CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA, enzyme, protein...

CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA VÀ RNA DNA chứa thông tin di truyền sinh vật Do nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử bat đầu việc thu nhận lượng nucleic acid (NA) đủ lớn đủ tinh đế tiến hành thí nghiệm DNA gồm loại: DNA gen, DNA ty thế, DNA lục lạp, DNA plasmid, DNA phage Tuỳ kích thước DNA, loại tế bào mà chọn phương pháp tách chiết khác đê đám bảo chiết DNA tinh khiết có hiệu suất cao Mối quan tâm hàng đầu kĩ thuật tách chiết NA thu nhận phân tử trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân huỷ tác nhân học (phân tử bị gẫy nghiền, lắc mạnh) hay hoá học (phân tử bị thuỷ giải enzyme nội bào giải phóng môi trường tế bào bị phá vỡ) Các NA cần tách chiết điều kiện nhiệt độ thấp đê ức chế hoạt động enzyme nội bào (DNase, RNase) A.Dung cu hoá chất: A.1 Dụng cụ: Eppendorí: ống đựng nhỏ nhựa polyethylen hay polypropylen chịu nhiệt độ khử trùng (latm, 121°c, 20 phút), nhiệt độ thấp (-20°C) số dung môi hữu cơ, thường có dung tích 0.2, 0.3, 0.5, 1.5, 2ml (hãng Eppendorí, hãng BioRađ ) Micropipet (pipetman): loại pipet chinh thể tích cần lấy dùng đế hút dung dịch tích nhỏ, độ xác cao Micropipet có nhiều cỡ: Loại Micropipet Đầu tip tương ứng 0.1->10 (màu trắng) 10->100, 10->200 10->200 (màu vàng) 100->1000 (màu xanh) - 1- cấu tạo micropipet thay đổi tuỳ theo kiếu thiết kế nhìn chung gồm: cần bơm, ngàm tựa, phận tip, phận điều chỉnh tích, sổ tích chọn, đầu hút (nơi gắn tip) Khi sử dụng cần ý: - Phải gắn chặt tip vào đầu hút không bị mắc sai sổ - Không đế pipet tiếp xúc với dung môi hữu cơ, hoá chất - Không đế pipet gần đèn cồn Không điều chỉnh ngường tích tối thiêu ngường thê tích tối đa Các đầu tip cần cho vào hộp giá (rack), đậy nắp hấp cao áp tiệt trùng sử dụng lần đế tránh tạp nhiềm A.2 Trang thiết bi thông dung: -I3 Bồn U nhiêt, tú đinh ôn: sử dụng phản ứng cần nhiệt độ ổn định thường có phận điều chỉnh nhiệt độ, cài đặt thời gian -í3 Tủ hút khí đỏc: dùng thí nghiệm có hóa chất bay độc như: phenol, chloroíbrm, ethidium bromide 2- - i3 TÙ cấv vô trùng: sử dụng phản ứng cần có vô trùng Tủ phải giữ sạch, khử trùng bề mặt cồn, trước sau sử dựng tủ cần trùng bên đèn tử ngoại (UV) 15 phút Nồi hấp tiêt trùng: dùng đê khử trùng hoá chất dụng cụ cần thiết Tù lanh: gồm có tủ mát tủ âm sâu (-20°c -70°C) dùng đế bảo quản hoá chất, mẫu Máv đo PH: dùng xác định pH dung dịch Máy Vortex: dùng đế đồng hoá mẫu dung dịch $ Máv ly tâm (ccntriíugc): dùng đe phân tách thu nhận phần tử khác dung dịch Khi sử dụng khối lượng mẫu phải đồng đặt đổi xứng qua trục máy Chỉ mở nắp máy ngưng hoàn toàn Nguyên tấc: phần tử khác dung dịch sè lắng với vận tổc khác chịu tác động lực li tâm Tuỳ thuộc vào khối lượng tỉ trọng phân tử vật chất mà ngưới ta chia làm loại ly tâm: Ly tâm phân đoan: dùng phân tách phần tử vật chất khác dựa vào khối lượng chúng Vận tốc lắng phần tử phụ thuộc vào lực ly tâm, khối lượng, tỷ trọng lực ma sát phần tử với dung dịch ly tâm Đe phân tách thành công phân tử có dung dịch cần phải có lực ly tâm thời gian ly tâm thích hợp Ly tâm đắng tỷ trong: phân tách phần tử vật chất dựa vào tỷ trọng chúng Phương pháp hiệu quả, cho phân đoạn phân tách khiết Ống ly tâm chứa cột dung dịch có tỷ trọng tăng dần từ xuống đáy tạo nên gradient tỉ trọng Các phần tử lắng trình ly tâm nằm vùng dung dịch có tỷ trọng tương đương với Saccharose Glycerol dùng phân tách bào quan, Cesium chloride (CsCl) dùng để phân tách protein NA A.3 Hoá chất: $ Nhũng điều cần chủ ý: - Tất dung dịch hoá chất nước cần phải tiệt trùng nồi hấp lọc qua màng lọc vi khuân Neu cần nên báo quản đông lạnh vi khuân nấm phát triên nguyên nhân phát sinh nuclease (tuỳ theo khuyến cáo mà hoá chất bảo quản nhiệt độ phòng, tủ lạnh (4°C) hay tủ âm sâu (-20°C) - Đe đề phòng tạp nhiễm nguyên liệu dung dịch hoá chất nên sử dụng đầu pipet nghiệm lần vứt bỏ - Hoá chất dạng dung dịch bảo quản dạng kéo dài lặp lặp lại việc giải đông thường biến tính Vì vậy, nên chia thành lượng nhỏ sử dụng hết một, hai ba lần bào quán -20°c -70°c Ví dụ dithiothreitol, - Người thao tác phải mang găng tay tiếp xúc bình đựng hoá chất - Một vài dung dịch đệm sử đụng thí nghiệm với thành phần có dung dịch với nồng độ khác nhau, cần phải chuân bị nhùng dung dịch gốc đậm đặc đe có thê pha loãng cần $ Dung dieh gốc: Tris-HCl IM (pH 7.5): hoà tan 121.1 g nước cất Thêm nước đê lít dung dịch Điều chỉnh pH đến 7.5, phân phối vào lọ hấp khử trùng 4- - Chú ý: màu dung dịch chuyển sang màu vàng ta nên bỏ chuân bị hoá chất - NaCỈ 5M: hoà tan 292.2g NaCl nước cất thêm nước đế lit dung dịch Phân phổi vào lọ hấp khử trùng - EDTA 0.5M (Ethylene diamin tetra acetat (pH 8.0): hoà tan 186.1g EDTA.2EẸO vào nước cất, vừa khuấy từ vừa thêm NaOH tinh đế điều chỉnh pH đến 8.0 thêm nước đế lít dung dịch Phân phổi vào lọ hấp khử trùng Chú ý: EDTA sè không hoà tan vào dung dịch pH không đạt mức 8.0 - SDS 10% (Sodium dodecyl sulfate): hoà tan lOOg SDS nước cất Nung nóng đến 68°c đc hoà tan dung dịch Điều chỉnh pH đến 7.2 cách thêm HC1 Thêm nước đê lít dung dịch Chủ ý: sử dụng khâu trang cân SDS dọn dẹp khu vực cân với cân sau sử dụng tinh SDS khuếch tán dễ dàng Không cần phải khử trùng SDS 10% - NaOH 10N: hoà tan 200gNaOH 500 ml nước cất Bảo quản lọ chất dẻo - Sodium acetate 3M (pH 5.2): hoà tan 81.62g trisodium acetate vào 200 ml nước cất Dung dịch có pH 5.2 - Kalium acetate 5M pH 4,8: lấy 29.5 ml acid acetic băng, thêm KOH đậm đặc để chỉnh đến pH 4.8, thêm nước vừa đủ 100 ml Không hấp tiệt trùng, bảo quản nhiệt độ phòng - Sarkosyl 20%(w/v) (N-lauroysarkosyl): hoà tan 20g N- lauroysackosyl nứơc cất (tăng nhiệt độ để giúp hoà tan) Thêm nước đến lOOml hấp khử trùng báo quản nhiệt độ phòng Dung dịch có màu vàng nhạt -RNase lOmg/ml: hoà tan lOmg/ml RNase TE, đun sôi 10 đế diệt DNase Chia thành thánh phần nhở bảo quản -20°c Phenol dẽm: 5- - • Đun khoảng lOOg phenol (tinh khiết, mới) bếp cách thuỷ 65°c cho cháy Rót thận trọng phenol chảy vào becher 250ml có chứa sẵn OOmg 8-hydroxyquinoline, thêm lOOml Tris-base 50mM (không pH) • Đậy giấy nhôm, khuấy nhẹ máy khuấy từ khoảng 10 phút nhiệt độ phòng Đe yên cho phân lớp Loại bở pha (pha nước, lưu ý pha hữu chứa phenol có màu vàng) nhiều tốt • Thêm 500ml Tris-HCl 50mM, pH 8, lặp lại bước đến pha phenol đạt đến pH (đo giấy) • Thêm 100 ml Tris-HCl 50mM, pH đệm TE • Bảo quản 4°c tháng chai nâu hay chai bọc giấy nhôm • Sử dụng: trộn với chloroíòrm với tỷ lệ 1/1 với chloroíbrm -iso amyl alcol theo tỷ lệ 25/24/1 • Chủ Ỷ: phenol chloroíòrm có tính độc cần mang bao tay tránh hít bay Phenol dễ cháy làm da tay cần giữ lại tất dụng cụ có dính phenol vứt bỏ an toàn - Ethidium bromide 1000X (5mg/mp: 0.1 g Ethidium bromide 20 ml nước cất Bảo quản nhiệt độ phòng lọ bọc giấy nhôm đê tránh ánh sáng Chú ý: hoá chất độc gây ung thư Phải mang găng tay thao tác pha chế tủ hút khí độc Bảo quản nhiệt độ phòng - Lysozyme: 20mg/ml nước cất Lọc tiệt trùng chia thành phần nhỏ (250ul), bảo quán -20°c - Protein K 20mg/ml Pha dung dịch mẹ 20mg/ml dung dịch gồm Tris-HCl pH7.5 10mM vàNaCl lOmM B Nguyên tắc chung: Quá trình tách chiết DNA trái qua giai đoạn: • Giai đoan 1: phá vỡ tế bào phương pháp vật lí hay hóa học Tuỳ loại tế bào, có cấu tạo thành và màng tế bào khác nhau, chọn phương pháp áp dụng thích hợp, riêng lẽ hay phối hợp Ví du: đổi với tế bào thực vật thường ta nghiền tế bào nitơ lỏng đế phá vỡ vách tế bào dùng chất tây đế phá màng tế bào Còn đổi với tế bào vi khuân người ta thường dùng lyzozyme EDTA đế phân giải màng Giai đoan 2: loại bỏ thành phần không mong muốn mẫu (protein, lipit, polysaccharide ) chủ yếu protein Mầu lắc thật mạnh dung dịch phenol phenol/chloroíbrm (1:1) sau chloroíbrm chloroíbrm-isoamyl alcolhol (24:1) Dung dịch có tác dụng làm biến tính protein, đồng thời không hoà tan NA sau ly tâm protein tủa thành lớp nằm giũa pha nước có chứa NA pha phenol/chloroíbrm Pha nước có chứa NA thu nhận lại Chiết xuất phenol: Nguyên lý việc sử dụng phenol chiết suất DNA nhu sau: - Tuy nhiệt độ thường phenol dạng tinh rắn (tan chảy 80°C) lẫn với 20% nước (v/v) phenol dạng nhũ tương gồm phân tử phenol phân tử nước vây quanh - Khi pha hồn hợp với dịch tế bào, phân tử phenol có tính kị thuỷ nên có khuynh hướng liên kết vào vùng kị thuỷ protein bên cấu trúc phân tử này, kết cục làm protein trương phồng lên lộ xuất nhóm bên kị thuỷ (của gốc amino acid) Các nhóm kị thuỷ protein kết hợp với tạo thành búi kết tủa gồm nhiều phân tử protein khác Trong DNA chất tan nước có thê hút sang chứa khác Phenol có ưu điếm tan nước (ở mức độ định) nên không cần khuấy trộn nhiều làm biến tính protein (vì khuấy trộn nhiều làm đứt gẫy DNA) Trong sử dụng chloroíòrm chloroíbrm-isoamyl alcolhol phải trộn đảo kĩ chất không tan nước Tuy nhiên nhiều lúc cần phái loại bỏ hoàn toàn phenol khởi dung dịch, cần phải lặp lại việc chiết xuất chloroíbrm ether Sử dụng hai loại dung môi hữu thường cho hiệu cao Pha thêm chloroform vào phenol làm tính kị thuỷ phenol tăng lên làm tăng hiệu biến tính protein Giai đoan 3: tủa NA Mục đích việc tủa nhằm thu nhận NA dạng cô đặc, mặt nhàm báo vệ chúng khỏi phân huỷ enzyme, mặt khác đế hoà tan chúng lại dung dịch theo nồng độ mong muốn Hai cách tủa thông dụng là: &Tiía ethanol: việc tủa thực môi trường có lực ion cao (nồng độ muối cao), nồng độ ethanol cao (2.5:1), nhiệt độ thấp tạo thuận lợi cho việc tủa Hầu toàn NA tủa điều kiện nêu &Tủa isoproỊĩanol: diêm khác biệt so với phương pháp tủa ethanol không cần diện muối (1:1) Các phân tử DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị tủa, chúng bị loại Trong hai phương pháp, NA sê thu nhận lại bàng li tâm Sau cặn tủa phải ethanol 70% để loại bỏ muối dấu vết isopropanol dính lại mầu Tiếp theo hoà tan nước khử ion dung dịch đệm đế bảo quản Ket tua bằnií ethanol: - Cho 2.5 lần ethanol vào dung dịch DNA có chứa sodium acetate NaCl nồng độ 0.2M trở lên, trộn cho vào buồng lạnh -20 -70°c đế kết tủa Có thay NaCl sodium phosphate với lượng nhỏ kết tủa DNA.Tuy nhiên dùng muối cần phải thâm tích đế loại bỏ muối Duy trì nhiệt độ thấp (khoảng 10-15 phút -70°c, khoảng l-12giờ -20°c - Quay ly tâm 15 phút 4°c với tốc độ 15000 v/ph đế tâp trung kết tủa Trước ly tâm thấy kết tủa trắng ống nghiệm, cần ly tâm nhẹ 3000 v/ph 4°c vòng lOphút đủ tập trung kết tủa Thậm chí dùng móc thuỷ tinh móc riêng phần tủa DNA dạng sợi trắng khỏi dịch ethanol hàm lượng DNA đú lớn - Bỏ nước mặt, để loại bó muối, cần thêm (khoảng hai lần thể tích mẫu) ethanol 70% vào ổng, lại ly tâm rót bỏ ethanol Neu nhiều DNA nhúng móc mang DNA vào lọ chứa ethanol 70% phút, lượng muối DNA giảm - Sấy khô hong khô ống chứa DNA thêm dung dịch đệm TE nước cất đế có dung dịch DNA với nồng độ thích hợp Chủ ý: thay ethanol isopropanol với lượng nhở (lượng tương đương với dịch DNA) cần kết tủa DNA dịch lớn với ống không thêm 2.5 lần thê tích ethanol Tuy nhiên sau nên kết tủa lại với ethanol khó làm khô isopropanol, hoà tan muối dùng isopropanol thật cần thiết có mùi khó chịu Kết túa bằnu butanol: Thêm vào dịch DNA lượng tương đương n-butanol, trộn ly tâm nhẹ Hút bỏ butanol rồ thêm vào lượng butanol khác lặp lại thao tác Hút bỏ butanol thêm vào lượng tương đương ethyl ether so với lượng dịch lại Quay ly tâm hút bỏ ether (ether chiết xuất butanol khỏi dịch) Loại bỏ vết ether lại cách bơm không khí (tốt nitơ) qua ống hút Pasteur vào ống nghiệm đế làm khô mẫu Cũng dùng buồng áp suất thấp (buồng chân không) đc làm bay ether Hoà tan DNA vào TE nước cất Phươnti pháp sử dung côt (DEAE-cellulose column) - Cột DEAE- cellulose chế từ pipet loại ml ống hút Pasteur Trước tiên lấy ống sạch, nhét vào chồ thắt ống lượng nhỏ loại dầu mỡ, hấp cao áp tiệt trùng Cho lên lớp khoảng 0.2 ml Sephađex50 tiệt trùng, cho lên khoảng 1 ml DE 52 tiệt trùng (hai chất liệu hoà riêng nước hấp cao áp) Cho dịch DNA chảy qua đế hấp phụ DNA , dịch qua lần đầu rót cho qua cột lần Rửa cột dung dịch đệm với lượng gấp lần thê tích cột, chứa Tris- HC1 (pH 7.5) lOmM, NaCl 50mM EDTA lmM Dung xuất dung dịch đệm nêu với nồng độ NaCl cao hơn, chứa Tris-HCl (pH 7.5) lOmM, NaCl 1.0M EDTA lmM Kết tủa ethanol Thầm tích Ngâm ống thẩm tích (túi thẩm tích, mua từ số hãng) nước chứa EDTA khoảng 50mM đun sôi 10 phút Thay nước cất lần, quấy đế rửa Đe nước cất mà hấp khử trùng 10 phút, bảo quản 4°c Tuyệt đối không để màng (ống) thẩm tích bị khô nước Thực thâm tích Cho mẫu dịch nguyên liệu vào ống thâm tích, kẹp chặt buộc chặt hai đầu, cho vào bình (chậu) chứa khoảng 500-1000 lần thê tích dung dịch đệm Ngoại dịch cần phải thay trường hợp thấm tích phenol DNA cần kéo dài thời gian thấm tích đến 48 Neu thâm tích CsCl khỏi DNA plasmid cần khoảng c Phưong pháp ly trích DNA ỏ’ thưc vât: Nguyên tấc: Chiết tách DNA gen từ mô thực vật có vấn đề khó khăn phải phá vách tế bào cứng phải loại polisaccharide Việc tách chiết DNA thực vật có nguyên tắc chung là: - 10 - Thu hoạch tế bào vi khuấn bàng máy ly tâm Chuân bị dịch trích tế bào a) Phá hủy tế bào Dịch Dịch vi trích khuân tế bào Phân hủy màng tế Máy ly tâm (Ọuay 8000 r.p.m bào 10 phút) ► Lớp lắng tế bào vi khuấn b) Ly tâm dịch trích tế bòa đế tách cặn không hòa tan Khi có nhũng tế bào bị phá hủy, bước cuối việc chuân bị dịch chiết tế bào loại bỏ mảnh không hòa tan Các thành phần mánh vờ thành tế bào chiết lắng qua ly tâm, lại dịch chiết tế bào Tinh khiết DNA từ dich chiết tế bào: Ngoài DNA, dịch chiết tế bào vi khuân chứa protein RNA Đe loại protein từ dịch chiết tế bào ta cho phenol hồn hợp tỉ lệ 1:1 phenol cloroíòrm Với nhiều dịch chiết tế bào, thành phần protein nhiều đến nồi việc trích chiết phenol không đủ đê tinh hoàn toàn NA vấn đề giải bàng việc xử lý phenol nhiều lần có điều không mong muốn sau lần trộn bước ly tâm gây đút gãy phân tử DNA Phương pháp xử lý dịch chiết tế bào dùng protease Pronase hay Proteinase K trước xử lý phenol Các enzyme phá gãy polypeptide thành đơn vị nhỏ hơn, đê dễ dàng phân tách phenol Sau ta dùng enzyme ribonuclease phân hủy nhanh chóng phân tử RNA thành đơn vị nhỏ ribonucleotide Cô đăc mẫu DNA: Thông thường chuân bị thành công thường tạo dung dịch đặc DNA mà không cần phải tiến hành cô đặc thêm Tuy nhiên, thu dịch loãng, điều quan trọng tìm phương pháp để cô đặc DNA Phương pháp cô đặc DNA sử dụng phố biến kết tủa ethanol Trong môi trường muối (chính xác cation hóa trị I Na +), nhiệt độ -20°c thấp Ethanol nguyên chất kết tủa cách hiệu NA ly tâm tốc độ cao Với dịch đặc DNA, ethanol tách lớp phần mẫu, phân tử DNA tủa mặt tiếp xúc Người ta thường sử dụng đũa thủy tinh nhúng xuyên qua dịch ethanol dung dịch DNA, khuấy đũa dung dịch, phân từ DNA bám chặt vào đũa kéo khỏi dung dịch dạng sợi dài Sau hòa tan lại vào dung tích nước dung dịch đệm thích hợp Tủa ethanol có tiến tách rời dung dịch thành phần NA Thu hồi DNA nhờ tủa Ethanol -20 - Ethanol nguyên chất tách lớp lên phần dịch cô đặc DNA Các sợi DNA tách từ đũa thủy tinh b) Đế dịch cô đặc nhất, ethanol thêm vào (với ti' lệ 2,5 tích ethanol nguyên chất tích dung dịch DNA) thu DNA tủa phương pháp ly tâm J Chuẩn bi DNA plasmid: Việc tinh plasmid từ dịch vi khuân gôm bước tương tự việc chuân bị total cell DNA Dịch tế bào có chứa plasmid tăng trưởng môi trường lỏng, thu hoạch chuẩn bị dịch trích tế bào Dịch trích xử lý đế loại protein, RNA tủa DNA phương pháp tủa Ethanol Tuy nhiên, có diêm khác tinh plasmid chuân bị total cell DNA là: chuấn bị plasmid, phải tách DNA plasmid từ lượng lớn DNA NST vi khuân tồn tế bào Việc phân tách hai loại DNA khó khăn cần thiết plasmid sử dụng kỳ thuật cloning Sự diện lượng DNA NST tạp nhiễm kỳ thuật cloning dễ dàng dẫn đến kết không mong muốn Có nhiều phương pháp đe loại bỏ DNA NST trình tinh plasmid, việc sử dụng phương pháp riêng lẽ hay kết hợp phương pháp với phân lập DNA plasmid tinh Các phương pháp dựa đặc điếm khác DNA plasmiđ DNA vi khuân,chủ yếu dựa vào kích cỡ Plasmid lớn 8% kích cờ DNA NST E.coli Do đó, kỹ thuật phân tách phân tử DNA nhỏ từ phân tử lớn mà tinh DNA plasmid cách hiệu Ngoài kích cờ, DNA NST plasmid khác vê hình thê Các plasmid tế bào vi khuan có dạng vòng, trình chuân bị dịch trích tế bào, DNA plasmid bị bẻ gãy thành mảnh dạng sợi ứng dụng phương pháp phân tách plasmid dạng vòng tù’ phân tử dạng sợi thu phân tử plasmid tinh a) Sir phân chia dua vào kích thước: Xử lý EDTA lysozyme với có mặt đường sucrose Te bào bị vách màng tế bào Sự phân giải màng tế bào kích ứng cách thêm vào chất tây không mang ion Triton X-100 (những chất tây ion SDS sè làm DNA NST bị gãy) Với phương pháp sổ lượng DNA bị gãy sè ly tâm tạo dịch tan suốt bao gồm toàn plasmiđ Vì nhừng đoạn DNA NST lớn, lớn nhiều so với plasmid, dính vào màng tê bào vi khuân sau có thê loại bỏ với mảnh vờ tê bào ly tâm.Tiến trình thực E.coli loài thân thuộc với Dịch tan DNA tế bào Hơn plasmid phân tử lớn, hòa tan với mảnh vỡ tế bào Sự phân chia theo kích thước sè bị thiếu DNA plasmid Vì ta cần quan tâm đến phương pháp khác đế loại bỏ nhiễm DNA vi khuân b) Sư phân tách dưa cấu hình: Phương pháp quan tâm tới khác cấu hình plasmid DNA NST Sự khác dùng đế phân tách loại DNA Ta cần nhìn nhận chặt chẽ toàn cấu hình plasmid Sẽ không xác nói plasmid có cấu hình dạng vòng, vòng DNA có the bị biến đôi nhân tố tạo thành dạng hoàn toàn khác Hầu hết plasmid tồn tế bào dạng siêu xoắn Dạng siêu xoắn biến đôi từ DNA sợi đôi, bền vững suốt trình chép plasmid nhờ enzyme topoisomerase cấu hình xoắn trì hai sợi polynucleotide nguyên vẹn, dạng gọi covalently- closed-circular (ccc) DNA Neu sợi bị gãy, dạng siêu xoắn trở lại dạng bình thường, dạng linh hoạt, gọi open-circular Như plasmid có cấu hình thay đối a) Dạng siêu xoắn quan trọng việc chuân bị plasmiđ phân tử siêu xoắn phân tách dễ dàng từ DNA sợi đôi bình thường Đế làm điều hai phương pháp dùng phố biến Cả hai phương pháp tinh DNA plasmid từ chất chiết tế bào thô sơ ữ Sư biến tính kiềm: Vấn đề kỳ thuật có khoảng pH nhỏ mà DNA sợi đôi bình thường bị biến tính, plasmid siêu xoắn không Neu bổ sung dung dịch hydroxide vào chất chiết tế bào hay dịch tan pH tăng đến 12- 12.5, pH cao làm đứt hydrogen phân tử DNA bình thường, sau sợi polynucleotide tách ra, thêm acid vào pH giám Những sợi DNA vi khuấn biến tính quấn lại với thành đám rối Hỗn hợp đem ly tâm đế tách DNA plasmid DNA plasmid nối lên trên, phân tử DNA thẳng lắng dứơi đáy ống nghiệm Một thuận lợi phương pháp (đặc biệt làm tan tế bào bang SDS trung hòa dd acetate Natri) hầu hết protein hay RNA không hòa tan loại bỏ ly tâm Sự xử lý với chất chiết phenol ribonuclease có thê không cần đến phương pháp biến tính bàng dung dịch kiềm sử dụng Phưong pháp ly tâm gradicnt nồng đô nhò’ Ethidiumbromỉde-Cesiuni Chloride: Gradient nồng độ tạo cách ly tâm dd CsCl với tốc độ cao Gradient tạo với lực ly tâm lớn kéo ion Cs + cr phía đáy nghiệm Sự di chuyển xuống cân bằng khuyểch tán Vì mật độ gradient thiết lập với mật độ CsCl cao phía đáy nghiệm Những đại phân tử diện dd CsCl ly tâm sê tạo dãy tách biệt theo gradient, dãy phân tử riêng biệt diện đâu tùy thuộc vào mật độ nồi DNA có mật độ khoảng 1,7g/cm ' sè di chuyển đến điếm nối có mật độ CsCl 1.7g/cm\ Trái lại protein có độ nối thấp nối lên đỉnh ống nghiệm, RN A lắng đáy Ly tâm đắng tỷ trọng - 23- phân tách DNA, RNA, protein thay việc xử lý với phenol ribonuclease đê tinh DNA Quan trọng phương pháp với diện EtBr dừng đê tách DNA siêu xoắn khỏi DNA bình thường EtBr kết hợp với DNA cách xen vào cặp base làm cho phần sợi DNA tháo xoắn dài (mỗi cặp > 3.4A 0) Sự tháo xoắn làm giảm mật độ nối 0.125g/cnr’ DNA thẳng Tuy nhiên DNA siêu xoắn đầu tận tự do, có đoạn duỗi kết hợp với lượng giới hạn ETBr Mật độ nôi phân tử siêu xoắn giảm 0.085g/cm\ Ket phân tử siêu xoắn tạo thành dãy gradient ETBr-CsCl vị trí khác với DNA vòng thắng Ly tâm đăng tỷ trọng với EtBr-CsCl phương pháp hiệu cho việc thu DNA plasmid Khi dịch tan tạo tù’ phương pháp này, dãy plasmid vị trí phân biệt với DNA thăng vi khuân, phân protein nôi lên đỉnh, RNA lang đáy Vị trí DNA plasmid nhìn thấy chiếu xạ tia cực tím lên thành ống nghiệm Tia làm cho EtBr kết dính phát huỳnh quang DNA plasmid đựơc lấy cách dùng ống tiêm đâm vào vị trí mẫu ống nghiệm EtBr kết hợp với DNA plasmid lấy n-butanol Lắc hồn hợp DNA plasmid với n-butanol phân hai lớp EtBr DNA Sau tách CsCl thẩm tích DNA plasmid đựợc đựng thâm tích đặt dd buffer CsCl thấm tích vào buffer Sư khuvểch đai plasmid: Sự chuân bị DNA plasmid có trở ngại tỷ lệ DNA plasmid so với tống DNA tế bào vi khuân Năng suất DNA từ việc nuôi cấy tế bào vi khuân không cao Vì cần phải khuyếch đại DNA plasmid Sự khuyếch đại nhằm vào việc tăng số lượng DNA plasmid Một vài DNA plasmid có số lượng lớn (20 hon), đặc tính có lợi cho khuếch đại Trong điều kiện đế khuếch đại DNA plasmid DNA thắng vi khuân không thê chép tông họp protein bị ức chế Nuôi cấy tế bào chuân bị cho tinh DNA plasmid Sau thỏa mãn mật độ tế bào đạt được, chất ức chế tống hợp protein thêm vào (chloramphenicol) ủ 12 Trong suốt thời gian plasmid tiếp tục chép chép DNA thẳng tong hợp protein bị ức chế Ket khoảng vài ngàn plasmid tạo thành Sự khuếch đại phương pháp có hiệu đế nâng cao số lượng DNA plasmid $ Sư chuẩn bi DNA phage: Sự khác chuấn bị DNA phage chuấn bị tống DNA tế bào DNA plasmid nguyên liệu ban đầu đê tinh phage chất chiết tế bào Ta có the thu lượng lớn hạt thực khuân dịch ngoại bào từ việc nuôi cấy vi khuẩn phương pháp nhiễm Khi ly tâm môi trường nuôi cấy này, vi khuân lắng xuống đáy ta thu hạt phage dịch huyền phù Tách hạt phage khỏi dịch huyền phù, DNA chúng tách cách khử protein đc loại bỏ vỏ capsid Phương pháp nhanh phương pháp chuân bị tông DNA tế bào DNA plasmid Khó khăn chính, đặc biệt phage lamda nuôi cấy phải đạt mật độ phage lamda đủ cao (số hạt phage /1 ml môi trường nuôi cấy) Thực tế mật độ phage lamda hợp lý tối đa 10 l0/ml Tuy nhiên với mật độ lượng DNA phage thu thấp 500ng DNA Vì thể tích nuôi cấy phải đạt 500 -lOOOml để thu luợng DNA phage mong muổn Phát trìên viêc nuôi đê đaí mẫt đô lamda cao: Phát triên việc nuôi cấy với dung tích lớn không vấn đề (có thể nuôi cấy 50 lit hay lớn công nghệ sinh học) Nhưng đê đạt mật độ phage tối đa cần vài kỳ Đối với phương pháp này, tế bào vi khuân đóng vai trò chính, phage lamda xâm nhiễm vào DNA vi khuân tạo dạng prophage Trong trường hợp mật độ phage vô thấp, muốn đạt mật độ phage lamda cao ta cần phải kích ứng đế phage vào giai đoạn sinh tan, kết tế bào vi khuấn chết phóng thích hạt phage vào môi trường Ta kiếm soát chúng thông qua gen cl (gen nằm vùng đột biến nhạy cám với nhiệt - 25- phage) Gen làm nhiệm vụ giúp phage liên kết với DNA tế bào chủ Gen cl hoạt động tốt 30 °c Bình thường tiềm tan xảy ra, 42°c gen cl bị bất hoạt tiềm tan không xảy ra.Sự cám ứng tiềm tan gen cl cách tăng nhiệt độ từ 30°C-42°C Gen cl xâm nhiễm vào DNA Ecoli đế sản xuất phage ngoại bào Ớ 30°c, không cám ứng tế bào nhân đôi Ớ 42°c, nhiệt độ cảm ứng tạo genome phage lamda mong muốn, phage qua trình phân chia, tổng hợp, đóng gói phóng thích Su' chuàn bỉ phaỉỉe ỉamdíi có khả nàmi tiềm tan: Mặc dù hầu hết phage lamda có tính tiềm tan, nhiều vector tạo dòng tạo từ phage lamda, cách loại bỏ gen cl vài gen khác tiềm tan không xảy Những vector không tiềm tan vào genome vi khuân, chúng xâm nhiễm vào tế bào chu trình sinh tan Đê đạt mật độ phage cao ta bô sung phage vào giai đọan tê bào phát triên thích hợp + Nếu bổ sung phage vào sổ tế bào thấp phage sè giết chết tế bào, mật độ phage + Neu bổ sung phage mật độ tế bào cao, nuôi cấy sè không hoàn tất lượng tế bào dư, mật độ phage +Thích hợp nuôi vi khuân mức cho phage vào mức đó, tạo cân bằng, việc nuôi cấy phát triển tốt, mật độ phage cao Đe xử lý vấn đề tốt cần kỹ kinh nghiêm Thu nhãn ghage từ viêc nuôi cay nhiễm: Những tế bào vi khuân tan tế bào nguyên sót lại loại bó khỏi dịch huyền phù ly tâm vấn đề ta phải giảm thê tích dịch huyền phù 5ml hay hơn, để dế kiểm soát lượng DNA, ta làm nhu sau: Khử protein phage PEG (là hợp chất polyme chuỗi dài) + NaCl + H 20 hấp thụ Các chất làm hạt phage dính lại với Sau ly tâm với tốc độ cao hạt phage với mảnh vỡ tế bào sót lai sau ly tâm lắng xuống đáy Loại bỏ phần dịch lơ lửng ta lượng phage với thể tích mong muốn Sir tỉnh sach DNA phage từ hat phíige thu đươc trên: Sự khử protein nhờ PEG chửa đủ lượng DNA phage, DNA phage thường xen lẫn với phần chất thu nên lượng phage thu có thê chứa mãnh vờ vi khuân, có thê DNA tê bào không mong muôn Ta có the sau ly tâm tinh hạt phage CsCl với phương pháp ly tâm độ đậm gradient Các hạt phage gradient CsCl có mật độ 1.45-1.50g/cm Việc lấy phage giong lấy DNA mô tả trước Loại bở CsCl tham tích đế phage DNA chiết xử lý phenol protease đế làm tan protein phage Su tỉnh sach DỈSA MI ỉ ỉỉảy mỗt vài van đề: Sự khác M13 lamda thuận lợi đe nhà sinh học phân tử chuân bị DNA M13 Sợi đôi MI3 giong sổ plasmid có sổ lượng lớn dễ dàng tinh phương pháp tinh plasmid Chuấn bị chất chiết tế bào từ tế bào nhiễm M13, M13 tách khỏi DNA vi khuân ly tâm tỷ trọng EtBr-CsCl DNA sợi đơn M13 chứa vỏ protein MI3 Thuận lợi so với lamda M13 dễ đạt mật độ cao, tiềm tan không xáy Đe đạt mật độ M13 cao ta cần tăng số lượng tế bào bị nhiềm lên Mật đô M13 đạt 10l2/ml cao cách dễ dàng không dùng chất ức chế đặc biệt Mật độ M13 cao có ý nghĩa việc chuẩn bị DN A sợi đơn M13 từ việc nuôi cấy thê tích nhỏ ml hay Trong trường hợp tiềm tan, vấn đề với mảnh vỡ tế bào sót lại dịch huyền phù Thường ly tâm gradient CsCl cần thiết phage lamda không cần thiết M13 Tóm lại, chuấn bị sợi đơn DNA M13 liên quan đến việc nuôi cấy nhiễm với tích nhở, ly tâm đế loại bỏ tế bào vi khuấn, tủa phage M13 với PEG, dùng phenol để loại bỏ vỏ protein, tủa ethanol đế thu DNA Sự chuân bị DNA M13 vi khuân qua giai đoạn sau: a Nuôi cấy tế bào bị nhiễm b Ly tâm loại bỏ tế bào Te bào lắng đáy, M13 lại dịch huyền phù c Thêm PEG vào dịch huyền phù, ly tâm đe tủa M13 d Phage M13 lơ lửng buffer e Thêm phenol loại bỏ vỏ protein thu dịch DNA M13 f Thêm ethanol đế tủa DNA M13, DNA lắng đáy g Thư DNA M13 thể tích nhỏ G Phương pháp tách chiết RNA: $ Phưong pháp tách chiết RNA tồng số: Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân huỷ RNase Hơn nữa, RNase lại có mặt khắp nơi (có nhiều ngón tay người thao tác, ), có hoạt tính cao bền vừng với tác nhân thương dùng đế loại bỏ enzyme (việc xử lý nhiệt 90°c không làm hoạt tính RNase) Vì lý đó, việc tách chiết RNA đòi hởi nhiều biện pháp thận trọng đe tránh tạp nhiễm RNase từ môi trường: thao tác điều kiện vô trùng, dụng cụ, hoá chất khử trùng nhiệt hay hoá chất, tránh tiếp xúc với dụng cụ bàng tay trần Phương pháp tách chiết RNA toàn phần bao gồm bước DNA: Te bào, mô nghiền dung dịch gồm chất tay mạnh (SDS, sacrosyl) nồng độ cao, tác nhân gây biến tính protein mạnh (guanidinium thyocyanate), chất khư (2- mercaptoethanol) Hai loại chất sau có tác dụng ức chế hoạt động RNase nội bào tách protein liên kết khỏi phân tử RNA Các protein loại bỏ khỏi mẫu qua xử lý phenol-chloroíbrm ly tâm RNA hoà tan pha nước tủa ethanol thu nhận lại qua ly tâm RNA báo quán năm dạng tủa dung dịch ethanol đông lạnh -70°c nước có chứa RNAsine (một chất ức chế RNase) £ Tách chiết tRNA, lìiRNA, rRNA: Khoảng 80% tổng số RNA tế bào rRNA, 15% tRNA Các RNA có kích thước trình tự xác định tách chiết dễ dàng kĩ thuật ly tâm, điện di, Riêng mRNA chiếm khoảng 5% tổng số RNA tế bào, lại có kích thước trình tự vô đa dạng Tuy nhiên chúng có đặc điếm chung có cấu trúc đuôi polyA (có thê lên tới 100A) Dựa vào cấu trúc đặc tính liên kết bô sung A-T NA người ta tách mRNA khỏi mẫu sắc kí lực oligodT-cellulose Dựa vào nguyên tắc trên, thương trường xuất nhừng kit (bộ mẫu thử) sử dụng viên bi từ có mang oligodT bề mặt Sau mRNA bám lên bề mặt viên bi từ thông qua liên kết bô sung với oligodT, viên bi thu nhận qua ly tâm, mRNA tách khỏi viên bi bàng cách rửa dung dịch đệm có hàm lượng muối thấp giữ lại Kĩ thuật cho phép thu nhận mRNA mẫu có khối lượng nhỏ Sau trình tinh sạch, NA đươc tinh nhờ số kĩ thuật siêu ly tâm, sắc kí hay điên di Triền vong kết nghicn cửu thành công hat nano-carbon từ boc silica cùa TS Ntiuvễn Chánh Khê Lần Việt Nam, quy trình xét nghiệm sinh học phân tử phát định lượng virus công nghệ nano-carbon từ thử nghiệm thành công nhóm nghiên cứu TS BS Phạm Hùng Vân, giảng viên môn vi sinh, khoa y, Đại học y dược TP.HCM Có kết quà nhờ vào việc làm chủ công nghệ chế tạo hạt nano-carbon từ bọc silica TS Nguyễn Chánh Khê (Trung tâm công nghệ cao TP.HCM) đế ứng dụng vào công nghệ tách chiết - 29- nucleic acid Kết mở nhiều triển vọng cho lĩnh vực công nghệ sinh học Việt Nam Vai trò hạt từ bọc silica Đe thực xét nghiệm PCR hay RT-PCR phát hiện, định lượng tác nhân vi sinh vật gây nhiễm trùng có mặt mẫu thử (bệnh phâm) khâu tách chiết nucleic acid từ mẫu thử khâu quan trọng Tùy thuộc vào tác nhân vi sinh vật, nucleic acid đích DNA hay RNA, tùy thuộc vào mẫu thử mà người làm xét nghiệm chọn phương pháp tách chiết nucleic acid thích hợp Trong nhiều phương pháp tách chiết nucleic acid phòng thí nghiệm PCR chân đoán sử dụng nay, phương pháp BOOM lựa chọn nhiều có the sử dụng cho nucleic acid đích DNA hay RNA cho nhiều loại bệnh phâm khác (phương pháp René BOOM, Trung tâm hàn lâm y học, Đại học Amsterdam Hà Lan phát minh vào năm 1989) Phương pháp BOOM hoạt động dựa nguyên tắc môi trường chaotropic, nucleic acid có khả bám lên hạt silica nhờ mà nucleic acid tách chiết từ mẫu thử Mặc dù phương pháp đơn giản hiệu nhung vần chưa thể tụ - động hóa thao tác phái có nhiều lần ly tâm dịch tách chiết để thu hồi silica Chính nhiều hãng sản xuất nghiên cứu cải tiến phương pháp BOOM, đưa phương pháp tách chiết nucleic acid đơn giản mà đạt hiệu cao Cải tiến thay phải dùng dung dịch hạt silica, người ta chế tạo màng lọc xốp bàng silica nhờ mà có thê tách chiết nucleic acid cách dùng ly tâm hay bơm hút chân không để dịch tách chiết mầu thử qua lọc xổp silica Một cải tiến chế tạo hạt từ bọc silica, dùng hạt từ bọc silica đê tách chiết nucleic acid từ dịch tách chiết mầu thử Đột phá phương pháp dùng hạt từ bọc silica có the tự động hóa máy thao tác mẫu mà phương pháp BOOM cổ điến hay phương pháp dùng màng lọc silica không thê áp dụng Có nói dù công nghệ hạt từ bọc silica công nghệ ưu việt ứng dụng tách chiết nucleic acid, nhiên có số hãng đưa thuốc thử tách chiết nucleic acid dựa công nghệ hạt từ bọc silica Lý hạn chế có vài nhà sản xuất nắm công nghệ nguồn sản xuất hạt từ bọc silica, hãng sản xuất thuổc thử tách chiết nucleic acid phải dựa vào nguồn cung cấp nhà sản xuất hạt từ bọc silica Làm chủ công nghệ chế tạo hạt nano- carbon từ bọc silica Mới Việt Nam, vào cuối năm 2007 vừa qua nhóm nghiên cứu có làm việc với TS Nguyễn Chánh Khê khu công nghệ cao TP.HCM (TS Khê người am hiểu công nghệ nano-carbon), nội dung làm việc xoay quanh chủ đề “ứng dụng công nghệ nanocarbon vào sản xuất hạt nano-carbon từ bọc silica” Ngày 16/2/2008 TS Nguyễn Chánh Khê nhóm nghiên cứu giao cho loại nano-carbon từ đê thử nghiệm Chúng đà chọn loại để thử loại nano-carbon từ có bọc silica Nhóm nghiên cứu tập trung thực nội dung: chọn thuốc thử, quy trình, đổi tượng để thử nghiệm tách chiết DNA, RNA loại hạt nano-carbon từ Ket cho thấy tất loại hạt nano-carbon từ bọc silica TS Nguyễn Chánh Khê sau rửa nhiều lần nước miliQ (nước khử ion tuyệt đổi tinh sạch) có khả tách chiết tinh DNA Với kết thành công đàu tiên này, tiếp tục thử nghiêm khả tách chiết DNA hạt nano-carbon từ đối tượng mẫu thứ thật huyết bệnh nhân xác định dương tính virus viêm gan B (là virus DNA) Chúng thấy loại hạt nano-carbon từ có khả tách chiết DNA vi sinh vật từ mẫu thử thật với hiệu Thử nghiệm khả tách chiết RNA mầu thật huyết bệnh nhân xác định dương tính virus viêm gan c (là virus RNA), ghi nhận loại hạt nano-carbon từ (có ký hiệu 200428-95-5 200428-95-7) có khả tách chiết RNA, loại hạt nano-carbon từ lại khả Chúng tiếp tục thử nghiệm thêm hiệu tách chiết RNA loại hạt nano-carbon từ (có ký hiệu 200428- 95-5 200428-95-7), mẫu huyết xác định dương tính HCV, ghi nhận loại hạt nano-carbon từ cho hiệu tách chiết RNA vi sinh vật từ mầu thử tốt Qua kết thử nghiệm nói trên, cho nhóm nghiên cứu TS Nguyễn Chánh Khê làm chủ công nghệ chế tạo hạt nano-carbon từ bọc silica đe ứng dụng vào công nghệ tách chiết nucleic acid Ket nghiên cứu thành công TS Khê giúp nhà khoa học (trong lĩnh vực công nghệ sinh học) nước thêm nhiều thuận lợi đơn giản hơn, lại tăng hiệu công nghệ tách chiết nucleic acid tác nhân vi sinh vật đích có mặt mẫu thử đế phát định lượng xét nghiệm PCR định tính hay định lượng Đây sở đe nhà nghiên cứu công nghệ sinh học nước tiếp cận công nghệ tự động hóa khâu tách chiết nucleic acid đích - khâu khó tự động hóa xét nghiệm PCR, mà có Roche Diagnostic làm chủ nhờ có công nghệ hạt từ bọc silica ứng dụng hạt nano- carbon từ bọc silica Hạt nano-carbon từ bọc silica áp dụng tách chiết DNA, RNA có nhiều khả ứng dụng khác áp dụng xét nghiệm dấu vân tay, phát quan hệ huyết thống, truy tìm tông tích, phát thủ phạm công nghệ giải trình tự (tinh sản phâm giải trình tự) Đây nội dung mà nhóm nghiên cứu triển khai thực hiện, dựa hạt nano- carbon từ bọc silica TS Nguyễn Chánh Khê nhóm cộng nghiên cứu chế tạo Thành công kết nghiên cứu hạt nano-carbon từ bọc silica mở trien vọng khác là: thuơng mại Hiện phải đặt mua thuốc thử tách chiết nucleic acid công nghệ hạt từ bọc silica với giá cao: 4.000 USD/50 ml Lý sụ đắt giá chồ có nhà sản xuất nắm đirợc công nghệ nguồn đe sản xuất hạt từ bọc silica Việt Nam, theo chúng tôi, nhóm nghiên cún TS Nguyễn Chánh Khê làm chủ đirợc công nghệ nguồn này, với nhiều khác biệt so với sản phâm có mặt thị truờng giới sử dụng hạt nano-carbon từ bọc silica hạt sắt nhiễm từ bọc silica Chính mà hạt nano-carbon tù’ bọc silica TS Nguyễn Chánh Khê che tạo, sau rửa không cần phải báo quán lạnh mà cần báo quản nhiệt độ thuờng, không bị hoạt tính TS.BS PHẠM HÙNG VÂN (Trường đại học y dược TP.HCM) Tài liêu tham kháo: Sinh học phân tử - Hồ HUỲNH THUỲ DƯƠNG- Nhà xuất bán giáo dục Thực tập sinh học phân tử lớp DH06SH Công nghệ sinh học-tập 4-KĨ thuật di truyền Công nghệ gen-GSTS Đái Duy Ban-NXB Khoa Học Kỹ Thuật Giáo trình thực tập sinh học phân tử trường đại học y dược TPHCM Giáo trình sinh học phân tu.pdf www.Google.com ... không mong muốn Có nhiều phương pháp đe loại bỏ DNA NST trình tinh plasmid, việc sử dụng phương pháp riêng lẽ hay kết hợp phương pháp với phân lập DNA plasmid tinh Các phương pháp dựa đặc điếm khác... ethanol đế tủa DNA M13, DNA lắng đáy g Thư DNA M13 thể tích nhỏ G Phương pháp tách chiết RNA: $ Phưong pháp tách chiết RNA tồng số: Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân huỷ RNase Hơn nữa, RNase... phương pháp BOOM, đưa phương pháp tách chiết nucleic acid đơn giản mà đạt hiệu cao Cải tiến thay phải dùng dung dịch hạt silica, người ta chế tạo màng lọc xốp bàng silica nhờ mà có thê tách chiết