Hướng dẫn thực tế cách phát hiện và đếm vi khuẩn sinh ra từ bào tử

Điều này một phần là do lượng nội bào tử vi khuẩn endospores sau này sẽ gọi tắt là spore cho thuận tiện, một phần bào tử ưa ấm chịu nhiệt và bào tử ưa nhiệt có thể còn sống sót sau quá t

Quy trình và hướng dẫn

Hướng dẫn thực tế cách phát hiện và đếm

vi khuẩn sinh ra từ bào tử

 

Mục lục Trang

1 Lời nói đầu……… 3

2 Định nghĩa thuật ngữ ………….………3

2.1 Nội bào tử vi khuẩn Endospores ……… 3

2.2 Khả năng kháng nhiệt (heat resistance) ……… 3

2.3 Vi khuẩn ưa ấm (Mesophiles) 4

2.4 Vi khuẩn chịu nhiệt (Thermophiles) 4

3 Phát hiện và đếm bào tử……… 4

3.1 Tổng số bào tử (cho điều kiện vệ sinh sản xuất )……… 4

3.2 Bào tử ưa ấm kháng nhiệt (Thermoresistant mesophilic spores) 4

3.3 Bào tử chịu nhiệt kháng nhiệt (Thermoresistant thermophilic spores) 5

4 Tài liệu tham khảo ……… 5

1 Lời nói đầu

Chất lượng vi sinh của nguyên liệu đóng vai trò quan trọng đến chất lượng của thành phẩm Điều này một phần

là do lượng nội bào tử vi khuẩn endospores (sau này sẽ gọi tắt là spore cho thuận tiện), một phần bào tử ưa ấm chịu nhiệt và bào tử ưa nhiệt có thể còn sống sót sau quá trình chế biến (process survivors) Do đó, quan trọng

là phải kiểm soát lượng tải bào tử trong nguyên liệu của các sản phẩm có độ axít thấp, thời hạn sử dụng ổn định (pH >4,6)

Tài liệu này nhằm mục đích cung cấp hướng dẫn thực tế về công việc kiểm tra vi sinh hằng ngày trong phòng lab

để phát hiện và đếm các vi khuẩn sinh ra từ bào tử Ngoài ra, tài liệu cũng cung cấp các định nghĩa thuật ngữ để hiểu rõ hơn về từ vựng

2 Định nghĩa thuật ngữ

2.1 Nội bào tử vi khuẩn (Endospores / Spores)

Một số vi khuẩn gram dương có thể tạo ra một cấu trúc đặc biệt, kháng nhiệt, bất động gọi là nội bào tử vi khuẩn (endospore) Bào tử này phát triển bên trong các tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn của nhiều giống (genera) (1)

và các ví dụ của vi khuẩn sinh ra từ bào tử đa số phân bố rộng rãi trong nhóm vi khuẩn gram dương Tuy nhiên, mặc dù các loài vi khuẩn sinh ra từ bào tử thì đa dạng, thông tin chi tiết nhất có thể tìm thấy phổ biến là nhóm vi

khuẩn hình que sống trong đất, thuộc giống Bacillus và Clostridium (3) Kể từ đó, bào tử được nhận diện là hình

thức khắc nhiệt nhất của sự sống trên trái đất Ở trạng thái bất động, các bào tử sẽ không trao đổi chất, có khả năng kháng cự rất cao với các tác nhân vật lý bao gồm (nhưng không hạn chế) nhiệt độ cao ẩm, nhiệt độ cao khô, tia UV, phóng xạ tia gamma, sấy khô mức cao (kể cả môi trường chân không), và các tác nhân oxy hoá Mặc dù bất hoạt sự trao đổi chất, các bào tử vẫn có khả năng kiểm soát liên tục tình trạng dinh dưỡng của môi trường xung quanh chúng, và chúng sẽ kích hoạt lại nhanh chóng khi phát hiện các chất dinh dưỡng thích hợp thông qua mầm bào tử và việc khôi phục sự phát triển sinh dưỡng (3)

2.2 Khả năng kháng nhiệt (Thermoresistance / heat resistance)

Đặc tính dễ nhận biết nhất của các bào tử vi khuẩn là khả năng kháng nhiệt đáng kể của chúng (3) Mức độ kháng nhiệt khác nhau được nhận biết giữa các loài khác nhau của vi khuẩn sinh ra từ bào tử Các nhân tố quan trọng khác xác định mức độ kháng nhiệt là các điều kiện môi trường xác định tại thời điểm của sự hình thành bào tử (3) Đối với nhóm các bào tử kháng nhiệt, các bào tử có thể sống sót ở nhiệt độ cao ẩm (100°C ở áp suất khí quyển) với giá trị D (thời gian giảm thập phân cần để tiêu diệt 90% tổng số vi sinh vật hoặc bào tử trong một mẫu ở nhiệt độ xác định) trong khoảng 20 - 30 phút

2.3 Vi khuẩn ưa ấm (Mesophiles)

Nói chung, các vi sinh vật có thể được phân loại dựa vào khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của chúng Các vi khuẩn ưa ấm là các vi sinh vật có khoảng nhiệt độ phát triển tối ưu là 20 - 45°C và nhiệt độ tối thiểu là 15 - 20°C Chúng có khả năng phát triển tối đa ở nhiệt độ 45°C hoặc thấp hơn trong một số trường hợp Hầu hết các

vi sinh vật sẽ thuộc nhóm vi khuẩn ưa ấm này (1)

2.4 Vi khuẩn chịu nhiệt (Thermophiles)

Một số vi sinh vật thuộc dạng chịu nhiệt Chúng có thể phát triển ở nhiệt độ 55°C hoặc cao hơn Chúng thường phát triển chậm ở 45°C và tối đa ở 55 - 65°C (1)

3 Phát hiện và đếm số bào tử

Để thuận tiện cho các mục đích vận hành thực tế, 3 cấp độ của các vi khuẩn sinh ra từ bào tử có thể được xác định căn cứ theo phương pháp phát hiện (2)

3.1 Tổng số bào tử (cho điều kiện vệ sinh sản xuất)

Tổng số bào tử được phát hiện bằng cách gia nhiệt sơ bộ mẫu sản phẩm khoảng 3-5ml trong một bể nước ở 80ºC/10 phút Kiểm chứng nhiệt độ nên được tiến hành ở mẫu đối chứng song song với mẫu thử Sau đó, mẫu 0.1 ml hoặc 1ml được cấy vào đĩa thạch PCA/BHI/TGY Các đĩa này nên được ủ ở nhiệt độ khuyến cáo là 35-37ºC trong thời gian 48 giờ (2)

Lưu ý: Mặc dù các tài liệu tham khảo đề nghị sử dụng nhiệt độ 30ºC để ủ, Tetra Pak đề nghị sử dụng nhiệt độ cao hơn, khoảng 35-37ºC để loại trừ sự phát triển của vi khuẩn Coryneforme mà có thể tồn tại ở các điều kiện nhiệt độ gia nhiệt sơ bộ mẫu khuyến cáo (80ºC/10 phút) (2)

3.2 Bào tử ưa ấm kháng nhiệt (Thermoresistant mesophilic spores)

Nhóm vi khuẩn này đóng góp phần quan trọng đến chất lượng của sản phẩm và có thể còn sống sót sau quá trình chế biến (process survivors) Bào tử ưa ấm kháng nhiệt được phát hiện bằng cách gia nhiệt mẫu sản phẩm 3-5ml trong bể nước (hoặc tốt hơn là bể dầu) ở nhiệt độ 100ºC/10 phút (2)

Lưu ý: Nếu bể dầu không sẵn có, hoặc nếu địa điểm đo lường ở trên cao, có thể sẽ rất khó để đạt được nhiệt

độ 100ºC Trong trường hợp này, đo lượng thời gian khi mẫu đạt 97ºC Có thể mất lâu hơn 10-15 minutes để đạt được nhiệt độ này Thời gian giữ nhiệt thêm này có thể tạm chấp nhận để đạt được mục đích của thí nghiệm Tổng thời gian tiếp xúc với nhiệt độ cao không được vượt quá 30 phút (2)

Sau đó, mẫu 0.1 ml hoặc 1ml được cấy vào đĩa thạch PCA/BHI/TGY Các đĩa này nên được ủ ở nhiệt độ khuyến cáo là 35-37ºC trong 5 ngày

Lưu ý: Thời gian ủ dài hơn là cần thiết đối với pha tiềm phát dài (longer lag phase) đối với sự phát triển của các vi khuẩn, cũng như cần kéo dài thời gian đối với sự phục hồi của các tế bào của bào tử đối với sự tiêu huỷ bởi nhiệt (2)

3.3 Bào tử ưa nhiệt kháng nhiệt (Thermoresistant thermophilic spores)

Lặp lại quy trình bên trên, chỉ khác là nhiệt độ ủ đĩa thạch nên là 55ºC

Lưu ý: Các đĩa thạch nên được ủ trong phòng/ thùng/ vật chứa mà có khả năng chống sấy khô đĩa thạch trong thời gian ủ kéo dài

4 Tài liệu tham khảo

(1) Lansing M Prescott, John P HarleyM, Donald A Klein Microbiology (fourth edition) THE McGRAW-HILL

COMPANIES, 1999

(2) Lembke F Tetra Pak R&D Stuttgart, 2003 unpublished

(3) Wayne L Nicholson, Nobuo Munakata, Gerda Horneck, Henry J Melosh and Peter Setlow Resistance

of Bacillus Endospores to Extreme Terrestrial and Extraterrestrial Enviroments MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS, Sept 2000, p 548-572