Tổng quan về clostridium botulinum và độc tố botulin

Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin Chương I: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Từ xa xưa, người biết đến sử dụng vi sinh vật ứng dụng vi sinh vật thực phẩm Các trình làm rượu, làm dấm, làm tương, muối chua thực phẩm ứng dụng đặc tính sinh học chủng vi sinh vật Khi khoa học phát triển, biết rõ vai trò vi sinh vật, việc ứng dụng vi sinh vật sản suất ngày rộng rãi có hiệu Trong tự nhiên vi sinh vật có lợi có vi sinh vật có hại như: chuẩn vi khuẩn gây bệnh cho người, trồng, động vật thuỷ sản, nhóm vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm, gây ô nhiễm môi trường xung quanh Chính ta cần phải tìm hiểu toàn có liên quan đến vi sinh vật để sử dụng tối đa đặc tính có hại đề phòng ảnh hưởng chúng đem lại Nội dung báo cáo cho ta đáp ứng cho ta nhìn tổng quan số vi khuẩn có hại thực phẩm, chủ yếu là: “Tổng quan Clostridium botulinum độc tố butulin”, độc tố botulin cho mạnh tự nhiên, mạnh độc tố aflatoxin độc tố khác, gây tê liệt bó thể dần tác động trực tiếp hay gián tiếp đến hệ thần kinh người 1.2 Mục đích Nghiên cứu vi sinh vật gây bệnh thực phẩm sâu tìm hiểu, tổng quan số loài thường xuyên nhiễm thực phẩm E.coli, Listeria monocytogenes, Salmonella đặc biệt vi khuẩn Clostridium botulinum độc tố botulin vi khuẩn Sau đưa số biện pháp phòng ngừa kiểm soát số nhóm vi khuẩn 1.3 Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm hình thái, cấu tạo di truyền, hoạt động sinh lý, hoá học, nhóm vi sinh vật Khả gây bệnh vi sinh vật thực phẩm mối liên quan chúng với thực phẩm Nghiên cứu độc tố vi sinh vật gây bệnh thực phẩm nhằm ngăn ngừa độc tố GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh -1- Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin Chương II: TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan độc tố vi sinh vật gây bệnh thực phẩm Thực phẩm chứa thành phần dưỡng chất, thích hợp cho phát triển số lớn vi sinh vật Chúng tồn tồn thực phẩm gây hư hỏng hay gây bệnh cho người Các loại vi sinh vật thường gặp công nghệ thực phẩm nấm mốc, vi khuẩn, nấm men, 2.1.1 Độc tố nấm mốc 2.1.1.1 Nấm mốc Nấm mốc tên chung để nhóm nấm nấm men nấm lớn có thể Đây nhóm vi sinh vật có cấu tạo dạng sợi có lông tơ, sợi tạo khuẩn ty dạng bột Màu sắc nấm mốc xuất bề mặt nước chấm, bánh mì để lâu ngày, rau nhiều loại thức ăn khác gây mùi, vị khó chịu Có số loài tiết chất độc gây ngộ độc thức ăn Mặt khác nấm mốc lại tham gia vào trình có lợi khác tác nhân quan trọng trình sản xuất nước chấm, nước tương, chao Nấm mốc hô hấp hiếu khí bắt buộc, phát triển số môi trường mà nấm men vi khuẩn phát triển môi trường mà có áp suất thẩm thấu, độ ẩm, độ acid lớn Sự phát triển nấm mốc thực phẩm nhanh chóng, dễ dàng nhận biết xuất dạng mốc dạng nùi bông, mờ nhạt, sợi màu Thí dụ như: sợi nấm thịt, mốc xanh bánh mỳ cũ….Trên thực tế nấm mốc nguyên nhân hư hỏng nhiều loài thực phẩm Tuy nhiên số nấm mốc đặc hiệu dùng công nghệ chế biến thực phẩm, hay thành phần thực phẩm Thí dụ như: nấm mốc chế biến cheese, tạo acid citric sản xuất soft drink… a Hình thái Nấm mốc màu xanh lục, chúng phát triển thức ăn có sẵn Nấm mốc loài vi sinh vật phát triển thành hình sợi phân nhánh, sợi phân nhánh phát triển thành đám chằng chịt, người ta gọi khuẩn ty hay hệ sợi nấm phát triển môi trường đặc thường phân làm loại rỏ rệt: khuẩn ty ký sinh khuẩn ty dinh dưỡng GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh -2- Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin Hình 2.1: Nấm mốc Aspergillus Hình 2.2: Penicilliumchrysogenum Hai loại ty khuẩn đóng vai trò nhiệm vụ khác Khuẩn ty dinh dưỡng làm nhiệm vụ rễ xanh Còn khuẩn ty ký sinh lại đóng vai trò sinh sản chủ yếu Mỗi sợi nấm lại phát triển thành phận khác Dưới cùng, nơi tiếp giáp với môi trường dinh dưỡng sợi nấm từ sợi phát triển thành giá đỡ Trên giá đỡ bọng nấm Xung quanh bọng nấm thể tế bào hình chai Thể hình chai lớp bao xung quanh Lớp chồng chất lên lớp Trên thể hình chai chuỗi bào tử trần Các bào tử trần dính vào thành chuỗi dài Nấm mốc không di chuyển quan vận chuyển, nấm mốc hoàn toàn hiếu khí, chúng phát triển điều kiện thoáng khí Về màu sắc nấm mốc có nhiều màu sắc khác có nấm mốc màu đỏ Neospora crassa, có loài có màu đen Aspergillus niger, có loài có màu xám Aspergillus usamii, có màu trắng xám Mucor hay Rhyzopus có loại màu xanh Penicillium Về hình thái khối lượng bào tử có nhiều kiểu khác GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh -3- Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin b Cấu tạo Do cấu tạo đặc biệt, nấm mốc hoàn toàn khác với vi khuẩn nấm men Dựa vào cấu tạo chúng mà người ta chia nấm mốc làm loại Loại nấm mốc có vách ngăn: Đây trường hợp mà khuẩn ty tạo thành chuỗi tế bào nối tiếp Ta xem nối tiếp đốt tre tre Ngăn cách hai tế bào màng ngăn Trong tế bào nấm có đủ quan tế bào, quan trọng có nhân, thường thấy Aspergillus Penicillium Loại nấm mốc vách ngăn: Đây loại nấm mốc đa hạch (nhiều hạch), hạch màng ngăn Hầu hết màng tế bào nấm lớp vỏ cellulose thực vật mà lại có chất kitin lớp vỏ cứng sâu bọ Chất dự trữ hydratcacbon nấm không đường bột mà chất glycogen Đặc biệt, tế bào nấm có giàu chất có hoạt tính sinh học (enzyme) giàu kháng sinh Lợi dụng đặc điểm người ta sử dụng nấm mốc sản xuất sản phẩm phục vụ cho đời sống Cấu tạo thành tế bào nấm mốc chưa hiểu hết Tuy nhiên nhiều tài liệu cho thấy có: 80-90% polisacarit; 1-3% hecxozamin; 3-8% lipit; 4% protein; chất màu (melamin) 2.1.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hình thành độc tố a Hoạt độ nước (aw) Là yếu tố quan trọng định lượng quan hệ hàm lượng nước thực phẩm vi sinh vật phát triển chúng Về mặt giá trị, aw độ ẩm tương đối trạng thái cân sản phẩm biểu diễn dạng thập phân, thực phẩm giữ nhiệt độ ổn định, bao bì kín, sau thời gian, hàm lượng nước thực phẩm đạt tới cân với nước môi trường khí bao quanh, đó: aw = HRkk / 100 Trong nhiều trường hợp, aw nhân tố môi trường chủ yếu kiểm soát phát triển nấm mốc xác định độ ổn định sản phẩm bảo quản Hiểu biết ảnh hưởng aw tới phát triển mốc sinh sản mycotoxin giúp tiên liệu khả tạo mycotoxin sản phẩm bảo quản Như sinh vật khác, nấm GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh -4- Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin mốc cần có nước để tồn sinh sản Khả chịu đựng môi trường có hoạt độ nước thấp nấm mốc thường cao vi sinh vật khác Trong số nấm mốc, có nhóm nấm mốc thuộc vào nhóm vi sinh vật ưa khô Một vài loài nấm mốc có khả phát triển aw = 0,75 thấp vòng sáu tháng Như nông sản thực phẩm bảo quản không khí 75% 85% ẩm bị nấm mốc ưa khô công diều kiện bảo quản bình thường b Nhiệt độ Nhiệt độ tác động chủ yếu tới sinh sản nảy nầm bào tử nấm mốc Theo nhiệt độ thích hợp cho phát triển, nấm mốc chia thành loại bao gồm: - Nấm mốc ưa nhiệt (đến 60oC, thermophile) - Nấm mốc chịu nhiệt (20 – 50oC, thermotolerant) - Nấm mốc chịu nhiệt (10 – 40oC, mesophile) - Nấm mốc ưa lạnh (5 – 10oC, psychrophile) - Nấm mốc ưa băng giá (dưới 10oC, cryophile) Hầu hết nông sản thực phẩm, đặc biệt dạng ngũ cốc bảo quản nhiệt độ thích hợp cho phát triển nhóm nấm mốc Nông sản thực phẩm bảo quản nước nhiệt đới thường bị Aspergillus công Aspergillus phát triển thích hợp điều kiện nhiệt độ ẩm (30oC) không khắc khe với độ ẩm (85%) c Môi trường điều tiết Giảm hàm lượng oxy tăng hàm lượng cacbonic khí bảo quản nông sản thực phẩm có tác dụng hạn chế đáng kể phát triển nấm mốc d Chất bảo quản Thông thường chất chống mốc, chống sâu hại thường có tác dụng hạn chế phát triển nấm mốc Tuy nhiên, không phép áp dụng dạng chế phẩm dùng cho người Đôi khi, thức ăn gia súc người ta sử dụng chất bảo quản gốc acid propionat e Phối hợp yếu tố GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh -5- Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin Thường yếu tố tác động riêng rẽ tới sản phẩm, mà ảnh hưởng yếu tố đồng thời Thông thường phối hợp yếu tố hạn chế đồng thời để bảo quản sản phẩm sản phẩm bảo quản thời gian dài Ví dụ bảo quản aw thấp, nhiệt độ thấp, khí điều tiết kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm Trong điều kiện bảo quản tự nhiên, aw yếu tố chủ đạo xác định thời gian bảo quản sản phẩm Trong nhiều trường hợp, điều kiện phát triển nấm mốc nông sản thực phẩm không trùng với điều kiện tối ưu cho tổng hợp mycotoxin chúng 2.1.1.3 Aflatoxin Đây độc tố nấm đáng sợ Nó gây nhiều ngộ độc bệnh bất trị khắp nơi toàn giới Nó làm chết số lớn súc vật trang trại, gia cầm, gia súc, chí cá người nạn nhân ngộ độc Con số báo khoa học có liên quan đến khía cạnh khác bệnh độc tố aflatoxin không ngừng tăng lên Với hiệu lực đáng sợ nó, loài Aspergillus flavus trợ thủ qúy khoa học: Nó cho phép nghiên cứu số qúa trình ung thư hoá, có tính chất quan trọng việc tìm phép chữa bệnh thích hợp Aflatoxin sản phẩm trao đổi thứ cấp bậc II qúa trình phát triển vi nấm, chất dự trữ chất cặn bã a Nguồn gốc Các chủng nấm mốc tổng hợp aflatoxin chủ yếu thuộc Aspergillus flavus, A parasiticus, A nomius Loài Penicillium puberulum sản aflatoxin với số lượng Aspergillus flavus nấm mốc mà hiệu lực gây độc gọi bệnh độc tố aflatoxin đáng sợ A flavus coi loài thấy khắp nơi giới: đất, chất hữu loại hạt, hạt có dầu Loài A flavus dễ nhận màu vàng lục dạng nhiều vón cục tản, bào tử tương đối lớn hình cầu, màu vàng nâu đến lục, sần sùi Chủng nấm mốc thích hợp điều kiện khí hậu ẩm nóng Việt Nam nước nhiệt đới, chí chúng phát triển điều kiện độ ẩm thấp 70- 80% Ở điều kiện nhiệt độ độ ẩm cao khả tổng hợp aflatoxin A flavus cao GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh -6- Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin A flavus sản sinh aflatoxin thay đổi theo tùy chủng, mặt khác phụ thuộc vào điều kiện xung quanh Trên lạc, nhiệt độ tốt cho A flavus sản sinh aflatoxin 250C 7-9 ngày Giữ nhiệt độ 450C thường xuyên sinh trưởng lẫn sinh sản aflatoxin bị ức chế Dưới 150C tốt 120C có không sinh aflatoxin Hàm lượng nước chất có vai trò việc sản sinh aflatoxin, có lẽ gắn liền với sinh trưởng tương đối A flavus Trên gạo có hàm lượng nước 24-26% ngô 19-24% aflatoxin hình thành nhanh chóng nhiệt độ ẩm Độ pH ban đầu môi trường ảnh hưởng đến hình thành aflatoxin; dù có xu hướng quy trị số 4-5 Tăng hàm lượng cacbonic khí hạn chế sinh trưởng A flavus, giảm sản lượng aflatoxin Các aflatoxin coi nhạy cảm với ánh sáng thực tế chúng nhạy cảm với tử ngoại b Cấu trúc Aflatoxin dùng để gọi hỗn hợp độc tố loài nấm A flavus sinh Là phức hợp cấu trúc hoá học gần nhau: aflatoxin B1, B2, G1, G2 Năm 1964 Asao cộng nghiên cứu đề xuất cấu trúc aflatoxin B1và G1 Các vết có màu xanh tím (Blue) gọi aflatoxin B Các vết có màu xanh lục (green) aflatoxin G 0CH3 Hình 2.3: Cấu trúc hóa học aflatoxin B1 GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh -7- Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin Hình 2.4: Cấu trúc aflatoxin G1 Công thức nguyên Aflatoxin B1: C17H12O6 Aflatoxin G1: CTN: C17H12O7 Sau chất Aflatoxin B có màu xanh tím khác xác định cấu trúc gọi Aflatoxin B2 dẫn xuất hydro hoá aflatoxin B1 nối đôi chưa no vòng furan CTN: C17H14O6 Tương tự Aflatoxin G1 có dẫn xuất hydro hoá vòng furan gọi Aflatoxin G2 CTN: C17H14O7 Hình 2.5: Cấu trúc aflatoxin B2 Hình 2.6: Cấu trúc aflatoxin G2 Năm 1963 nghiên cứu chất độc sữa thịt bò ăn phải thực phẩm có aflatoxin, Alicroft Carnaghan chiết tách chất có khả gây vịt rối loạn tương tự aflatoxin gây Độc tố gọi “độc tố sữa”, chất hydroxyl hoá aflatoxin B1 B2 vị trí 9a gọi aflatoxin M1 M2: CTN: C17H12O7 C17H14O7 GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh -8- Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin Hình 2.7: Cấu trúc aflatoxin M1 Hình 2.8: Cấu trúc aflatoxin M2 Tóm lại, aflatoxin thuộc nhóm chất có thành phần hóa học tương đồng chứa nhân coumarin kết hợp với phần bisfuran phần lại phần penthanon B1 B2 vòng lacton sáu cạnh G1 hay G2, aflatoxin M1 M2 dẫn chất hydroxyl hoá aflatoxin B1 B2, afltoxin B1 có nhiều độc tính cao nên thường xem đối tượng việc phân tích chất Aflatoxin M1 quan tâm độc tính giống aflatoxin B1 thường hay xuất sữa sản phẩm từ sữa bò sữa ăn thức ăn có aflatoxin c Độc tính Độc tính với aflatoxin, người ta thấy có loạt triệu chứng gắn liền với nhiễm độc cấp tính biến đổi liên quan đến nhiễm độc mãn tính Loại sau có chất di truyền tương ứng với ba kiểu: gây ung thư, gây quái thai gây đột biến Hậu việc nhiễm aflatoxin phụ thuộc nhiều vào tuổi, giới tính, loài, trạng thái dinh dưỡng, mức tần số tiếp xúc Độc tính cấp ngộ độc cấp tính thể chết động vật thí nghiệm khoảng thời gian thay đổi tùy theo khả chịu đựng loài Giải phẩu bệnh cho thấy hoại tử chảy máu nhu mô gan, viêm tiểu cầu thận cấp, tụ máu phổi Gan nhợt nhạt, màu tăng thể tích Khi nối đôi vòng furan đầu độc tính giảm 4,5 lần Như B1 độc B2 G1 độc G2 Và độc tính giảm có hai vòng lacton (G1và G2) aflatoxin loại B độc loại G GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh -9- Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin Độc tính mãn triệu chứng nhiễm độc mãn tính khác Đầu tiên ăn ngon chậm lớn, chí có xuống cân, gan chịu ảnh hưởng nặng chất độc Ảnh hưởng mặt hoá sinh lên tế bào có nhiều nghiên cứu tác động aflatoxin acid nucleic tổng hợp protein Aflatoxin B1 tác động giống ActinomycineD, chúng ức chế qúa trình tổng hợp liều cao liều thấp cho kết qủa chậm Theo Clifford Rees chế tác động sau: - Tác động qua lại với DNA ức chế polimerase chịu trách nhiệm tổng hợp DNA RNA: chúng gắn vào vòng purin DNA - Đình tổng hợp DNA: Giống chế Actinomycine D, chúng xen vào vòng xoắn kép DNA guanin Ức chế enzym DNA polimerase cần thiết cho việc tổng hợp DNA - Giảm tổng hợp RNA: tác động tương hổ với cấu tử chất nhiễm sắc tác động lên - A polimerase làm ngăn trở chép DNA RNA polimerase - Biến đổi hình thái nhân tế bào thể tách nhân, chất nhiễm sắc bị đùn ngoài, hạt ribonucleoprotein tập trung lại thành vùng dày đặc - Giảm tổng hợp protein, tăng khả gây ung thư: có nhiễm độc mãn tính, triệu chứng thấy ăn chậm lớn, có xuống cân gan chịu ảnh hưởng nặng xuất thoái hoá tế bào nhu mô gan, tăng sinh tế bào biểu mô, tế bào lympho bị thâm nhiễm Aflatoxin chất gây ung thư mạnh hấp thu qua đường tiêu hoá, hấp thu 2,5mg aflatoxin 89 ngày thấy xuất ung thư gan sau năm Liều gây ung thư aflatoxin thấp 1000 lần so với phẩm màu azoic, đặc biệt ung thư gan 2.1.3 Vi khuẩn E coli 2.1.3.1 Ý nghĩa E coli trực khuẩn đường ruột phân lập từ phân người lần vào năm 1885, Escherich đặt tên Bacterium coli commune, ngày gọi Escherichia coli (thường viết tắt E coli), E coli loài vi khuẩn ký sinh đường ruột động vật máu nóng (bao GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh - 10 - Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin sử dụng để điều trị trương lực viêm mạch bạch huyết cổ tử cung, chất chống tiết cholin tác dụng phụ phát lâm sàng Mặc dù phân bố khắp thể tác động trực tiếp BT hệ thần kinh trung ương không rõ độc tố thần kinh botulin với trọng lương phân tử 150 kDa vượt qua hàng rào bảo vệ não 2.3.5.2 Ảnh hưởng gián tiếp Ảnh hưởng BT khớp thần kinh thần kinh quan thoi kết ảnh hưởng gián tiếp khác hệ thần kinh trung ương Tại xương sống, BT tạo phản xạ kiềm chế tế bào thần kinh vận động alpha cách phong tỏa tế bào thần kinh vận động gamma tín hiệu hướng tâm Ia II 2.3.6 Hoạt hộng gây đau đớn BT Khi BT sử dụng để điều trị rối loạn hoạt động dẫn đến đau đớn đáng kể Cho đến nay, cách giảm đau đớn giảm tăng hoạt động Tuy nhiên, đau đớn formalin gây giảm trực tiếp BT Có lẽ ảnh hưởng BT dựa vào hoạt động dẫn truyền thần kinh khác acetylcholine Cơ chất P (SP), chất có khả gây bệnh thần kinh dẫn đến đau đớn, giãn mạch viêm thần kinh bị chặn BT với acetylcholine mắt tế bào thần kinh xống lưng Việc kết hợp kiềm chế với giảm SNAP 25 cho thấy hiệu ứng trực tiếp BT 2.3.7 Sự phân bố Clostridium botulinum Clostridium botulinum bào tử phổ biến rộng rãi môi trường xảy chủ yếu đất trầm tích biển Chúng bao gồm: - Đất trồng trọt đất rừng - Cặn đáy suối, hồ ven biển nước Tỷ lệ Clostridium botulinum toàn giới thay đổi tùy theo khu vực địa lý, mà nhiều khả có liên quan đến thành phần vật lý hoá học đất vi sinh vật nơi Ví dụ loại ưa lạnh loại không thủy phân protein nhóm B E tìm thấy phổ biến đất có độ lạnh thông thường cặn GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh - 37 - Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin đáy loại thủy phân protein ưa nhiệt độ trung bình nhóm A va B tìm thấy phổ biến đất ẩm Ngoài ra, mầm bệnh bào tử có số nơi khác như: – Trong đường tiêu hóa loài cá, chim dày động vật có vú – Mang nội tạng động vật có vỏ cua loài sò hến – Trong mật ong loài ong – Bào tử Clostridium botulinum kháng cự căng thẳng môi trường (thì) tìm thấy vài thức ăn, bụi, chất xịt (bình xịt), chất thải môi trường khác 2.3.8.Tình hình nhiễm Clostridium botulinum thực phẩm giới Việt Nam Tai Việt Nam: Hiện sinh hoạt hàng ngày, loại thực phẩm đóng hộp có mặt phổ biến thị trường nhiều người tiêu dùng sử dụng Vào mùa mưa bão, ngập lụt, người nội trợ gia đình thường lại quan tâm đến vấn đề dự trữ loại thực phẩm nhà để đối phó với khó khăn xảy Một thực phẩm thường dự trữ loại thực phẩm đóng hộp Nếu mua sử dụng loại đồ hộp không cẩn thận, người bị ngộ độc ăn phải mầm bệnh phát triển loại thực phẩm Ngộ độc thường ghi nhận bị nhiễm độc tố vi khuẩn Clostridium botulinum có đồ hộp, gây tử vong Tại số nơi giới: 161 dân làng tỉnh Nan (miền Bắc Thái Lan) phát bệnh sau ăn măng tre muối muối chua lễ hội Nhân viên y tế Thái Lan cho dịch bệnh tỉnh Nan bảo quản măng tre không tốt tạo vi khuẩn Clostridium botulium có độc tố chết người Độc tố vi khuẩn Clostridium botulinum độc tố mạnh sử dụng làm vũ khí sinh học Độc tố gây tử vong làm tê liệt hô hấp làm người bệnh không thở GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh - 38 - Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin Hình 2.19: Đội cứu hộ bệnh nhân lên máy bay tới Người bệnh phải hỗ trợ thở để sống sót dây thần kinh phục hồi Do bệnh viện tỉnh Nan tải bệnh nhân, 17 bệnh nhân nặng đưa máy bay lên Bangkok điều trị vào ngày 23/03.Về bản, 17 bệnh nhân chưa qua nguy hiểm Mặc dù huyết áp mạch bình thường, bệnh nhân chưa hồi phục Thậm chí số người không cử động thể Các bác sỹ nhận định tình trạng bệnh nhân phụ thuộc vào lượng chất độc họ ăn phải Một số bệnh nhân bị chứng nhiễm trùng phổi, biến chứng dùng máy thở Nhiều người bị nhiễm trùng bàng quang Một bệnh nhân nữ 14 tuổi, bệnh nhân nặng điều trị bệnh viện Ramathibodi, bị hôn mê sâu Cô bé nhúc nhích người Để giảm biến chứng dùng máy thở lâu, bác sỹ cân nhắc thực phẫu thuật mở khí quản, dùng khí quản nhân tạo đặt cổ cô bé Tiến sỹ Prat Boonyawongvirot, Phó Thư ký Thường trực Bộ Y tế Công cộng Thái Lan, cho biết không bị biến chứng, bệnh nhân phải hai tháng hồi phục Trước tình hình trên, quan chức y tế Thái Lan phải cầu viện giúp đỡ chuyên gia quốc tế để điều trị bệnh nhân Các chuyên gia vũ khí sinh học quân đội chuyên gia Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đến tỉnh Nan điều tra bệnh Đến nay, Bộ trưởng Y tế Công cộng Thái Lan, Pinij Jarusombat, lệnh cho nhân viên y tế tỉnh Nan tỉnh lân cận kiểm tra măng tre chợ xem sản phẩm có nhiễm vi khuẩn Clostridium botulinum hay không Huyện Ban Luang (tỉnh Nan), tâm điểm dịch GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh - 39 - Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin bệnh, cấm bán vận chuyển mang tre đóng hộp Bộ Y tế Công cộng Thái Lan khuyên dân chúng không nên hoảng sợ nên ăn thức ăn nấu chín, phải luộc măng tre 30 phút Theo Christopher Braden, chuyên gia Trung tâm Atlanta Trung tâm Kiểm soát Phòng bệnh Mỹ (CDC), đợt ngộ độc thức ăn lớn nhiều thập kỷ giới Vào đợt bùng phát năm 1991, 90 người Ai Cập phát bệnh sau ăn thức ăn chứa vi khuẩn Clostridium botulinum 2.3.9 Các phương pháp phát Clostridium botulinum 2.3.9.1 Phương pháp truyền thống Thử nghiệm độc tố Clostridium botulinum chuột Trong tất phương pháp pháp xác định độc tố botulinum thực phẩm phương pháp phát thể chuột tiêu chuẩn để xác định độc tố Sự diện chất độc phát cách tiêm vào chuột trích xuất từ thực phẩm sau quan sát cho đặc tính triệu chứng bệnh ngộ độc chuột chết sau khoảng thời gian 48 A Thiết bị vật liệu Tủ lạnh Khăn khô Đèn Bunsen Gạc thấm vô khuẩn mở Cối chày vô trùng Chiếc kẹp vô trùng Những ống hút nút vô trùng Thiết bị pipet khí (không hút pipet miệng) Những ống nghiệm nuôi cấy 10 Bình kỵ khí 11 Dây cấy vòng 12 Vườn ươm 35 - 280C 13 Bình mẫu vô trùng GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh - 40 - Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin 14 Những giá treo đồ ống nghiệm nuôi cấy 15 Những tiêu hiển vi 16 Kính hiển vi 17 Đĩa petri vô trùng 100 mm 18 Máy ly tâm ống 19 Máy ly tâm, làm lạnh, tốc độ cao 20 Tripsin 21 Những ống tiêm ml, gạc thấm vô khuẩn,với 25 số đo, 5/ kim inch để tiêm thuốc chuột 22 Chuột nặng 16-24 G 23 Những lồng chuột, thức ăn, bình lấy mẫu nước,… 24 Lọc Millipore kích thước lỗ 0,45 μm B Môi trường thuốc thử Dung dịch cồn iốt (4% iốt 70% ethanol) Canh gan thịt Dung dịch Trypticase trích xuất từ peptone-men glucose, canh thịt (TPGY) với trypsin (TPGYT) Lagg volk lagg volk agar kỵ khí Gạc thấm vô khuẩn, đệm phốt phát chất gien, độ pH 6.2 Ethanol tuyệt đối Chất phản ứng nhuộm gam tím crystal violet dung dịch methylene blue Nước muối sinh lý học vô khuẩn Chế phẩm thuốc kháng độc loại AF (lấy từ CDC) 10 Dung dịch Trysin 11 Dung dịch Sodium hydroxide N 12 Dung dịch Axít clohiđric N C Chuẩn bị mẫu - Kiểm tra sơ bộ: Mẫu giữ lạnh thử nghiệm, trừ loại thực phẩm đóng hộp chưa mở, mà không cần phải làm lạnh Trước thử nghiệm, ghi tên sản phẩm, tên nhà sản xuất chủ sản xuất, nguồn gốc mẫu, GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh - 41 - Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin loại container kích cỡ, nhãn mác, lô hàng sản xuất, mã sản xuất, tình trạng container Làm container đánh dấu với mã số nhận dạng phòng thí nghiệm - Thực phẩm rắn lỏng: Chuyển giao loại thực phẩm vô trùng lỏng Ngoài ra, cấy miếng nhỏ sản phẩm trực tiếp vào canh môi trường với kẹp vô trùng Cấy loại thực phẩm lỏng trực tiếp vào canh môi trường với pipet vô trùng Dự trữ mẫu sau nuôi cấy cho vào ống nghiệm để dành sau sử dụng lại - Mở loại thực phẩm đóng hộp: Kiểm tra bề sản phẩm mùi Ghi nhớ chứng phân hủy Đừng nếm sản phẩm trường hợp D Phát Clostridium botulinum Tăng sinh Loại oxy khỏi môi trường cách đun sôi môi trường 10 – 15 phút làm lạnh nhanh không cần lắc cấy ống môi trường thịt đun với – g thực phầm rắn – ml thực phẩm lỏng 15ml moi trường tăng sinh, ủ 350C Cấy ống TPGY trên, ủ 280C Sử dụng TPGYT thay sinh vật phân hủy thuộc nhóm không phân giải protein loại B, E, F Tiêm thêm chất dẫn truyền độc tố từ bề mặt canh môi trường Sau ngày ủ bệnh kiểm tra canh môi trường gồm kiểm tra độ đục, sinh phân hủy hạt thịt, mùi Kiểm tra môi trường nuôi cấy kinh hiển vi, nhuộm gram crystal violet dung dịch methylene blue Quan sát hình thái học sinh vật lưu ý tồn tế bào Clostridium botulinum điển hình, phạm vi hình thành bào tử vị trí bào tử tế bào Vào thời điểm quan sát thấy có độc tố thi ta làm theo mục F bên Thông thường, sau ủ ngày thời kỳ thích hợp cho hình thành độc tố botulin Nếu sau ngày mà không phát thấy độc tố ta nên ủ thêm 10 ngày để phát bào tử nảy mầm trễ trước đem bỏ mẫu thử GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh - 42 - Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin Phân lập Clostridium botulinum phân lập từ dịch tăng sinh mẫu gốc hình thành bào tử tốt Tiền xử lý mẫu trước cấy ria Thêm thể tích cồn tuyệt đối, hay ml vào môi trường tăng sinh, trộn ủ 1h nhiệt độ phòng Xử lý bề mặt môi trường nuôi cấy Sử dụng dây cấy vòng khử trùng cấy lên môi trường phân lập để thu khuẩn lac riêng lẽ Nếu cần thiết, để có khuẩn lạc riêng lẽ pha loãng môi trường Ủ 35OC khoảng 48 h điều kiện kỵ khí E Lựa chọn vùng C botulinum điển hình Chọn lọc Lựa chọn khoảng 10 khuẩn lạc đặc trưng có đặc điểm lồi Trên môi trường lagg vokl, chúng thường có sáng bề mặt quan sát ánh sáng Vùng sang thường kéo dài rộng đường viền bất định vùng Clostridium botulinum Vùng sáng khuẩn lạc Clostridium botulinum loại C, D, E bình thường bao quanh khu vực rộng (2-4 mm) kết tủa màu vàng Khuẩn lạc loại A B nói chung có vùng phát triển nhỏ Khó khăn chọn vùng chứa độc tố có vùng khác chi Clostridium botulinum với đặc điểm hình thái tượng tự không sản sinh độc tố Tiêm chủng Sử dụng dây cấy vòng chuyển cấy chuyển vô trùng để cấy chuyển vùng chọn vào ống nuôi cấy vô trùng Cấy Clostridium botulinum loại E vào canh môi trường TPGY Cấy loại độc tố khác Clostridium botulinum vào canh trường gan xắt nhỏ môi trường thịt Ủ mô tả phần ngày Sau xác định sản xuất độc tố mô tả phần F phía Phân lập Cấy chuyển chủng sinh độc tố đĩa môi trường thạch lagg vokl Ủ đĩa thứ kỵ khí 35 ° C Ủ đĩa thứ hiếu khí 35 ° C Nếu vùng điển hình Clostridium botulinum tìm thấy đĩa kỵ khí (không có tăng GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh - 43 - Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin trưởng đĩa hiếu khí) khuẩn lạc môi trường khiết Việc phân lập Clostridium botulinum thất bại việc chọn khuẩn lạc đặc trưng Lặp lặp lại qua bước tăng sinh làm tăng số lượng đủ để trình phân lập F Phát xác định độc tố botulin Chuẩn bị mẫu thực phẩm Mẫu môi trường phát có độc tố C botulinum, lấy phần để thử nghiệm độc tính, phần lại lưu trữ tủ lạnh Ly tâm mẫu có chứa chất rắn lơ lửng điều kiện lạnh sử dụng chất lỏng mặt cho thử nghiệm độc tố Xác định tính độc tố mẫu thực phẩm môi trường - Xử lý trypsin: Độc tố loại không phân hủy protein, có diện, cần hoạt tính trypsin để phát Do đó, việc xử lý dịch thực phẩm, thực phẩm lỏng nuôi cấy môi trường TPGY với trypsin trước kiểm tra độc tố Không xử lý môi trường nuôi cấy TPGYT trypsin môi trường có chứa sẵn trypsin việc xử lý nhiều làm phân hủy hoàn toàn độc tố Điều chỉnh lại pH dịch mẫu đến 6,2 cách sử dụng NaOH HCl 1N Thêm 0,2 ml dung dịch trypsin vào 1,8 ml dịch mẫu cần kiểm tra độc tố Ủ 35 – 370C h lắc nhẹ - Kiểm tra độc tố: Tiến hành thử nghiệm song song mẫu không xử lý trypsin với mẫu xử lý trypsisn Pha loãng phần mẫu chất lỏng không xử lý trypsin với nồng độ 1:5, 1:10 1:100 gel-phosphate buffer Thực tương tự mẫu xử lý trypsin Mỗi độ pha loãng tiến hành tiêm vào cặp chuột bụng với 0,5 ml dung dịch không pha loãng không xử lý 0,5 ml độ pha loãng mẫu thử nghiệm không xử lý Lặp lại thao tác với mẫu xử lý với trypsin Đun nóng 1,5 ml dịch không xử lý 10 phút 100°C Làm lạnh mẫu gia nhiệt tiêm vào đôi chuột 0,5 ml dung dịch không pha loãng Những chuột không chết, có độc tố botulin, bất hoạt nhiệt - Quan sát tất chuột định kỳ 48 h cho triệu chứng bệnh ngộ độc Ghi lại triệu chứng tử vong Dấu hiệu ngộ độc điển hình GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh - 44 - Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin chuột bắt đầu xuất 24 h lông, khó thở, yếu chân tay, cuối tê liệt với thở nhanh, sau tử vong suy hô hấp Cái chết chuột mà triệu chứng lâm sàng bệnh ngộ độc không đủ chứng cho thấy chứa độc tố tiêm botulin Đôi khi, chết xảy từ hóa chất khác có dung dịch tiêm, từ chấn thương Nếu sau 48h quan sát, ngoại trừ tất chuột chết, lặp lại thử nghiệm độc tính cách sử dụng dịch pha loãng nồng độ cao Cần phải pha loãng dung dịch từ không giết chết chuột đến giết chết chuột để thiết lập liều tối thiểu gây chết người (MLD) trước ước tính số lượng độc tố có mặt Các MLD có độ pha loãng cao giết chết hai chuột (hoặc tất chuột tiêm), từ liệu số ml / MLD tính toán 2.3.9.2 Phương pháp đại a Phương pháp Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Đựợc sử dụng để phát độc tố hoạt tính sinh học dò tìm độc tố không tích cực.Những tiến kỹ thuật vài thập niên vừa qua thúc đẩy phát triển nhiều kỹ thuật chuẩn đoán huyết nhanh nhạy, xác bệnh truyền nhiễm Mặt khác, phát triển kỹ thuật tự động cho phép đơn giản hóa thao tác thực Nguyên tắc phương pháp miễn dịch phản ứng kết hợp tế bào (kháng nguyên) với kháng thể đặc hiệu Tín hiệu phản ứng miễn dịch nhận biết thông qua ngưng tủa hay kết dính kháng nguyên – kháng thể cách sử dụng kháng thể đánh dấu (bằng chất nhuộm huỳnh quang, đồng vị phóng xạ hay enzyme) Trong số phương pháp phân tích miễn dịch, phương pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzyme (Enzyme – Linked Immunosorbent Assay: ELISA) quan tâm nhiều có tính đơn giản hiệu cao Phương pháp sử dụng cho hầu hết loại kháng nguyên với độ nhạy độ đặc hiệu cao Nguyên tắc kỹ thuật ELISA sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên đĩa giếng Nếu có diện kháng nguyên mục tiêu mẫu, kháng nguyên giữ lại bề mặt giếng kháng nguyên phát cách sử dụng kháng thể GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh - 45 - Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin thứ cấp có gắn với enzyme horseradish peroxydase hay alkaline phosphate Khi bổ sung chất đặc hiệu enzyme vào giếng, enzyme xúc tác phản ứng thủy phân chất để tạo sản phẩm có màu hay phát sáng Bằng cách theo dõi đổi màu phát diện định lượng kháng nguyên ELISA sử dụng rộng rãi dạng kit thương mại cải tiến để tự động hóa ELISA sử dụng phát định lượng vi sinh vật thực phẩm thời gian vài sau tăng sinh b Phương pháp lai phân tử Hiện nhiều hệ thống thiết lập dựa DNA để định lượng vi sinh vật độc tố Tuy nhiên, có phương pháp lai phân tử (hay gọi phương pháp mẫu dò, probes) phương pháp PCR thương mại hóa dạng kit phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm Phương pháp sử dụng mẫu dò để phát vi sinh vật thực phẩm dựa phát đoạn gen đặc trưng vi sinh vật Cơ sở việc sử dụng mẫu dò phương pháp lai phân tử Quá trình bao gồm tách rời hai mạch đôi chuỗi xoắn kép DNA nhiệt độ vượt nhiệt độ nóng chảy (T m) phân tử DNA tái bắt cặp trình tự nucleotide bổ sung nhiệt độ trở lại bình thường Sự lai phân tử xảy đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ sung với vùng trình tự DNA mục tiêu gặp chuyển động nhiệt nhiệt độ môi trường thấp Tm vài độ Quá trình lai phân tử chiu ảnh hưởng nhiều yếu tố: nồng độ DNA môi trường, nhiệt độ thời gian phản ứng, kích thước trình tự lai lực ion môi trường Ví dụ: Ở hệ thống dò Gen – trak (Framingham, USA), hệ thống sử dụng que thử với mẫu dò để phát Listeria mẫu bơ sữa mẫu môi trường mẫu dò đoạn oligomer AND đánh dấu hóa chất phát quang Quy trình phân tích chia làm bước: 1) Phá vỡ tế bào thu nhận rRNA 2) Mẫu dò phát chứa fluorescein isothiocyanate đầu 5` 3` phân tử đặt vào phản ứng GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh - 46 - Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin 3) Que thử bao bọc polydeoxythymidine (dT) để gắn với oligodA mẫu dò 4) Que thử đặt ống đo chứa mẫu dò phát đánh dấu enzyme 5) Sau rửa loại phần enzyme thừa, que thử đặt vào ống đo chứa chất tạo màu 6) Sau ủ để màu, màu phát bước sóng 450nm c Phương pháp PCR Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) phương pháp invitro để tổng hợp DNA dựa khuôn trình tự DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng khuôn thành hàng triệu nhờ hoạt động enzyme polymerase cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA Kỹ thuật Karl Mullis mà cộng phát minh vào năm 1985 Hiện nay, kỹ thuật sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo đột biến gen, chẩn đoán bệnh, phát mầm bệnh vi sinh vật có thực phẩm… Tất DNA polymerase cần mồi chuyên biệt để tổng hợp mạch DNA từ mạch khuôn Mạch khuôn thường trình tự DNA gen (gọi trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu gen quy định việc tổng hợp loại độc tố chuyên biệt vi sinh vật Mồi đoạn DNA ngắn, có khả bắt cặp bổ sung với đầu đoạn mạch khuôn nhờ hoạt động DNA polymerase đoạn mồi nối dài để hình thành mạch Phương pháp PCR hình thành dựa đặc tính DNA polymerase Khi có diện hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu trình tự DNA phản ứng PCR, điều kiện đảm bảo hoạt động DNA polymerase, đoạn DNA nằm hai mồi khuếch đại thành số lượng lớn đến mức thấy sau nhuộm ethidium bromide thu nhận đoạn DNA cho mục đích thao tác gen Như vậy, để khuếch đại trình tự DNA xác định, cần phải có thông tin tối thiểu trình tự DNA, đặc biệt trình tự base hai đầu đoạn đủ để tạo mồi bổ sung chuyên biệt GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh - 47 - Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp Mỗi chu kỳ gồm bước: - Bước 1: Biến tính Trong dung dịch phản ứng bao gồm thành phần cần thiết cho chép, phân tử DNA biến tính nhiệt độ cao Tm phân tử, thường 94 – 95oC 30 – 60 giây Mạch đôi DNA tách thành dạng mạch đơn - Bước 2: Bước lai Nhiệt độ hạ thấp Tm mồi cho phép mồi bắt cặp với mạch khuôn, nhiệt độ khoảng 40 – 70oC, khoảng 30 – 60 giây - Bước 3: Tổng hợp Nhiệt độ tăng lên đến 72 oC giúp cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp tốt Thời gian bước tùy thuộc độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút Trong phản ứng PCR, chu kỳ gồm bước lặp lại nhiều lần, lần lặp lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu lần trước khuếch đại theo cấp số nhân Theo tính toán sau 30 đến 40 chu kỳ khuếch đại tạo 10 Sau phản ứng PCR, DNA nhuộm ethidium bromide quan sát thấy thông qua việc điện di sản phẩm PCR gel agarose quan sát tia UV (bước sóng 320nm) Quy trình chung cho việc phát vi khuẩn gây bệnh mẫu thực phẩm phương pháp PCR sau: - Bước 1: Tăng sinh môi trường không chọn lọc thời gian từ 10 – 20 - Bước 2: Thu dịch nuôi cấy, ly tâm bỏ mảnh vụn, ly tâm gộp sinh khối tế bào vi khuẩn, huyền phù tế bào dung dịch TE (10mM Tris – HCl pH= 8,0, 1mM EDTA) với thể tích 1/10 thể tích dịch nuôi cấy ban đầu, xử lý nhiệt 100 oC 10 phút, ly tâm loại bỏ tạp chất không tan ức chế phản ứng PCR - Bước 3: Thực phản ứng PCR - Bước 4: Điện di gel agarose 1,5% xem kết đèn UV GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh - 48 - Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin Biện pháp kiểm soát Clostridium botulinum thực phẩm Không dùng đồ conserve đựng lon mà nắp phồng lên, chảy nước Cẩn thận với rau cải, tỏi ngâm dầu vô keo vô hũ nhà Nếu trường hợp tự làm conserve nguyên liệu tươi cần phải cất tủ lạnh phải quăng sau 10 ngày Không dùng thực phẩm hư, bọt, thúi bốc mùi lạ lúc nấu Không nên ăn, nghi ngờ đồ conserve không vô keo vô lọ cẩn thận phép vệ sinh Không nên cho cháu tuổi ăn mật ong kể loại sản phẩm có ghi nhãn hiệu như…đã hấp khử trùng pasteurized… Giữ vệ sinh tối đa giai đoạn làm đồ conserve nhà Nếu có máy autoclave để hấp khử lý tưởng Nếu nhà máy hấp autoclave tạm áp dụng phương pháp nước nóng cần vô keo làm đồ conserve Keo nắp cần nấu nước sôi để diệt trùng Sau bỏ nguyên vật liệu vào keo, đậy nắp lại cho thật kỹ sau đem bỏ vào nồi nước thật sôi để khử trùng lần chót GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh - 49 - Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin Chương 3: KẾT LUẬN Clostridium botulinum vi khuẩn nguy hiểm vi chúng tiết độc tố botulin tác động ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương gây tê liệt phần thể dần toàn thể người động vật Tuy nguy hiểm độc tố botulin có vài ứng dụng ích lợi y khoa trị liệu: Độc tố A sử dụng để trị xáo trộn thần kinh gây co thắt cơ, bệnh chứng gây ngứa ngái da, đau vùng mặt (douleur myofaciale), tiết nhiều mồ hôi (hyperhidrose), nhức đầu (migraine) Tuy bệnh nhiễm vi khuẩn Clostridium botulinum xảy mà quên phòng tránh, mà phải tuân thủ biện pháp kiểm soát chúng độc tố vi khuẩn mạnh bi nhiễm tỷ lệ tử vong cao GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh - 50 - Tổng Quan Về Clostridium Botulinum Và Độc Tố Botulin TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Phùng Quốc Chướng: “Tình hình nhiễm Salmonella lợn vùng Tây Nguyên khả phòng trị ” Luận án PTS khoa học nông nghiệp, HN 1995 Hồ Văn Nam, Nguyễn Thị Đào Nguyên, Trương Quang, Phùng Quốc Chướng, Chu Đức Thắng, Phạm Ngọc Thạch: “Bệnh viêm ruột ỉa chảy lợn”, KHKT thú y tập I, hội thú y VN 1997 Đại cương phương pháp kiểm tra vi sinh thực phẩm - Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng - năm 1997 Kiểm tra vệ sinh chất lượng sản phẩm - Tô Minh Châu - năm1999 Tiếng Anh CDC Botulism http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/botulism_g.htm ACIA Botulisme (Clostridium botulinum) http://www.inspection.gc.ca/francais/fsssa/concen/cause/botulismf.shtml FDA C.botulinum http://www.cfsan.fda.gov/~mow/chap2.html Dr Philippe Abimelec Traitement des rides par la toxine botulique de type A http://www.abimelec.com/botox_anti_rides.html Binz, T., H Kuranzono, M Wille, J Frevert, K Wernars, and H Niemann (1990) J Biol Chem 265, 9153-9158 Craven, K E., J.L Ferreira, M.A Harrison, and P Edmonds (2002) JOAC 85 (5), 1025-1028 East, A.K., P.T Richardson, D Allaway, M D Collins, T A Roberts, and D.E Thompson (1992) FEMS Microbiol Lett 75, 225-230 Ferreira, J.L., M.K Hamdy, S.G McCay, and B.R Baumstark (1992) J Rapid Methods and Automation in Microbio 1,29-39 Ferreira, J.L., and R.G Crawford (1998) J Rapid Methods and Automation in Microbio 6,289-296 http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalM anualBAM/UCM070879 GVHD: Phạm Minh Nhựt SVTH: Lê Đức Anh - 51 -