tom tat luan an -TRINH

1 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN I ĐẶT VẤN ĐỀ Việc sử dụng thuốc dân gian có truyền thống lâu đời giới Khi quan sát giới tự nhiên loài người nhận thấy, thảm thực vật có ích cho họ, ốm đau họ biết sử dụng loài thực vật để chữa bệnh, biết tránh lồi có tác dụng độc Ban đầu kinh nghiệm vận dụng qui luật giá trị tài nguyên để chữa bệnh Dần dần hình thành y học mà ngày nhà khoa học gọi y học cổ truyền dân tộc Các nhà khoa học nhận thấy “sinh vật nhà hóa học tuyệt vời” giỏi nhà hóa học việc tổng hợp chất tự nhiên Việt Nam có nguồn tài nguyên động thực vật vô phong phú đa dạng Theo Phạm Hồng Hộ Nguyễn Nghĩa Thìn, thực vật bậc cao có mạch thống kê 10.500 lồi, dự đốn khoảng 12.000 lồi Số lồi thuốc thống kê Việt Nam 3948 loài thuộc 307 họ thực vật, chiếm 37,6% số loài tự nhiên Dân tộc Việt Nam có truyền thống từ lâu sử dụng cỏ cơng tác phịng chữa bệnh Trong trình lịch sử khai thác sử dụng thuốc, nhân dân tích lũy nhiều kinh nghiệm sử dụng độc đáo, nhiều thuốc có hiệu điều trị cao Tuy nhiên nhiều kinh nghiệm, thuốc quý dân tộc thiểu số ứng dụng phạm vi hẹp cộng đồng đứng trước nguy bị lãng quên Những năm gần đây, nhu cầu phát triển kinh tế xã hội, môi trường tự nhiên nhiều khu vực bị hủy hoại nghiêm trọng làm thu hẹp vùng phân bố khả phát triển khơng lồi thuốc Bên cạnh nhiều lồi thuốc bị khai thác thường xun với khối lượng lớn để thỏa mãn thu nhập kinh tế người dân yêu cầu thị trường ngồi nước Vì vậy, thơng qua việc khảo sát đặc điểm hóa thực vật, dược tính … thuốc, bước lý giải thích việc trị bệnh thảo dược, đồng thời tiêu chuẩn hoá thuốc cổ truyền nhằm sử dụng cách hợp lý, có hiệu đồng thời góp phần bảo tồn thuốc dân tộc Chính việc nghiên cứu hóa học hợp chất thiên nhiên định hướng vào hoạt tính sinh học ngày ý Tại Việt Nam thuốc thuộc chi ráng, Drynaria thường dân gian sử dụng chữa trị bệnh phong thấp, nhức mỏi, đau gân xương, bong gân, gãy xương… Tuy nhiên nghiên cứu hóa học hoạt tính sinh học lồi nước giới không nhiều Với mục tiêu tìm hiểu thành phần hố học thử nghiệm số hoạt tính sinh học, qua góp phần giải thích làm sáng tỏ chế trị bệnh thuốc cổ truyền, tiến hành khảo sát thành phần hóa học thử nghiệm hoạt tính sinh học chất phân lập từ số loài thuộc chi Drynaria Việt Nam Nội dung luận án: Phân lập hợp chất tinh khiết từ thân rễ Bổ cốt toái Tắc kè đá Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật hiểm định, chống oxy hóa hoạt tính kích thích thích tế bào tạo xương MG63 hợp chất phân lập II NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Nghiên cứu thành phần hoá học Tắc kè đá, Drynaria bonii , chưa nghiên cứu nước Trong chi Drynaria, loài nghiên cứu nhiều D.fortunei tác giả Trung Quốc Nhật Bản Đây lần Tắc kè đá Drynaria bonii nghiên cứu cách toàn diện thành phần hóa học thử nghiệm hoạt tính sinh học Phân lập xác định cấu trúc hóa học 31 hợp chất tự nhiên từ loài D fortunei D bonii Trong trình nghiên cứu phân lập xác định cấu trúc 16 hợp chất từ bổ cốt toái 15 hợp chất từ Tắc kè đá có chất tự nhiên, chất bao gồm: fortunamid (DFM V, chất mới), drynafuran (DBC I, chất mới) bavachinin (DFH II); bakuchiol (DFH III); citrostadienyl acetat (DFH IV); citrostadienol (DFH VB); myristin (DFH VI); bisdemethoxycurcumin (DFC II); isobavachalcon (DFC I); demetoxycurcumin (DFC V); curcumin (DFC III); cycloeucalenol (DFA III); acid protocatechuic (DFA I, DBA II); emodin (DFA VI); cycloartanol (DFA V); (-)-epicatechin (DFM III); liquiritin (DFM II); chrysophanol (DBH I); triphyllol (DBH IVC); α-tocopherol (DBH III); 5-hydroxymetylfurfural (DBA I); nobiletin (DBC III); isoliquiritigenin (DBA VI); protocatechualdehyd (DBA III); nicotiflorin (DBM III); rutin (DBM I); etyl β-D-fructopyranosid (DBM V); linocaffein (DBM IV); 24-methylen-cycloartan-3βol (DBH IVB); 1-O-β-D-glucopyranosyl-(2S,3R,4E,8Z)-2-[(2-hydroxyoctadecanoyl)amino]-4,8- octadecadien-1,3-diol (DBM VI) Trong số chất biết có 25 chất lần phát chi Drynaria Thử nghiệm hoạt tính sinh học Hoạt tính chống oxi hóa: mẫu DFC III, DFA I, DFM III biểu hoạt tính chống oxy hóa DPPH với giá trị SC50 26,45; 13,12; 14,5 µg/ml Các mẫu DBA III, DBM I biểu hoạt tính chống oxy hố hệ DPPH với giá trị SC50 4,87 25,0 µg/ml (phụ lục 186) Hoạt tính kích thích tế bào tạo xương MG63: nồng độ 100µg/ml hợp chất bavachinin, bakuchiol, isobavachalcon, bisdemethoxycurcumin, curcumin, cycloartanol, liquiritin, (-)-epicatechin, (24R) cyclomargenol kích thích phát triển tế bào MG63 101,68%, 110,93%, 112,13%, 112,82%, 98,96%, 98,52%, 140,98%, 106,69%, 118,18% Kết góp phần giải thích, làm sở khoa học cho việc sử dụng bổ cốt toái tắc kè đá điều trị bệnh xương khớp theo y học cổ truyền Việt Nam Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: hợp chất DFH II DFH III có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định E coli (12,5 µg/ml); B subtilliss (12,5 µg/ml); S aureus (12,5 µg/ml); Asp niger (DFH II: 50 µg/ml; DFH III: 12,5 µg/ml), hợp chất DFC I có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định E coli (12,5 µg/ml); B subtillis (12,5 µg/ml); Asp niger (12,5 µg/ml); S aureus (12,5 µg/ml); F.oxysporum (12,5 µg/ml); S.cerevisiae (12,5 µg/ml); C.albicans (25 µg/ml); DFC II có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định E coli (50 µg/ml); Asp Niger ( 50 µg/ml); DFC I, DFC III DFC V kháng vi khuẩn E coli (50 µg/ml); DFA VI kháng vi sinh vật kiểm định E coli (50 µg/ml), B subtillis (50 µg/ml), Asp Niger ( 50 µg/ml), C.albicans (50 µg/ml) Ba hợp chất DBA IV, DBM I, DBH I kháng vi sinh vật kiểm định E coli (50 µg/ml), DBH III kháng vi sinh vật kiểm định P.aeruginosa (50 µg/ml), DBA I kháng vi sinh vật kiểm định B subtilliss (50 µg/ml), DBA III, DBC I DBC III kháng vi sinh vật kiểm định A.niger (50 µg/ml) III BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN Luận án gồm 127 trang với chương, 35 bảng, sơ đồ, 13 hình, 84 tài liệu tham khảo 187 phụ lục phổ Trong đó, phần mở đầu trang, tổng quan 26 trang, phương pháp nghiên cứu 10 trang, thực nghiệm 29 trang, kết biện luận 67 trang, kết luận kiến nghị trang NộI DUNG LUậN áN CHƯƠNG TổNG QUAN Tng hợp tài liệu nghiên cứu thành phần hóa học dược tính chi Drynaria, lồi D.fortunei loài D.bonii tác giả nước Sơ lược ứng dụng phổ NMR xác định cấu trúc nhóm chất flavonoid CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 MẪU NGUYÊN LIỆU Mẫu nguyên liệu thân rễ bổ cốt toái thu hái Châu Đốc – An Giang vào tháng 12 năm 2007 thân rễ tắc kè đá thu hái huyện Hàm Thuận Nam, tỉnh Bình Thuận vào tháng năm 2009 Mẫu tươi rửa sạch, phơi nơi thoáng mát sau sấy khơ 50 0C Mẫu khô xay nhỏ thành bột, nguyên liệu dùng nghiên cứu 3 Mẫu nguyên liệu DS Phan Văn Đệ Trung tâm Sâm dược liệu TP Hồ Chí Minh giám định tên khoa học 2.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC CHẤT Quá trình phân lập chất từ cao phân đoạn tiến hành sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel pha thường pha đảo, nhựa trao đổi ion Dianion HP-20, gel Sephadex LH-20 máy sắc ký lỏng điều chế cao áp (P-HPLC) hiệu Agilent 1100 Series DAD đầu dò UV Theo dõi sắc ký cột sắc ký mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) 2.3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT Cấu trúc hợp chất xác định dựa việc phân tích số liệu phổ khối lượng, phổ khối lượng phân giải cao, phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều, chiều so sánh với kt qu ó c cụng b 2.4 PHƯƠNG PHáP THử NGHIƯM HO¹T TÝNH SINH HäC Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tiến hành theo phương pháp khuếch tán thạch, sử dụng khoanh giấy lọc tẩm mẫu chất theo nồng độ tiêu chuẩn Hoạt tính chống oxi hố tiến hành theo phương pháp thử nghiệm DPPH thơng qua phản ứng bao vây gốc tự Hoạt tính kích thích phát triển tế bào tạo xương MG63 dựa mức độ phát triển tế bào MG63 nuôi cấy với mẫu thử sau ngày CHƯƠNG THỰC NGHIỆM Quá trình điều chế cao thực riêng biệt cho lồi Bột thân rễ khơ trích kiệt etanol theo phương pháp ngâm dầm nhiệt độ phịng, lọc, quay thu hồi dung mơi, thu cao etanol Trích pha rắn silica gel cao etanol giải hấp đơn dung môi: eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat metanol Dung dịch giải hấp qua cột thu hồi dung môi áp suất kém, thu loại cao Sử dụng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ khác máy sắc ký lỏng cao áp điều chế phân lập hợp chất tinh khiết từ cao phân đoạn Phần cịn trình bày kết phổ nghiệm số vật lý 31 chất phân lập kết thử nghiệm hoạt tính sinh học Cây bổ cốt tối Cây tắc kè đá CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC CHẤT CÔ LẬP Sử dụng phương pháp hóa lý đại MS, HR-MS, phổ 1D-NMR 2D-NMR xác định cấu trúc hóa học 31 hợp chất, có chất lần phát tự nhiên Do khn khổ có hạn, chúng tơi trình bày phần biện luận cấu trúc số chất tiêu biểu 4.1.1 Hợp chất DFM V fortunamid (66) Hợp chất DFM V thu từ cao metanol thân rễ bổ cốt tối có dạng bột trắng ngà Hợp chất DFM V cho phản ứng dương tính với thuốc thử FeCl3/EtOH chứng tỏ phải hợp chất phenolic Phổ IR (phụ lục 91) cho dao động nhóm –OH 3447cm-1, carbonyl 1654 cm-1, carbon olefin 1503 cm-1, nhóm chức eter 1026 cm-1 Phổ UV (phụ lục 92) cho đỉnh hấp thu cực đại 340,5 nm; 274 nm Phổ 1H NMR (phụ lục 93) xuất tín hiệu vịng benzen lần δH [7,04 (1H; d giống dd; 8,5 Hz; H-6); 7,10 (1H; d; 8,5 Hz; H-5) 7,11 (1H, s giống d, H-2)], hai proton nối đơi cấu hình trans δH [6,29 (1H; d; 16,0 Hz; H-8); 7,41 (1H; d; 16,0 Hz; H-7)] tín hiệu proton phân tử đường glucose δH [4,75 (1H; d; 7Hz; H-1’); 3,70 (1H; m; H-6’a); 3,45 (1H; m; H-6’b); 3,29 (1H; m; H-3’); 3,34 (1H; m; H-5’); 3,32 (1H; m; H-2’) 3,15 (1H; m; H-4’)] Phổ 13 C NMR (phụ lục 94) kết hợp với kỹ thuật DEPT (phụ lục 95) cho thấy tín hiệu 15 carbon bao gồm carbon carbonyl δC 167,9; hai carbon bậc ba mang nối đơi ngồi vịng δC (117,8; 143,3); sáu carbon vịng benzen có hai carbon bậc ba mang oxy δC (114,7; 116,1; 120,4; 129,0; 146,8 147,1) sáu carbon đường glucose δC (60,7; 69,7; 73,2; 75,8; 77,3 101,6) Phổ HMBC (phụ lục 96), cho thấy hai proton nối đơi cấu hình trans δH [6,29 (1H; d; 16,0 Hz; H8); 7,41 (1H; d; 16,0 Hz; H-7)] tương quan với carbon carbonyl carbon bậc bốn vịng thơm chứng tỏ hệ nối đơi liên kết với nhóm carbonyl gắn trực tiếp vào vịng thơm C-1 (δC 129,0), ảnh hưởng hiệu ứng cộng hưởng nhóm carbonyl độ dịch chuyển hố học H-7 H-8 (hai proton ngồi vịng) δH 7,41 δH 6,29 Hai nhóm hydroxy vịng benzen gắn C-3/C-4 C-2/C-4 Trên phổ HMBC proton H-7 cho tương quan với hai carbon bậc ba vòng thơm δC (114,7; 120,4), điều khẳng định hai carbon phải C-2 C-6, đồng thời hai nhóm -OH vịng phải gắn vào C-3 C-4 Proton δH 7,04 (1H; d giống dd; 8,5 Hz) cho tương quan HMBC với C-7 carbon vòng thơm mang oxy hẳn phải H-6 Như hai proton H-5 H-2 có độ dịch chuyển hố học δH [7,10 (1H, d, 8,5 Hz) 7,11 (1H, s giống d)] Phổ HMBC cho thấy carbon mang oxy δC 147,1 cho tương quan với H-6 H-anomer, tín hiệu carbon phải C-4 xác nhận phân tử glucose gắn C-4 Hằng số ghép spin H-anomer J= Hz chứng tỏ phân tử đường glucose có cấu hình β Hình 4.9: Tương quan HMBC DFM V Tín hiệu carbon carbonyl δC 167,9 cho dự đốn nhóm chức acid amid Tuy nhiên phổ IR khơng xuất dao động nhóm chức acid khẳng định diện nhóm amid phân tử DFM V Hơn phổ HR-ESI-MS (phụ lục 98) cho đỉnh ion giả phân tử [M-H]- m/z= 340,1042 kết phân tích ngun tố cho cơng thức C15H18NO8 hồn tồn khẳng định cơng thức phân tử hợp chất DFM V C15H19NO8 Vậy hợp chất DFM V 4-O-β-D-glucopyranosyl caffeic acid amid Các tra cứu chương trình Scifinder cho thấy DFM V chưa công bố giới, đặt tên hợp chất DFMV fortunamid (66) Chất rắn màu trắng ngà, điểm chảy 190-1910C (MeOH) Phổ IR (KBr, cm-1): 3447(-OH), 1654 (C=O), 1503 (C=C), 1026 (C-O-) Phổ UV (MeOH): λmax 340,5; 274 nm Phổ khối lượng HR-ESI-MS m/z = 340,1042 [M-H]Phổ 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6), δH, ppm: 7,11(1H; s; H-2); 7,10 (1H; d; 8,5 Hz; H-5); 7,04 (1H; d; 8,5 Hz; H-6); 7,41(1H; d; 16,0 Hz; H-7); 6,29 (1H; d; 16,0 Hz ;H-8); 4,75 (1H; d; 7,0 Hz; H-1’); 3,70 (1H; m; H-6’a); 3,45 (1H; m; H-6’b); 3,32 (1H; m; H-3’); 3,25 (1H; m; H-5’); 3,29 (1H; m; H-2’); 3,15 (1H; m; H-4’) Phổ 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6), δC, ppm: 129,0 (C-1); 114,7 (C-2); 146,8 (C-3); 147,1 (C-4); 116,1 (C-5); 120,4 (C-6); 143,3 (C-7); 117,8 (C-8); 167,9 (C-9); 101,6 (C-1’); 73,2 (C-2’); 75,8 (C-3’); 69,7 (C-4’); 77,2 (C-5’); 60,7 (C-6’) 4.1.2 Hợp chất DBC I Hợp chất DBC I thu từ cao chloroform thân rễ tắc kè đá dạng bột nâu sẫm Phổ 1H NMR (phụ lục 123) cho thấy tín hiệu hai proton olefin đặc trưng vòng furan [δH 6,12 (1H; d; 3,5 Hz; H-3); 6,35 (1H; d; 3,5 Hz; H-4)], năm proton vòng thơm δH [7,16 (1H; m; H-2’); 7,45 (1H; m; H-3’); 7,44 (1H; m; H-4’); 7,43 (1H; m; H-5’); 7,17 (1H; m; H-6’)], proton olefin xuất dạng mũi đơn δH 7,50 (1H; s; H-6) tín hiệu proton nhóm aldehid δH 9,66 (1H; s; H-β) Phổ 13C NMR (phụ lục 124) kết hợp với kỹ thuật DEPT (phụ lục 125) cho thấy hợp chất có 14 carbon có carbon carbonyl δC 192,6 (C-β); hai carbon olefin bậc ba mang oxy δC [149,2 (C-2); 159,3 (C-5)], tám carbon sp2 bậc ba hai carbon sp2 bậc bốn Phổ HMBC (phụ lục 126) cho thấy hai proton δH 6,12 (1H; d; 3,5 Hz; H-3) 6,35 (1H; d; 3,5 Hz; H-4) cho tương quan với hai carbon sp2 bậc ba mang oxy δC 149,2 (C-2) 159,3 (C-5) chứng tỏ hai proton proton vòng furan Tương quan proton δH 4,33 (2H; s) nhóm –CH2OH với carbon δC 159,3 carbon sp2 δC 110,0 xác nhận nhóm –CH2OH gắn trực tiếp vào vịng furan C-5 (δC 159,3) proton δH 6,35 (1H; d; 3,5 Hz) H-4 Tín hiệu proton xuất dạng mũi đơn δH 7,50 (1H; s) cho tương quan với C-3, hai carbon sp2 bậc bốn (C-2 carbon δC 137,6) carbon carbonyl δC192,6 xác nhận proton H-6 Ngoài tương quan proton aldehid δH 9,66 (1H; s) với hai carbon sp2 bậc bốn δC 137,6 133,5 chứng tỏ nhóm aldehid gắn C-α C-α gắn vào vòng benzen Phổ ROESY (phụ lục 127a) cho tương quan proton aldehyd với proton olefin chứng tỏ cấu hình Z nối đơi C=C Phổ HR-ESI-MS (phụ lục 128) cho đỉnh ion giả phân tử m/z 251,0679 [M+Na]+ tương ứng với công thức phân tử C14H12O3Na Từ phân tích phổ nêu trên, hợp chất DBCI xác định α-[[5(hydroxymetyl)-2-furanyl]metylen]benzenacetaldehyd (drynafuran, 71) Theo tra cứu phần mềm Scifinder, hợp chất lần phân lập từ thiên nhiên 3' 2' α 1' 4' 5' 6' β C C CHO H O drynafuran (71) CH 2OH Chất rắn màu vàng sẫm, điểm chảy 114-116 0C (MeOH) Phổ khối lượng HR-ESI-MS m/z :251,0679 [M+Na]+ Phổ 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6), δH, ppm: 6,12 (1H; d; 3,5 Hz; H-3); 6,35 (1H; d; 3,5 Hz; H-4); 7,50 (1H; s; H-6); 4,33 (2H; s; H-7); 9,66 (1H; s; H-β); 7,16 (1H; m; H-2’); 7,45 (1H; m; H-3’); 7,44 (1H; m; H-4’); 7,43 (1H; m; H-5’); 7,16 (1H; m; H-6’) Phổ 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6), δC, ppm: 149,2 (C-2); 117,5 (C-3); 110,0 (C-4); 159,3 (C-5); 136,2 (C-6); 55,7 (C-7); 137,6 (C-α); 192,6 (C-β); 133,5 (C-1’); 128,9 (C-2’); 128,3 (C-3’); 128,0 (C-4’); 128,3 (C-5’); 128,9 (C-6’) 4.1.3 Hợp chất DFA III cycloeucalenol (62) Hợp chất DFA III thu từ cao etyl acetat bổ cốt toái dạng tinh thể hình kim màu trắng, phản ứng dương tính với thuốc thử đặc trưng terpenoid H2SO4/ EtOH Phổ 1H NMR (phụ lục 61) xuất tín hiệu cộng hưởng sáu nhóm metyl vùng trường cao δH [0,96 (3H, s, H-18); 0,89 (3H; d; 6,0 Hz; H-21); 1,01 (3H, d, Hz; H-26); 1,02 (3H, d, Hz, H-27 ); 0,91 (3H, d, Hz, H-28); 0,89 (3H, s; H-29)]; tín hiệu proton olefin δH 4,65 (1H, s, H- 30a) 4,71 (1H, s, H- 30b); mũi cộng hưởng δH 3,02 (1H, m) ứng với proton > CH-OH Phổ 13C NMR (phụ lục 62) kết hợp kỹ thuật DEPT (phụ lục 63) cho thấy DFA III có 30 carbon, có carbon tứ cấp (1 carbon tứ cấp dạng >C= , δC 155,6 ppm, C-24), carbon loại –CH [trong có carbon loại >CH-OH (δC 74,2 ppm, C-3)] carbon loại CH3 12 carbon loại –CH2 [(trong có carbon loại =CH2 (δC 105,8 ppm, C-30)] Phổ ESI-MS (phụ lục 66) cho biết đỉnh ion phân tử DFA III m/z 426,5 tương ứng với công thức phân tử C30H50O, độ bất bão hòa Phổ HSQC (phụ lục 65) cho thấy hai proton H-19a δH 0,09 (1H, d, Hz) H-19b δH 0,39 (1H, d, 4Hz) tương quan với carbon –CH2 có độ dịch chuyển hóa học 26,1 ppm Đây hai tín hiệu cộng hưỡng đặc trưng proton gem –CH2− gắn vòng cyclopropyl Các trietrpenoid có khung cycloartan mang vịng cyclopropyl, vị trí C-9, C-10, hai proton gem đặc trưng gắn vòng cyclopropyl xuất dạng mũi đôi vùng trường cao phổ 1H NMR với số ghép cặp J= 4,3 Hz [28] Như hợp chất DFA III triterpenoid vịng có khung cycloartan mang nối đơi kiểu −CH=CH2 nhóm −OH Với kết phổ nêu trên, kết hợp với tài liệu tham khảo[39] DFA III xác định 4,14-dimetyl-9,19-cyclocholest-24(30)-en3-ol (cycloeucalenol) (62) Chất rắn màu trắng, điểm chảy 136-138 0C (CHCl3) 7 Phổ khối lượng ESI-MS m/z: 427,5 [M+H] + Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH, ppm: 3,02 (1H; m; H-3); 0,96 (3H; s; H-18); 0,09 (1H; d; Hz; H-19a); 0,39 (1H; d; 4Hz; H-19b); 0,89 (3H; d; 6,0 Hz; H-21); 1,01 (3H; d; Hz; H-26); 1,02 (3H; d; Hz; H-27); 0,91 (3H; d; Hz; H-28); 0,89 (3H; s; H-29 ); 4,65 (1H; s; H-30a); 4,71 (1H; s; H-30b) Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC, ppm: 29,9 (C-1); 34,3 (C-2); 74,2 (C-3); 43,8 (C-4); 42,6 (C-5); 23,7 (C-6); 24,2 (C-7); 45,5 (C-8); 22,5 (C-9); 29,1 (C-10); 25,9 (C-11); 32,2 (C-12); 44,6 (C-13); 48,1 (C-14); 34,4 (C-15); 27,1 (C-16); 51,2 (C-17); 16,9 (C-18); 26,1 (C-19); 35,0 (C-20); 17,8 (C-21); 34,3 (C-22); 30,4 (C-23); 155,6 (C-24); 32,8 (C-25); 21,8 (C26); 21,2 (C-27); 14,0 (C-28); 18,4 (C-29); 105,8 (C-30) 4.1.4 Hợp chất DBH IVB Hợp chất DBH IVB thu từ cao ete dầu hỏa tắc kè đá dạng bột màu trắng, cho phản ứng dương tính với thuốc thử đặc trưng terpenoid Phổ 1H NMR (phụ lục 111) cho thấy có mặt bảy nhóm metyl có bốn nhóm metyl bậc bốn [δH 0,96 (3H; s; H-18); 0,96 (3H; s; H-30); 0,90 (3H; s; H-28); 0,81 (3H; s; H-29)], ba nhóm metyl bậc ba xuất dạng mũi đôi [δH 0,88 (3H; d; 7,5 Hz; H-21); 1,01 (3H; d; 3,0 Hz; H-26); 1,03 (3H; d; 2,5 Hz; H-27)] tín hiệu hai proton olefin δH 4,71 (1H, brs, H-31a) 4,66 (1H, brs, H-31b), hai proton metilen không tương đương đặc trưng vòng cyclopropan [δH 0,33 (1H; d; 3,5 Hz; H-19a); 0,55 (1H; d; 4,0 Hz; H-19b)] Phổ 13C NMR (phụ lục 112) kết hợp với kỹ thuật DEPT (phụ lục 113) xác định DBH IVB có tất 31 carbon, tín hiệu cộng hưởng carbon xác định có mặt nhóm metyl [δC 18,0 (C-18); 18,3 (C-21); 22,0 (C-26); 21,8 (C-27); 18,6 (C-28); 14,0 (C-29); 25,4 (C-30)] nối đôi [δC 156,9; 105,9] Phổ HSQC (phụ lục 117) cho thấy hai tín hiệu proton olefin [δH 4,71 (1H, brs); 4,66 (1H, brs)] đính carbon δC 105,9 chứng tỏ DBH IVB chứa nối đôi kiểu >C=CH2 Các phổ 1H NMR 13C NMR DBH IVB tương tự hợp chất DFA III, khác biệt đáng kể xuất thêm tín hiệu nhóm metyl Phổ HMBC (phụ lục 114) cho thấy tương quan proton hai nhóm metyl bậc bốn với carbon δC 78,8 (C-3) carbon bậc bốn δC 40,4 (C-4) chứng tỏ C-4 phải mang hai nhóm metyl Phổ khối lượng APCI-MS (phụ lục 116) cho đỉnh ion giả phân tử m/z 441,4 [M+H]+ tương ứng với công thức cộng C31H53O Các kiện phổ DBH IVB hoàn toàn phù hợp với cấu trúc hợp chất 24methylene-cycloartan -3β-ol (69)[11,69] 24-metylen-cycloartan-3β-ol (69) Chất rắn màu trắng, điểm chảy 118-1210C (CHCl3) Phổ khối lượng APCI-MS m/z: 441,4 [M+H]+ Phổ 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δH, ppm: 3,29 (1H, m, H-3); 0,96 (3H; s; H-18); 0,33 (1H; d; 3,5 Hz; H-19a); 0,55 (1H; d; 4,0 Hz; H-19b); 0,88 (3H; d; 7,5 Hz; H-21); 1,01 (3H; d; 3,0 Hz; H-26); 1,03 (3H; d; 2,5 Hz; H-27); 0,90 (3H; s; H-28); 0,81 (3H; s; H-29); 0,96 (3H; s; H-30); 4,71 (1H, brs; H-31a); 4,66 (1H, brs; H-31b) Phổ 13C NMR (125 MHz, CDCl3) δC, ppm: 31,9 (C-1); 30,3 (C-2); 78,8 (C-3); 40,4 (C-4); 47,1 (C-5); 21,1 (C-6); 28,1(C-7); 47,9(C-8); 20,0 (C-9); 26,0 (C-10); 26,0 (C-11); 35,0 (C-12); 45,3 (C-13); 48,8 (C-14); 32,9 (C-15); 26,4 (C-16); 52,5(C-17); 18,0 (C18); 29,9 (C-19); 36,1(C-20); 18,3 (C-21); 35,5 (C-22); 31,2 (C-23); 156,9 (C-24); 33,8 (C-25); 22,0 (C-26); 21,8 (C-27); 18,6 (C-28); 14,0 (C-29); 25,4 (C-30); 105,9 (C-31) 4.1.5 Hợp chất DFH II Hợp chất DFH II thu dạng bột màu vàng Phổ 1H-NMR (phụ lục 1) xuất tín hiệu 22 proton, có bốn proton ghép orto vòng benzen 1,4 δH [(7,39; 2H; d; 8,5Hz; H-2’/H-6’) 6,89 (2H; d; 8,5Hz; H-3’/ H-5’)], hai proton vòng benzen 1,2,4,5 δH [ (7,57 ;1H; s; H-5) 6,53 (1H; s; H-8)], hai nhóm metylen δH [2,66 (1H; dd; 3,0 Hz 16,5 Hz; H-3a); 3,00 (1H; dd; 13,0 Hz 16,5 Hz; H-3b); 3,23 (2H; d; 7Hz; H-1’’)], proton gắn vào carbon mang oxy δH 5,43 (1H; dd; 13Hz 3Hz; H-2), ba proton nhóm metoxy δH 3,90 (3H; s), proton nhóm hydroxy tự δH 8,50 (1H; s); proton nối đơi ngồi vịng δH 5,26 (1H; m giống t; H-2’’) hai nhóm metyl vinyl δH [1,70 (3H; s; H-4’’); 1,72 (3H; s; H-5’’)] Phổ 13C-NMR (phụ lục 2) kết hợp với kỹ thuật DEPT (phụ lục 3) cho biết DFH II có 21 carbon bao gồm carbon nhóm carbonyl >C= O δC (190,6; C-4), mười hai carbon nhân thơm có sáu carbon bậc vòng thơm δC [127,3 (C-5); 99,8 (C-8); 116,1 (C-3’/ C-5’); 128,9 (C-2’/ C-6’)], ba carbon sp2 mang oxy [δC 163,2 (C-9); 158,5 (C-4’); 164,6 (C-7)], nối đôi ngồi vịng [δC 123,0 (C-2’’); 133,0 (C3’’)], hai nhóm metylen δC [28,3 (C-1’’); 44,6 (C-3)], hai nhóm metyl δC [17,7 (C-4”); 25,8 (C-5’’)] nhóm metoxy δC 56,3 carbon bậc ba mang oxy δC 80,6 (C-2) Trên phổ HMBC (phụ lục 4) tín hai nhóm metyl vinyl tương quan với [H3-4’’(1,70 (3H, s) với C5’’ (δC 25,8) H3-5” [1,72 (3H, s) với C-4’’ (δC 17,7)] tương quan với hai carbon nối đôi ngồi vịng [δC 123,0 (C-2’’,= CH-); 133,0 (C-3’’; >C =)] nên carbon C-3’’ phải mang hai nhóm metyl carbon olefin lại C-2’’ Trong phổ 1H-NMR, proton nối đôi xuất dạng pic đa ghép cặp với hai proton nhóm metyl benzil kế cận sáu proton metyl vinyl Tương quan hai proton nhóm metyl benzyl (H2-1’’) với C-2’’ C-3’trong phổ HMBC phù hợp với kiện xác nhận diện nhóm 3- metyl-2- butenyl phân tử (hình 4.1) Từ kiện cho thấy DFH II có nhóm prenyl DFH II có 21 carbon trừ carbon nhóm prenyl carbon nhóm metoxy δC 56,3, khung DFH II có 15 carbon, số có carbon bậc hai δC 28,3 (C-11), carbon bậc ba mang oxy δC 80,6 (C-2) carbon carbonyl xuất từ trường thấp 190,6 ppm chứng tỏ DFH II hợp chất flavonoid kiểu flavanon Phổ HMBC cho thấy hai proton nhóm metylen xuất δH [2,66 (1H; dd; Hz 16,5 Hz); 3,00 (1H; dd; 13 Hz 16,5 Hz)] tương quan với carbon carbonyl nên H2-3 Proton có độ dịch chuyển hóa học δH [5,43 (1H; dd; Hz 13 Hz)] cho tương quan với carbon carbonyl δC 190,6 chứng tỏ proton H-2 hợp chất flavanon Trong phổ HMBC, hai tín hiệu proton ghép orto vịng B δH [7,39 (2H, d, 8,5 Hz) 6,89 (2H; d; 8,5 Hz)] tương quan với carbon bậc ba mang oxy δC 158,5 xác nhận C-4’ DFH II, carbon C- 4’ không cho tương quan với proton nhóm metoxy chứng tỏ C-4’ mang nhóm hydroxy, H-2 cho tương quan với carbon olefin bậc bốn mang nối đôi δC 131,3 hai carbon olefin bậc ba mang nối đôi δC 128,9 Vậy ba carbon C-1’ C-2’/ C-6’ vòng B khung flavanon Phổ HSQC (phụ lục 5) cho biết tín hiệu δH 7,39 (2H) H-2’/H-6’ Vậy tín hiệu mang hai proton δH 6,89 H-3’/ H5’ Suy carbon C-3’/ C-5’ có độ dịch chuyển hóa học δC 116,1 Hai proton xuất dạng pic đơi vịng A δH [7,57 (1H; s); 6,53 (1H; s)] cho tương quan với carbon carbonyl phổ HMBC chứng tỏ hai proton phải gắn C-5 C-8 Proton gắn C-5 chịu ảnh hưởng peri nhóm >C=O nên có độ dịch chuyển hóa học cao proton gắn C-8 Vậy độ dịch chuyển hóa học H-5 δH 7,57 (1H; s) độ dịch chuyển hóa học H-8 δH 6,53 (1H; s) Ngoài proton H-5 cịn cho tương quan với carbon metylen nhóm prenyl δC 28,3 khẳng định nhóm prenyl gắn vào C-6 Như nhóm metoxy cịn lại gắn vào C-7 Proton H-2 δH 5,43 (1H; dd; 13,0 Hz 3,0 Hz) xuất dạng pic đôi đôi, ghép spin mạnh với proton H-3 với số ghép J= 13,0 Hz (ghép aa) J= 3,0 Hz (ghép ea), chứng tỏ H-2 nằm vị trí trục (hình 4.2) Như cấu hình DFH II 2S Phổ HR-ESI-MS (phụ lục 6) cho biết đỉnh ion phân tử giả DFH II [M+ Na]+ = 361,1406 ứng với công thức C21H22O4Na Từ nhận định phổ nghiệm nêu kết hợp với tài liệu tham khảo[28,49], hợp chất DFH II xác định 4’-hydroxy-6-prenyl-7-metoxyflavanon (bavachinin) (53) bavachinin (53) Chất rắn dạng bột, màu vàng Điểm chảy 152- 1540C (aceton) Phổ khối lượng HR-ESI-MS m/z: 361,1406 [M+Na]+ Phổ 1H NMR (500 MHz, aceton-d6), δH, ppm: 5,43 (1H; dd; 13,0 Hz; 3,0 Hz; H-2); 2,66 (1H; dd; 3,0 Hz 16,5 Hz; H-3a); 3,00 (1H; dd; 13,0 Hz 16,5 Hz; H-3b); 7,57 (1H ; s; H-5); 6,53 (1H ; s; H-8); 7,39 (1H; d; 8,5 Hz; H-2’); 6,89 (1H; d; 8,5 Hz; H-3’); 6,89 (1H; d; 8,5 Hz; H-5’); 7,39 (1H; d; 8,5 Hz; H-6’); 3,23 (2H; d; 7,0 Hz ; H-1’’); 5,26 (1H; m; H-2’’); 1,70 (3H; s; H-4’’); 1,72 (3H; s; H-5’’); 3,91 (3H, s, -OMe) Phổ 13C NMR (125 MHz, aceton-d6), δC, ppm: 80,6 (C-2); 44,6 (C-3); 190,6 (C-4); 127,3 (C-5); 124,8 (C-6); 164,6 (C-7); 99,8 (C-8); 163,2 (C-9); 114,9 (C-10); 131,3 (C-1’); 128,9 (C-2’); 116,1 (C-3’); 158,5 (C-4’); 116,1 (C-5’); 128,9 (C-6’); 29,3 (C-1’’); 123,0 (C-2’’); 133,0 (C-3’’); 17,7 (C-4’’); 25,8 (C-5’’); 56,7 (-OMe) 4.2 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC 4.2.1 Hoạt tính bắt gốc tự DPPH: Phương pháp thử nghiệm hoạt tính bắt gốc tự DPPH chất tinh khiết phân lập từ bổ cốt tối tắc kè đá trình bày mục 2.4.2 Kết thử nghiệm trình bày bảng 3.10 Kết thử nghiệm cho thấy ba mẫu DFC III, DFA I, DFM III biểu hoạt tính chống oxy hóa DPPH với giá trị SC50 26,45; 13,12; 14,5 µg/ml Các mẫu DBA III, DBM I biểu hoạt tính chống oxy hố hệ DPPH với giá trị SC50 4,87 25,0 µg/ml (phụ lục 186) 10 4.2.2 Kết thử nghiệm hoạt tính kích thích phát triển tế bào tạo xương MG63 Kết sàng lọc hoạt tính kích thích phát triển tế bào MG63 cho thấy cao chiết cồn cao phân đoạn có hoạt tính mạnh nồng độ 100µg/ml sau ngày ni cấy Tiến hành thử nghiệm chất tinh khiết nồng độ 100µg/ml cho thấy hợp chất bavachinin, bakuchiol, isobavachalcon, bisdemethoxycurcumin, curcumin, cycloartanol, liquiritin, (-)-epicatechin, (24R) cyclomargenol kích thích phát triển tế bào MG63 101,68%, 110,93%, 112,13%, 112,82%, 98,96%, 98,52%, 140,98%, 106,69%, 118,18% Kết góp phần giải thích việc sử dụng bổ cốt toái tắc kè đá điều trị bệnh xương khớp theo y học cổ truyền Việt Nam Kết chi tiết trình bày bảng 3.12 3.13 4.2.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chất tinh khiết phân lập từ bổ cốt toái tắc kè đá trình bày mục 2.4.1 Kết cho thấy hợp chất DFH II DFH III có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định E coli (12,5 µg/ml); B subtilliss (12,5 µg/ml); S aureus (12,5 µg/ml); Asp niger (DFH II: 50 µg/ml; DFH III: 12,5 µg/ml), hợp chất DFC I có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định E coli (12,5 µg/ml); B subtillis (12,5 µg/ml); Asp niger (12,5 µg/ml); S aureus (12,5 µg/ml); F.oxysporum (12,5 µg/ml); S.cerevisiae (12,5 µg/ml); C.albicans (25 µg/ml); DFC II có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định E coli (50 µg/ml); Asp Niger ( 50 µg/ml); DFC I, DFC III DFC V kháng vi khuẩn E coli (50 µg/ml); DFA VI kháng vi sinh vật kiểm định E coli (50 µg/ml), B subtillis (50 µg/ml), Asp Niger ( 50 µg/ml), C.albicans (50 µg/ml) Ba hợp chất DBA IV, DBM I, DBH I kháng vi sinh vật kiểm định E coli (50 µg/ml), DBH III kháng vi sinh vật kiểm định P.aeruginosa (50 µg/ml), DBA I kháng vi sinh vật kiểm định B subtilliss (50 µg/ml), DBA III, DBC I DBC III kháng vi sinh vật kiểm định A.niger (50 µg/ml) (phụ lục 185) 4.3 BIỆN LUẬN CHUNG Bổ cốt toái tắc kè đá hai thuốc nhân dân sử dụng để điều trị bệnh xương khớp hiệu quả, nhiên nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học hai lồi chưa có nhiều Việt Nam giới Đây lần hai loài Drynaria fortunei Drynaria bonii nghiên cứu tương đối tồn diện thành phần hóa học hoạt tính sinh học Kết nghiên cứu phân lập 31 hợp chất, có chất lần tìm thấy tự nhiên 24 hợp chất lần phân lập chi Drynaria Thành phần hóa học chủ yếu chi Drynaria hợp chất flavonoid triterpenoid, điều tương đồng với nghiên cứu tác giả trước Điểm đặc biệt cấu trúc triterpenoid chi Drynaria Việt Nam khung cycloartan Theo công bố trước đây, hợp chất triterpenoid chi Drynaria thường có cấu trúc hopan fernan Đây lần phân lập triterpenoid có cấu trúc cycloartan chi Drynaria 24-metylene-cycloartan-3β-ol, cycloeucalenol, triphyllol cycloartanol Hoạt tính sinh học thử nghiệm chất phân lập cho thấy chất có hoạt tính chống oxy hóa tương đối mạnh hệ DPPH, kích thích phát triển tế bào tạo xương MG63 Những kết góp phần giải thích chế trị bệnh theo y học cổ truyền, tạo sở khoa học cho nghiên cứu định hướng ứng dụng nhằm có sản phẩm phục vụ nhu cầu chăm sóc sức khỏe nhân dân KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Bằng phương pháp sắc ký, từ hai loài Drynaria fortunei (Kunze ex Mett) J Sm Drynaria bonii H Christ Việt Nam, phân lập 31 hợp chất tinh khiết có chất tự nhiên 29 chất biết Bằng phương pháp phổ đại IR, UV, 1D-NMR, 2D-NMR, MS, HR-MS xác định cấu trúc 31 hợp chất có hợp chất diện hai loài
Hai chất mới: fortunamid (DFM V) drynafuran (DBC I) 11
Hai chín hợp chất biết nhận danh:  bavachinin (DFH II)  bakuchiol (DFH III)  citrostadienyl acetat (DFH IV)  citrostadienol (DFH VB)  myristin (DFH VI)  bisdemethoxycurcumin (DFC II)  isobavachalcon (DFC I)  demetoxycurcumin (DFC V)  curcumin (DFC III)  cycloeucalenol (DFA III)  acid protocatechuic (DFA I, DBA II)  emodin (DFA VI)  cycloartanol (DFA V)  (-)-epicatechin (DFM III)  liquiritin (DFM II)  chrysophanol (DBH I)  α-tocopherol (DBH III)  triphyllol (DBH IVC)  5-hydroxymetylfurfural (DBA I)  nobiletin (DBC III)  isoliquiritigenin (DBA VI)  protocatechualdehyd (DBA III)  nicotiflorin (DBM III)  rutin (DBM I)  etyl β-D-fructopyranosid (DBM V)  linocaffein (DBM IV)  24-methylen-cycloartan-3β-ol (DBH IVB)  cerebrosid (DBM VI) Trong số 29 hợp chất biết gồm có 25 hợp chất lần phân lập chi Drynaria hợp chất lồi Thử nghiệm hoạt tính sinh học cho thấy phần lớn chất phân lập có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Năm mẫu biểu hoạt tính bắt gốc DPPH mạnh Các hợp chất DFH II, DFH III, DFC I, DFC II, DFC III, DFA V, DFM II, DFM III, DBH IVC kích thích phát triển tế bào MG63 giá trị 101,68%, 110,93%, 112,13%, 112,82%, 98,96%, 98,52%, 140,98%, 106,69%, 118,18% KIẾN NGHỊ
Tiếp tục khảo sát thành phần hóa học số lồi thuộc chi Dynaria như: Dynaria propinqua, Drynaria quercifolia, Drynaria rigidula,
Thử nghiệm hoạt tính chống lỗng xương số dịng tế bào tạo xương khác MC3T3-E1
Thử nghiệm khả gia tăng hoạt lực enzym phosphat kiềm, biệt hóa tế bào  ... 127 trang với chương, 35 bảng, sơ đồ, 13 hình, 84 tài liệu tham khảo 187 phụ lục phổ Trong đó, phần mở đầu trang, tổng quan 26 trang, phương pháp nghiên cứu 10 trang, thực nghiệm 29 trang, kết... etanol theo phương pháp ngâm dầm nhiệt độ phịng, lọc, quay thu hồi dung mơi, thu cao etanol Trích pha rắn silica gel cao etanol giải hấp đơn dung môi: eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat metanol... Hz)] tương quan với carbon bậc ba mang oxy δC 158,5 xác nhận C-4’ DFH II, carbon C- 4’ khơng cho tương quan với proton nhóm metoxy chứng tỏ C-4’ mang nhóm hydroxy, H-2 cho tương quan với carbon