Hướng dẫn thực tế cách phát hiện và đếm vi khuẩn sinh ra từ bào tử

    Quy trình hướng dẫn Hướng dẫn thực tế cách phát đếm vi khuẩn sinh từ bào tử                                      QAM‐588016‐0101 / VN                                     Hướng dẫn thực tế cách phát đếm vi khuẩn sinh từ bào tử     Mục lục Trang Lời nói đầu…………………………………………………………………………………… Định nghĩa thuật ngữ ………….………………………………………………………………3 2.1 Nội bào tử vi khuẩn Endospores ………………………………………………… 2.2 Khả kháng nhiệt (heat resistance) ……… 2.3 Vi khuẩn ưa ấm (Mesophiles) 2.4 Vi khuẩn chịu nhiệt (Thermophiles) .4 Phát đếm bào tử……………… 3.1 Tổng số bào tử (cho điều kiện vệ sinh sản xuất )……………… 3.2 Bào tử ưa ấm kháng nhiệt (Thermoresistant mesophilic spores) 3.3 Bào tử chịu nhiệt kháng nhiệt (Thermoresistant thermophilic spores) Tài liệu tham khảo …………………                                    QAM‐588016‐0101/VN                                   Trang  2/ 5    Hướng dẫn thực tế cách phát đếm vi khuẩn sinh từ bào tử     Lời nói đầu Chất lượng vi sinh nguyên liệu đóng vai trò quan trọng đến chất lượng thành phẩm Điều phần lượng nội bào tử vi khuẩn endospores (sau gọi tắt spore cho thuận tiện), phần bào tử ưa ấm chịu nhiệt bào tử ưa nhiệt sống sót sau trình chế biến (process survivors) Do đó, quan trọng phải kiểm soát lượng tải bào tử nguyên liệu sản phẩm có độ axít thấp, thời hạn sử dụng ổn định (pH >4,6) Tài liệu nhằm mục đích cung cấp hướng dẫn thực tế công việc kiểm tra vi sinh ngày phòng lab để phát đếm vi khuẩn sinh từ bào tử Ngoài ra, tài liệu cung cấp định nghĩa thuật ngữ để hiểu rõ từ vựng Định nghĩa thuật ngữ 2.1 Nội bào tử vi khuẩn (Endospores / Spores) Một số vi khuẩn gram dương tạo cấu trúc đặc biệt, kháng nhiệt, bất động gọi nội bào tử vi khuẩn (endospore) Bào tử phát triển bên tế bào sinh dưỡng vi khuẩn nhiều giống (genera) (1) ví dụ vi khuẩn sinh từ bào tử đa số phân bố rộng rãi nhóm vi khuẩn gram dương Tuy nhiên, loài vi khuẩn sinh từ bào tử đa dạng, thông tin chi tiết tìm thấy phổ biến nhóm vi khuẩn hình que sống đất, thuộc giống Bacillus Clostridium (3) Kể từ đó, bào tử nhận diện hình thức khắc nhiệt sống trái đất Ở trạng thái bất động, bào tử không trao đổi chất, có khả kháng cự cao với tác nhân vật lý bao gồm (nhưng không hạn chế) nhiệt độ cao ẩm, nhiệt độ cao khô, tia UV, phóng xạ tia gamma, sấy khô mức cao (kể môi trường chân không), tác nhân oxy hoá Mặc dù bất hoạt trao đổi chất, bào tử có khả kiểm soát liên tục tình trạng dinh dưỡng môi trường xung quanh chúng, chúng kích hoạt lại nhanh chóng phát chất dinh dưỡng thích hợp thông qua mầm bào tử việc khôi phục phát triển sinh dưỡng (3) 2.2 Khả kháng nhiệt (Thermoresistance / heat resistance) Đặc tính dễ nhận biết bào tử vi khuẩn khả kháng nhiệt đáng kể chúng (3) Mức độ kháng nhiệt khác nhận biết loài khác vi khuẩn sinh từ bào tử Các nhân tố quan trọng khác xác định mức độ kháng nhiệt điều kiện môi trường xác định thời điểm hình thành bào tử (3) Đối với nhóm bào tử kháng nhiệt, bào tử sống sót nhiệt độ cao ẩm (100°C áp suất khí quyển) với giá trị D (thời gian giảm thập phân cần để tiêu diệt 90% tổng số vi sinh vật bào tử mẫu nhiệt độ xác định) khoảng 20 - 30 phút                                    QAM‐588016‐0101/VN                                   Trang  3/ 5    Hướng dẫn thực tế cách phát đếm vi khuẩn sinh từ bào tử     2.3 Vi khuẩn ưa ấm (Mesophiles) Nói chung, vi sinh vật phân loại dựa vào khoảng nhiệt độ thích hợp cho phát triển chúng Các vi khuẩn ưa ấm vi sinh vật có khoảng nhiệt độ phát triển tối ưu 20 - 45°C nhiệt độ tối thiểu 15 20°C Chúng có khả phát triển tối đa nhiệt độ 45°C thấp số trường hợp Hầu hết vi sinh vật thuộc nhóm vi khuẩn ưa ấm (1) 2.4 Vi khuẩn chịu nhiệt (Thermophiles) Một số vi sinh vật thuộc dạng chịu nhiệt Chúng phát triển nhiệt độ 55°C cao Chúng thường phát triển chậm 45°C tối đa 55 - 65°C (1) Phát đếm số bào tử Để thuận tiện cho mục đích vận hành thực tế, cấp độ vi khuẩn sinh từ bào tử xác định theo phương pháp phát (2) 3.1 Tổng số bào tử (cho điều kiện vệ sinh sản xuất) Tổng số bào tử phát cách gia nhiệt sơ mẫu sản phẩm khoảng 3-5ml bể nước 80ºC/10 phút Kiểm chứng nhiệt độ nên tiến hành mẫu đối chứng song song với mẫu thử Sau đó, mẫu 0.1 ml 1ml cấy vào đĩa thạch PCA/BHI/TGY Các đĩa nên ủ nhiệt độ khuyến cáo 3537ºC thời gian 48 (2) Lưu ý: Mặc dù tài liệu tham khảo đề nghị sử dụng nhiệt độ 30ºC để ủ, Tetra Pak đề nghị sử dụng nhiệt độ cao hơn, khoảng 35-37ºC để loại trừ phát triển vi khuẩn Coryneforme mà tồn điều kiện nhiệt độ gia nhiệt sơ mẫu khuyến cáo (80ºC/10 phút) (2) 3.2 Bào tử ưa ấm kháng nhiệt (Thermoresistant mesophilic spores) Nhóm vi khuẩn đóng góp phần quan trọng đến chất lượng sản phẩm sống sót sau trình chế biến (process survivors) Bào tử ưa ấm kháng nhiệt phát cách gia nhiệt mẫu sản phẩm 3-5ml bể nước (hoặc tốt bể dầu) nhiệt độ 100ºC/10 phút (2) Lưu ý: Nếu bể dầu không sẵn có, địa điểm đo lường cao, khó để đạt nhiệt độ 100ºC Trong trường hợp này, đo lượng thời gian mẫu đạt 97ºC Có thể lâu 10-15 minutes để đạt nhiệt độ Thời gian giữ nhiệt thêm tạm chấp nhận để đạt mục đích thí nghiệm Tổng thời gian tiếp xúc với nhiệt độ cao không vượt 30 phút (2) Sau đó, mẫu 0.1 ml 1ml cấy vào đĩa thạch PCA/BHI/TGY Các đĩa nên ủ nhiệt độ khuyến cáo 35-37ºC ngày Lưu ý: Thời gian ủ dài cần thiết pha tiềm phát dài (longer lag phase) phát triển vi khuẩn, cần kéo dài thời gian phục hồi tế bào bào tử tiêu huỷ nhiệt (2) Cần để ý quy trình mô tả bên dựa kiến thức thu nhiều năm làm công tác kiểm tra vi sinh thực tế không xem tài liệu khoa học lý thuyết khía cạnh                                    QAM‐588016‐0101/VN                                   Trang  4/ 5    Hướng dẫn thực tế cách phát đếm vi khuẩn sinh từ bào tử     3.3 Bào tử ưa nhiệt kháng nhiệt (Thermoresistant thermophilic spores) Lặp lại quy trình bên trên, khác nhiệt độ ủ đĩa thạch nên 55ºC Lưu ý: Các đĩa thạch nên ủ phòng/ thùng/ vật chứa mà có khả chống sấy khô đĩa thạch thời gian ủ kéo dài Tài liệu tham khảo (1) Lansing M Prescott, John P HarleyM, Donald A Klein Microbiology (fourth edition) THE McGRAW-HILL COMPANIES, 1999 (2) Lembke F Tetra Pak R&D Stuttgart, 2003 unpublished (3) Wayne L Nicholson, Nobuo Munakata, Gerda Horneck, Henry J Melosh and Peter Setlow Resistance of Bacillus Endospores to Extreme Terrestrial and Extraterrestrial Enviroments MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS, Sept 2000, p 548-572                                    QAM‐588016‐0101/VN                                   Trang  5/ 5