ERGOCALCIFEROL Ergocalciferolum Calciferol, vitamin D2 C28H44O P.t.l: 396,7 Ergocalciferol (5Z, 7E, 22E) - 9,10 secoergosta - 5, 7, 10 (19), 22 - tetraen 3β - ol, phải chứa từ 97,0 đến 103,0% C28H44O Tính chất Tinh thể trắng trắng, bột kết tinh trắng vàng, nhạy cảm với không khí, nhiệt độ ánh sáng Trong dung dịch phụ thuộc vào nhiệt độ thời gian xảy tượng đồng phân hoá trở lại, tạo thành preergocalciferol Tan vô hạn ethanol 96%, tan dầu béo, thực tế không tan nước Dung dịch dung môi bay không bền nên cần dùng Định tính Có thể chọn hai nhóm định tính sau: Nhóm I: B, C Nhóm II: A, C A Phổ hồng ngoại (Phụ lục 4.2) chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại ergocalciferol chuẩn (ĐC) B Trong phép thử ergosterol, vết sắc ký đồ dung dịch thử phải tương tự vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (1) vị trí, màu sắc kích thước C Điểm chảy 112 – 117 oC (Phụ lục 6.7), xác định không cần tán thành bột sấy khô Góc quay cực riêng Từ +103o đến +107o (Phụ lục 6.4) Hoà tan nhanh không làm nóng 0,200 g chế phẩm ethanol aldehyd (TT) pha loãng thành 25,0 ml với dung môi, đo vòng 30 phút, dùng ống dm Ergosterol Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4) Bản mỏng: Silica gel G (TT) Dung môi khai triển: Cyclohexan - ether peroxyd (1 : 1), hỗn hợp có chứa 0,01% butylhydroxy toluen (TT) Dung môi hoà tan: Ethylen clorid (TT) có chứa 1,0% squalan (TT) 0,01% butyl-hydroxytoluen (TT) Dung dịch thử: Hoà tan 0,25 g chế phẩm dung môi hoà tan pha loãng thành ml với dung môi Dung dịch đối chiếu (1): Hoà tan 0,10 g ergocalciferol chuẩn (ĐC) dung môi hoà tan pha loãng thành ml với dung môi Dung dịch đối chiếu (2): Hoà tan mg ergosterol chuẩn (ĐC) dung môi hoà tan pha loãng thành 50 ml với dung môi Dung dịch đối chiếu (3): Hỗn hợp đồng thể tích dung dịch đối chiếu (1) dung dịch đối chiếu (2) Tất dung dịch pha trước dùng Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng 10 µl dung dịch trên, riêng dung dịch đối chiếu (3) chấm 20 µl Triển khai sắc ký ngay, điều kiện tránh ánh sáng đến dung môi 15 cm Lấy mỏng để khô không khí Phun lần dung dịch thuốc thử antimon triclorid (TT) Quan sát sắc ký đồ đến phút sau phun Vết sắc ký đồ dung dịch thử ban đầu có màu vàng da cam, sau trở thành nâu Trên sắc ký đồ dung dịch thử, vết có màu tím vết (tương ứng với ergosterol xuất chậm hơn) không đậm màu vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (2) (0,2%) Trong sắc ký đồ dung dịch thử, vết tương ứng với vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (1) (2) không phép có vết khác Phép thử có giá trị sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (3) cho hai vết tách rõ ràng Tạp chất khử Không 20 phần triệu Hoà tan 0,1 g chế phẩm ethanol aldehyd (TT) pha loãng thành 10,0 ml với dung môi Thêm 0,5 ml dung dịch tetrazolium xanh 0,5% ethanol aldehyd (TT) 0,5 ml dung dịch tetramethylamoni hydroxyd loãng (TT) Để yên phút thêm 1,0 ml acid acetic băng (TT) Song song chuẩn bị dung dịch đối chiếu với 10,0 ml dung dịch có chứa 0,2 µg hydroquinon ml ethanol aldehyd (TT) Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1) hai dung dịch thu bước sóng 525 nm Mẫu trắng 10,0 ml ethanol aldehyd (TT) xử lý tương tự mẫu thử Độ hấp thụ dung dịch thử không lớn độ hấp thụ dung dịch đối chiếu Định lượng Tiến hành định lượng nhanh tốt, tránh ánh sáng quang hoá không khí Tiến hành phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3) Pha động: Hexan - pentanol (997 : 3) Dung dịch thử: Hoà tan 10,0 mg chế phẩm 10,0 ml toluen (TT) không làm nóng pha loãng thành 100,0 ml pha động Dung dịch chuẩn: Cũng chuẩn bị theo cách dùng 10,0 mg ergocalciferol chuẩn (ĐC) thay cho chế phẩm Dung dịch phân giải: Hoà tan 0,5 g colecalciferol chuẩn dùng cho phép thử hiệu (ĐC) ml toluen (TT) pha loãng thành 10,0 ml pha động, đun hồi lưu cách thuỷ 90 oC 45 phút làm lạnh Điều kiện sắc ký: Cột (25 cm x 4,6 mm) nhồi silica gel thích hợp (5 đến 10 µm) Detector quang phổ hấp thụ tử ngoại bước sóng 254 nm Tốc độ dòng: ml/phút Cách tiến hành: Tiêm thể tích thích hợp dung dịch phân giải ghi sắc ký đồ, điều chỉnh độ nhạy cho chiều cao pic colecalciferol lớn 50% độ cao thang đo Tiêm tất lần Khi sắc ký đồ ghi điều kiện mô tả, thời gian lưu tương đối khoảng 0,4 pre-colecalciferol, 0,5 transcolecalciferol 1,0 colecalciferol Độ lệch chuẩn tương đối colecalciferol không lớn 1% hệ số phân giải precolecalciferol trans-colecalciferol không nhỏ 1,0 Nếu cần thiết điều chỉnh tỷ lệ thành phần tốc độ dòng pha động để đạt độ phân giải Tiêm thể tích thích hợp dung dịch chuẩn ghi sắc ký đồ, điều chỉnh độ nhạy cho chiều cao pic ergocalciferol lớn 50% độ cao thang đo Tiêm thể tích dung dịch thử ghi sắc ký đồ Tính hàm lượng phần trăm C28H44O từ biểu thức: 100 × W2 × S1 W1 × S Trong đó: W1: Khối lượng tính mg chế phẩm có dung dịch thử W2: Khối lượng tính mg ergocalciferol chuẩn dung dịch chuẩn S1: Diện tích pic (hoặc chiều cao) ergocalciferol sắc ký đồ dung dịch thử S2: Diện tích pic (hoặc chiều cao) ergocalciferol sắc ký đồ dung dịch chuẩn Bảo quản Ergocalciferol cần bảo quản bình kín chứa khí nitơ, tránh ánh sáng để nhiệt độ – oC, lượng thuốc lọ kín mở cần sử dụng