Luận văn định danh nấm phytophthora spp bằng các kỹ thuật sinh học phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ******* NGUYỄN HUỲNH HOÀNG MINH ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***** ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: TS LÊ ĐÌNH ĐÔN KS TRỊNH THỊ PHƢƠNG VY Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***** IDENTIFYING Phytophthora spp BY MOLECULAR TECHNOLOGIES GRADUATION OF THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor: Student: PhD LE DINH DON NGUYEN HUYNH HOANG MINH Bs TRINH THI PHUONG VY HCMC, 8/2006 TERM: 2002 - 2006 LỜI CẢM ƠN - Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến cán giáo viên Trường Đại Học Nông Lâm, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học tạo điều kiện cho em thực đề tài - Em biết ơn hướng dẫn thầy Tiến sĩ Lê Đình Đôn, Kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy, Kỹ sư Nguyễn Văn Lẫm tận tình hướng dẫn em suốt thời gian thợc đề tài - Cảm ơn thầy cô, anh chị giảng viên Phòng Công Nghệ Sinh Học – Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài - Xin gửi lời cảm ơn đến bạn thực tập đề tài Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, đặc biệt bạn nhóm Bảo Vệ Thực Vật thời gian qua tận tình giúp đỡ - Cảm ơn tập thể lớp Công nghệ sinh học khóa 28 chia kỉ niệm buồn vui suốt thời gian bốn năm học vừa qua Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2006 Sinh viên Nguyễn Huỳnh Hoàng Minh iv TÓM TẮT Nguyễn Huỳnh Hoàng Minh, Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh “ ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ” Giáo viên hướng dẫn: TS Lê Đình Đôn KS Trịnh Thị Phương Vy Nấm Phytophthora xem tác nhân nguy hiểm hàng đầu cho kinh tế nông nghiệp nước ta Dựa số kết đạt từ nghiên cứu trước hình thái sinh thái giống nấm này, đề nghị qui trình định danh giống nấm sở cấu trúc di truyền chúng Mục đích đề tài bao gồm việc sử dụng kỹ thuật PCR, kỹ thuật giải trình tự nhằm khuếch đại xác định vùng trình tự đặc trưng ITS1- 5,8S- ITS2 Kết đề tài tạo sở cho nghiên cứu điều tra kiểm soát mầm bệnh Phytophthora nước ta Sau thực toàn qui trình, thu số kết sau: - Sản phẩm khuếch đại vùng ITS1- 5,8S- ITS2 hai mẫu nấm tiêu Bà Rịa sầu riêng Đồng Nai 900 bp Trong sản phẩm khuếch đại hai mẫu nấm địa lan cho band 800 bp 900 bp hai band - Kết giải trình tự hai mẫu nấm địa lan cho thấy trình tự toàn vùng ITS1- 5,8S- ITS2 khoảng 800 bp Trong vùng ITS1 khoảng 225 bp; vùng 5,8S 160 bp vùng ITS2 420 bp v MỤC LỤC o0o Trang Lời cảm ơn iv Tóm tắt v Mục lục vi Danh mục hình ix Danh mục bảng x Danh sách chữ viết tắt xi Giới thiệu 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích – yêu cầu đề tài 1.2.1 Mục đích đề tài .2 1.2.2 Yêu cầu đề tài 1.2.3 Giới hạn đề tài 1.2.4 Đối tượng đề tài 2 Tổng quan 2.1 Giới thiệu giống Phytophthora 2.1.1 Cây tiến hoá Phytophthora 2.1.2 Chu kì sống Phytophthora 2.1.3 Phân lập Phytophthora từ bôl phận nhiễm bệnh 2.1.4 Một số môi trường phân lập Phytophthora từ mô bệnh .6 2.1.5 Đặc điểm hình thái giống Phytophthora .6 2.1.6 Phân biệt nấm Pythium nấm Phytophthora 2.2 Một số bệnh Phytophthora nghiên cứu Việt Nam 2.2.1 Cà chua khoai tây .8 2.2.2 Khoai sọ 2.2.3 Dứa .8 2.2.4 Họ cam chanh 2.2.5 Sầu riêng vi 2.2.6 Mận .9 2.2.7 Cao su .10 2.3 Các kỹ thuật phát định danh Phytophthora 11 2.3.1 Kỹ thuật quan sát hình thái môi trường nuôi cấy 11 2.3.2 So sánh tương xứng sinh sản sinh dưỡng 12 2.3.3 Kỹ thuật protein profile 12 2.3.4 Isozyme 13 2.3.5 Huyết học kit chuẩn đoán .13 2.3.6 Kỹ thuật RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism ) 14 2.3.7 Kỹ thuật probe acid nucleic, DNA fingerprinting 14 2.3.8 Sự lai DNA-DNA 15 2.3.9 Kỹ thuật PCR RAPD 15 2.4 Một số công trình nghiên cứu định danh nấm Phytophthora 15 2.4.1 Một số công trình nghiên cứu nước .15 2.4.2 Công trình nghiên cứu nước 17 2.5 Một số lưu ý trước thực thí nghiệm 18 2.5.1 Sơ lược trình tự ITS .18 2.5.2 Danh mục loài Phytophthora tìm thấy Việt Nam 19 Vật Liệu phương pháp .21 3.1 Thời gian địa điểm thực đề tài 21 3.1.1 Thời gian thực .21 3.1.2 Địa điểm thực .21 3.2 Vật liệu hoá chất 21 3.2.1 Tăng sinh nhân sinh khối 21 3.2.2 Ly trích DNA 22 3.2.3 Điện di 22 3.2.4 Kỹ thuật PCR 23 3.3 Phương pháp nghiên cứu .23 3.3.1 Tăng sinh nhân sinh khối 23 3.3.2 Ly trích DNA 24 3.3.3 Kỹ thuật PCR 26 3.3.4 Kỹ thuật giải trình tự 28 vii 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 viii Danh sách hình Hình 2.1 Chu kì sống Phytophthora Hình 2.2 Một số bệnh Phytophthora gây số trồng 10 Hình 2.3 Vùng trình tự ITS DNA ribosome 18 Hình 4.1 Sản phẩm qui trình 31 Hình 4.2 Sản phẩm qui trình ly trích 31 Hình 4.3 Thang nồng độ DNA chuẩn 32 Hình 4.4 Kết qủa phản ứng PCR 33 Hình 4.5 Sản phẩm PCR lần thứ hai .34 Hình 4.6 Mẫu tinh dùng cho phản ứng giải trình tự 36 Hình 4.7 Cây phát sinh loài hai mẫu địa lan .40 ix Danh sách bảng Bảng 2.1 Cây tiến hoá nấm Phytophthora………………………………… Bảng 2.2 Danh mục loài nấm Phytophthora tìm thấy Việt Nam 19 Bảng 3.1 Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 25 l .26 Bảng 3.2.Thành phần cho phản ứng PCR thể tích 50 l 27 Bảng 3.3.Chu kì nhiệt cho phản ứng PCR 27 Bảng 4.1 Các nguồn nấm ngân hàng gen dùng để so sánh 37 Bảng 4.2 So sánh trình tự nucleotide vùng ITS hai mẫu DL1, DL2 38 Bảng 4.3 Kết so sánh vùng đoạn ITS1- 5,8S- ITS2 40 Bảng 4.4 Trình tự vùng gen (ITS1-5.8S-ITS2) mẫu Phytophthora địa lan 42 x 38 Hình 4.7 Cây phát sinh loài hai mẫu địa lan Theo hình 4.7 hai mẫu nấm có chung nguồn gốc thuộc loài P.multivesiculata ( dòng CBS545.96) Chúng thực thêm số so sánh nhằm xác định tiểu phần gen vùng (ITS1-5,8S-ITS2) dựa trình tự tương đồng vùng ITS dòng nấm P.multivesiculata chủng CBS545.96 Bảng 4.3 Kết so sánh vùng đoạn gen ITS1- 5,8S- ITS2 P.multi CBS545.96 ITS1 5,8S ITS2 Tỉ lệ tương đồng vùng ITS1 mẫu 100%; vùng ITS2 99,5%; vùng 5,8S 100% Dựa trình tự ITS1, trình tự ITS2 trình tự vùng 5.8S thu bảng kết sau 39 Bảng 4.4 Trình tự vùng gen (ITS1-5.8S-ITS2) mẫu Phytophthora địa lan #18S NAAGCTGGAGAGAGACTTCCCC #ITS1 CCACACCTAAAAAACTTTCCACGTGAACCGTATCAACCCCTTTAGTTGGGGGTCTTGCTT GGCGTGCGGCTGCTGGCCTTTATTGGTTGGCTGGCTGCGTGCTGGGCGAGCCCTATCATG GCGATCGTTTGGACCTCGGTCTGAGCTAGTAGCTTTTGTTTTAAACCCATTCTTTAATAC TGATTATACTGTGGGGACGAAAGTCTCTGCTTTTAACTAGATAG #5_8S AACTTTCAGCAGTGGATGTCTAGGCTCGCACATCGATGAAGAACGCTGCGAACTGCGATA CGTAATGCGAATTGCAGGATTCAGTGAGTCATCGAAATTTTGAACGCATATTGCACTTCC GGGTTAGTCCTGGGAGTATGCCTGTATCAGTGTCCGTA #ITS2 GTACATCAAACTTGGCTTTCTTCCTTCCGTGTAGTCGGTGGAGGAGACGTCAGATGTGAA GTGTCTTGCGGTTGGCCTTCGGGTCGTCTGCGAGTCCTTTGAAATGTACTGAACTGTACT CTCTCTTTGCTCGAAAAGCGTGGTATTGTTGGTTGTGGAGACTGCCTGTGTGGCCAGTCG GCGACCGGTTTGTCTGCTACGGCGTTTAATGGAGGAGTGTTCGATTCGCGGTATGGTTG GCTTCGGCTGAACAGACGCTTATTGGACGTTTTTCCTGCTGTGGCGTGATGGGCTGGTG AACCGTAGCTGTGTTNTGGCTTGGTCTTTGAATCGGCTTTGCTGTTGCGAAGTAGAGCGG CGGCTTCGGCTGTCGAGGGGTCGATCCATTTTGGGAAGTTTGTGTGTACTTCGGTGCGCA TCTCAA #28S ATATCAGGCAAGATTA Theo kết bảng 4.4, đến số điều cần thảo luận như: - Kết BLAST đoạn trình tự ngân hàng gen cho thấy sản phẩm hai mẫu nấm thuộc giống Phytophthora ( phù hợp với kết định danh quan sát hình thái kỹ sư Trịnh Thị Phương Vy) - Vùng ITS1- 5,8S- ITS2 hai mẫu nấm có 850 nucleotide Điều phù hợp kết PCR hai mẫu nấm cho sản phẩm khoảng 800 bp - Kết so sánh phần mềm ClustalX toàn vùng ITS1- 5,8S- ITS2 vẽ phát sinh loài phần mềm Treeview cho thấy hai mẫu nấm có quan hệ gần với loài P multivesiculata, đặc biệt dòng P multivesiculata CBS545.96 - Để khẳng định lại kết tiến hành so sánh trình tự tiểu phần nhỏ ITS1; ITS2; 5,8S Tỉ lệ tương đồng phép so sánh đạt gần 100% Chúng kết luận hai mẫu thuộc loài P multivesiculata dòng CBS545.96 - Đối chiếu với bảng danh mục loài Phytophthora có mặt Việt Nam ( A Drenth I Guest, 2004) chứng minh loài xuất Việt Nam kể từ năm 2004 40 Phần KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Kết giải trình tự cho ta số kết luận như: - Ứng dụng kỹ thuật PCR phát hai mẫu nấm tiêu Bà Rịa sầu riêng Đồng Nai thuộc giống Phytophthora chưa xác định rõ hai mẫu nấm địa lan - Kết giải trình tự hai mẫu nấm địa lan có cấu trúc trình tự gần giống Trình tự hai mẫu nấm sau so sánh ngân hàng gen cho kết gần với ba dòng nấm bao gồm P.multivesiculata, P multivesiculata CBS545.96 P syringae Kết thu phát sinh loài cho thấy hai mẫu nấm có trình tự tương đồng với dòng P multivesiculata CBS545.96 - So với bảng danh mục loài Phytophthora xuất Việt Nam A Drenth I Guest điều tra năm 2004 cho thấy loài nấm mặt bảng danh mục loài nấm Phytophthora gây bệnh Việt Nam 5.2 Đề nghị - Giải trình tự trực tiếp hai nấm Phytophthora tiêu Bà Rịa sầu riêng Đồng Nai - Tăng số lượng mẫu phân tích nhằm phát mức độ đa dạng loài nấm đối tượng - Áp dụng qui trình định danh cho nghiên cứu loài nấm loại lan Lâm Đồng 41 Phần TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trịnh Thị Phương Vy, 2005 Định danh nấm Phytopthora spp kỹ thuật PCR ( Polymerase Chain Reaction) kết hợp mô tả hình thái học Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005 Sinh học phân tử, giới thiệu phương pháp ứng dụng, NXB Nông Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh Tiếng Anh André Drenth David I Guest, 2004 Diversity and Management of Phytophthora in Southeast Asia, Australian Centre for International Agricultural Research Canberra James C Correll Genetic, Biochemical, Molecular Techniques for the Identification and Detection of Soilborne Plant-Pathogenic Fungi Alex A Appiad, Isaac Y Opoku Andrews Y Akrofi, 2004 Natural occurrence and distribution of stem cankers caused by Phytophthora palmivora on cocoa S.E Zitko L.W Timmer,1994 Competitive Parasitc Abilities of Phytophthora parasitica and P palmivora on Fibrous Roots of Citrus D Cooke, N Williams J M Duncan, The uses of ITS regions in Phytophthora species C Silvar, J M Duncan, D.E.L Cooke, N.A Williams, J Diaz F Merino, 2004 Development of specific PCR primers for identification and detection of Phytophthora capsici Leon T Wangsomboondee J.B Ristaino, 2002 Optimization of Sample Size and DNA Extraction Methods to Improve PCR Detection of Different Propagules of Phytophthora infestans 10 A Drenth J.A.G Irwin, 2001 Routine DNA based Diagnostic Test for Phytophthora 11 F Yamak, T.L Peever, G.G Grove, R.J Boal, 2002 Occurrence and Identification of Phtophthora spp Pathogenic to Pear Fruit in Irrigation Water in the Wenatchee River Valley of Washington State 42 12 Frank N Martin Paul W Tooley, 2004 Identification of Phtophthora to Species Level Using Restriction Fragment Length Polymophism Analysis of a Polymerase chain Reaction-Amplified Region of Mitochondrial DNA 13 P Chowdappa, D Brayford, J Smith J Flood, 2003 Molecular discrimination of Phytophthora isolates on cocoa and their relationship with coconut, black pepper and bell pepper isolates based on rDNA repeat and AFLP fingerprints, CURRENT SCIENCE, VOL 84, NO 14 C.M Brasier, D.E.L Cooke J.M Duncan, 1999 Origin of a new Phytophthora pathogen through interspecific hydridization 4 4 5 [...]... biến đổi cho nên các kỹ thuật định danh trước đây (chẳng hạn như kỹ thuật quan sát hình thái) không thể định danh được một số loài Ngày nay, dựa trên những tiến bộ khoa học kỹ thuật mà đặc biệt là những tiến bộ về các kỹ thuật sinh học phân tử ta có thể giải quyết những khó khăn trên Các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại với các kỹ thuật như: kỹ thuật PCR, kỹ thuật sử dụng enzyme cắt, kỹ thuật đọc trình... Phytophthora bằng các kỹ thuật sinh học phân tử 2 1.2 Mục đích – yêu cầu của đề tài 1.2.1 Mục đích của đề tài Định danh nấm Phytophthora. bằng các kỹ thuật sinh học phân tử Cụ thể là sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS4 và ITS5 để khuếch đại vùng ITS1 và ITS2 trong ribosomal DNA của nấm Phytophthora Sau đó dùng kỹ thuật đọc trình tự để định danh các mẫu nấm trên 1.2.2 Yêu cầu của đề tài - Tăng sinh, nhân sinh. .. cấu trúc phân tử DNA của các loài nấm từ đó cho phép việc định danh chúng một cách chính xác hơn Với sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học và được sự hướng dẫn của Tiến Sĩ Lê Đình Đôn, Kỹ Sư Trịnh Thị Phương Vy ( Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật- Khoa Nông Học) Chúng tôi đã thực hiện đề tài ” ĐỊNH DANH NẤM Phytophthora spp BẰNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ” nhằm hoàn thiện qui trình định danh nấm Phytophthora. .. sinh khối các mẫu nấm Phytophthora trên nhiều loại cây trồng ở một số vùng khác nhau - Phát hiện đoạn gen ITS1- 5,8S- ITS2 bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS4 và ITS5 - Sử dụng kỹ thuật đọc trình tự để định danh các mẫu nấm đã phân lập ở trên 1.2.3 Giới hạn của đề tài Đề tài chỉ thực hiện được trên các mẫu nấm phân lập được ở một số cây trồng thuộc vùng Đông Nam Bộ Do đó, đề tài chỉ định danh được ở... dứa do P.nicotianae 2.3 Phát hiện và định danh Phytophthora Hiện nay để phát hiện Phytophthora, người ta dựa trên nhiều kỹ thuật khác nhau 2.3.1 Kỹ thuật quan sát những đặc điểm về hình thái của Phytophthora trên môi trƣờng nuôi cấy Đây được xem là kỹ thuật định danh cơ bản bởi vì nó xuất hiện sớm và được sử dụng rộng rãi trong quá trình phân lập, định danh các loài nấm cũng như vi khuẩn gây bệnh Những... 2.1.3 Phân lập Phytophthora từ các bộ phận nhiễm bệnh của cây Các loài Phytophthora chỉ tấn công trên các bộ phận khỏe mạnh của cây bao gồm cả rễ Do đó, mầm bệnh có thể hiện diện khi không có dấu hiệu rõ ràng Các loài Phytophthora khó phân lập từ các mô hoại tử bởi vì các mô này thường che giấu nhiều mầm bệnh thứ cấp Sự phân lập thành công các loài Phytophthora từ mô bệnh bao gồm sự lựa chọn cẩn thận các. .. di truyền khác Kỹ thuật này được sử dụng như một kỹ thuật xác định sự đa dạng di truyền trong các loài nấm, đột biến dinh dưỡng – sinh trưỡng, đột biến nitrate- nonutilizing (nit ) 2.3.3 Kỹ thuật protein profile Điện di protein hòa tan trong ứng dụng ở cấp độ loài và dưới loài Kỹ thuật này bao gồm ly trích protein tổng số từ sợi nấm và bào tử đính., phân tách trên gel polyacrylamide bằng điện di, nhuộm... pháp: quan sát hình thái và sinh học phân tử Phương pháp sinh học phân tử dùng cho những nghiên cứu chi tiết, sử dụng PCRRFLP phân tích đoạn gen ITS1-5,8S-ITS2 trên vùng ITS thuộc DNA ribosome của 180 dòng phân lập Phân tích trình tự trên ITS2 cho 50 dòng phân lập được dùng cho điều tra mối quan hệ giữa sự thay đổi di truyền và sự phát sinh loài giữa các loài phân lập Dòng phân lập được chia làm 12 nhóm... thuật hiện đại về sinh hoá hay sinh học phân tử Chúng tôi xin giới thiệu một số kỹ thuật phổ biến nhằm phát hiện và định danh một số giống nấm gây bệnh thường gặp (James C Correll Genetic, Biochemical, and Molecular Techniques for the Identification and Detection of Soilborne Plant-Pathogenic Fungi) 2.3.2 So sánh sự tƣơng đồng về sinh sản và sinh dƣỡng Kỹ thuật so sánh tính tương đồng về sinh sản thường... vùng này có giá trị thay đổi giữa các loài nấm và do đó có thể xác định mối quan hệ giữa các loài (Bruns và cộng sự, 1992) Kỹ thuật này rất có giá trị bởi tính tiến hóa ở mức độ cao của các loài và các chủng có thể được so sánh PCR rất có giá trị trong việc xác định ở mức độ loài và chủng Nó phù hợp để xác đinh các nhóm, các chủng đặc biệt Gần đây, kỹ thuật khuếch đại các đoạn đa hình RAPD (Randomly