Các phương pháp xác định tính và định lượng saponin bằng quang phổ UV vis

Saponin còn gọi là Saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. Saponin cũng có trong một số động vật như hải sâm, cá sao. Saponin gồm các chất vô định hình thường là cao phân tử .Tiền tố latinh sapo có nghĩa là xà phòng và thực tế thường gặp từ saponification có nghĩa là sự xà phòng hóa trong cả tiếng Anh và tiếng Pháp.

Mục Lục 4

18

18

Saponin và phương pháp xác định Saponin tổng số

Phần I : Saponin- Tính chất, Cấu tạo và Phân loại

I) Saponin-Nguồn gốc và tính chất đặc trưng

1) Định nghĩa : Saponin còn gọi là Saponosid là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi

trong thực vật Saponin cũng có trong một số động vật như hải sâm, cá sao Saponin gồm các chất vô định hình thường là cao phân tử Tiền tố latinh sapo có nghĩa là xà phòng và thực tế thường gặp từ "saponification" có nghĩa là sự xà phòng hóa trong cả tiếng

Anh và tiếng Pháp

Dưới tác dụng của enzym có trong thực vật hay vi khuẩn hoặc do axít loãng, Saponin bị thuỷ phân thành các phần gồm genin gọi là Sapogenin (aglycone ) và phần đường (glycone) gồm một hoặc nhiều phân tử đường Các đường phổ biến là D-glucoza, D-galactoza, L-arabinoza, axít galactunoic, axít D-glucuronic Phần genin có thể có cấu trúc cholan như sapogeninsteroi hoặc Sapogenintritecpen dạng β-amirin (axít olenoic), dạng α-amirin (axít asiatic), dạng lupol (axit buletinie) hoặc tritecpen bốn vòng

2) Sự phân bố trong thực vật: Saponin Steroid thường gặp trong những cây một lá mầm Các họ hay gặp là: Amaryllidaceae, Dioscoreaceae, Liliaceae, Smilacaceae Ðáng chú

ý nhất là một số loài thuộc chi Dioscorea L.; Agave L.; Yucca L

Saponin Triterpenoid thường gặp trong những cây 2 lá mầm thuộc các họ như:

Acanthaceae, Amaranthaceae, Araliaceae, Campanulaceae, Caryophyll-aceae, Fabaceae, Polygalaceae, Rubiaceae, Sapindaceae, Sapotaceae

Trong cây saponin thường tích lũy ở những bộ phận khác nhau: tích lũy ở quả như bồ kết,

bồ hòn; rễ như cam thảo, viễn chí, cát cánh; lá như dứa Mỹ

3)Tính chất vậy lý của Saponin:

Saponin là Glucosid với các đặc tính tạo bọt bởi sự kết hợp của Sapogenin (phần kị nướctan trong chất béo ) và phần đường tan trong nước

Saponin đa số có vị đắng ngoại trừ một số như Glycyrrhizin có trong cam thảo bắc, Abrusosid trong cam thảo dây, Oslandin trong cây Polypodium vulgare có vị ngọt.Saponin tan trong nước, Alcol, rất ít tan trong Aceton, Ether, hexan do đó người ta dùng ba dung môinày để tủa saponin Saponin có thể bị tủa bởi chì Acetat, Bari Hydroxyd, Ammoni Sulfat Saponin khó bị thẩm tích, người ta dựa vào tính chất này để tinh chế Saponin trong quá trìnhchiết xuất Phần genin tức là sapogenin và dẫn chất Acetyl Sapogenin thường dễ kết tinh hơn Saponin

Saponin gồm các chất vô định hình thường có cao phân tử Độ tan của saponin cũng bị ảnh hưởng bởi các tính chất của dung môi (như bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, thành phần, và pH), trong đó nước và cồn (methanol, ethanol) là dung môi trích Saponin phổ biến nhất.) Các

saponin đều là các chất hoạt quang Thường các Steroit saponin thì tả truyền còn Triterpenoit Saponin thì hữu truyền Điểm nóng chảy của các Sapogenin thường rất cao.

4.Một số tính chất đặc biệt của Saponin:

- Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi hòa tan vào nước, có tác dụng nhũ hoá và tẩysạch

- Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng

- Ðộc với động vật máu lạnh đặc biệt là vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hôhấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên

- Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt,có tác dụng lomg đờm, lợi tiểu, liều cao gây nôn mửa, đi lỏng

_Có thể tạo phứa với Cholesterol hoặc các chá 3--hydroxysteroid khác

_Tuy vậy một vài tính chất trên không thể hiện ở một vài saponin.Ví dụ: sarsaparillosid thì không có tính phá huyết cũng như tính tạo phức với cholesterol

II) Phân loại Saponin: Các saponin có thể được phân loại như steroid, triterpenoidal hoặc

ancaloit tùy thuộc vào bản chất của các aglycone Dựa theo cấu trúc hoá học có thể chia ra:

 Saponin Triterpenoid : Gồm loại trung tính và loại acid

 Saponin Steroid : Gồm loại trung tính và loại kiềm ( có Nito hay còn gọi là Ankaloid Saponin )

Cấu trúc hóa học:

1) Saponin Triterpenoid: Phần genin của loại này có 30 Carbon cấu tạo bởi 6 nhóm

Hemiterpen, được chia làm 2 loại là

 Saponin triterpenoid pentacyclic

 Saponin triterpenoid tetracyclic

1.1) Saponin Triterpennoid pentacyclic : Gồm các nhóm Olean, Ursan, Lupan, Hopan 1.1.a) Nhóm Olean: Phần lớn các Saponin Triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm này.

Phần aglycon có 5 vòng và thường là dẫn chất của 3 hydroxy olean 12 ene, tức là  amyrin (A)

-Vd: Một vài aglycon

- Acid oleanolic: R1 = R2 = R4 = R5 = - CH3, R3 = -COOH

- Hederagenin: R2 = R4 = R5 = -CH3, R1 = - CH2OH , R3 = -COOH

- Gypsogenin: R2 = R4 = R5 =- CH3, R1 = -CHO , R3 = -COOH

Mạch đường có thể nối vào C-3 theo dây nối acetal, có khi mạch đường nối vào C-28 theo dây nối ester Gần đây người ta phân lập được các saponin có đến 10-11 đơn vị đường nếu kể cả 2 mạch, riêng một mạch có thể đến 6 đơn vị đường

1.1.b) Nhóm Ursan : Cấu trúc của nhóm ursan cũng tương tự như nhóm olean chỉ khác

là nhóm methyl ở C-30 không đính vào vị trí C-20 mà lại đính ở vị trí C-19 Các sapogenin nhóm ursan thường là những dẫn chất của 3- hydroxy ursan 12-ene, tức là α-amyrin Những Saponin của nhóm này ít gặp hơn nhóm olean Cinchona glycosid A, Cinchona glycosid B có trong cây canh-ki-na, Asiaticosid có trong rau má là những Saponin của nhómnày

1.1.c) Nhóm Lupan: Cấu trúc của nhóm lupan có các vòng A,B,C,D giống như các

nhóm trên, chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-20 ở ngoài vòng và thường có nối đôi ở vị trí

20-29 Lấy một ví dụ là saponin có trong rễ cây Ô rô Acanthus iliciformis Một số saponin

có trong cây ngũ gia bì chân chim cũng thuộc nhóm này

1.1.d) Nhóm Hopan: Cấu trúc của nhóm hopan có các vòng A,B,C,D giống như các

nhóm trên, chỉ khác vòng E là vòng 5 cạnh, C-22 ở ngoài vòng và nhóm methyl góc đính ở C-18 thay vì ở C-17 Saponin đầu tiên được biết là chất mollugocin A có trong cỏ

thảm Mollugo hirta L.

1.2) Saponin Triterpenoid Tetracyclic: Gồm 3 nhóm chính là Dammaran,

Lanostan, Cucurbitan.

1.2.a) Nhóm Dammaran : Ðại diện là các saponin của nhân sâm Phần aglycon gồm

bốn vòng và một mạch nhánh Khi tác dụng bởi acid thì mạch nhánh đóng vòng tạo thành vòng tetrahydropyran Bằng các phương pháp đặc biệt để cắt phần đường, người ta đã thu được các genin thật Hai genin chính là: protopanaxadiol và protopanaxatriol

Phần đường nối vào OH ở cabon số 3 hoặc có khi thêm 1 mạch nữa nối vào OH ở mạch nhánh

Saponin triterpenoid tetracyclic nhóm damaran còn gặp trong hạt táo (Ziziphus

jujuba Mill.), rau đắng biển (Bacopa monnieri (L.) Wettst.

1.2.b) Nhóm Lanostan: Holothurin A, một trong những saponin có trong các loài hải

sâm - Holothuria spp là một ví dụ của nhóm này

Một nhóm phụ của nhóm Lanostan là nhóm Cycloartan có cấu trúc 9,19 cyclo (9)

lanostan Các Saponin Abrusosid A, B, C, D có trong cam thảo dây Abrus precatorius là

những saponin thuộc nhóm này

1.2.c) Nhóm Cucurbitan : Phần lớn các saponin nhóm Cucurbitan gặp

tronghọ Cucurbitaceae Ở đây nhóm CH3 ở C19 không đính vào C10 mà thay vào đó lại đính ở C9

2 Saponin Steroid: Gồm một số nhóm như Spirostan, Furostan, Aminofurostan,

_Đặc điểm chung : Những chất này có 27 carbon như cholesterol nhưng mạch nhánh từ

C20 tới C27 tạo thành 2 vòng có oxy (16,22 và 22,26 diepoxy ), một vòng là hydrosfuran (vòng E) và một vòng là hydropyran (vòng F) Hai vòng này nối với nhau bởi 1 carbon

chung ở C-22 Mạch nhánh này được gọi là mạch nhánh Spiroacetal Ba chất trên là 3 đồng

phân

 Sarsasapogenin và Smilagenin thì khác nhau do cấu hình ở C-25

Sarsasapogenin có nhóm methyl ở C-25 hướng axial có cấu hình tuyệt đối 25S, Smilagenin

thì nhóm methyl ở C-25 hướng equatorial có cấu hình tuyệt đối 25R

Các Saponin nhóm này có nối vòng C và D trans (khác với glycosid tim) Còn vòng A và

B có thể là cis như ở chất Sarsasapogenin và Smilagenin hoặc có thể là trans như ở chất Tigogenin.

 Smilagenin và Tigogenin khác nhau do cấu hình ở C-5.

Công thức lập thể của 3 chất Sarsasapogenin, Smilagenin và Tigogenin: Nhóm OH ở

C3 thường hướng , một số hướng α ví dụ các saponin của tỳ giải Ở dạng glycosid phần đường được nối vào OH ở C-3, một số ít trường hợp ở C1 Mạch đường thường phân nhánh

2.2) Nhóm Furostan :

Đặc điểm chung : Nhóm này có cấu trúc tương tự như nhóm Spirostan chỉ khác là vòng

F bị biến đổi.Có hai trường hợp :_Trường hợp thứ nhất: vòng F mở và nhóm alcol bậc một

ở C-26 được nối với đường glucose Nếu glucose ở C-26 bị cắt (bởi enzym hoặc bởi acid) thì xảy ra sự đóng vòng F thành vòng hydropyran và chuyển thành dẫn chất nhóm

Spirostan.

Ví dụ Sarsaparillosid dưới tác dụng của enzym thủy phân cắt mạch glucose ở C-26 sẽ chuyển thành Parillin.

Trường hợp thứ hai: vòng F là vòng 5 cạnh do sự đóng vòng 22-25 epoxy ví dụ

Avenacosid có trong yến mạch (Avena L Họ Lúa - Poaceae) Avenacosid A cũng có 2

mạch đường Khi thủy phân cắt đường glucose ở C-26 thì cũng chuyển thành dẫn chất

nhóm Spirostan Sarsaparilosid và Avenacosid A đều có 2 mạch đường Người ta gọi đây

là các bidesmosid (desmos = mạch)

2.3) Nhóm Aminofurostan: Ở đây vòng F mở như trường hợp sarsaparillosid nói ở trên

nhưng ở vị trí C-3 đính nhóm NH2 Ví dụ jurubin, là saponin có trong Solanum

paniculatum.

2.4) Nhóm Spirosolan: Nhóm này chỉ khác nhóm spirostan ở nguyên tử oxy của vòng F

được thay bằng NH Một điểm cần chú ý là ở đây có Isomer ở C-22 (khác với nhóm

spirostan) Ví dụ Solasonin có trong cây cà Úc (cà lá xẻ ) Solanum laciniatum có cấu

trúc (25R) 22α còn tomatin là các saponin có trong cây cà chua thì có cấu trúc (25S) 22

2.5) Nhóm Solanidan: Solanin có trong mầm khoai tây thuộc nhóm này Ở đây 2 vòng E

và F cùng chung 1C và 1N

Những chất thuộc 3 nhóm Aminofurostan, Spirosolan và Solanidan đều có chứa N vừa mang tính alcaloid vừa mang tính glycosid nên được gọi là những chất Glycoalcaloid 2.6) Ngoài những nhóm Saponin Steroid kể trên người ta còn gặp một số saponin steroid

có cấu trúc mạch nhánh khác : Ví dụ Polypodosaponin và Oslandin được Jizba phân lập

(1971) từ thân rễ cây Polypodium vulgare L Oslandin là một bidesmosid có vị ngọt

α-Spinasterol glycosid có trong cây chè Camelia sinensis (L.) O K.tze (Thea sinensis L.).

III) Một số loại saponin quan trọng và tác dụng :

1) Một số loại Saponin quan trọng:

Saponin Ro: Có khả năng phân giải rượu, chống viêm gan, phục hồi hư tổn gan

Saponin Rb1: Kiềm chế hệ thống thần kinh trung ương, làm dịu cơn đau, bảo vệ tế bào gan.Saponin Rb2: Chống bệnh tiểu đường, chống xơ cứng gan, đẩy nhanh khả năng hấp thụ của

tế bào gan

Saponin Rc: Giúp làm dịu cơn đau, làm tăng tốc độ tổng hợp protein

Saponin Rd: Đẩy nhanh hoạt động của vỏ tuyến thượng thận

Saponin Re: Bảo vệ gan, làm tăng tốc độ tổng hợp của các tế bào tủy

Saponin Rf: Giúp làm dịu cơn đau trong các tế bào não

Saponin Rg1: Giúp tập trung, chống mệt mỏi

Saponin Rg2: Hạn chế sự gắn kết các tiểu cầu máu, phụ hồi trí nhớ

Saponin Rh1: Bảo vệ gan, chống khối u, hạn chế gắn kết tiểu cầu máu

Saponin Rh2: Hạn chế ung thư phát triển, hạn chế khối u phát triển

2) Tác dụng, công dụng của một số Saponin

- Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho, là hoạt chất chính trong các dược liệu chữa ho như viễn chí, cát cánh, cam thảo, thiên môn, mạch môn

- Một số dược liệu chứa Saponin có tác dụng thông tiểu như rau má, tỳ giải, thiên môn, mạch môn,

- Saponin có mặt trong một số vị thuốc bổ như nhân sâm, tam thất và một số cây thuộc họ nhân sâm khác

- Saponin làm tăng sự thấm của tế bào; sự có mặt của saponin sẽ làm cho các hoạt chất khác

dễ hoà tan và hấp thu, ví dụ trường hợp digitonin trong lá Digital

- Một số Saponin có tác dụng chống viêm Một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus

- Một số có tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm

- Nhiều saponin có tác dụng diệt các loài thân mềm (nhuyễn thể)

- Sapogenin Steroid dùng làm nguyên liệu để bán tổng hợp các thuốc steroid

- Digitonin dùng để định lượng cholesterol

- Một số nguyên liệu chứa saponin dùng để pha nước gội đầu, giặt len dạ, tơ lụa

Một số saponin tăng cường khả năng hấp thụ thức ăn của động vật không nhi lại thì số khác rất có hại

Ví dụ: Saponin tìm thấy trong yến mạch và rau bina tăng và thúc đẩy khả năng của cơ thể

để hấp thụ canxi và silicon, do đó hỗ trợ tiêu hóa Một số cỏ dại cỏ chứa một lượng đáng kể các saponin nguy hiểm và kết quả trong cuộc sống đe dọa độc tính đối với các loài động vật nào đó

Phần II : Phương pháp xác định Saponin tồng số_ Phương pháp quang phổ

Có nhiều phương pháp xác định Saponin song phần trình bày của nhóm chỉ đề cập đến phương pháp quang phổ

I) Tổng quan về phương pháp quang phổ

Phương pháp quang phổ đã trở thành một phương pháp phổ biến trong việc định lượng Saponin

từ nguyên liệu thực vật và có thể cả động vật bởi vì nó đơn giản, nhanh chóng và không tốn kém để thực hiện.

1) Cách xử lí mẫu phân tích: Để đánh giá saponin tổng số có thể thực hiện bằng một

thao tác đơn giản để kiểm tra sự có mặt của Saponin Điều này có thể được thực hiện bằngcách đặt các nguyên liệu thực, động vật vào một ống nghiệm chứa đầy nước cất và lắc mạnhtrong 2 phút( Ncube et al, 2011) Sự xuất hiện của bọt ổn định và liên tục trên bề mặt chấtlỏng trong 15 phút chỉ ra sự có mặt của các Saponin Định lượng Saponin thường được thựchiện bởi phương pháp quang phổ và phương pháp sắc ký Sự khác biệt giữa hai phươngpháp này là phương pháp quang phổ cho biết tổng giá trị Saponin trong khi phương pháp sắc

ký định lượng hợp chất Saponin cụ thể

2) Hóa chất : Phương pháp khảo nghiệm xác định saponin tổng số,Vanillin-acid Sulfuric

là lựa chọn phổ biến nhất trong phương pháp định lượng Saponin trong máy quang phổ Tuynhiên có vài yếu tố, chẳng hạn như lựa chọn các tiêu chuẩn, bước sóng và những yếu tố kháccần được xem xét trước khi sử dụng phương pháp này

3) Nguyên tắc thực hiện: Các nhuyên tắc cơ bản của phương pháp này là các phản ứng

oxy hóa giữa Saponin Triterpene với vanillin( Li et al, 2010) Axit sunfuric được sử dụngnhư là chất oxy hóa và màu sắc đặc trưng của phản ứng là màu tím ( Hiai, Oura, &Hakajima, 1976) và đôi khi axit Pecloric được sử dụng( Chen, Xie et al, 2007; Li, Zu et al,2010; Wu et al, 2001)

Do sự khác biệt trong việc lựa chọn thuốc thử, điều kiện để cho thuốc thử phát triển đầy

đủ màu sắc, tiêu chuẩn và các bước sóng từ các nghiên cứu trước đó như đã, thật khó để sosánh các kết quả trong mỗi lần kiểm định.Tuy nhiên nó cung cấp tài liệu tham khảo tốt chothiết kế thử nghiệm trong tương lai

II) Một số phương pháp quang phổ trong xác định Saponin tổng số

1) Phương pháp UV-Quang phổ : Đây là phương pháp được áp dụng rộng rãi nhất Quang phổ UV / VIS Ultraviolet : Phân tích Saponin trong vùng ánh sáng khả kiến

1.1) Hoá chất sử dụng : Trong phương pháp hóa chất được dùng là một hỗn hợp

củaVanillin và Acid Acetic được sử dụng có thể dùng acid H2SO4 thay thế Vanillindễ dàng

1.2)Nguyên tắc thực hiện: Hai công trình (Patel et al., 2012a và Ncube et al., 2011) đã

được tìm thấy bằng cách sử dụng các điều kiện 60°C và 10 phút để cho hỗn hợp có sự phát triển đầy đủ màu sắc theo một thủ tục trong Hiai et al (1976) Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu khác sử dụng 70 ° C trong 15 phút (Chen et al., 2007b) và 20 phút (Li et al., 2010b) cho phép phát triển đầy đủ màu sắc Sự khác biệt này cần được chuẩn hóa, vì thời gian phản ứng

có thể gán trực tiếp với giá trị độ hấp thụ thực mà sau đó chuyển vào số lượng

1.3) Cách tiến hành: Phương pháp tổng Saponin là để định lượng tổng số saponin từ

phản ứng của Triterpene oxy hóa Saponin với Vanillin (Li et al., 2010b), nhưng không tránhkhỏi đặt câu hỏi liệu việc lựa chọn tiêu chuẩn để được sử dụng trong máy quang phổ là điềucần thiết để thể hiện các nhóm saponin chính xác từ các nguồn thực vật Thật không may,các thông tin có liên quan về việc lựa chọn các tiêu chuẩn là hiếm được tìm thấy Không giảithích được ghi trong tác phẩm trước đây về việc lựa chọn bước sóng, nhưng hầu hết cácnghiên cứu lựa chọn bước sóng 544 nm được quan sát Tuy nhiên, các bước sóng được chọnnằm trong khoảng 480-610 nm, trừ 473 nm (Mostafa et al., 2013) và 283 nm (Liu et al.,2012b), có lẽ là do sự hấp thụ tối đa của màu tím nằm trong phạm vi này (Bruice, 2007)

1.4) Lưu ý : Để đảm bảo rằng các điều kiện thích hợp, điều quan trọng là dung dịch acid

Aanillinacetic phải được tạo thành trong cùng một ngày tiến hành đo đã được sử dụng

nguyên nhân docơ chế của acid Acetic-vanillin, acid Percloric làm mất nước với các nhóm Hydroxyldo đó làm tăng số lượng liên kết đôi trong hệ thống liên hợp

1.5) Phương pháp quang phổ UV/vis với một số mẫu thực vật

phép phát triển đầyđủ màu sắc

Điều kiện làm mát trước khí UV/vis đo lường

Tiêu chuẩn sử dụng

Bước sóng được chọn (nm)

70 o C,15 phút

Chạy nước, 2 phút

Axit oleanolic

sử dụng cao nhất MAE)

Củ khoai mì

Ipomoea 0,5 ml 8%vanillin trong

ethanol+ 5ml dungdịch axit sulfuric 72%

70 o C, 20 phút

Chạy nước, 2 phút

Axit oleanolic

quang phổ Unico 2100( shan ghai Unico Equipment Co.Ltd.

Các thông số khai thác lò vi sóng hỗ trợ tối ưu ở 51 O C,

7 phút, 900W, 52 ml/g, ethanol 42%

và 3 quá trình chiết saponin mang lại