Nghiên cứu chiết tách Anthocyanin từ hoa dâm bụt ứng dụng làm giấy chỉ thị an toàn trong phân tích hóa học

Hiện nay, chất màu tự nhiên đang ngày càng được quan tâm, bởi nó là chất tạo màu không độc hại, thân thiện với môi trường và được ứng dụng rộng rãi cho nhiều ngành công nghiệp. Anthocyanin là họ màu rất phổ biến, tồn tại trong hầu hết các thực vật bậc cao và được tìm thấy trong một số loại rau, hoa, quả, hạt, có màu từ đỏ đến tím như: quả nho, quả dâu, bắp cải tím, lá tía tô, đài hoa Hibiscus, đậu đen, quả cà tím, gạo nếp than, gạo đỏ. Trong số đó, Hibiscus RosaSinensis (Cây hoa dâm bụt) là nguyên liệu có hàm lượng Anthocyanin khá cao.Nhiều nghiên cứu đã cho thấy Anthocyanin trong Hibiscus không những tạo màu tốt mà còn có tác dụng tốt đối với sức khoẻ con người và động vật. Vì thế, nó được sử dụng rộng rãi để làm thuốc, màu thực phẩm, các sản phẩm sử dụng trong gia đình hay dùng làm thức ăn chăn nuôi gia súc.Ngoài ra, đặc tính đặc biệt của chất màu Anthocyanin là thay đổi màu theo pH môi trường. Do đó, Anthocyanin hoàn toàn có thể dùng làm chất chỉ thị để xác định nhanh môi trường pH. Vai trò làm giấy chỉ thị chính là sự tiện dụng của nó. Chỉ cần một mẩu giấy nhỏ hay lượng nhỏ, ta có thể biết dung dịch đang sử dụng có tính acid hay base và độ mạnh yếu của tính acidbase( một cách tương đối) dựa vào sự thay đổi đậm nhạt của màu sắc. Hiện nay, những chất chỉ thị tổng hợp như chỉ thị vạn năng, methyl da cam, phenolphtalein… có nhiều hàng giả, hàng nhái và có xuất xứ không rõ ràng nên ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu và thí nghiệm. Do vậy, nghiên cứu sử dụng Anthocyanin làm chất chỉ thị là việc làm cần thiết nhằm phát triển hơn nữa các hợp chất hữu cơ có nguồn gốc thiên nhiên, đáp ứng nhu cầu phát triển bền vững đang được đặt ra cấp bách hiện nay. Tuy nhiên, ứng dụng Anthocyanin làm chất chỉ thị an toàn, “thông minh” trong hóa học phân tích và phân tích thực phẩm cho đến nay vẫn chưa được đề cập một cách đầy đủ, hệ thống. Đây cũng là hướng nghiên cứu chúng tôi lựa chọn đó là:“Nghiên cứu chiết tách Anthocyanin từ hoa dâm bụt ứng dụng làm giấy chỉ thị an toàn trong phân tích hóa học.”Mục tiêu của đề tài là:1. Khảo sát được điều kiện chiết tách Anthocyanin từ Hoa dâm bụt2. Nghiên cứu được ứng dụng của Anthocyanin làm giấy chỉ thị an toàn trong phân tích hóa học.

THAM DỰ CUỘC THI TRI THỨC TRẺ VÌ GIÁO DỤC

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH ANTHOCYANIN TỪ HOA DÂM BỤT ỨNG DỤNG LÀM GIẤY CHỈ THỊ AN TOÀN TRONG PHÂN TÍCH HÓA HỌC

Nhóm nghiên cứu

ThS Nguyễn Thị Thùy Linh

DS Vũ Thị Thu Thùy

Nơi thực hiện :

Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất

Trường Đại học Dược Hà Nội

Địa chỉ liên hệ thuylinhdhd@gmail.com

DT 0977663687

HÀ NỘI – 2016

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Cây hoa dâm bụt 3

1.1.1 Tên gọi và phân loại 3

1.1.2 Mô tả thực vật 3

1.1.3 Phân bố 4

1.1.4 Thành phần hóa học 4

1.1.5 Công dụng 4

1.2 Anthocyanin 5

1.2.1 Giới thiệu 5

1.2.2 Cấu trúc hóa học 5

1.2.3 Tính chất hóa lý của Anthocyanin 8

1.2.4 Vai trò của Anthocyanin trong một số lĩnh vực 10

1.3 Tổng quan chất chỉ thị 12

1.4 Kỹ thuật đo quang phổ vi sai ……….14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.2 Nguyên vật liệu – thiết bị 15

2.2.1 Nguyên vật liệu 15

2.2.2 Thiết bị 16

2.3 Nội dung nghiên cứu 17

2.4 Phương pháp nghiên cứu 17

2.4.1 Quy trình phân tích 17

2.4.2 Sơ đồ quá trình nghiên cứu 21

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 Khảo sát điều kiện chiết Anthocyanin……… 22

3.1.1 Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết mẫu 24

3.1.2 Tính hàm lượng Anthocyanin trong dịch chiết……… 24

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến màu của Anthocyanin……… 27

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết Anthocyanin tại các pH đến λmax 30

3.4 Xác định khoảng đổi màu của chất chỉ thị Anthocyanin 31

3.5 Ứng dụng của Anthocyanin 33

3.5.1 Ứng dụng dịch chiết làm chỉ thị màu trong chuẩn độ acid-base 33

3.5.2 Nghiên cứu làm giấy chỉ thị để phát hiện nhanh pH môi trường 35

3.5.3 Ứng dụng trong kiểm nghiệm thuốc 40

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

4.1 Kết luận 41

4.2 Kiến nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

PHỤ LỤC 47

Phụ lục 1: Độ hấp thụ của Anthocyanin tại các dung môi chiết suất khác nhau 47

Phụ lục 2: Khảo sát ảnh hưởng của pH đến màu Anthocyanin ……… 48

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Bảng 3.5 Kết quả xác định nồng độ NaOH bằng H2C2O4 0,1000N 33 Bảng 3.6 Bảng khảo sát nồng độ Anthocyanin tẩm vào giấy chỉ thị 35

Hình 3.3 Độ hấp thụ Anthocyanin theo hệ dung môi C2H5OH – H2O khác

Hình 3.4 Màu của Anthocyanin tại các pH=1 đến pH=14 29

Hình 3.6 Sự thay đổi cấu trúc Anthocyanin vào pH 31 Hình 3.7 Màu của Anthocyanin tại pH=5 đến pH=7,5 32

Hình 3.9 Kết quả khảo sát nồng độ Anthocyanin tẩm vào giấy 36

Hình 3.10 Ảnh hưởng của thời gian ngâm đến độ nhạy của giấy chỉ thị

Hình 3.12 Màu của giấy chỉ thị Anthocyanin theo pH 39 Hình 3.13 Sự đổi màu của giấy chỉ thị trên một số thuốc có tính acid,

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, chất màu tự nhiên đang ngày càng được quan tâm, bởi nó là chất tạo màu không độc hại, thân thiện với môi trường và được ứng dụng rộng rãi cho nhiều ngành công nghiệp Anthocyanin là họ màu rất phổ biến, tồn tại trong hầu hết các thực vật bậc cao và được tìm thấy trong một số loại rau, hoa, quả, hạt, có màu từ đỏ đến tím như: quả nho, quả dâu, bắp cải tím, lá tía tô, đài hoa Hibiscus, đậu đen, quả cà tím, gạo nếp than, gạo đỏ Trong số đó, Hibiscus Rosa-Sinensis (Cây hoa dâm bụt) là nguyên liệu có hàm lượng Anthocyanin khá cao

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy Anthocyanin trong Hibiscus không những tạo màu tốt mà còn có tác dụng tốt đối với sức khoẻ con người và động vật Vì thế, nó được sử dụng rộng rãi để làm thuốc, màu thực phẩm, các sản phẩm sử dụng trong gia đình hay dùng làm thức ăn chăn nuôi gia súc

Ngoài ra, đặc tính đặc biệt của chất màu Anthocyanin là thay đổi màu theo

pH môi trường Do đó, Anthocyanin hoàn toàn có thể dùng làm chất chỉ thị để xác định nhanh môi trường pH Vai trò làm giấy chỉ thị chính là sự tiện dụng của

nó Chỉ cần một mẩu giấy nhỏ hay lượng nhỏ, ta có thể biết dung dịch đang sử dụng có tính acid hay base và độ mạnh yếu của tính acid/base( một cách tương đối) dựa vào sự thay đổi đậm nhạt của màu sắc Hiện nay, những chất chỉ thị tổng hợp như chỉ thị vạn năng, methyl da cam, phenolphtalein… có nhiều hàng giả, hàng nhái và có xuất xứ không rõ ràng nên ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu và thí nghiệm Do vậy, nghiên cứu sử dụng Anthocyanin làm chất chỉ thị là việc làm cần thiết nhằm phát triển hơn nữa các hợp chất hữu cơ có nguồn gốc thiên nhiên, đáp ứng nhu cầu phát triển bền vững đang được đặt ra cấp bách hiện nay Tuy nhiên, ứng dụng Anthocyanin làm chất chỉ thị an toàn, “thông minh” trong hóa học phân tích và phân tích thực phẩm cho đến nay vẫn chưa được đề

cập một cách đầy đủ, hệ thống Đây cũng là hướng nghiên cứu chúng tôi lựa chọn đó là:

“Nghiên cứu chiết tách Anthocyanin từ hoa dâm bụt ứng dụng làm giấy chỉ thị an toàn trong phân tích hóa học.”

Mục tiêu của đề tài là:

1 Khảo sát được điều kiện chiết tách Anthocyanin từ Hoa dâm bụt

2 Nghiên cứu được ứng dụng của Anthocyanin làm giấy chỉ thị an toàn trong phân tích hóa học

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Cây hoa dâm bụt

1.1.1 Tên gọi và phân loại [18]

a Tên gọi

- Tên gọi Tên khoa học: Hibiscus rosa-sinensis L

- Tên khác Rose – mallow, chinese hibiscus, chinese rose

- Tên tiếng anh: Roselle

- Tên thường gọi: Bông bụt, Bụp

: Bông (Malvaceae) : Dâm bụt (Hibiscus) : Hibiscus

: Hibiscus rosa sinensis

Lá có hình bầu dục, nhọn đầu, tròn gốc, mép có răng to, có chất nhầy…[18, 23]

Quanh năm có hoa Tràng gồm 5 cánh hoa, màu đỏ và đường kính khoảng 3 inch, lớn xếp xoắn sát đè lên nhau Nhị nhiều tập hợp trên một trụ dài thẳng hay hơi cong Thực tế, ngày nay, hoa có rất nhiều màu như vàng, tím cà, hồng, trắng… Có một đặc điểm là hoa rất nhanh tàn, mỗi hoa sẽ chỉ kéo dài một hoặc hai ngày [13] Quả là một quả nang tròn dài khoảng 3 cm, rất khó hình thành [18]

1.1.2 Phân bố

Hibiscus rosa-sinensis có nguồn gốc nhiệt đới châu Á (Trung Quốc) Cây Hoa dâm bụt có ở khắp nơi trên thế giới nhưng được tập trung nhiều nhất ở các vùng nhiệt đới [12, 17]

Ở Việt Nam, Hibiscus rosa-sinensis được trồng ở khắp nơi, đặc biệt ở miền Nam nước ta Hiện nay, dâm bụt có nhiều giống, rất phong phú, đa dạng về hình thái và màu sắc

1.1.3 Thành phần hóa học

Hoa dâm bụt rất giàu polyphenol, flavonoid và anthocyanins [23]

Lá và thân cây có chứa β-sitosterol, stigmasterol, taraxeryl acetate và ba hợp chất cyclopropane và các dẫn xuất của họ [18]

Hoa dâm bụt chứa cyanidin diglucoside, flavonoid và vitamin, thiamine, riboflavin, niacin và axit ascorbic (Ghani, 2003) Quercetin-3-diglucoside, 3,7-diglucoside, cyanidin-3,5-diglucoside và cyanidin-3-sophoroside-5 glucoside đã được phân lập từ hoa vàng; tất cả hợp chất ở trên và kaempferol-3xylosylglucoside đã được phân lập từ nhụy hoa (Rastogi & Mehrotra, 1993) [18]

1.1.4 Công dụng

a Trong ngành dược

Lá, hoa và rễ của cây hoa dâm bụt đã được biết đến là có tính chất như kích thích tình dục, rong kinh, tránh thai, thuốc nhuận tràng,… [12]

Ngoài ra, cây hoa dâm bụt còn có hoạt tính kháng nấm và một trong những thành phần của nó đã được tìm thấy khả năng chống lại tế bào ung thư ở người trong nhiều giai đoạn phân chia tế bào Mặt khác, nó có khả năng cung cấp hợp chất có hoạt tính sinh học hoạt động như chất chống oxy hóa, bảo vệ tim mạch

và có khả năng ngăn chặn sự gia tăng của tế bào ác tính [20, 24]

b Công dụng đối với cảnh quan

Hiện nay, cây hoa dâm bụt có khoảng 100 loại được sử dụng trang trí Hoa

có nhiều màu sắc phong phú như: trắng, đỏ, vàng, xanh, xám, cam, tím, nâu, hồng, xanh lá cây, tím,… [15, 17]

Cây phù hợp trồng làm hàng rào quanh khuôn viên vườn, viền lối đi hoặc viền trong các khuôn viên đô thị Ngoài ra, chúng ta cũng có thể trồng cây trong chậu cảnh để trang trí ban công, sân thượng hoặc đặt bàn trang trí nội thất

1.2 Anthocyanin

1.2.1 Giới thiệu

Các Anthocyanin thuộc một trong những nhóm các chất màu tự nhiên flavonoid tan trong nước lớn nhất trong thế giới thực vật Thuật ngữ Anthocyanin bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, trong đó Anthocyanin là sự kết hợp giữa Anthos – nghĩa là hoa và Kyanos – nghĩa là xanh Tuy nhiên, không chỉ có màu xanh, Anthocyanin còn mang đến cho thực vật nhiều màu sắc rực rỡ khác

như hồng, đỏ, cam và các màu trung gian khác [11, 19]

1.2.2 Cấu trúc hóa học

Anthocyanin là những glycosid do gốc đường kết hợp với gốc aglycon có màu (anthocyanidin) Các Anthocyanin khi mất hết nhóm đường được gọi là

anthocyanidin hay aglycon Mỗi Anthocyanidin có thể bị glycosyl hóa acylate bởi các loại đường và các acid khác tại các vị trí khác nhau Vì thế lượng anthocyanin lớn hơn anthocyanidin từ 15-20 lần Aglycon của chúng có cấu trúc

cơ bản được mô tả như sau:

Hình 1.1 Cấu trúc cơ bản aglycon của Anthocyanin

Các gốc đường có thể được gắn vào vị trí 3,5,7; thường được gắn vào vị trí

3 và 5 còn vị trí 7 rất ít Phân tử Anthocyanin gắn đường vào vị trí 3 gọi là monoglycosid, ở vị trí 3 và 5 gọi là diglycosid Sự khác biệt giữa chúng là số lượng các nhóm hydroxy hóa, bản chất và số lượng các gốc đường liên kết với cấu trúc của chúng Đến nay có những báo cáo của hơn 500 Anthocyanin khác nhau và 23 Anthocyanidin [5, 22]

Các aglycon của Anthocyanin khác nhau chính là do các nhóm gắn vào vị trí R1 và R2, thường là −H, −OH hoặc −OCH3

Bảng 1.1 Cấu trúc cơ bản của các chất trong nhóm Anthocyanin

Cấu trúc cơ bản Anthocyanidin R 3 ′ R 4 ′ R 5 ′ R 3 R 5 R 6 R 7

Aurantinidin −H −OH −H −OH −OH −OH −OH

Cyanidin −OH −OH −H −OH −OH −H −OH

Delphinidin −OH −OH −OH −OH −OH −H −OH

Europinidin −OCH 3 −OH −OH −OH −OCH 3 −H −OH

Luteolinidin −OH −OH −H −H −OH −H −OH

Pelargonidin −H −OH −H −OH −OH −H −OH

Malvidin −OCH 3 −OH −OCH 3 −OH −OH −H −OH

Peonidin −OCH 3 −OH −H −OH −OH −H −OH

Petunidin −OH −OH −OCH 3 −OH −OH −H −OH

Rosinidin −OCH −OH −H −OH −OH −H −OCH

1.2.3 Tính chất hóa lý của Anthocyanin

Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực Anthocyanin hòa tan tốt trong H2O, C2H5OH, CH3OH…[5, 7]

Màu sắc Anthocyanin thay đổi phụ thuộc vào nhiệt độ, các chất màu và nhiều yếu tố khác,… Nhưng chủ yếu phụ thuộc vào pH môi trường Khi tăng số lượng nhóm OH trong vòng benzen thì màu càng xanh đậm Mức độ methyl hóa các nhóm OH ở vòng benzen càng cao thì màu càng đỏ Nếu nhóm OH ở vị trí thứ ba kết hợp với các gốc đường thì màu sắc cũng sẽ thay đổi theo số lượng các gốc đường được đính vào nhiều hay ít [5, 22]

Các Anthocyanin cũng phụ thuộc rất mạnh vào pH của môi trường [5]:

- Khi pH > 7 các Anthocyanin có màu xanh và khi pH < 7 các Anthocyanin

có màu đỏ

- Ở pH = 1 các Anthocyanin thường ở dạng muối oxonium màu cam đến đỏ

- Ở pH = 4 - 5 chúng có thể chuyển về dạng base Cacbinol hay base Chalcon không màu

- Ở pH = 6 – 7 chúng ở dạng Anion quinoid có màu tím

- Ở pH = 7 - 8 lại về dạng base Quinoidal Anhydro màu xanh

Hình 1.2 Sự phụ thuộc cấu trúc Anthocyanin vào pH

Màu sắc của Anthocyanin còn có thể thay đổi do hấp thụ ở trên polysaccharid Khi đun nóng lâu dài các Anthocyanin có thể phá hủy và mất màu [5]

Anthocyanin có bước sóng hấp thụ trong vùng nhìn thấy, khả năng hấp thụ cực đại tại bước sóng 510 – 540 nm Độ hấp thụ là yếu tố liên quan mật thiết đến màu sắc của các Anthocyanin Chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ Anthocyanin thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ Anthocyanin càng lớn độ hấp thụ càng mạnh [5]

Tóm lại, trong môi trường acid, các Anthocyanin là những base và có thể tạo muối bền vững với acid Anthocyanin cũng có khả năng cho muối với base Như vậy chúng có tính chất lưỡng tính (amphote) Muối với acid thì có màu đỏ, còn muối với kiềm thì có màu xanh [5]

1.2.3 Vai trò của Anthocyanin trong một số lĩnh vực

a Trong đời sống

Trong lĩnh vực thực phẩm, với khả năng chống oxy hóa cao, Anthocyanin được sử dụng để bảo quản thực phẩm, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa cho thực phẩm Kết quả nghiên cứu cho thấy, với một lượng nhỏ nguyên liệu vỏ khoai lang (1% w/w), khả năng bảo quản của các sản phẩm thực phẩm có chứa

mỡ được kéo dài khá lâu và có thể so sánh với chất chống oxy hóa tổng hợp BHA Ngoài các tác dụng chống oxy hóa, Anthocyanin còn được sử dụng như chất màu tự nhiên tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho thực phẩm và khá an toàn

Ví dụ: dịch chiết Anthocyanin từ các loại rau củ có màu đỏ như vỏ quả nho, dâu tây, vỏ khoai lang… đã được dùng để làm chất màu thay thế màu tổng hợp trong

sản xuất kẹo cứng [28]

b Trong Y học

Đối với sức khỏe của con người, theo nghiên cứu của David Heber, Đại học Harvard (Mỹ), các anthocyanin có thể cắt được cơn đau tim, giảm thiểu các tổn thương não liên quan đột quỵ và ngăn cản sự tạo thành các cục máu đông trong lòng mạch máu (nguyên nhân dẫn đến tắc mạch, gây tai biến mạch máu não và những cơn nhồi máu cơ tim đột ngột), hạn chế sự suy giảm sức đề kháng [18] Các nhà khoa học cũng đã chứng minh được rằng Anthocyanin có tác dụng tốt trong chống lão hóa, ngăn ngừa sự phát triển của các khối u, bướu, hạn chế nguy

cơ bị đột quỵ, giảm nguy cơ mắc ung thư… Nhờ đó, Anthocyanin giúp bảo vệ màng dạ dày chống lại các tổn thương do sự oxy hóa, làm ngưng lại giai đoạn đầu của ung thư dạ dày, ung thư ruột, ruột kết Hơn nữa, các nghiên cứu còn cho thấy Anthocyanin còn có tác dụng tốt trong việc điều hòa lượng đường huyết của những bệnh nhân đái tháo đường Khả năng chữa bệnh của Anthocyanin vẫn

đang được nghiên cứu để tìm hiểu cơ chế và ứng dụng trong y học Các ứng dụng trên đã mở ra một triển vọng về việc sản xuất thực phẩm, thực phẩm chức năng chữa bệnh có hiệu quả [12,28]

Anthocyanin còn là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quý như: khả năng chống oxy hóa cao nên được sử dụng để chống lão hóa, hoặc chống oxy hóa các sản phẩm thực phẩm, hạn chế sự suy giảm sức đề kháng; có tác dụng làm bền thành mạch, chống viêm, hạn chế sự phát triển của các tế bào ung thư; tác dụng chống các tia phóng xạ [16, 26]

c Trong phân tích hóa học

Tại các trường THCS, THPT, việc sử dụng giấy chỉ thị vạn năng, các chỉ thị acid-base cho các thí nghiệm rất nhiều để kiểm chứng tính chất acid hay base trong hóa học, chuẩn độ, pha chế là phổ biến Để tăng hứng thú cho học sinh với môn hóa học, các thầy cô giáo đã tự làm các thí nghiệm “hóa học vui” bằng cách sử dụng dịch chiết trong nước của một số loài hoa, rau, củ, quả như hoa dâm bụt, hoa bách nhật, lá của bắp cải tím, rau lang, củ khoai tím, cánh hoa của hoa phong lữ, cây anh túc, quả của cây việt quất, phần thân rễ của cây đại hoàng… để xem sự đổi màu của dịch chiết trong các môi trường pH khác nhau Giấy chỉ thị màu “tự chế” này chứa Anthocyanin - chất bị đổi thành màu đỏ trong môi trường dung dịch acid và chuyển thành màu xanh trong môi trường dung dịch base, đặc điểm này tương tự như giấy chỉ thị vạn năng trong phòng thí nghiệm Vì vậy, việc tự tạo chỉ thị màu là giải pháp hay giúp giáo viên thực hiện tốt kế hoạch dạy học, giúp học sinh nhận thấy hóa học gần gũi với đời sống và tạo tâm lý vui thích khi học bài

Ứng dụng Anthocyanin làm chất chỉ thị an toàn, “thông minh” trong hóa học phân tích và phân tích thực phẩm cho đến nay vẫn chưa được đề cập một

cách đầy đủ, hệ thống Nghiên cứu của Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (nay là Học viện Nông nghiệp Việt Nam), Anthocyanin được ứng dụng làm chất chỉ thị phát hiện nhanh hàn the trong thực phẩm Hay nghiên cứu của Đại học Bách Khoa Đà Nẵng cũng cho thấy rằng Anthocyanin cũng được ứng dụng làm chất chỉ thị an toàn trong phân tích thực phẩm và hóa học [12, 22]

1.3 Tổng quan chất chỉ thị [2]

Chất chỉ thị màu (CTM) là là những chất có màu sắc thay đổi theo sự biến đổi pH của dung dịch Chúng thường là những chất hữu cơ có tính acid base, trong đó dạng acid và dạng base liên hợp có màu khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc phân tử của chúng Khi pH của dung dịch biến đổi, cấu trúc phân tử của chúng bị biến đổi theo, dẫn đến màu thay đổi

Nếu kí hiệu dạng acid của chất chỉ thị là HInd, dạng base liên hợp với nó là Ind-, trong dung dịch có cân bằng sau:

Khi cho CTM vào nước thì cân bằng được thiết lập :

HInd + H2O H3O+ + Ind- (1) Nếu cân bằng (CB) dịch chuyển về phía phải () dung dịch có màu của dạng base (Ind- )

Nếu cân bằng (CB) dịch chuyển về phía trái () dung dịch có màu của dạng acid (Hind)

Nếu một trong một hệ có hai chất có màu khác nhau thì việc quan sát bằng mắt chỉ cho phép ta nhận được màu của một chất khi nồng độ của nó ít nhất gấp

10 lần nồng độ chất kia Như vậy :

Khi

][

][

Khi

][

][

1 , màu của chất chỉ thị là màu của anion Ind–

Bảng 1.2 Một số chất chỉ thị thường dùng trong chuẩn độ acid – base

Chỉ thị Màu chỉ thị trong

môi trường acid

Khoảng pH đổi màu chỉ thị

Màu chỉ thị trong môi trường kiềm

Phenolphtalein Không màu 8,0 – 10,0 Tím đỏ (hồng)

Cơ chế ứng dụng Anthocyanin làm giấy chỉ thị

Trong môi trường nước, pH có ảnh hưởng đáng kể đến màu sắc của Anthocyanin Màu sắc của Anthocyanin thay đổi theo sự thay đổi của pH Sự thay đổi cấu trúc của Anthocyanin khi pH thay đổi đã được đề cập trong phần tính chất hóa học

Anthocyanin giống như một chất chỉ thị tự nhiên, có màu hồng hay đỏ ở pH thấp, màu tím ở pH trung gian và màu xanh ở pH cao [7]

1.4 Kỹ thuật đo quang phổ vi sai

Trong kiểm nghiểm các dạng thuốc bào chế, trước tiên phải qua công đoạn chiết hoạt chất ra khỏi tá dược Dịch chiết khó tránh khỏi mang theo tạp chất Tạp chất này có thể gây sai số cho quá trình định lượng bằng phương pháp đo quang

Để loại trừ sai số này, người ta thường sử dụng kỹ thuật đo quang vi sai: Trên phổ của chất nghiên cứu, chọn 2 bước sóng λ1 và λ2, ở đó hiệu số độ hấp thụ ∆A là lớn nhất

Đo độ hấp thụ A của chất thử ở 2 bước sóng trên

Ngoài ra, chất màu anthocyanin thay đổi theo pH Tại pH = 1 các Anthocyanin tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavium có độ hấp thụ cực đại, còn ở

pH = 4,5 thì chúng lại ở dạng carbinol không màu

Vì vậy, Phương pháp Vi sai theo pH để loại hết ảnh hưởng của các chất không phải Anthocyanin

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phương pháp chiết tách Anthocyanin từ Hoa dâm bụt, ứng dụng làm giấy chỉ thị an toàn trong phân tích hóa học

Đối tượng mẫu phân tích là Anthocyanin và đối tượng nghiên cứu là Hoa dâm bụt Các mẫu phân tích được lấy trên địa bàn thành phố Hà Nội (Bãi bồi Sông Hồng)

Hình 2.1 Hoa dâm bụt 2.2 Nguyên vật liệu – thiết bị

- Vitamin C, lọ 100 viên (Công ty cổ phần dược phẩm Đại Uy)

Các hóa chất đạt tiêu chuẩn hóa chất tinh khiết phân tích (RA) của

- Sodium hydroxide (Merck)

- Acid phosphorid (Trung Quốc)

- Sodium dihydrophosphate (Trung Quốc)

- Sodium hydrophosphate (Trung Quốc)

- Potassium hydrophosphate (Trung Quốc)

- Potassium dihydrophosphate(Trung Quốc)

- Potassium hydroxide (Merck)

- Chỉ thị Phenolphtalein

2.2.2 Thiết bị

- Cân kỹ thuật XT1200c có độ chính xác 0,01 g

- Cân phân tích Mettler Toledo có độ chính xác 0,0001 g

- Máy đo pH Meter 744

- Máy lắc siêu âm Elma (Germany)

- Máy ly tâm HermLe Z383K

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát được điều kiện chiết tách Anthocyanin từ Hoa dâm bụt

- Nghiên cứu được ứng dụng của Anthocyanin làm giấy chỉ thị an toàn trong phân tích hóa học

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Quy trình phân tích

- Nguyên liệu là Hoa dâm bụt đã loại bỏ nhụy hoa

- Rửa sạch, để khô

- Nghiền nguyên liệu

- Cân nguyên liệu và tiến hành chiết Anthocyanin, sau đó lưu trữ dịch chiết Anthocyanin

- Xác định hàm lượng Anthocyanin bằng phương pháp quang phổ vi sai

- Khảo sát ảnh hưởng của pH đến màu Anthocyanin cũng như sự thay đổi cấu trúc phân tử của nó, chúng tôi xác định λmax của mỗi dung dịch pH khác nhau

- Làm giấy chỉ thị bằng cách ngâm tẩm giấy lọc trong dịch chiết ở thời gian

và nồng độ phù hợp

- Ứng dụng dịch chiết và giấy chỉ thị Anthocyanin phát hiện nhanh pH môi trường

Xác định hàm lượng Anthocyanin bằng phương pháp Vi sai

Nguyên tắc: chất màu Anthocyanin thay đổi theo pH Tại pH=1 các Anthocyanin tồn tại ở dạng oxonium hoặc flavium có độ hấp thụ cực đại, còn ở

pH = 4,5 thì chúng lại ở dạng carbinol không màu

Hình 2.2 Phổ hấp thụ Anthocyanin tại pH=1 và pH=4,5

Nhìn vào hình ta thấy bước sóng cực đại của pH=1 là cao nhất còn ở pH=4,5 thì gần như bằng 0

Vì vậy, theo lý thuyết, tại pH=4,5 sẽ không màu, nhưng thực tế ta vẫn thấy

có màu hồng nhạt Điều đó chứng tỏ trong quá trình chiết tách vẫn có sự cạnh tranh giữa các chất màu và một lượng chất màu khác cũng được chiết ra Tuy nhiên, chỉ có Anthocyanin mới có tính chất biến đổi màu theo pH nên ta sẽ chỉnh

pH để đánh giá hàm lượng Anthocyanin

Phương pháp Vi sai chọn đo quang tại 2 điểm là bước sóng cực đại và 700

nm đã tạo ra một nền trừ để loại hết ảnh hưởng của các chất không phải Anthocyanin

Đo mật độ quang của mẫu tại pH=1 và pH=4,5 tại bước sóng hấp thụ cực đại, so với độ hấp thụ tại bước sóng 700 nm

Dựa trên công thức của định luật Lambert-Beer

C l

Trong đó:

A: mật độ quang hoặc độ hấp thụ

C: Nồng độ chất nghiên cứu (mol/l)

l: là bề dày của dung dịch (cm)

: hệ số hấp thụ mol

Nếu nồng độ C tính theo phần trăm (kl/tt) và l tính theo centimet thì:

A = E1cm1% l.C Trong đó: E1cm1% là hệ số hấp thụ riêng

Nồng độ Anthocyanin sẽ được tính theo công thức:

V M

a V

n l

A C

 





Do vậy, lượng Anthocyanin theo công thức:

) 2 (

10

l

V K M A a

M: Khối lượng phân tử của Anthocyanin (g/mol)

l: Chiều dày cuvet (cm)

m

m

m 

% 100

Trong đó:

m1: Khối lượng trước khi sấy

m2: Khối lượng sau khi sấy

Từ đó tính được hàm lượng Anthocyanin theo phần trăm:

% Anthocyanin toàn phần (w/w) =

) 100

a: Lượng Anthocyanin tính được theo công thức (2) (mg)

m: khối lượng nguyên liệu ban đầu (g)

w: Độ ẩm của Hoa dâm bụt (%)

2.4.2 Sơ đồ quá trình nghiên cứu

Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu

Tính hàm lượng của Anthocyanin trong dịch chiết

Ảnh hưởng của pH đến màu và λmax của dịch chiết

Ứng dụng làm chỉ thị phát hiện nhanh

pH

Xác định khoảng đổi màu của Anthocyanin

Chất chỉ thị

Ứng dụng giấy chỉ thị phát hiện nhanh một số thuốc có tính acid, base

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Khảo sát điều kiện chiết Anthocyanin

Xác định bước sóng cực đại của Anthocyanin

Để xác định bước sóng cực đại khi phân tích Anthocyanin chúng tôi chọn máy quang phổ UV-VIS Quét phổ dịch chiết Anthocyanin trong khoảng 400 –

800 nm, chọn cực đại hấp thụ cho Anthocyanin và thu được kết quả như sau:

Hình 3.1 Phổ hấp thụ của Anthocyanin

Anthocyanin chiết được từ Hoa dâm bụt có cực đại hấp thụ tại 520 nm

Để giảm ảnh hưởng của dung môi và tạp chất nhưng vẫn đảm bảo được độ nhạy của phương pháp khi phân tích Anthocyanin nên chọn bước sóng phát hiện tại λ = 520 nm

Dựa vào tính chất Anthocyanin tan trong nước nên lựa chọn dung môi chiết Anthocyanin là nước Tuy nhiên, khi chiết thu được hàm lượng Anthocyanin rất thấp

Do đó, để tăng khả năng hòa tan Anthocyanin và tham khảo một số bài báo [6, 24], chúng tôi đã sử dụng thêm Ethanol vào dung môi chiết Ethanol vừa có tính phân cực tốt, giá thành rẻ rất thích hợp để sử dụng Và