cac phuong phap tach chiet (1)

CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA VÀ RNA DNA chứa thông tin di truyền sinh vật Do nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử bắt đầu việc thu nhận lượng nucleic acid (NA) đủ lớn đủ tinh để tiến hành thí nghiệm DNA gồm loại: DNA gen, DNA ty thể, DNA lục lạp, DNA plasmid, DNA phage Tuỳ kích thước DNA, loại tế bào mà chọn phương pháp tách chiết khác để đảm bảo chiết DNA tinh khiết có hiệu suất cao Mối quan tâm hàng đầu kĩ thuật tách chiết NA thu nhận phân tử trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân huỷ tác nhân học (phân tử bị gẫy nghiền, lắc mạnh) hay hoá học (phân tử bị thuỷ giải enzyme nội bào giải phóng môi trường tế bào bị phá vỡ) Các NA cần tách chiết điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động enzyme nội bào (DNase, RNase) A.Dụng cụ hoá chất: A.1 Dụng cụ: Eppendorf: ống đựng nhỏ nhựa polyethylen hay polypropylen chịu nhiệt độ khử trùng (1atm, 121oC, 20 phút), nhiệt độ thấp (-20oC) số dung môi hữu cơ, thường có dung tích 0.2, 0.3, 0.5, 1.5, 2ml (hãng Eppendorf, hãng BioRad…) Micropipet (pipetman): loại pipet chỉnh thể tích cần lấy dùng để hút dung dịch thể tích nhỏ, độ xác cao Micropipet có nhiều cỡ: -1- Loại Micropipet 0.1->1, 1->10 10->100, 10->200 100->1000 Đầu tip tương ứng 0.1->10 (màu trắng) 10->200 (màu vàng) 100->1000 (màu xanh) Cấu tạo micropipet thay đổi tuỳ theo kiểu thiết kế nhìn chung gồm: cần bơm, ngàm tựa, phận đẩy tip, phận điều chỉnh thể tích, số thể tích chọn, đầu hút (nơi gắn tip) Khi sử dụng cần ý: - Phải gắn chặt tip vào đầu hút không bị mắc sai số - Không để pipet tiếp xúc với dung môi hữu cơ, hoá chất - Không để pipet gần đèn cồn - Không điều chỉnh ngưỡng thể tích tối thiểu ngưỡng thể tích tối đa - Các đầu tip cần cho vào hộp giá (rack), đậy nắp hấp cao áp tiệt trùng sử dụng lần để tránh tạp nhiễm A.2 Trang thiết bị thông dụng: Bồn ủ nhiệt, tủ định ôn: sử dụng phản ứng cần nhiệt độ ổn định thường có phận điều chỉnh nhiệt độ, cài đặt thời gian Tủ hút khí độc: dùng thí nghiệm có hóa chất bay độc như: phenol, chloroform, ethidium bromide… Tủ cấy vô trùng: phản ứng cần có vô trùng Tủ phải giữ sử dụng sạch, khử trùng bề mặt cồn, trước sau -2- sử dụng tủ cần (UV) 15 phút trùng bên đèn tử ngoại Nồi hấp tiệt trùng: dùng để khử trùng hoá chất dụng cụ cần thiết Tủ lạnh: gồm có tủ mát tủ âm sâu (-20oC -70oC) dùng để bảo quản hoá chất, mẫu Máy đo PH: dùng xác định pH dung dịch Máy Vortex: dùng để đồng hoá mẫu dung dịch Máy ly tâm (centrifuge): dùng để phân tách thu nhận phần tử khác dung dịch Khi sử dụng khối lượng mẫu phải đồng đặt đối xứng qua trục máy Chỉ mở nắp máy ngưng hoàn toàn Nguyên tắc: phần tử khác dung dịch lắng với vận tốc khác chịu tác động lực li tâm Tuỳ thuộc vào khối lượng tỉ trọng phân tử vật chất mà ngưới ta chia làm loại ly tâm: Ly tâm phân đoạn: dùng phân tách phần tử vật chất khác dựa vào khối lượng chúng Vận tốc lắng phần tử phụ thuộc vào lực ly tâm, khối lượng, tỷ trọng lực ma sát phần tử với dung dịch ly tâm Để phân tách -3- thành công phân tử có dung dịch cần phải có lực ly tâm thời gian ly tâm thích hợp Ly tâm đẳng tỷ trọng: phân tách phần tử vật chất dựa vào tỷ trọng chúng Phương pháp hiệu quả, cho phân đoạn phân tách khiết Ống ly tâm chứa cột dung dịch có tỷ trọng tăng dần từ xuống đáy ống tạo nên gradient tỉ trọng Các phần tử lắng trình ly tâm nằm vùng dung dịch có tỷ trọng tương đương với Saccharose Glycerol dùng phân tách bào quan, Cesium chloride (CsCl) dùng để phân tách protein NA A.3 Hoá chất: Những điều cần ý: - Tất dung dịch hoá chất nước cần phải tiệt trùng nồi hấp lọc qua màng lọc vi khuẩn Nếu cần nên bảo quản đông lạnh vi khuẩn nấm phát triển nguyên nhân phát sinh nuclease (tuỳ theo khuyến cáo mà hoá chất bảo quản nhiệt độ phòng, tủ lạnh (4oC) hay tủ âm sâu (-20oC) - Để đề phòng tạp nhiễm nguyên liệu dung dịch hoá chất nên sử dụng đầu pipet ống nghiệm lần vứt bỏ - Hoá chất dạng dung dịch bảo quản dạng kéo dài lặp lặp lại việc giải đông thường biến tính Vì vậy, nên chia thành lượng nhỏ sử dụng hết một, hai ba lần bào quản -20oC -70oC Ví dụ dithiothreitol,… - Người thao tác phải mang găng tay tiếp xúc bình đựng hoá chất - Một vài dung dịch đệm sử dụng thí nghiệm với thành phần có dung dịch với nồng độ khác nhau, cần phải chuẩn bị dung dịch gốc đậm đặc để pha loãng cần -4- Dung dịch gốc: - Tris-HCl 1M (pH 7.5): hoà tan 121.1g nước cất Thêm nước để lít dung dịch Điều chỉnh pH đến 7.5, phân phối vào lọ hấp khử trùng Chú ý: màu dung dịch chuyển sang màu vàng ta nên bỏ chuẩn bị hoá chất - NaCl 5M: hoà tan 292.2g NaCl nước cất thêm nước để lit dung dịch Phân phối vào lọ hấp khử trùng - EDTA 0.5M (Ethylene diamin tetra acetat (pH 8.0): hoà tan 186.1g EDTA.2H2O vào nước cất, vừa khuấy từ vừa thêm NaOH tinh thể để điều chỉnh pH đến 8.0 thêm nước để lít dung dịch Phân phối vào lọ hấp khử trùng Chú ý: EDTA không hoà tan vào dung dịch pH không đạt mức 8.0 - SDS 10% (Sodium dodecyl sulfate): hoà tan 100g SDS nước cất Nung nóng đến 68oC để hoà tan dung dịch Điều chỉnh pH đến 7.2 cách thêm HCl Thêm nước để lít dung dịch Chú ý: sử dụng trang cân SDS dọn dẹp khu vực cân với cân sau sử dụng tinh thể SDS khuếch tán dễ dàng Không cần phải khử trùng SDS 10% - NaOH 10N: hoà tan 200gNaOH 500 ml nước cất Bảo quản lọ chất dẻo - Sodium acetate 3M (pH 5.2): hoà tan 81.62g trisodium acetate vào 200 ml nước cất Dung dịch có pH 5.2 - Kalium acetate 5M pH 4.8: lấy 29.5 ml acid acetic băng, thêm KOH đậm đặc để chỉnh đến pH 4.8, thêm nước vừa đủ 100 ml Không hấp tiệt trùng, bảo quản nhiệt độ phòng - Sarkosyl 20%(w/v) (N-lauroysarkosyl): hoà tan 20g N- lauroysackosyl nứơc cất (tăng nhiệt độ để giúp hoà tan) Thêm nước đến 100ml hấp khử trùng bảo quản nhiệt độ phòng Dung dịch có màu vàng nhạt -RNase 10mg/ml: hoà tan 10mg/ml RNase TE, đun sôi 10 để diệt DNase Chia thành thánh phần nhỏ bảo quản -20oC -5- - Phenol đệm: • Đun khoảng 100g phenol (tinh khiết, mới) bếp cách thuỷ 65oC cho chảy Rót thận trọng phenol chảy vào becher 250ml có chứa sẵn 100mg • 8-hydroxyquinoline, thêm 100ml Tris-base 50mM (không chỉnh pH) • Đậy giấy nhôm, khuấy nhẹ máy khuấy từ khoảng 10 phút nhiệt độ phòng Để yên cho phân lớp Loại bỏ pha (pha nước, lưu ý pha hữu chứa phenol có màu vàng) nhiều tốt • Thêm 500ml Tris-HCl 50mM, pH 8, lặp lại bước đến pha phenol đạt đến pH (đo giấy) • Thêm 100 ml Tris-HCl 50mM, pH đệm TE • Bảo quản 4oC tháng chai nâu hay chai bọc giấy nhôm • Sử dụng: trộn với chloroform với tỷ lệ 1/1 với chloroform –iso amyl alcol theo tỷ lệ 25/24/1 • Chú ý: phenol chloroform có tính độc Cần mang bao tay tránh hít bay Phenol dễ cháy làm da tay Cần giữ lại tất dụng cụ có dính phenol vứt bỏ an toàn - Ethidium bromide 1000X (5mg/ml): 0.1 g Ethidium bromide 20 ml nước cất Bảo quản nhiệt độ phòng lọ bọc giấy nhôm để tránh ánh sáng Chú ý: hoá chất độc gây ung thư Phải mang găng tay thao tác pha chế tủ hút khí độc Bảo quản nhiệt độ phòng - Lysozyme: 20mg/ml nước cất Lọc tiệt trùng chia thành phần nhỏ (250ul), bảo quản -20oC - Protein K 20mg/ml Pha dung dịch mẹ 20mg/ml dung dịch gồm Tris-HCl pH7.5 10mM NaCl 10mM B Nguyên tắc chung: Quá trình tách chiết DNA trải qua giai đoạn: -6- Giai đoạn 1: phá vỡ tế bào phương pháp vật lí hay hóa học Tuỳ loại tế bào, có cấu tạo thành và màng tế bào khác nhau, chọn phương pháp áp dụng thích hợp, riêng lẽ hay phối hợp Ví dụ: tế bào thực vật thường ta nghiền tế bào nitơ lỏng để phá vỡ vách tế bào dùng chất tẩy để phá màng tế bào Còn tế bào vi khuẩn người ta thường dùng lyzozyme EDTA để phân giải màng Giai đoạn 2: loại bỏ thành phần không mong muốn mẫu (protein, lipit, polysaccharide…) chủ yếu protein Mẫu lắc thật mạnh dung dịch phenol phenol/chloroform (1:1) sau chloroform chloroform-isoamyl alcolhol (24:1) Dung dịch có tác dụng làm biến tính protein, đồng thời không hoà tan NA sau ly tâm protein tủa thành lớp nằm pha nước có chứa NA pha phenol/chloroform Pha nước có chứa NA thu nhận lại Chiết xuất phenol: Nguyên lý việc sử dụng phenol chiết suất DNA sau: - Tuy nhiệt độ thường phenol dạng tinh thể rắn (tan chảy 80oC) lẫn với 20% nước (v/v) phenol dạng nhũ tương gồm phân tử phenol phân tử nước vây quanh - Khi pha hỗn hợp với dịch tế bào, phân tử phenol có tính kị thuỷ nên có khuynh hướng liên kết vào vùng kị thuỷ protein bên cấu trúc phân tử này, kết cục làm protein trương phồng lên lộ xuất nhóm bên kị thuỷ (của gốc amino acid) Các nhóm kị thuỷ protein kết hợp -7- với tạo thành búi kết tủa gồm nhiều phân tử protein khác Trong DNA chất tan nước hút sang ống chứa khác Phenol có ưu điểm tan nước (ở mức độ định) nên không cần khuấy trộn nhiều làm biến tính protein (vì khuấy trộn nhiều làm đứt gẫy DNA) Trong sử dụng chloroform chloroform-isoamyl alcolhol phải trộn đảo kĩ chất không tan nước Tuy nhiên nhiều lúc cần phải loại bỏ hoàn toàn phenol khỏi dung dịch, cần phải lặp lại việc chiết xuất chloroform ether Sử dụng hai loại dung môi hữu thường cho hiệu cao Pha thêm chloroform vào phenol làm tính kị thuỷ phenol tăng lên làm tăng hiệu biến tính protein Giai đoạn 3: tủa NA Mục đích việc tủa nhằm thu nhận NA dạng cô đặc, mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi phân huỷ enzyme, mặt khác để hoà tan chúng lại dung dịch theo nồng độ mong muốn Hai cách tủa thông dụng là: Tủa ethanol: việc tủa thực môi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao), nồng độ ethanol cao (2.5:1), nhiệt độ thấp tạo thuận lợi cho việc tủa Hầu toàn NA tủa điều kiện nêu Tủa isopropanol: điểm khác biệt so với phương pháp tủa ethanol không cần diện muối (1:1) Các phân tử DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị tủa, chúng bị loại Trong hai phương pháp, NA thu nhận lại li tâm Sau cặn tủa phải ethanol 70% để loại bỏ muối dấu vết isopropanol dính lại mẫu Tiếp theo hoà tan nước khử ion dung dịch đệm để bảo quản Kết tủa ethanol: - Cho 2.5 lần ethanol vào dung dịch DNA có chứa sodium acetate NaCl nồng độ 0.2M trở lên, trộn cho vào buồng lạnh -20 -70oC để kết tủa Có thể thay NaCl sodium phosphate với lượng nhỏ kết tủa DNA.Tuy nhiên dùng muối cần phải thẩm tích để loại bỏ muối -8- - Duy trì nhiệt độ thấp (khoảng 10-15 phút -70oC, khoảng 1-12giờ -20oC - Quay ly tâm 15 phút 4oC với tốc độ 15000 v/ph để tâp trung kết tủa Trước ly tâm thấy kết tủa trắng ống nghiệm, cần ly tâm nhẹ 3000 v/ph 4oC vòng 10phút đủ tập trung kết tủa Thậm chí dùng móc thuỷ tinh móc riêng phần tủa DNA dạng sợi trắng khỏi dịch ethanol hàm lượng DNA đủ lớn - Bỏ nước mặt, để loại bỏ muối, cần thêm (khoảng hai lần thể tích mẫu) ethanol 70% vào ống, lại ly tâm rót bỏ ethanol Nếu nhiều DNA nhúng móc mang DNA vào lọ chứa ethanol 70% phút, lượng muối DNA giảm - Sấy khô hong khô ống chứa DNA thêm dung dịch đệm TE nước cất để có dung dịch DNA với nồng độ thích hợp Chú ý: thay ethanol isopropanol với lượng nhỏ (lượng tương đương với dịch DNA) cần kết tủa DNA dịch lớn với ống thêm 2.5 lần thể tích ethanol Tuy nhiên sau nên kết tủa lại với ethanol khó làm khô isopropanol, hoà tan muối dùng isopropanol thật cần thiết có mùi khó chịu Kết tủa butanol: Thêm vào dịch DNA lượng tương đương n-butanol, trộn ly tâm nhẹ Hút bỏ butanol rồ thêm vào lượng butanol khác lặp lại thao tác Hút bỏ butanol thêm vào lượng tương đương ethyl ether so với lượng dịch lại Quay ly tâm hút bỏ ether (ether chiết xuất butanol khỏi dịch) Loại bỏ vết ether lại cách bơm không khí (tốt nitơ) qua ống hút Pasteur vào ống nghiệm để làm khô mẫu Cũng dùng buồng áp suất thấp (buồng chân không) để làm bay ether Hoà tan DNA vào TE nước cất Phương pháp sử dụng cột (DEAE-cellulose column) -9- Cột DEAE- cellulose chế từ pipet loại ml ống hút Pasteur Trước tiên lấy ống sạch, nhét vào chỗ thắt ống lượng nhỏ loại dầu mỡ, hấp cao áp tiệt trùng Cho lên lớp khoảng 0.2 ml Sephadex50 tiệt trùng, cho lên khoảng 0.1 ml DE 52 tiệt trùng (hai chất liệu hoà riêng nước hấp cao áp) Cho dịch DNA chảy qua ống để hấp phụ DNA , dịch qua lần đầu rót cho qua cột lần Rửa cột dung dịch đệm với lượng gấp lần thể tích cột, chứa TrisHCl (pH 7.5) 10mM, NaCl 50mM EDTA 1mM Dung xuất dung dịch đệm nêu với nồng độ NaCl cao hơn, chứa Tris-HCl (pH 7.5) 10mM, NaCl 1.0M EDTA 1mM Kết tủa ethanol Thẩm tích Ngâm ống thẩm tích (túi thẩm tích, mua từ số hãng) nước chứa EDTA khoảng 50mM đun sôi 10 phút Thay nước cất lần, quấy để rửa Để nước cất mà hấp khử trùng 10 phút, bảo quản 4oC Tuyệt đối không để màng (ống) thẩm tích bị khô nước Thực thẩm tích Cho mẫu dịch nguyên liệu vào ống thẩm tích, kẹp chặt buộc chặt hai đầu, cho vào bình (chậu) chứa khoảng 500-1000 lần thể tích dung dịch đệm Ngoại dịch cần phải thay trường hợp thẩm tích phenol DNA cần kéo dài thời gian thẩm tích đến 48 Nếu thẩm tích CsCl khỏi DNA plasmid cần khoảng C Phương pháp ly trích DNA thực vật: Nguyên tắc: Chiết tách DNA gen từ mô thực vật có vấn đề khó khăn phải phá vách tế bào cứng phải loại polisaccharide Việc tách chiết DNA thực vật có nguyên tắc chung là: - 10 - Thu hoạch tế bào vi khuẩn máy ly tâm Dịch vi khuẩn Máy ly tâm (Quay 8000 r.p.m 10 phút) Lớp lắng tế bào vi khuẩn Chuẩn bị dịch trích tế bào a) Phá hủy tế bào Màng tế bào Dịch trích tế bào Phân hủy màng tế bào b) Ly tâm dịch trích tế bòa để tách cặn không hòa tan Dịch trích tế bào Ly tâm DNA, RNA, protein Mảnh vỡ tế bào Khi có tế bào bị phá hủy, bước cuối việc chuẩn bị dịch chiết tế bào loại bỏ mảnh không hòa tan Các thành phần mảnh vỡ thành tế bào chiết lắng qua ly tâm, lại dịch chiết tế bào 3.Tinh khiết DNA từ dịch chiết tế bào: Ngoài DNA, dịch chiết tế bào vi khuẩn chứa protein RNA Để loại protein từ dịch chiết tế bào ta cho phenol hỗn hợp tỉ lệ 1:1 phenol cloroform Với nhiều dịch chiết tế bào, thành phần protein nhiều việc trích chiết phenol không đủ để tinh hoàn toàn NA Vấn đề giải - 19 - việc xử lý phenol nhiều lần có điều không mong muốn sau lần trộn bước ly tâm gây đứt gãy phân tử DNA Phương pháp xử lý dịch chiết tế bào dùng protease Pronase hay Proteinase K trước xử lý phenol Các enzyme phá gãy polypeptide thành đơn vị nhỏ hơn, để dễ dàng phân tách phenol Sau ta dùng enzyme ribonuclease phân hủy nhanh chóng phân tử RNA thành đơn vị nhỏ ribonucleotide 4.Cô đặc mẫu DNA: Thông thường chuẩn bị thành công thường tạo dung dịch đặc DNA mà không cần phải tiến hành cô đặc thêm Tuy nhiên, thu dịch loãng, điều quan trọng tìm phương pháp để cô đặc DNA Phương pháp cô đặc DNA sử dụng phổ biến kết tủa ethanol Trong môi trường muối (chính xác cation hóa trị I Na+), nhiệt độ -20oC thấp Ethanol nguyên chất kết tủa cách hiệu NA ly tâm tốc độ cao Với dịch đặc DNA, ethanol tách lớp phần mẫu, phân tử DNA tủa mặt tiếp xúc Người ta thường sử dụng đũa thủy tinh nhúng xuyên qua dịch ethanol dung dịch DNA, khuấy đũa dung dịch, phân tử DNA bám chặt vào đũa kéo khỏi dung dịch dạng sợi dài Sau hòa tan lại vào dung tích nước dung dịch đệm thích hợp Tủa ethanol có tiến tách rời dung dịch thành phần NA Thu hồi DNA nhờ tủa Ethanol - 20 - a) Ethanol nguyên chất tách lớp lên phần dịch cô đặc DNA Các sợi DNA tách từ đũa thủy tinh b) Để dịch cô đặc nhất, ethanol thêm vào (với tỉ lệ 2,5 thể tích ethanol nguyên chất thể tích dung dịch DNA) thu DNA tủa phương pháp ly tâm Chuẩn bị DNA plasmid: Việc tinh plasmid từ dịch vi khuẩn gồm bước tương tự việc chuẩn bị total cell DNA Dịch tế bào có chứa plasmid tăng trưởng môi trường lỏng, thu hoạch chuẩn bị dịch trích tế bào Dịch trích xử lý để loại protein, RNA tủa DNA phương pháp tủa Ethanol Tuy nhiên, có điểm khác tinh plasmid chuẩn bị total cell DNA là: chuẩn bị plasmid, phải tách DNA plasmid từ lượng lớn DNA NST vi khuẩn tồn tế bào Việc phân tách hai loại DNA khó khăn cần thiết plasmid sử dụng kỹ thuật cloning Sự diện lượng DNA NST tạp nhiễm kỹ thuật cloning dễ dàng dẫn đến kết không mong muốn Có nhiều phương pháp để loại bỏ DNA NST trình tinh plasmid, việc sử dụng phương pháp riêng lẽ hay kết hợp phương pháp với phân lập DNA plasmid tinh Các phương pháp dựa đặc điểm khác DNA plasmid DNA vi khuẩn,chủ yếu dựa vào kích cỡ Plasmid lớn 8% kích cỡ DNA NST E.coli Do đó, kỹ thuật phân tách phân tử DNA nhỏ từ phân tử lớn mà tinh DNA plasmid cách hiệu Ngoài kích cỡ, DNA NST plasmid khác hình thể Các plasmid tế bào vi khuẩn có dạng vòng, trình chuẩn bị dịch trích tế bào, DNA plasmid bị bẻ gãy thành mảnh dạng sợi Ứng dụng phương pháp phân tách plasmid dạng vòng từ phân tử dạng sợi thu phân tử plasmid tinh - 21 - a) Sự phân chia dựa vào kích thước: Xử lý EDTA lysozyme với có mặt đường sucrose Tế bào bị vách màng tế bào Sự phân giải màng tế bào kích ứng cách thêm vào chất tẩy không mang ion Triton X-100 (những chất tẩy ion SDS làm DNA NST bị gãy) Với phương pháp số lượng DNA bị gãy ly tâm tạo dịch tan suốt bao gồm toàn plasmid Vì đoạn DNA NST lớn, lớn nhiều so với plasmid, dính vào màng tế bào vi khuẩn sau loại bỏ với mảnh vỡ tế bào ly tâm.Tiến trình thực E.coli loài thân thuộc với Dịch tan DNA tế bào Hơn plasmid phân tử lớn, hòa tan với mảnh vỡ tế bào Sự phân chia theo kích thước bị thiếu DNA plasmid Vì ta cần quan tâm đến phương pháp khác để loại bỏ nhiễm DNA vi khuẩn b)Sự phân tách dựa cấu hình: Phương pháp quan tâm tới khác cấu hình plasmid DNA NST Sự khác dùng để phân tách loại DNA Ta cần nhìn nhận chặt chẽ toàn cấu hình plasmid Sẽ không xác nói plasmid có cấu hình dạng vòng, vòng DNA bị biến đổi nhân tố tạo thành dạng hoàn toàn khác Hầu hết plasmid tồn tế bào dạng siêu xoắn Dạng siêu xoắn biến đổi từ DNA sợi đôi, bền vững suốt trình chép plasmid nhờ enzyme topoisomerase Cấu hình xoắn trì hai sợi polynucleotide nguyên vẹn, dạng gọi covalently-closedcircular (ccc) DNA Nếu sợi bị gãy, dạng siêu xoắn trở lại dạng bình thường, dạng linh hoạt, gọi open-circular Như plasmid có cấu hình thay đổi - 22 - Dạng siêu xoắn quan trọng việc chuẩn bị plasmid phân tử siêu xoắn phân tách dễ dàng từ DNA sợi đôi bình thường Để làm điều hai phương pháp dùng phổ biến Cả hai phương pháp tinh DNA plasmid từ chất chiết tế bào thô sơ Sự biến tính kiềm: Vấn đề kỹ thuật có khoảng pH nhỏ mà DNA sợi đôi bình thường bị biến tính, plasmid siêu xoắn không Nếu bổ sung dung dịch hydroxide vào chất chiết tế bào hay dịch tan pH tăng đến 1212.5, pH cao làm đứt nối hydrogen phân tử DNA bình thường, sau sợi polynucleotide tách ra, thêm acid vào pH giảm Những sợi DNA vi khuẩn biến tính quấn lại với thành đám rối Hỗn hợp đem ly tâm để tách DNA plasmid, DNA plasmid lên trên, phân tử DNA thẳng lắng dứơi đáy ống nghiệm Một thuận lợi phương pháp (đặc biệt làm tan tế bào SDS trung hòa dd acetate Natri) hầu hết protein hay RNA không hòa tan loại bỏ ly tâm Sự xử lý với chất chiết phenol ribonuclease không cần đến phương pháp biến tính dung dịch kiềm sử dụng Phương pháp ly tâm gradient nồng độ nhờ Ethidiumbromide-Cesium Chloride: Gradient nồng độ tạo cách ly tâm dd CsCl với tốc độ cao Gradient tạo với lực ly tâm lớn kéo ion Cs+ Cl- phía đáy ống nghiệm Sự di chuyển xuống cân bằng khuyếch tán Vì mật độ gradient thiết lập với mật độ CsCl cao phía đáy ống nghiệm Những đại phân tử diện dd CsCl ly tâm tạo dãy tách biệt theo gradient, dãy phân tử riêng biệt diện đâu tùy thuộc vào mật độ DNA có mật độ khoảng 1.7g/cm3 di chuyển đến điểm có mật độ CsCl 1.7g/cm3 Trái lại protein có độ thấp lên đỉnh ống nghiệm, RNA lắng đáy Ly tâm đẳng tỷ trọng có - 23 - thể phân tách DNA, RNA, protein thay việc xử lý với phenol ribonuclease để tinh DNA Quan trọng phương pháp với diện EtBr dùng để tách DNA siêu xoắn khỏi DNA bình thường EtBr kết hợp với DNA cách xen vào cặp base làm cho phần sợi DNA tháo xoắn dài (mỗi cặp > 3.4Ao) Sự tháo xoắn làm giảm mật độ 0.125g/cm3 DNA thẳng Tuy nhiên DNA siêu xoắn đầu tận tự do, có đoạn duỗi kết hợp với lượng giới hạn ETBr Mật độ phân tử siêu xoắn giảm 0.085g/cm3 Kết phân tử siêu xoắn tạo thành dãy gradient ETBr-CsCl vị trí khác với DNA vòng thẳng Ly tâm đẳng tỷ trọng với EtBr-CsCl phương pháp hiệu cho việc thu DNA plasmid Khi dịch tan tạo từ phương pháp này, dãy plasmid vị trí phân biệt với DNA thẳng vi khuẩn, phần protein lên đỉnh, RNA lắng đáy Vị trí DNA plasmid nhìn thấy chiếu xạ tia cực tím lên thành ống nghiệm Tia làm cho EtBr kết dính phát huỳnh quang DNA plasmid đựơc lấy cách dùng ống tiêm đâm vào vị trí mẫu ống nghiệm EtBr kết hợp với DNA plasmid lấy n-butanol Lắc hỗn hợp DNA plasmid với n-butanol phân hai lớp EtBr DNA Sau tách CsCl thẩm tích DNA plasmid đựợc đựng ống thẩm tích đặt ống dd buffer CsCl thẩm tích vào buffer Sự khuyếch đại plasmid: Sự chuẩn bị DNA plasmid có trở ngại tỷ lệ DNA plasmid so với tổng DNA tế bào vi khuẩn Năng suất DNA từ việc nuôi cấy tế bào vi khuẩn không cao Vì cần phải khuyếch đại DNA plasmid Sự khuyếch đại nhằm vào việc tăng số lượng DNA plasmid Một vài DNA plasmid có số lượng lớn (20 hơn), đặc tính có lợi cho khuếch đại Trong điều kiện để khuếch đại DNA plasmid DNA thẳng vi khuẩn chép tổng hợp protein bị ức chế Nuôi cấy tế bào chuẩn - 24 - bị cho tinh DNA plasmid Sau thỏa mãn mật độ tế bào đạt được, chất ức chế tổng hợp protein thêm vào (chloramphenicol) ủ 12 Trong suốt thời gian plasmid tiếp tục chép chép DNA thẳng tổng hợp protein bị ức chế Kết khoảng vài ngàn plasmid tạo thành Sự khuếch đại phương pháp có hiệu để nâng cao số lượng DNA plasmid Sự chuẩn bị DNA phage: Sự khác chuẩn bị DNA phage chuẩn bị tổng DNA tế bào DNA plasmid nguyên liệu ban đầu để tinh phage chất chiết tế bào Ta thu lượng lớn hạt thực khuẩn thể dịch ngoại bào từ việc nuôi cấy vi khuẩn phương pháp nhiễm Khi ly tâm môi trường nuôi cấy này, vi khuẩn lắng xuống đáy ta thu hạt phage dịch huyền phù Tách hạt phage khỏi dịch huyền phù, DNA chúng tách cách khử protein để loại bỏ vỏ capsid Phương pháp nhanh phương pháp chuẩn bị tổng DNA tế bào DNA plasmid Khó khăn chính, đặc biệt phage lamda nuôi cấy phải đạt mật độ phage lamda đủ cao (số hạt phage /1 ml môi trường nuôi cấy) Thực tế mật độ phage lamda hợp lý tối đa 10 10/ml Tuy nhiên với mật độ lượng DNA phage thu thấp 500ng DNA Vì thể tích nuôi cấy phải đạt 500 -1000ml để thu luợng DNA phage mong muốn Phát triển việc nuôi cấy để đạt mật độ lamda cao: Phát triển việc nuôi cấy với dung tích lớn không vấn đề (có thể nuôi cấy 50 lit hay lớn công nghệ sinh học) Nhưng để đạt mật độ phage tối đa cần vài kỹ Đối với phương pháp này, tế bào vi khuẩn đóng vai trò chính, phage lamda xâm nhiễm vào DNA vi khuẩn tạo dạng prophage Trong trường hợp mật độ phage vô thấp, muốn đạt mật độ phage lamda cao ta cần phải kích ứng để phage vào giai đoạn sinh tan, kết tế bào vi khuẩn chết phóng thích hạt phage vào môi trường Ta kiểm soát chúng thông qua gen cI (gen nằm vùng đột biến nhạy cảm với nhiệt - 25 - phage) Gen làm nhiệm vụ giúp phage liên kết với DNA tế bào chủ Gen cI hoạt động tốt 30 oC Bình thường tiềm tan xảy ra, 42oC gen cI bị bất hoạt tiềm tan không xảy ra.Sự cảm ứng tiềm tan gen cI cách tăng nhiệt độ từ 30oC-42oC Gen cI xâm nhiễm vào DNA Ecoli để sản xuất phage ngoại bào Ở 30oC, không cảm ứng tế bào nhân đôi Ở 42oC, nhiệt độ cảm ứng tạo genome phage lamda mong muốn, phage qua trình phân chia, tổng hợp, đóng gói phóng thích Sự chuẩn bị phage lamda có khả tiềm tan: Mặc dù hầu hết phage lamda có tính tiềm tan, nhiều vector tạo dòng tạo từ phage lamda, cách loại bỏ gen cI vài gen khác tiềm tan không xảy Những vector tiềm tan vào genome vi khuẩn, chúng xâm nhiễm vào tế bào chu trình sinh tan Để đạt mật độ phage cao ta bổ sung phage vào giai đọan tế bào phát triển thích hợp + Nếu bổ sung phage vào số tế bào thấp phage giết chết tế bào, mật độ phage + Nếu bổ sung phage mật độ tế bào cao, nuôi cấy không hoàn tất lượng tế bào dư, mật độ phage +Thích hợp nuôi vi khuẩn mức cho phage vào mức đó, tạo cân bằng, việc nuôi cấy phát triển tốt, mật độ phage cao Để xử lý vấn đề tốt cần kỹ kinh nghiệm Thu nhận phage từ việc nuôi cấy nhiễm: Những tế bào vi khuẩn tan tế bào nguyên sót lại loại bỏ khỏi dịch huyền phù ly tâm Vấn đề ta phải giảm thể tích dịch huyền phù 5ml hay hơn, để dể kiểm soát lượng DNA, ta làm sau: Khử protein phage PEG (là hợp chất polyme chuỗi dài) + NaCl H2O hấp thụ Các chất làm hạt phage dính lại với - 26 - + Sau ly tâm với tốc độ cao hạt phage với mảnh vỡ tế bào sót lai sau ly tâm lắng xuống đáy Loại bỏ phần dịch lơ lửng ta lượng phage với thể tích mong muốn Sự tinh DNA phage từ hạt phage thu trên: Sự khử protein nhờ PEG chứa đủ lượng DNA phage, DNA phage thường xen lẫn với phần chất thu nên lượng phage thu chứa mãnh vỡ vi khuẩn, DNA tế bào không mong muốn Ta sau ly tâm tinh hạt phage CsCl với phương pháp ly tâm độ đậm gradient Các hạt phage gradient CsCl có mật độ 1.45-1.50g/cm3 Việc lấy phage giống lấy DNA mô tả trước Loại bỏ CsCl thẩm tích để phage DNA chiết xử lý phenol protease để làm tan vỏ protein phage Sự tinh DNA M13 gây vài vấn đề: Sự khác M13 lamda thuận lợi để nhà sinh học phân tử chuẩn bị DNA M13 Sợi đôi M13 giống số plasmid có số lượng lớn dễ dàng tinh phương pháp tinh plasmid Chuẩn bị chất chiết tế bào từ tế bào nhiễm M13, M13 tách khỏi DNA vi khuẩn ly tâm đẳng tỷ trọng EtBr-CsCl DNA sợi đơn M13 chứa vỏ protein M13 Thuận lợi so với lamda M13 dễ đạt mật độ cao, tiềm tan không xảy Để đạt mật độ M13 cao ta cần tăng số lượng tế bào bị nhiễm lên Mật đô M13 đạt 1012/ml cao cách dễ dàng không dùng chất ức chế đặc biệt Mật độ M13 cao có ý nghĩa việc chuẩn bị DNA sợi đơn M13 từ việc nuôi cấy thể tích nhỏ ml hay Trong trường hợp tiềm tan, vấn đề với mảnh vỡ tế bào sót lại dịch huyền phù Thường ly tâm gradient CsCl cần thiết phage lamda không cần thiết M13 - 27 - Tóm lại, chuẩn bị sợi đơn DNA M13 liên quan đến việc nuôi cấy nhiễm với thể tích nhỏ, ly tâm để loại bỏ tế bào vi khuẩn, tủa phage M13 với PEG, dùng phenol để loại bỏ vỏ protein, tủa ethanol để thu DNA Sự chuẩn bị DNA M13 vi khuẩn qua giai đoạn sau: a Nuôi cấy tế bào bị nhiễm b Ly tâm loại bỏ tế bào Tế bào lắng đáy, M13 lại dịch huyền phù c Thêm PEG vào dịch huyền phù, ly tâm để tủa M13 d Phage M13 lơ lửng buffer e Thêm phenol loại bỏ vỏ protein thu dịch DNA M13 f Thêm ethanol để tủa DNA M13, DNA lắng đáy g Thu DNA M13 thể tích nhỏ G.Phương pháp tách chiết RNA: Phương pháp tách chiết RNA tổng số: Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân huỷ RNase Hơn nữa, RNase lại có mặt khắp nơi (có nhiều ngón tay người thao tác,…), có hoạt tính cao bền vững với tác nhân thừơng dùng để loại bỏ enzyme (việc xử lý nhiệt 90oC không làm hoạt tính RNase) Vì lý đó, việc tách chiết RNA đòi hỏi nhiều biện pháp thận trọng để tránh tạp nhiễm RNase từ môi trường: thao tác điều kiện vô trùng, dụng cụ, hoá chất khử trùng nhiệt hay hoá chất, tránh tiếp xúc với dụng cụ tay trần Phương pháp tách chiết RNA toàn phần bao gồm bước DNA: Tế bào, mô nghiền dung dịch gồm chất tẩy mạnh (SDS, sacrosyl) nồng độ cao, tác nhân gây biến tính protein mạnh (guanidinium thyocyanate), chất khư (2- mercaptoethanol) Hai loại chất sau có tác dụng ức chế hoạt động RNase nội bào tách protein liên kết khỏi phân tử RNA - 28 - Các protein loại bỏ khỏi mẫu qua xử lý phenol-chloroform ly tâm RNA hoà tan pha nước tủa ethanol thu nhận lại qua ly tâm RNA bảo quản năm dạng tủa dung dịch ethanol đông lạnh -70oC nước có chứa RNAsine (một chất ức chế RNase) Tách chiết tRNA, mRNA, rRNA: Khoảng 80% tổng số RNA tế bào rRNA, 15% tRNA Các RNA có kích thước trình tự xác định tách chiết dễ dàng kĩ thuật ly tâm, điện di,…Riêng mRNA chiếm khoảng 5% tổng số RNA tế bào, lại có kích thước trình tự vô đa dạng Tuy nhiên chúng có đặc điểm chung có cấu trúc đuôi polyA (có thể lên tới 100A) Dựa vào cấu trúc đặc tính liên kết bổ sung A-T NA người ta tách mRNA khỏi mẫu sắc kí lực oligodT-cellulose Dựa vào nguyên tắc trên, thương trường xuất kit (bộ mẫu thử) sử dụng viên bi từ có mang oligodT bề mặt Sau mRNA bám lên bề mặt viên bi từ thông qua liên kết bổ sung với oligodT, viên bi thu nhận qua ly tâm, mRNA tách khỏi viên bi cách rửa dung dịch đệm có hàm lượng muối thấp giữ lại Kĩ thuật cho phép thu nhận mRNA mẫu có khối lượng nhỏ Sau trình tinh sạch, NA đươc tinh nhờ số kĩ thuật siêu ly tâm, sắc kí hay điên di Triển vọng kết nghiên cứu thành công hạt nano-carbon từ bọc silica TS Nguyễn Chánh Khê Lần Việt Nam, quy trình xét nghiệm sinh học phân tử phát định lượng virus công nghệ nano-carbon từ thử nghiệm thành công nhóm nghiên cứu TS BS Phạm Hùng Vân, giảng viên môn vi sinh, khoa y, Đại học y dược TP.HCM Có kết nhờ vào việc làm chủ công nghệ chế tạo hạt nano-carbon từ bọc silica TS Nguyễn Chánh Khê (Trung tâm công nghệ cao TP.HCM) để ứng dụng vào công nghệ tách chiết - 29 - nucleic acid Kết mở nhiều triển vọng cho lĩnh vực công nghệ sinh học Việt Nam Vai trò hạt từ bọc silica Để thực xét nghiệm PCR hay RT-PCR phát hiện, định lượng tác nhân vi sinh vật gây nhiễm trùng có mặt mẫu thử (bệnh phẩm) khâu tách chiết nucleic acid từ mẫu thử khâu quan trọng Tùy thuộc vào tác nhân vi sinh vật, nucleic acid đích DNA hay RNA, tùy thuộc vào mẫu thử mà người làm xét nghiệm chọn phương pháp tách chiết nucleic acid thích hợp Trong nhiều phương pháp tách chiết nucleic acid phòng thí nghiệm PCR chẩn đoán sử dụng nay, phương pháp BOOM lựa chọn nhiều sử dụng cho nucleic acid đích DNA hay RNA cho nhiều loại bệnh phẩm khác (phương pháp René BOOM, Trung tâm hàn lâm y học, Đại học Amsterdam - Hà Lan phát minh vào năm 1989) Phương pháp BOOM hoạt động dựa nguyên tắc môi trường chaotropic, nucleic acid có khả bám lên hạt silica nhờ mà nucleic acid tách chiết từ mẫu thử Mặc dù phương pháp đơn giản hiệu chưa thể tự động hóa thao tác phải có nhiều lần ly tâm dịch tách chiết để thu hồi silica Chính nhiều hãng sản xuất nghiên cứu cải tiến phương pháp BOOM, đưa phương pháp tách chiết nucleic acid đơn giản mà đạt hiệu cao Cải tiến thay phải dùng dung dịch hạt silica, người ta chế tạo màng lọc xốp silica nhờ mà tách chiết nucleic acid cách dùng ly tâm hay bơm hút chân không để đẩy dịch tách chiết mẫu thử qua lọc xốp silica Một cải tiến chế tạo hạt từ bọc silica, dùng hạt từ bọc silica để tách chiết nucleic acid từ dịch tách chiết mẫu thử Đột phá phương pháp dùng hạt từ bọc silica tự động hóa máy thao tác mẫu mà phương pháp BOOM cổ điển hay phương pháp dùng màng lọc silica áp dụng - 30 - Có thể nói dù công nghệ hạt từ bọc silica công nghệ ưu việt ứng dụng tách chiết nucleic acid, nhiên có số hãng đưa thuốc thử tách chiết nucleic acid dựa công nghệ hạt từ bọc silica Lý hạn chế có vài nhà sản xuất nắm công nghệ nguồn sản xuất hạt từ bọc silica, hãng sản xuất thuốc thử tách chiết nucleic acid phải dựa vào nguồn cung cấp nhà sản xuất hạt từ bọc silica Làm chủ công nghệ chế tạo hạt nano- carbon từ bọc silica Mới Việt Nam, vào cuối năm 2007 vừa qua nhóm nghiên cứu có làm việc với TS Nguyễn Chánh Khê khu công nghệ cao TP.HCM (TS Khê người am hiểu công nghệ nano-carbon), nội dung làm việc xoay quanh chủ đề “ứng dụng công nghệ nano-carbon vào sản xuất hạt nano-carbon từ bọc silica” Ngày 16/2/2008 TS Nguyễn Chánh Khê nhóm nghiên cứu giao cho loại nano-carbon từ để thử nghiệm Chúng chọn loại để thử loại nano-carbon từ có bọc silica Nhóm nghiên cứu tập trung thực nội dung: chọn thuốc thử, quy trình, đối tượng để thử nghiệm khả tách chiết DNA, RNA loại hạt nano-carbon từ Kết cho thấy tất loại hạt nano-carbon từ bọc silica TS Nguyễn Chánh Khê sau rửa nhiều lần nước miliQ (nước khử ion tuyệt đối tinh sạch) có khả tách chiết tinh - 31 - DNA Với kết thành công này, tiếp tục thử nghiệm khả tách chiết DNA hạt nano-carbon từ đối tượng mẫu thử thật huyết bệnh nhân xác định dương tính virus viêm gan B (là virus DNA) Chúng thấy loại hạt nano-carbon từ có khả tách chiết DNA vi sinh vật từ mẫu thử thật với hiệu Thử nghiệm khả tách chiết RNA mẫu thật huyết bệnh nhân xác định dương tính virus viêm gan C (là virus RNA), ghi nhận loại hạt nano-carbon từ (có ký hiệu 200428-95-5 200428-95-7) có khả tách chiết RNA, loại hạt nano-carbon từ lại khả Chúng tiếp tục thử nghiệm thêm hiệu tách chiết RNA loại hạt nano-carbon từ (có ký hiệu 200428-95-5 200428-95-7), mẫu huyết xác định dương tính HCV, ghi nhận loại hạt nano-carbon từ cho hiệu tách chiết RNA vi sinh vật từ mẫu thử tốt Qua kết thử nghiệm nói trên, cho nhóm nghiên cứu TS Nguyễn Chánh Khê làm chủ công nghệ chế tạo hạt nano-carbon từ bọc silica để ứng dụng vào công nghệ tách chiết nucleic acid Kết nghiên cứu thành công TS Khê giúp nhà khoa học (trong lĩnh vực công nghệ sinh học) nước thêm nhiều thuận lợi đơn giản hơn, lại tăng hiệu công nghệ tách chiết nucleic acid tác nhân vi sinh vật đích có mặt mẫu thử để phát định lượng xét nghiệm PCR định tính hay định lượng Đây sở để nhà nghiên cứu công nghệ sinh học nước tiếp cận công nghệ tự động hóa khâu tách chiết nucleic acid đích - khâu khó tự động hóa xét nghiệm PCR, mà có Roche Diagnostic làm chủ nhờ có công nghệ hạt từ bọc silica Ứng dụng hạt nano- carbon từ bọc silica Hạt nano-carbon từ bọc silica áp dụng tách chiết DNA, RNA có nhiều khả ứng dụng khác áp dụng xét nghiệm dấu vân tay, phát quan hệ huyết thống, truy tìm tông tích, phát thủ phạm công nghệ giải trình tự (tinh sản phẩm giải trình tự) Đây nội dung mà - 32 - nhóm nghiên cứu triển khai thực hiện, dựa hạt nano-carbon từ bọc silica TS Nguyễn Chánh Khê nhóm cộng nghiên cứu chế tạo Thành công kết nghiên cứu hạt nano-carbon từ bọc silica mở triển vọng khác là: thương mại Hiện phải đặt mua thuốc thử tách chiết nucleic acid công nghệ hạt từ bọc silica với giá cao: 4.000 USD/50 ml Lý đắt giá chỗ có nhà sản xuất nắm công nghệ nguồn để sản xuất hạt từ bọc silica Ở Việt Nam, theo chúng tôi, nhóm nghiên cứu TS Nguyễn Chánh Khê làm chủ công nghệ nguồn này, với nhiều khác biệt so với sản phẩm có mặt thị trường giới sử dụng hạt nano-carbon từ bọc silica hạt sắt nhiễm từ bọc silica Chính mà hạt nano-carbon từ bọc silica TS Nguyễn Chánh Khê chế tạo, sau rửa không cần phải bảo quản lạnh mà cần bảo quản nhiệt độ thường, không bị hoạt tính TS.BS PHẠM HÙNG VÂN (Trường đại học y dược TP.HCM) Tài liệu tham khảo: Sinh học phân tử - HỒ HUỲNH THUỲ DƯƠNG- Nhà xuất giáo dục Thực tập sinh học phân tử lớp DH06SH Công nghệ sinh học-tập 4-Kĩ thuật di truyền Công nghệ gen-GSTS Đái Duy Ban-NXB Khoa Học Kỹ Thuật Giáo trình thực tập sinh học phân tử trường đại học y dược TPHCM Giáo trình sinh học phân tử.pdf www Google.com - 33 -