,757 2,129 2,294 2,820 2,747 3,398 3,104 3,869 0,538 0,647 1,249 1,480 1,836 2,244 2,363 2,948 2,781 3,531 3,157 4,060 0,386 0,463 1,075 1,234 1,773 2,034 2,635 2,982 3,394 3,827 47 4,091 4,597 4,680 5,285 3,874 4,398 Protein DH (%) tổng 0,000 5,140 8,115 11,034 14,054 17,414 2,240 5,164 8,233 11,436 14,617 18,434 2,462 5,236 8,260 11,281 14,335 17,709 0,000 4,227 6,774 9,376 12,085 15,165 1,640 3,862 6,188 8,643 11,249 14,198 1,718 4,146 6,397 8,704 10,999 13,746 0,000 3,549 6,129 9,637 13,217 16,969 20,695 24,066 (g/100ml) 8,164 8,328 8,762 8,390 8,387 8,378 8,287 8,486 8,855 8,569 8,550 8,562 8,038 8,087 8,616 8,687 8,631 8,612 7,232 7,396 7,544 8,043 7,939 7,900 7,829 7,885 7,961 8,027 7,994 7,796 7,628 8,207 8,167 7,998 7,956 7,230 7,832 7,554 8,639 8,774 8,870 8,986 8,708 8,449 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ THEO PHẦN MỀM THỐNG KÊ SPSS 19 3.1 Amin Multivariate Testsc Effect time time * pH Value F Hypothesis df Error df Sig a 2,000 7,000 ,000 Pillai's Trace ,994 594,561 Wilks' Lambda ,006 594,561a 2,000 7,000 ,000 Hotelling's Trace 169,875 594,561 a 2,000 7,000 ,000 Roy's Largest Root 169,875 594,561a 2,000 7,000 ,000 1,859 35,137 6,000 16,000 ,000 ,005 a 6,000 14,000 ,000 29,154 29,154 6,000 12,000 ,000 19,248 b 3,000 8,000 ,000 Pillai's Trace Wilks' Lambda Hotelling's Trace Roy's Largest Root 32,340 51,327 a Exact statistic b The statistic is an upper bound on F that yields a lower bound on the significance level c Design: Intercept + pH Within Subjects Design: time Tests of Within-Subjects Contrasts Measure:amin Type III Sum of Source time time Level vs Level 16,364 16,364 1279,257 ,000 Level vs Level 13,220 13,220 1075,801 ,000 Level vs Level 1,687 ,562 43,957 ,000 Level vs Level 1,043 ,348 28,279 ,000 Level vs Level ,102 ,013 Level vs Level ,098 ,012 time * pH Error(time) Squares df 48 Mean Square F Sig Tests of Between-Subjects Effects Measure:amin Transformed Variable:Average Type III Sum of Source Intercept Squares df Mean Square F Sig 34,660 34,660 2750,043 ,000 2,537 ,846 67,107 ,000 ,101 ,013 pH Error Pairwise Comparisons Measure:amin 95% Confidence Interval for Differencea Mean Difference (J) pH pH2 pH5 ,550* ,092 ,002 ,231 ,869 pH8 ,381* ,092 ,019 ,063 ,700 pH6 1,268* ,092 ,000 ,949 1,586 pH2 -,550* ,092 ,002 -,869 -,231 pH8 -,169 ,092 ,616 -,488 ,150 pH6 * ,717 ,092 ,000 ,398 1,036 pH2 -,381* ,092 ,019 -,700 -,063 pH5 ,169 ,092 ,616 -,150 ,488 pH6 * ,092 ,000 ,567 1,205 pH2 * -1,268 ,092 ,000 -1,586 -,949 pH5 -,717* ,092 ,000 -1,036 -,398 pH8 * ,092 ,000 -1,205 -,567 pH5 pH8 pH6 (I-J) Std Error Sig.a (I) pH ,886 -,886 Based on estimated marginal means * The mean difference is significant at the ,05 level a Adjustment for multiple comparisons: Bonferroni 49 Lower Bound Upper Bound 3.2 Amonia Multivariate Testsc Effect time Value Pillai's Trace Wilks' Lambda Hotelling's Trace Roy's Largest Root time * pH F Hypothesis df Error df Sig ,993 474,785a 2,000 7,000 ,000 ,007 a 474,785 2,000 7,000 ,000 135,653 474,785a 2,000 7,000 ,000 135,653 a 2,000 7,000 ,000 474,785 Pillai's Trace ,977 2,549 6,000 16,000 ,063 Wilks' Lambda ,032 10,803a 6,000 14,000 ,000 Hotelling's Trace 30,409 30,409 6,000 12,000 ,000 Roy's Largest Root 30,400 81,066b 3,000 8,000 ,000 a Exact statistic b The statistic is an upper bound on F that yields a lower bound on the significance level c Design: Intercept + pH Within Subjects Design: time Tests of Within-Subjects Contrasts Measure:amonia Type III Sum of Source time time Level vs Level ,580 ,580 1031,921 ,000 Level vs Level ,682 ,682 553,900 ,000 Level vs Level ,133 ,044 79,108 ,000 Level vs Level ,133 ,044 35,934 ,000 Level vs Level ,004 ,001 Level vs Level ,010 ,001 time * pH Error(time) Squares df 50 Mean Square F Sig Tests of Between-Subjects Effects Measure:amonia Transformed Variable:Average Type III Sum of Source Squares Intercept df Mean Square F Sig 1,266 1,266 1340,012 ,000 pH ,205 ,068 72,130 ,000 Error ,008 ,001 Pairwise Comparisons Measure:amonia 95% Confidence Interval for Differencea Mean Difference (J) pH pH2 pH5 -,155* ,025 ,002 -,243 -,068 pH8 -,260* ,025 ,000 -,347 -,173 pH6 ,074 ,025 ,109 -,013 ,162 pH2 ,155* ,025 ,002 ,068 ,243 pH8 * ,025 ,019 -,192 -,017 pH6 * ,230 ,025 ,000 ,142 ,317 pH2 ,260* ,025 ,000 ,173 ,347 pH5 ,105* ,025 ,019 ,017 ,192 pH6 * ,334 ,025 ,000 ,247 ,422 pH2 -,074 ,025 ,109 -,162 ,013 pH5 -,230* ,025 ,000 -,317 -,142 pH8 * ,025 ,000 -,422 -,247 pH5 pH8 pH6 (I-J) Std Error Sig.a (I) pH -,105 -,334 Based on estimated marginal means * The mean difference is significant at the ,05 level a Adjustment for multiple comparisons: Bonferroni 51 Lower Bound Upper Bound Univariate Tests Measure:amonia Sum of Squares df Mean Square F Contrast ,205 ,068 Error ,008 ,001 Sig 72,130 ,000 The F tests the effect of pH This test is based on the linearly independent pairwise comparisons among the estimated marginal means 3.3 Formol Multivariate Testsc Effect time time * pH Value F Hypothesis df a Error df Sig Pillai's Trace ,996 798,504 2,000 7,000 ,000 Wilks' Lambda ,004 798,504a 2,000 7,000 ,000 Hotelling's Trace 228,144 a 798,504 2,000 7,000 ,000 Roy's Largest Root 228,144 798,504a 2,000 7,000 ,000 1,894 47,747 6,000 16,000 ,000 ,003 44,058a 6,000 14,000 ,000 Hotelling's Trace 39,819 39,819 6,000 12,000 ,000 Roy's Largest Root 26,383 70,356b 3,000 8,000 ,000 Pillai's Trace Wilks' Lambda a Exact statistic b The statistic is an upper bound on F that yields a lower bound on the significance level c Design: Intercept + pH Within Subjects Design: time Tests of Within-Subjects Contrasts Measure:formol Type III Sum of Source time time Level vs Level 23,104 23,104 1818,724 ,000 Level vs Level 19,907 19,907 1342,223 ,000 Level vs Level 2,190 ,730 57,457 ,000 Level vs Level 1,740 ,580 39,112 ,000 Level vs Level ,102 ,013 Level vs Level ,119 ,015 time * pH Error(time) Squares df 52 Mean Square F Sig Tests of Between-Subjects Effects Measure:formol Transformed Variable:Average Type III Sum of Source Intercept Squares df Mean Square F Sig 49,177 49,177 3423,772 ,000 3,324 1,108 77,134 ,000 ,115 ,014 pH Error Pairwise Comparisons Measure:formol 95% Confidence Interval for Differencea Mean Difference (J) pH pH2 pH5 ,395* ,098 ,023 ,054 ,735 pH8 ,121 ,098 1,000 -,219 ,462 pH6 1,342* ,098 ,000 1,001 1,682 pH2 * -,395 ,098 ,023 -,735 -,054 pH8 -,273 ,098 ,140 -,614 ,067 pH6 ,947* ,098 ,000 ,606 1,287 pH2 -,121 ,098 1,000 -,462 ,219 pH5 ,273 ,098 ,140 -,067 ,614 pH6 1,220* ,098 ,000 ,880 1,561 pH2 -1,342* ,098 ,000 -1,682 -1,001 pH5 * -,947 ,098 ,000 -1,287 -,606 pH8 -1,220* ,098 ,000 -1,561 -,880 pH5 pH8 pH6 (I-J) Std Error Sig.a (I) pH Based on estimated marginal means * The mean difference is significant at the ,05 level a Adjustment for multiple comparisons: Bonferroni 53 Lower Bound Upper Bound 3.4 DH Multivariate Testsc Effect Value time time * pH Error df Sig 6,569a 2,000 7,000 ,025 ,348 6,569 a 2,000 7,000 ,025 1,877 6,569a 2,000 7,000 ,025 1,877 a 2,000 7,000 ,025 Wilks' Lambda Roy's Largest Root Hypothesis df ,652 Pillai's Trace Hotelling's Trace F 6,569 Pillai's Trace ,361 ,587 6,000 16,000 ,736 Wilks' Lambda ,644 ,574a 6,000 14,000 ,745 Hotelling's Trace ,544 ,544 6,000 12,000 ,766 Roy's Largest Root ,529 1,410b 3,000 8,000 ,309 a Exact statistic b The statistic is an upper bound on F that yields a lower bound on the significance level c Design: Intercept + pH Within Subjects Design: time Tests of Within-Subjects Contrasts Measure:DH4 Type III Sum of Source time time Level vs Level 5,022 5,022 14,575 ,005 Level vs Level 4,104 4,104 13,199 ,007 Level vs Level ,372 ,124 ,360 ,784 Level vs Level ,039 ,013 ,041 ,988 time * pH Error(time) Squares Level vs Level df Mean Square Effects Tests of2,757 Between-Subjects Level vs Level Measure:DH4 2,487 F Sig ,345 ,311 Transformed Variable:Average Type III Sum of Source Intercept pH Error Squares df Mean Square F Sig 43,914 43,914 15,479 ,004 ,867 ,289 ,102 ,957 22,696 2,837 54 Pairwise Comparisons Measure:DH4 95% Confidence Interval for Differencea Mean Difference (J) pH pH2 pH5 ,641 1,375 1,000 -4,143 5,425 pH8 ,426 1,375 1,000 -4,358 5,211 pH6 ,674 1,375 1,000 -4,110 5,459 pH2 -,641 1,375 1,000 -5,425 4,143 pH8 -,215 1,375 1,000 -4,999 4,570 pH6 ,033 1,375 1,000 -4,751 4,818 pH2 -,426 1,375 1,000 -5,211 4,358 pH5 ,215 1,375 1,000 -4,570 4,999 pH6 ,248 1,375 1,000 -4,537 5,032 pH2 -,674 1,375 1,000 -5,459 4,110 pH5 -,033 1,375 1,000 -4,818 4,751 pH8 -,248 1,375 1,000 -5,032 4,537 pH5 pH8 pH6 (I-J) Std Error Sig.a (I) pH Based on estimated marginal means a Adjustment for multiple comparisons: Bonferroni 3.5 Đạm tổng số: 55 Lower Bound Upper Bound Multivariate Testsc Effect Value time time * pH F Hypothesis df Error df Sig a 2,000 7,000 ,871 Pillai's Trace ,039 ,141 Wilks' Lambda ,961 ,141a 2,000 7,000 ,871 Hotelling's Trace ,040 ,141 a 2,000 7,000 ,871 Roy's Largest Root ,040 ,141a 2,000 7,000 ,871 1,086 3,166 6,000 16,000 ,030 ,207 a 6,000 14,000 ,053 2,421 2,421 6,000 12,000 ,091 1,437 b 3,000 8,000 ,057 Pillai's Trace Wilks' Lambda Hotelling's Trace Roy's Largest Root 2,797 3,832 a Exact statistic b The statistic is an upper bound on F that yields a lower bound on the significance level c Design: Intercept + pH Within Subjects Design: time Tests of Within-Subjects Contrasts Measure:Ntong Type III Sum of Source time time Level vs Level ,039 ,039 ,122 ,736 Level vs Level ,025 ,025 ,278 ,612 Level vs Level 3,720 1,240 3,826 ,057 Level vs Level ,915 ,305 3,445 ,072 Level vs Level 2,593 ,324 Level vs Level ,708 ,089 time * pH Error(time) Squares df 56 Mean Square F Sig Tests of Between-Subjects Effects Measure:Ntong Transformed Variable:Average Type III Sum of Source Intercept Squares df Mean Square F Sig 804,428 804,428 9932,647 ,000 pH ,380 ,127 1,562 ,273 Error ,648 ,081 Pairwise Comparisons Measure:Ntong 95% Confidence Interval for Differencea Mean Difference (J) pH pH2 pH5 ,485 ,232 ,423 -,324 1,293 pH6 ,326 ,232 1,000 -,483 1,134 pH8 ,347 ,232 1,000 -,461 1,156 pH2 -,485 ,232 ,423 -1,293 ,324 pH6 -,159 ,232 1,000 -,967 ,649 pH8 -,137 ,232 1,000 -,946 ,671 pH2 -,326 ,232 1,000 -1,134 ,483 pH5 ,159 ,232 1,000 -,649 ,967 pH8 ,022 ,232 1,000 -,787 ,830 pH2 -,347 ,232 1,000 -1,156 ,461 pH5 ,137 ,232 1,000 -,671 ,946 pH6 -,022 ,232 1,000 -,830 ,787 pH5 pH6 pH8 (I-J) Std Error Sig.a (I) pH Based on estimated marginal means a Adjustment for multiple comparisons: Bonferroni 57 Lower Bound Upper Bound