Luan an Loi in 17 12 2014

ĐẶT VẤN ĐỀ Nằm vùng khí hậu nhiệt đới, Việt Nam có nguồn thực vật phong phú đa dạng Trong đó, nhiều dùng làm thuốc có có độc tính cà độc dược, mã tiền, ô đầu dùng, phải sử dụng liều lượng, không dùng đúng, chúng gây ngộ độc cho người bệnh [2], [3], [6], [9], [11], [27] Phụ tử, Ô đầu chứa thành phần có độc tính cao cho vị thuốc quý, dùng phổ biến Y Dược học cổ truyền phương Đông Trung Quốc Vị thuốc Ô đầu củ mẹ Phụ tử củ số loài thuộc chi Aconitum [2], [6], [11], [29] Hiện giới, có nghiên cứu chi Aconitum nhằm phát triển sản phẩm theo hướng đại, nâng cao hiệu sử dụng loài thuộc chi phòng điều trị bệnh Ở Việt Nam, Ô đầu đưa vào trồng Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu từ năm 70 kỷ trước [3], [11] Theo số tài liệu [6], [9], [11], [22], [27] Ô đầu Việt Nam ghi nhận tên là: A fortunei Hemsl A carmichaeli Debx Theo đề tài nghiên cứu tác giả Bùi Hồng Cường (năm 2007) với mục tiêu xây dựng phương pháp chế biến Phụ tử, bào chế cao Phụ tử cho sản phẩm có tác dụng cường tim, độc tính thấp xác định số thành phần hóa học Phụ tử sống sản phẩm, xác định Ô đầu trồng Sa Pa – Lào Cai thuộc loài A carmichaeli Debx tập trung nghiên cứu theo hướng chế biến cổ truyền [11] Hiện nay, Ô đầu trồng nhiều huyện Quản Bạ, Đồng Văn, tỉnh Hà Giang người dân địa phương sử dụng theo kinh nghiệm làm thuốc chữa bệnh đau nhức xương khớp nấu cháo ăn để tăng cường sức khoẻ Tuy nhiên, hàng năm nước ta có nhiều vụ ngộ độc chất lượng dược liệu không bảo đảm, sử dụng nhầm lẫn, đầu độc dược liệu, chế phẩm có nguồn gốc từ Ơ đầu Do cần có nghiên cứu thành phần hóa học, xác định chất dược liệu để kiểm sốt tốt chất lượng sử dụng an toàn hiệu Năm 2013, Thủ Tướng Chính phủ phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu đến năm 2020 định hướng đến năm 2030, theo Ơ đầu quy hoạch trồng tỉnh Hà Giang [35] Để phát triển vùng trồng Ô đầu cách bền vững, cần có nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học Ô đầu Hà Giang theo hướng ứng dụng Y Dược học đại, góp phần phát triển sản phẩm từ Ơ đầu nhằm tạo đầu cho Ô đầu Hà Giang Qua tham khảo, đến chưa thấy có nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học Ô đầu trồng tỉnh Hà Giang Để đóng góp mặt khoa học, thực tiễn góp phần giải vấn đề nêu trên, luận án với tên đề tài “Nghiên cứu thành phần hoá học số tác dụng sinh học Ô đầu (Aconitum carmichaeli Debx.) trồng tỉnh Hà Giang” thực nhằm mục tiêu sau: Xác định tên khoa học Ô đầu trồng tỉnh Hà Giang Nghiên cứu thành phần hóa học: định tính, định lượng nhóm chất, chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hoá học chất phân lập Đánh giá độc tính cấp thử số tác dụng sinh học số phân đoạn dịch chiết từ Ô đầu trồng tỉnh Hà Giang để gợi mở hướng sử dụng dược liệu Để đạt mục tiêu trên, luận án tập trung vào nội dung nghiên cứu sau: + Xác định tên khoa học Ô đầu trồng tỉnh Hà Giang phương pháp so sánh đặc điểm hình thái phương pháp so sánh trình tự ADN + Định tính, định lượng, chiết xuất, phân lập nhóm chất alcaloid, polysacharid từ Ơ đầu, Phụ tử sống nhóm chất flavonoid từ Ô đầu + Thử độc tính cấp phân đoạn dịch chiết alcaloid, flavonoid, polysaccharid + Thử tác dụng tăng cường miễn dịch phân đoạn dịch chiết chứa polysaccharid, tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan phân đoạn dịch chiết chứa flavonoid, tác dụng giảm đau phân đoạn chứa alcaloid có độc tính thấp Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Về thực vật 1.1.1.Vị trí phân loại chi Aconitum L Theo tài liệu [2], [3], [6], [22], [27], [89] Ô đầu thuộc chi Aconitum L., vị trí chi Aconitum L hệ thống phân loại thực vật tóm tắt sau: Ngành Mộc lan (Magnoliophyta) Lớp Mộc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae) Bộ Hoàng liên (Ranunculales) Họ Hoàng liên (Ranunculaceae) Chi Aconitum L 1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Aconitum L Theo tài liệu [40], [89], [105], [115], [135], lồi thuộc chi Aconitum có đặc điểm sau: Thân thảo, sống năm nhiều năm Lá lồi thuộc chi Aconitum có màu xanh đậm khơng có kèm Lá hình bàn tay chia thùy thùy sâu với 5-7 phần Mỗi phần lại chia thành thùy với hình cưa Lá xếp xoắn ốc, có cuống dài Hoa mọc thẳng đứng, có màu: xanh đậm, tím, trắng, vàng, hồng với nhiều nhị hoa Hoa phân biệt có năm đài hoa, hoa có hình mũ Hoa có 2-10 cánh hoa Hai cánh hoa to đặt đài thân dài Hoa có túi rỗng đỉnh chứa mật hoa Những cánh hoa khác nhỏ khơng hình thành, có 3-5 nỗn hợp phần Quả tổ hợp nang, nang chứa nhiều hạt Hiện nay, chi Aconitum L thành phân chi (subgenera) [89] với đặc điểm sau: - Phân chi Aconitum L: Cây thảo, sống năm, giả năm, có rễ củ Đài hoa khơng gần khơng có móc, đài hình mũ, hình thuyền cong hình lưỡi liềm, hình trụ Phiến cánh hoa có mơ tiết đỉnh rìa, mơi rõ khơng, cựa ngắn dài, vắng mặt, noãn 3-5 - Phân chi Lycotonum petermann: Cây thảo, sống lâu năm, có thân rễ đài hoa khơng có móc, đài hình trụ hình mũ cao hình thuyền Phiến cánh hoa có mơ tiết đỉnh có cựa hình túi uốn cong, môi thường thẳng ngắn Lá noãn 3- (8) - Phân chi Gymnaconitum Rapaics: Cây thảo, sống năm Lá chia phần hình chân vịt Đài hoa có móc, đài hình thuyền Cánh hoa khơng có cựa, mơi rộng, hình quạt, rìa có Lá nỗn 6-13 1.1.3 Số lƣợng phân bố loài thuộc chi Aconitum L Trên giới: Theo Neelofar Jabeen, Mohammad I Kozgar, giới có khoảng 300 lồi thuộc chi Aconitum, phân bố khu vực phía bắc ơn đới, khu vực lạnh bán cầu bắc [104], [105] Phân bố chủ yếu vùng núi Đông Á, Đông Nam Á, Trung Âu, số thấy phía tây bắc Mỹ phía tây nước Mỹ Khu vực dãy núi Himalaya có loài thuộc chi Aconitum ở: Pakistan, Ấn Độ, Nepal, Bhutan, bắc Tây Tạng Đến 33 loài tìm thấy khu vực Himalaya Theo Eti Sharma A K Gaur [55]: Ở Ấn Độ có khoảng 24 loài phân bố chủ yếu núi cao thuộc dãy Himalaya độ cao khoảng 3000-4200 m Các lồi Ấn Độ phân thành hai loại lồi có độc lồi khơng độc Lồi khơng độc như: A heterophyllum Wall., A laeve Royle A routndifolium Kar et Kir Lồi có độc như: A chasmanthum Stapf ex Holmes, A ferox Hardy Perennial , A deinorrhizum, A falconeri Stapf., A balfourii (Bruhl) Muk., A moschatum (Bruhl) Stapf , A violaceum Jacquem ex Stapf, A spicatum Stapf., A bisma (Buch Ham.) Rapaics A laciniatum (Bruhl) Stapf Ở Nepal có 38 lồi, 16 lồi sử dụng làm thuốc, phân bố chủ yếu phía đơng Nepal, khu vực ẩm, có độ cao 1800-4200 m [116] Ở Buthan có 19 lồi thuộc chi Aconitum [105] Ở Rumani có 10 lồi Ở Uckraina phát có 12 loài thuộc chi Aconitum, phân thành phân chi là: Aconitum, Lycoctonum Anthora mô tả củ hoa Trong phân chi Aconitum nhiều với phân nhánh là: Aconitum, Cammarum DC với 10 lồi Hai phân chi cịn lại tìm thấy loài [40] Theo Wei Wang, Yang Liu, Sheng-Xiang Yu, Tian-Gang Gao & Zhi-Duan Chen, họ Ranunculaceae với 59 chi khoảng 2500 loài, chi Aconitum với 300 loài phân thành phân chi là: A subg Lycoctonum (DC.) Peterm., A subg Aconitum (Stapf.) Rapaics, A.subg Gymnaconitum (Stapf.) Rapaics Phân chi A.subg Gymnaconitum (Stapf.) Rapaics có lồi là: A gymnarum Maxim Phân chi A subg Gymnaconitum phát vào năm 2013 cao nguyên Thanh Hải - Tây Tạng, Trung Quốc [135] Số loài thuộc chi Aconitum ghi nhận đến giới 948 loài nhiên có trùng lặp cách đặt tên lồi quốc gia, vùng khác nên thực chất có 331 lồi chấp nhận [105], [153] Tại Việt Nam: Cây Ô đầu trồng Việt Nam có nguồn gốc nhập nội từ nguồn: Nguồn thứ ngành Y tế thức nhập giống từ Trung Quốc, trồng Sa Pa- Lào Cai từ đầu năm 70 kỷ trước, sau trồng Bắc Hà - Lào Cai Sìn Hồ - Lai Châu Nguồn thứ cộng đồng người Hoa huyện Quản Bạ Đồng Văn - Hà Giang tự động nhập giống Ô đầu từ bên biên giới trồng vườn nhà nương rẫy Có tài liệu cho rằng, Ô đầu Việt Nam mọc hoang tỉnh Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu, Cao Bằng [3], [6], [11], [22], [27], [29] Cây Ô đầu trồng Việt Nam, ghi nhận tên là: A fortunei Hemsl A carmichaeli Debx [3], [6], [27], [29] Theo đề tài nghiên cứu tác giả Bùi Hồng Cường tên khoa học Ơ đầu trồng Sa Pa - Lào Cai A carmichaeli Debx [11] Đến chưa có cơng bố tên khoa học Ô đầu trồng tỉnh Hà Giang Do đó, cần có nghiên cứu xác định tên khoa học Ô đầu trồng tỉnh Hà Giang 1.1.4 Xác định tên khoa học loài thuộc chi Aconitum L giải trình tự ADN Thơng tin di truyền thể sinh vật chứa đựng phân tử có tên ADN, chuỗi xoắn kép gồm mạch đơn tạo thành từ loại nucleotid gồm A (adenin), C (cytosin), G (guanin), T (thymin) Các nucleotid nối trình tự xác định khác lồi, chí cá thể Giải trình tự ADN kỹ thuật giúp xác định xếp loại nucleotid A, C, G, T phân tử ADN, nhờ nghiên cứu đặc điểm di truyền mức độ sinh học phân tử Phương pháp giải trình tự ADN: + Phương pháp Sanger: Phương pháp enzym Sanger cộng phát minh vào năm 1977 hoàn thiện, dễ dàng thực phịng thí nghiệm Các đoạn ADN cần xác định trình tự phải tạo dịng vào vector để nhân thành nhiều tế bào vi khuẩn, sau tách chiết tinh khiết vector từ vi khuẩn để thành vector tự Lượng ADN sau tách chiết phân vào ống nghiệm khác để thực phản ứng giải trình tự Mỗi phản ứng bao gồm: vector có gắn chèn đoạn ADN cần xác định trình tự, đoạn mồi bổ sung cách đặc hiệu với trình tự vector vị trí đoạn chèn ADN, enzym ADN polymerase, bốn loại dNTP 1% loại ddNTP (ddNTP dideoxynucleotid triphosphat có cấu trúc hóa học gốc OH vị trí carbon thứ đường deoxyribose làm cho dNTP gắn vào Do kết thúc phản ứng kéo dài chuỗi Kết tạo mạch ADN có chiều dài khác tương ứng với vị trí trình tự nucleotid đoạn ADN gốc Các ddNTP đánh dấu đồng vị phóng xạ 32P hay 35S Sau điện di gel polyacrylamid, vạch điện di hiển thị kỹ thuật phóng xạ tự ghi Từ vạch xác định trình tự ADN Hình 1.1 Trình tự ADN xác định phương pháp Sanger + Phương pháp giải trình tự máy tự động: Ngày nay, việc giải trình tự thực dễ dàng nhờ có hỗ trợ máy giải trình tự tự động Máy giải trình tự hoạt động dựa theo nguyên lý phương pháp Sanger có cải biến Trong ddNTP khơng đánh dấu phóng xạ mà đánh dấu chất huỳnh quang khác cho loại ddNTP Máy giải trình tự tự động bao gồm thành phần như: hệ mao quản, hệ chiếu sáng laser, hệ nhận xử lý tín hiệu Các vạch điện di mao quản phát sáng qua chùm tia sáng laser Hệ thống nhận diện tín hiệu màu ghi lại mã hóa thành nucleotid A, T, C, G Hình 1.2 Hệ thống giải trình tự ADN máy tự động - Ứng dụng phương pháp giải trình tự gen ADN là: định danh, xác định kiểu gen, nghiên cứu đột biến + Ứng dụng định danh loài thuộc chi Aconitum: Theo nghiên cứu tác giả Jun He cộng năm 2010, cho thấy phương pháp giải trình tự gen ADN so sánh với gen chuẩn ngân hàng gen, tác giả xác định trình tự gen tên khoa học loài thuộc chi Aconitum Trung Quốc là: A carmichaeli, A alboviolaceum, A brachypodum, A contortum, A coreanum, A gymnandrum, A hemsleyanum, A kusnezoffii, A nagarum, A scaposum, A tanguticum, A vilmorinianum, A racemulosum, A chrysotrichum, A crassiflorum, A finetianum, A gigas, A scaposum [83] 1.2 Thành phần hóa học số lồi thuộc chi Aconitum L Thành phần hóa học lồi thuộc chi Aconitum thường có nhóm chất alcaloid, polysaccharid, flavonoid, alcaloid thành phần Ngồi cịn có acid hữu cơ, đường tự do, acid amin, sterol, carotenoid Sự phân bố nhóm chất này, khác phận: củ, lá, hoa, quả, hạt, thân [6], [11], [27] 1.2.1 Thành phần hóa học số lồi thuộc chi Aconitum giới 1.2.1.1 Alcaloid Căn vào cấu trúc khung diterpenoid, số lượng nguyên tử C chia alcaloid thành nhóm [64], [72], [81], [82], [84], [94], [109]: - Khung C18- diterpenoid alcaloid - Khung C19- diterpenoid alcaloid - Khung C20- diterpenoid alcaloid - Nhóm Bisditerpenoid - Nhóm alcaloid khác Dựa vào số liên kết ester với khung diterpenoid, nhóm chia thành nhóm: alcaloid diester (aconitin, mesaconitin ), alcaloid monoester (benzoylaconin, benzoylmesaconin), alcaloid alkamin [11], [117] * Alcaloid C18-diterpenoid Các C18-diterpen alcaloid có nguồn gốc từ C19- diterpen alcaloid, khung carbon có chứa 18C C18 Trong hợp chất này, C4 thay nguyên tử hydrogen, nhóm ester nhóm 3,4-epoxid Đến có hàng trăm alcaloid phân lập từ loài thuộc chi Aconitum như: lappaconitin, ranaconitin, sepaconitin, aconosin, acoseptrin, dolaconin, finaconitin, puberanin, kirimin…[50], [52], [68], [80], [81], [116], [118], [142] Các alcaloid chia thành nhóm là: lappaconitin ranaconitin [125], [139] Nhóm lappaconitin có cấu trúc đặc trưng diện nguyên tử carbon vị trí C-4 Nhóm ranaconitin cấu trúc đặc trưng nguyên tử oxy vị trí C-7 Khung cấu trúc nhóm alcaloid C18-diterpenoid lappaconitin, ranaconitin trình bày hình 1.3 16 13 12 14 17 10 R N 15 11 18 Khung C18- diterpenoid Lappaconitin Ranaconitin Hình 1.3 Cấu trúc alcaloid C18-diterpenoid * Alcaloid C19-diterpenoid Khung cấu trúc nhóm alcaloid C19-diterpenoid trình bày hình 1.4 12 17 10 16 13 14 15 11 R N 19 18 Hình 1.4 Cấu trúc khung C19-diterpenoid alcaloid C19-diterpenoid alcaloid hình thành dựa khung hexacyclic carbon Những hợp chất thường chứa nhiều ngun tử oxy, có nguyên tử oxy hoạt động, số bị ester hóa acid thơm acid acetic Những alcaloid coi dẫn xuất aconitin Các alcaloid C19-diterpenoid tìm thấy nhiều lồi Aconitum spp., có 250 hợp chất công bố như: aconitin, mesaconitin, hypaconitin, delcosin, karacolin, hokbusin A, fuzilin, neolin…[81], [116], [124], [141] Những hợp chất chia làm nhóm [52] là: + Nhóm aconitin: Hợp chất aconitin lần phân lập từ loài A napellus vào năm 1821 Peschier, nhiên đến 1959 xác định cấu trúc Cấu trúc nhóm khơng có ngun tử oxy vị trí C-7, có nhóm α-OH vị trí C-6 Dựa vào ngun tử nitơ phân thành nhóm nhỏ là: amin, imin, hỗn hợp acetal N-O, amid Chất đại diện cho nhóm như: aconitin, mesaconitin, hypaconitin… phân lập từ số loài như: A carmichaeli, A napellus, A jaluense, A kusnezoffii… + Nhóm lycoctonin: Cấu trúc đặc trưng có mặt nguyên tử oxy vị trí C-7 Chất đại diện lycaconitin, lycoctonin phân lập từ A lycoctonum + Nhóm pyrodelphinin: cấu trúc so sánh với nhóm aconitin khơng có nhóm ợ vị trí C-8 chất đại diện như: pyrodelphynin, flaconitin phân lập từ A tuberosum, Aconitum falconeri Stapf + Nhóm lacton: cấu trúc có vịng δ-lacton, chất đại diện heterophyllidin, heterophyllisin, heterophyllin phân lập từ A heterophyllum + Nhóm có nguồn gốc sinh tổng hợp từ nhóm aconitin thường có nguyên tử nitơ nối với C-17 Chất đại diện secokaraconitin phân lập từ A karacolincum + Nhóm cấu trúc đặc trưng cầu nối bất thường C-8 với C-17, C-8 với C-10, C-7 với C-17 Chất đại diện vilmoraconitin phân lập từ A vilmorinianum Cấu trúc số alcaloid thuộc nhóm C19-diterpenoid trình bày hình 1.5 Aconitin Lycoctonin Pyrodelphynin Heterophyllin Secokaraconitin Vilmoraconitin Hình 1.5 Một số alcaloid thuộc nhóm C19-diterpenoid alcaloid 10 ... benzoylmesaconin, benzoylaconin, benzoylhypaconin, 14- anisoyaconin, neolin, ignavin, mesaconin, benzoylaconin, 16pyromesaconin, pyraconin, 15 – α – hydroxyneolin, ajaconin benzoylmesaconin kết hợp với interleukin... Đến có hàng trăm alcaloid phân lập từ loài thuộc chi Aconitum như: lappaconitin, ranaconitin, sepaconitin, aconosin, acoseptrin, dolaconin, finaconitin, puberanin, kirimin…[50], [52], [68], [80],... ex Rchb [122 ] glucopyranosid A.angustifolium Bernh ex Rchb [122 ] Quercetin - 7-O-α-L-arabinopyranosid-3-O-(2’’acetyl)-β-D-galactopyranosid A.angustifolium Bernh ex Rchb [122 ] Quercetin - 7-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-Lrhamnopyranosid-3-O-β-D-glucopyranosid