CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA, enzyme, protein...

Mối quan tâm hàng đầu củacác kĩ thuật tách chiết NA là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đakhông bị phân huỷ bởi các tác nhân cơ học phân tử bị gẫy do nghiền, lắc

CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾTDNA VÀ RNA

DNA chứa thông tin di truyền của sinh vật Do đó mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân

tử đều bat đầu bằng việc thu nhận một lượng nucleic acid (NA) đủ lớn và đủ tinh sạch đế tiếnhành các thí nghiệm kế tiếp DNA gồm các loại: DNA bộ gen, DNA ty thế, DNA lục lạp, DNAplasmid, DNA phage Tuỳ kích thước DNA, loại tế bào mà chọn phương pháp tách chiết khácnhau đê đám bảo chiết được DNA tinh khiết và có hiệu suất cao Mối quan tâm hàng đầu củacác kĩ thuật tách chiết NA là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đakhông bị phân huỷ bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gẫy do nghiền, lắc mạnh) hay hoá học(phân tử bị thuỷ giải bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ).Các NA cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp đê ức chế hoạt động của các enzymenội bào (DNase, RNase)

Micropipet (pipetman): là loại pipet

có thể chinh được thể tích cần lấydùng đế hút dung dịch thế tích nhỏ, độ chính xác cao

Micropipet có nhiều cỡ:

cấu tạo micropipet thay đổi tuỳ theo kiếu thiết kế nhưng nhìn chung gồm: cầnbơm, ngàm tựa, bộ phận đấy tip, bộ phận điều chỉnh thế tích, sổ chỉ thế tíchđược chọn, đầu hút (nơi gắn tip)

Khi sử dụng cần chú ý:

- Phải gắn chặt tip vào đầu hút nếu không sẽ bị mắc sai sổ

- Không đế pipet tiếp xúc với dung môi hữu cơ, hoá chất

- 1

-Loại Micropipet Đầu tip tương ứng

0.1->10 (màu trắng)10->100, 10->200 10->200 (màu vàng)

100->1000 (màu xanh)

A.2 Trang thiết bi thông dung:

-I3 Bồn U nhiêt, tú đinh ôn: sử dụng trong các phản ứng cần nhiệt độ ổn định thường có bộ

phận điều chỉnh nhiệt độ, cài đặt thời gian

-í 3 Tủ hút khí đỏc: dùng trong các thí nghiệm có hóa chất bay hơi độc như: phenol,

chloroíbrm, ethidium bromide

2

i 3 TÙ cấv vô trùng:

sử dụng trong các phản ứng cần có sự

vô trùng Tủ phải luôn được giữ sạch,

khử trùng bề mặt bằng cồn, trước và

sau khi sử dựng tủ cần được thanh

trùng bên trong bằng đèn tử ngoại

Nồi hấp tiêt trùng: dùng đê khử

trùng các hoá chất và dụng cụ cần thiết

Tù lanh: gồm có tủ mát và tủ âm sâu

(-20°c và -70°C) dùng đế bảo quản hoá chất, mẫu

Máv đo PH: dùng xác định pH của các dung dịch.

Máy Vortex: dùng đế đồng nhất hoá mẫu hoặc dung dịch.

$ Máv ly tâm (ccntriíugc): dùng đe phân tách và thu nhận các phần tử khác nhau trong cùng

một dung dịch Khi sử dụng khối lượng mẫu phải đồng đều và đặt đổi xứng qua trục máy Chỉ

mở nắp khi máy ngưng hoàn toàn

Nguyên tấc: các phần tử khác nhau trong một dung dịch sè lắng với vận tổc khác nhau khi chịutác động của lực li tâm Tuỳ thuộc vào khối lượng và tỉ trọng của các phân tử vật chất màngưới ta chia làm 2 loại ly tâm:

Ly tâm phân đoan: dùng phân tách các phần tử vật chất khác nhau dựa vào khối lượng củachúng Vận tốc lắng của các phần tử phụ thuộc vào lực ly tâm, khối lượng, tỷ trọng và lực masát của các phần tử với dung dịch ly tâm Đe phân tách thành công các phân tử có trong mộtdung dịch cần phải có lực ly tâm và thời gian ly tâm thích hợp

Ly tâm đắng tỷ trong: phân tách các phần tử vật chất dựa vào tỷ trọng của chúng Phương phápnày rất hiệu quả, cho các phân đoạn phân tách thuần khiết Ống ly

(UV) ít nhất 15 phút.

tâm chứa một cột dung dịch có tỷ trọng tăng dần từ trên xuống đáy ổng tạo nên gradient tỉtrọng.

Các phần tử sẽ lắng trong quá trình ly tâm và nằm

trong vùng dung dịch có tỷ trọng tương đương với

nó

Saccharose và Glycerol được dùng khi phân tách các

bào quan, Cesium chloride (CsCl) được dùng để

phân tách protein và NA

A.3 Hoá chất:

$ Nhũng điều cần chủ ý:

- Tất cả các dung dịch hoá chất và nước cần phải được tiệt trùng bằng nồihấp hoặc lọc qua màng lọc vi khuân Neu cần cũng nên báo quản đônglạnh bởi vì vi khuân và nấm phát triên là nguyên nhân phát sinhnuclease (tuỳ theo khuyến cáo mà các hoá chất được bảo quản ở nhiệt

độ phòng, tủ lạnh (4°C) hay tủ âm sâu (-20°C)

- Đe đề phòng tạp nhiễm giữa các nguyên liệu và các dung dịch hoá chấtnên sử dụng đầu pipet và ổng nghiệm một lần rồi vứt bỏ

- Hoá chất ở dạng các dung dịch nếu bảo quản ở dạng kéo dài hoặc lặp đilặp lại việc giải đông thường biến tính Vì vậy, nên chia thành lượngnhỏ sử dụng hết trong một, hai ba lần và bào quán ở -20°c hoặc -70°c

Ví dụ dithiothreitol,

- Người thao tác phải mang găng tay khi tiếp xúc bình đựng hoá chất

- Một vài dung dịch đệm được sử đụng trong các thí nghiệm với cùngthành phần có trong dung dịch đó nhưng với những nồng độ khác nhau,

vì vậy cần phải chuân bị nhùng dung dịch gốc đậm đặc đe có thê phaloãng khi cần

$ Dung dieh gốc:

Tris-HCl IM (pH 7.5): hoà tan 121.1 g trong nước cất Thêm nước đê được 1 lít dung dịch Điều chỉnh pH đến 7.5, phân phối vào lọ và hấp khử trùng

4

Chú ý: nếu màu dung dịch đã chuyển sang màu vàng ta nên bỏ đi và chuân bị hoá chất mới.

- NaCỈ 5M: hoà tan 292.2g NaCl trong nước cất thêm nước đế được 1 litdung dịch Phân phổi vào lọ và hấp khử trùng

- EDTA 0.5M (Ethylene diamin tetra acetat (pH 8.0): hoà tan 186.1gEDTA.2EẸO vào nước cất, vừa khuấy từ vừa thêm NaOH tinh thế đếđiều chỉnh pH đến 8.0 rồi thêm nước đế được 1 lít dung dịch Phân phổivào lọ và hấp khử trùng

Chú ý: EDTA sè không hoà tan vào dung dịch nếu pH không đạt ở mức 8.0

- SDS 10% (Sodium dodecyl sulfate): hoà tan lOOg SDS trong nước cất.Nung nóng đến 68°c đc hoà tan dung dịch Điều chỉnh pH đến 7.2 bằngcách thêm HC1 Thêm nước đê được 1 lít dung dịch

Chủ ý: sử dụng khâu trang khi cân SDS và dọn dẹp khu vực đã cân cùng với cái cân sau khi sửdụng vì tinh thế SDS khuếch tán rất dễ dàng Không cần phải khử trùng SDS 10%

- NaOH 10N: hoà tan 200gNaOH trong 500 ml nước cất Bảo quản trong

- Sarkosyl 20%(w/v) (N-lauroysarkosyl): hoà tan 20g N- lauroysackosyltrong nứơc cất (tăng nhiệt độ để giúp hoà tan) Thêm nước đến lOOml

và hấp khử trùng báo quản ở nhiệt độ phòng Dung dịch có màu vàngnhạt

-RNase lOmg/ml: hoà tan lOmg/ml RNase trong TE, đun sôi 10 đế diệt DNase Chia thành cácthánh phần nhở và bảo quản ở -20°c

Phenol dẽm:

5

• Đun khoảng lOOg phenol (tinh khiết, mới) trên bếp cách thuỷ 65°c chocháy Rót thận trọng phenol đã chảy vào becher 250ml có chứa sẵn

1 OOmg

• 8-hydroxyquinoline, thêm lOOml Tris-base 50mM (không chính pH)

• Đậy bằng giấy nhôm, khuấy nhẹ trên máy khuấy từ khoảng 10 phút ởnhiệt độ phòng Đe yên cho phân lớp Loại bở pha trên (pha nước, lưu ýpha hữu cơ chứa phenol có màu vàng) càng nhiều càng tốt

• Thêm 500ml Tris-HCl 50mM, pH 8, và lặp lại bước trên đến khi phaphenol đạt đến pH 8 (đo bằng giấy)

• Thêm 100 ml Tris-HCl 50mM, pH 8 hoặc đệm TE

• Bảo quản ở 4°c được 2 tháng trong chai nâu hay chai bọc giấy nhôm

• Sử dụng: trộn với chloroíòrm với tỷ lệ 1/1 hoặc với chloroíbrm -isoamyl alcol theo tỷ lệ 25/24/1

• Chủ Ỷ: phenol và chloroíòrm đều có tính rất độc cần mang bao tay vàtránh hít hơi bay ra Phenol dễ cháy và làm phỏng da tay cần giữ lại tất

cả những dụng cụ có dính phenol và vứt bỏ an toàn

- Ethidium bromide 1000X (5mg/mp: 0.1 g Ethidium bromide trong 20

ml nước cất Bảo quản ở nhiệt độ phòng trong lọ bọc giấy nhôm đêtránh ánh sáng

Chú ý: hoá chất này rất độc có thế gây ung thư Phải mang găng tay khi thao tác và pha chếtrong tủ hút khí độc Bảo quản ở nhiệt độ phòng

- Lysozyme: 20mg/ml trong nước cất Lọc tiệt trùng và chia thành cácphần nhỏ (250ul), bảo quán ở -20°c

- Protein K 20mg/ml Pha dung dịch mẹ 20mg/ml trong dung dịch gồmTris-HCl pH7.5 10mM vàNaCl lOmM

B Nguyên tắc chung:

Quá trình tách chiết DNA trái qua 3 giai đoạn:

Giai đoan 1: phá vỡ tế bào bằng phương pháp vật lí hay hóa học Tuỳ từng loại tế bào, có

cấu tạo thành và và màng tế bào khác nhau, chọn phương pháp áp dụng thích hợp, riêng lẽ hayphối hợp

Ví du: đổi với tế bào thực vật thường ta nghiền tế bào trong nitơ lỏng đế phá vỡ vách tế bàohoặc dùng các chất tây đế phá màng tế bào Còn đổi với tế bào vi khuân người ta thường dùnglyzozyme và EDTA đế phân giải màng

Giai đoan 2: loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu (protein, lipit,

polysaccharide ) chủ yếu là protein Mầu được lắc thật mạnh trong một dung dịch phenolhoặc phenol/chloroíbrm (1:1) sau đó bằng chloroíbrm hoặc chloroíbrm-isoamyl alcolhol (24:1).Dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein, đồng thời không hoà tan NA vì thế sau khi lytâm protein sẽ tủa thành một lớp nằm giũa pha nước có chứa NA và pha phenol/chloroíbrm.Pha nước có chứa NA sẽ được thu nhận lại

Chiết xuất bằng phenol:

Nguyên lý của việc sử dụng phenol trong chiết suất DNA nhu sau:

- Tuy ở nhiệt độ thường phenol ở dạng tinh thế rắn (tan chảy ở 80°C)nhưng khi lẫn với 20% nước (v/v) thì phenol ở dạng nhũ tương gồm cácphân tử phenol ở giữa và các phân tử nước vây quanh

- Khi pha hồn hợp này với dịch tế bào, các phân tử phenol có tính kị thuỷnên có khuynh hướng liên kết vào vùng kị thuỷ của protein ở bên trongcấu trúc của các phân tử này, kết cục làm protein trương phồng lên và lộxuất nhóm bên kị thuỷ (của gốc amino acid) ra ngoài Các nhóm kị thuỷnày của protein khi đó kết hợp

với nhau tạo thành búi kết tủa gồm nhiều phân tử protein khác nhau Trong khi đó DNA vẫn làchất tan trong nước và có thê hút sang ổng chứa khác.

Phenol có ưu điếm có thể tan trong nước (ở mức độ nhất định) nên không cần khuấy trộnnhiều cũng có thể làm biến tính protein (vì khuấy trộn nhiều có thế làm đứt gẫy DNA) Trongkhi đó sử dụng chloroíòrm hoặc chloroíbrm-isoamyl alcolhol thì phải trộn đảo kĩ vì các chấtnày không tan trong nước Tuy nhiên nhiều lúc cần phái loại bỏ hoàn toàn phenol khởi dungdịch, khi đó cần phải lặp lại việc chiết xuất bằng chloroíbrm hoặc ether Sử dụng cả hai loạidung môi hữu cơ thường cho hiệu quả cao hơn Pha thêm chloroform vào phenol làm tính kịthuỷ của phenol tăng lên và làm tăng hiệu quả biến tính protein

Giai đoan 3: tủa NA.

Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận NA dưới dạng cô đặc, một mặt nhàm báo vệ chúngkhỏi sự phân huỷ của các enzyme, mặt khác đế có thế hoà tan chúng lại trong dung dịch theonồng độ mong muốn Hai cách tủa thông dụng là:

&Tiía trong ethanol: việc tủa này được thực hiện trong môi trường có lực ion cao (nồng độ

muối cao), và nồng độ ethanol cao (2.5:1), nhiệt độ thấp tạo thuận lợi cho việc tủa Hầu nhưtoàn bộ NA đều tủa trong các điều kiện nêu trên

&Tủa trong isoproỊĩanol: diêm khác biệt so với phương pháp tủa trong ethanol là không cần

sự hiện diện của muối (1:1) Các phân tử DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị tủa, do đóchúng bị loại ra

Trong cả hai phương pháp, NA sê được thu nhận lại bàng li tâm Sau đó cặn tủa phải đượcrứa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại trênmầu Tiếp theo nó sẽ được hoà tan trong nước khử ion hoặc dung dịch đệm đế bảo quản

Ket tua bằnií ethanol:

- Cho 2.5 lần ethanol vào dung dịch DNA có chứa sodium acetate và NaCl nồng độ 0.2M trởlên, trộn đều rồi cho vào buồng lạnh -20 hoặc -70°c đế kết tủa Có thế thay NaCl bằng sodiumphosphate với lượng rất nhỏ cũng có thế kết tủa DNA.Tuy nhiên nếu dùng muối này thì cầnphải thâm tích đế loại bỏ muối này

- Duy trì nhiệt độ thấp (khoảng 10-15 phút ở -70°c, hoặc khoảng l-12giờ

ở -20°c

- Quay ly tâm ở 15 phút ở 4°c với tốc độ 15000 v/ph đế tâp trung kết tủa.Trước khi ly tâm có thế thấy kết tủa trắng trong ống nghiệm, khi đó chỉcần ly tâm nhẹ 3000 v/ph ở 4°c trong vòng lOphút cũng đủ tập trungkết tủa Thậm chí có thể dùng móc thuỷ tinh móc riêng phần tủa DNAdưới dạng sợi trắng khỏi dịch ethanol nếu hàm lượng DNA đú lớn

- Bỏ nước mặt, để loại bó muối, cần thêm (khoảng hai lần thể tích mẫu)ethanol 70% vào ổng, lại ly tâm rót bỏ ethanol Neu nhiều DNA thì cóthể nhúng móc mang DNA vào lọ chứa ethanol 70% một ít phút, lượngmuối trong DNA sẽ giảm

- Sấy khô hoặc hong khô ống chứa DNA rồi thêm dung dịch đệm TEhoặc nước cất đế có dung dịch DNA với nồng độ thích hợp

Chủ ý: có thế thay ethanol bằng isopropanol với lượng nhở hơn (lượng tương đương với dịchDNA) khi cần kết tủa DNA trong dịch khá lớn với ống không thế thêm 2.5 lần thê tích ethanol.Tuy nhiên sau đó nên kết tủa lại với ethanol vì khó làm khô isopropanol, ít hoà tan muối và chỉdùng isopropanol khi thật cần thiết vì có mùi khó chịu

Kết túa bằnu butanol:

Thêm vào dịch DNA một lượng tương đương n-butanol, trộn đều rồi ly tâm nhẹ Hút bỏbutanol rồ thêm vào lượng butanol khác và lặp lại thao tác trên

Hút bỏ butanol rồi thêm vào một lượng tương đương ethyl ether so với lượng dịch còn lại.Quay ly tâm rồi hút bỏ ether (ether sẽ chiết xuất butanol khỏi dịch)

Loại bỏ vết ether còn lại bằng cách bơm không khí (tốt hơn là nitơ) qua ống hút Pasteur vàotrong ống nghiệm đế làm khô mẫu Cũng có thế dùng buồng áp suất thấp (buồng chân không)

đc làm bay hơi ether

Hoà tan DNA vào TE hoặc nước cất

Phươnti pháp sử dung côt (DEAE-cellulose column)

Cột DEAE- cellulose có thế được chế từ pipet loại 1 ml hoặc ống hút Pasteur Trước tiên lấymột ống sạch, nhét vào chồ thắt của ống một lượng nhỏ bông đã loại dầu mỡ, hấp cao áp tiệttrùng.

Cho lên lớp bông khoảng 0.2 ml Sephađex50 đã tiệt trùng, rồi cho lên đó khoảng

1. 1 ml DE 52 cũng đã tiệt trùng (hai chất liệu được hoà riêng trong nướcrồi hấp cao áp)

Cho dịch DNA chảy qua ổng đế hấp phụ DNA , dịch qua lần đầu được rót cho đi qua cột lầnnữa

Rửa cột bằng dung dịch đệm với một lượng gấp mấy lần thê tích cột, chứa Tris- HC1 (pH 7.5)lOmM, NaCl 50mM và EDTA lmM

Dung xuất bằng dung dịch đệm nêu trên nhưng với nồng độ NaCl cao hơn, chứa Tris-HCl (pH

7.5) lOmM, NaCl 1.0M và EDTA lmM Kết tủa bằng ethanol Thầm tích

Ngâm ống thẩm tích (túi thẩm tích, có thể mua được từ một số hãng) trong nước chứa EDTAkhoảng 50mM rồi đun sôi trong 10 phút

Thay nước cất mấy lần, quấy đế rửa sạch

Đe nước cất vậy mà hấp khử trùng 10 phút, rồi bảo quản ở 4°c Tuyệt đối không để màng(ống) thẩm tích bị khô nước

Thực hiện thâm tích Cho mẫu dịch nguyên liệu vào ống thâm tích, kẹp chặt hoặc buộc chặthai đầu, cho vào bình (chậu) chứa khoảng 500-1000 lần thê tích dung dịch đệm Ngoại dịchnày có thế cần phải thay trong trường hợp thấm tích phenol trong DNA trong khi cần kéo dàithời gian thấm tích đến 48 giờ Neu thâm tích CsCl khỏi DNA plasmid thì cần khoảng 4 giờ

c Phưong pháp ly trích DNA ỏ’ thưc vât:

Nguyên tấc:

Chiết tách DNA bộ gen từ các mô thực vật có vấn đề khó khăn là phải phá vách tế bào rất cứng và phải loại các polisaccharide Việc tách chiết DNA thực vật có nguyên tắc chung đó là:

10

- Nghiền các mô, tế bào bằng biện pháp cơ học (nghiền mô trong đá khô,nitơ lỏng bằng cối, chày, sứ) để phá vờ thành cellulose, giái phóng cácthành phần bên trong tế bào.

- Sử dụng đệm có chất tẩy (CTAB) đế phá vỡ màng nhân, giải phóngDNA

- Sử dụng các hoá chất (phố biến là EDTA) đế bảo vệ DNA khỏi sự phânhuỷ bởi các enzyme nuclease nội bào

- Sử dụng các hoá chất như chloroíbrm, isoamyl alcohol, phenol đế loạiprotein và các tạp chất ra khỏi DNA

- Thu hồi DNA bằng cách kết tủa DNA trong cồn, hoặc isopropanol, sau

đó li tâm thu lấy kết tủa DNA

- Hoà tan DNA bằng nước cất hoặc dung dịch đệm

- Loại bỏ RNA bàng cách sử dụng men RNaseThực tế, những phức hợp polysaccharides và phenol khác nhau ở nhiều dạng thực vật, vì thế sè

có những phương pháp ly trích khác nhau phù hợp cho từng dạng đó Ví dụ, mô thực vật cómột lượng lớn phức hợp của phenol thì ta sẽ thêm vào dung dịch ly trích những tác nhân làmgiảm hoặc hoà tan phức hợp đó

PhưoTig pháp dùng CATB:

Là phương pháp ly trích sử dụng chất có hoạt tính bề mặt là cation CTAB Đây là phương phápđơn giản nhất thường được sử dụng nhất khi ly trích DNA từ thực vật cho phép thu được mộtlượng DNA tinh sạch lớn, DNA có thế được tách ra từ trong những thành phần có nhiều phứchợp polysaccharide và protein bàng sự thay đôi nồng độ muối trong dung dịch

pH dung dịch gây tổn hại đến phân tử DNA Dung dịch Tris-HCl sê đáp ứng đế ngăn chặn sựgiảm nhanh pH.

- Ngoài ra, Mg2' sê kích hoạt men DNase làm phân huỷ DNA, vì thế sẽlàm giảm lượng DNA trong mẫu EDTA là một chelate và hấp thụnhững ion dương đó bằng cách tạo phức

- CTAB là một ion dương có hoạt tính bề mặt, nó sè tạo phức với DNA làion âm trong dung dịch Khi nồng độ muối trong dung dịch lớn hơn0.7M, phức hợp DNA-CTAB được hoà tan trong dung dịch Và khinồng độ muối trong dung dịch nhỏ hơn 0.7M thì phức họp DNA-CTAB

sẽ được tủa NaCl thêm vào để điều khiến nồng độ muối trong dungdịch Và như thế, mercaptoethanol và PVP thường thêm vào dung dịch

ly trích đế bảo vệ DNA

- Hơn thế nừa, phenol và chloroíorm được thêm vào đế biến tính cácphần tử tạp như protein và sắc tổ ĩsoamylalcohol loại bỏ bọt và ngăncản sự tạo bọt trong dung dịch khi trộn và ôn định 2 pha nước và phenolhoặc chloroíbrm sau ly tâm Khi mẫu được ly tâm, trong eppendorf sẽphân tách thành ba lớp Lớp thứ nhất là dung dịch DNA, lớp giữa lànhững cặn bã và protein, lớp cuối cùng là phenol hoặc chloroíòrm

- Isopropanol thêm vào để phân tách thu nhận DNA Vì đặc tính củaDNA thường tủa trong dung dịch isopropanol hoặc ethanol khi có sựtồn tại của những ion dương Na+, K+ Trong trường hợp này, RNAkhông được tủa do nó bị thoái hoá thành nucleoside triphosphate DNAtủa được rửa bằng dung dịch ethanol 70% đê loại bỏ CTAB và NaCl.Bởi vì, DNA không hoà tan được trong ethanol nên nó được giữ ở trạngthái kết tủa Sodium acetate, potassium acetate hoặc ammonium acetateđược thêm vào đế tủa và hồi tính lại DNA

- Sơ dồ:

D Phuong pháp jỵ trích DNA từ nấm:

Mục đích - Ỷ nghĩa

Đa số các loài nấm thường được phân biệt dựa vào hình thái phát triển, hình dạng đặctrưng, kích thước bào tử, môi trường chọn lọc hay tính chất sinh hoá Ngày nay, kỳ thuật sinhhọc phân tử cho phép xác định chính xác tên loài, những đặc điểm di truyền của cá thế và quầnthế Trên cơ sở đó tạo nên tiền đề cho phương pháp định danh bàng phân tử, các nghiên cún sâuhơn về gen, hệ enzyme hay protein Từ những mục đích đó, vật liệu ban đầu không thê thiếuđược đó là ly trích được DNA tông sổ của nấm Sau đây là phương pháp ly trích DNA từ nấmđơn gián và thường sử dụng trong phòng thí nghiệm

Phuong pháp

Nghiền mẫu

Mầu được nghiền trong nitơ lỏng thật mịn, và trong quá trình nghiền nitơ được bố sungliên tục Mầu nghiền tránh tạp nhiễm và phải đồng nhất nhau về lượng đê thuận tiện trong quátrình ly trích Mầu nghiền xong cho vào eppendorí 1.5 ml (1/2 thê tích), eppendorf đựng mẫuphải giữ trong nitơ lỏng hay trong tủ -

80°c

Qui trình ly trích

13

2. Phần bột nấm được cho vào eppenđorf 1.5 ml (1/2 thế tích) và thêm vào

đó 500 ul lysis buffer Trộn đều bằng máy vortex, đem mẫu ủ trong bồnwarter bath ở 65°c khoảng 1 - 2 giờ

3. Lấy mẫu ra và thêm 300 ul dung dịch phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1), trộn đều nhẹ bằng máy vortex khoảng 30 giây Lytâm mẫu 13500 vòng/10 phúƯ4°C

4. Hút khoáng 450 ul phần dịch nổi bên trên cho vào eppendorí 1.5 ml mới.Lặp lại bước 2, nhưng thay bằng dung dịch chloroíbrm / isoamylalcohol(24:l)

5. Thêm 0.6 thế tích isopropanol và 0.03 thố tích sodium acetate vàoeppendorf 1.5 ml trên, đảo eppenđorf thật nhẹ nhàng khoảng 8-10 lần.Đem mẫu ủ ở -20°c trong 30 phút

Mỏt số điều cần lưu ý Chú ý trong thao tác

Các chất sử dụng phải được vô trùng , bàn thí nghiệm và tay luôn được giữ sạch Tránhthao tác mạnh có thế làm tổn hại đến DNA Chú ý: SDS và ammonium acetate không được khửtrùng trong nồi hấp

Lưọng mẫu ly trích

So sánh lượng mầu trong Protocol với lượng mẫu thực tế, nếu lượng mầu thực tế lớn gấpđôi thì phải tăng thế tích các chất lên gấp đôi, thòi gian ly tâm và thời gian ủ không thay đổi.Tuy nhiên, khi làm với lượng mẫu nhiều thì ảnh hưởng đến quá trình ly tâm, thao tác cân thận

và mức độ trộn của dung dịch kém

Tuổi mẫu

Mầu sử dụng cho ly trích tốt nhất ở giai đoạn còn trẻ, có nghĩa là tế bào đang ở giai đoạntrướng thành, các quá trình sinh lý, sinh hóa hoàn chính.

Nghiền mẫu

- Cân thận khi thao tác với nitơ lỏng

- Mầu phải được nghiền thật mịn

- Tránh tạp giữa các mẫu trong quá trình nghiền

- Mầu nghiền được lấy và trữ trong tủ âm sâu không quá 2 tuần Tốc độ

và thòi gian ly tâm

Không cần điều chỉnh tốc độ và thời gian ly tâm chính xác sau khi trộn mầu vớichloroíbrm và isoamylalchohol hoặc hồi tính lại DNA tủa Ngoài ra, không cần thiết ly tâm ởtổc độ cao khi ở tốc độ ấy không có sự phân tách

Sản lưọng DNA thu đưọc

- Phụ thuộc vào đối tượng ly trích Phụ thuộc vào thao tác thí nghiệm

- Phụ thuộc vào phương pháp ly trích

E. Phương pháp jỵ trích DNA ở đỏng vât:

Nguvcn tắc:

Có the tách chiết DNA từ các nguyên liệu khác nhau như máu, nước bọt, mô cơ, lông, tóc (cònnguyên chân tóc, chân lông) và các loại mô khác Có nhiều phưong pháp tách chiết khác nhau.Tuy vậy tách chiết DNA có một nguyên tắc chung là:

- Tách tế bào có nhân ra khỏi vật mang

- Phá vỡ tế bào, màng và phân huỷ protein, giải phóng DNA ra khỏi nhân

- Tách DNA ra khỏi đệm và bảo quản DNA ở 4°c

Các bước tiến hành:

Tuỳ theo các nguyên liệu khác nhau mà ta có thê áp dụng một số bước tiến hành khác nhau:

a) Tách chiết DNA từ mỏ dông vât:

Bước 1: Cắt mô thành từng miếng nhỏ Nghiền mô trong nitơ lỏng đế thành bột mịn Cho mẫuvào ổng nghiệm chờ nitơ bay hết Cho khoảng lOOmg mẫu vào ống eppendorĩ loại 1.5ml.Bước 2: thêm 500ul đệm STE (0.1M NaCl, 0.05M Tris-HCl (pH 7.5), 0.001 M EDTA) Hoàtrộn nhẹ nhàng Bố sung 12ul protease K (nồng độ lOmg/ml) và 37ul SDS 10% Trộn đều hồnhợp, ủ ở 55°c trong 2 giờ, thỉnh thoảng lắc nhẹ.

Bước 3: thêm 1 lượng dung dịch PCI (phenol: chloroíbrm: isoamyl alcohol với tỷ lệ 25:24:1)bằng thế tích mẫu, trộn nhẹ, đê ở nhiệt độ phòng 5 phút Ly tâm 9000 vòng/5 phút

Bước 4: chuyến phần dịch nối phía trên sang ống eppendorf sạch Lặp lại bước 3 và 4 một lầnnữa

Bước 5: thêm một lượng dung dịch CI (chloroíorm: isoamyl alcohol với tỷ lệ 24: l)bằng thếtích mẫu, trộn nhẹ, đô ở nhiệt độ phòng 5 phút Ly tâm 9000 vòng/5 phút Chuyên phần dịchnôi sang ổng eppendorf sạch

Bước 6: thêm một lượng Sodium acetate 3M (NaOAc) bằng 1/10 lượng mẫu và một lượng cồnethylic 95% bằng 2.5 lần lượng mẫu ở -20°c ít nhất trong 2 giờ, hoặc qua đêm Ly tâm 9000vòng/10 phút

Bước 7: rửa sạch bằng cồn ethylic 70% Hút sạch ethylic

Bước 8: hoà tan kết tủa bằng 500ul dung dịch TE IX, bảo quản ở 4°c

b) Tách chiết DNA từ máu bang chelex:

Bước 1: lấy lOOul máu tươi, hoặc 1 miếng giáy thấm, hoặc vài đã thấm máu, kích thước 0.5 X

0.5cm cho vào ống eppendorf

Bước 2: thêm lml đệm chiết PBS (137mM NaCl; 2.7mM KC1; lOmM Na2HP04; 2mMKH2PO4) lắc đều, sau đó đế yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Ly tâm 14000 vòng/5 phút.Thu kết tủa

Lặp lại bước 2 khoảng 2-3 lần

Bước 3: Thêm 150ul Chelex, bảo quản ở nhiệt độ 4°c đến -20°c

c) Tách chiết DNA từ máu nhờ muối: