CÁC PHƯƠNG PHÁP sắc ký cột

TS: Ngô Đại Nghiệp Lớp: SHO7B1 Nhóm MSSV  Nguyễn Đinh Diễm Thụy 30700514  Huỳnh Thị Lệ Phương  Nguyễn Anh Tôn  Trần Quốc Nhẫn 30760857 30700536 30700342  Sự tinh protein quan trọng từ protein tinh xác định trình tự acid amin, mối liên hệ tiến hóa protein cá thể khác khảo sát chức sinh hóa protein  Để tinh protein, người ta thường dựa vào đặc điểm tương đồng tính chất khác vốn có  Trong số trường hợp, để dễ dàng cho việc tinh sạch, người ta gắn vào protein đuôi acid amin (tag) - tạo dạng protein dung hợp (fusion protein) Tủa protein Thẩm tích Siêu lọc Sắc ký (Sắc ký giấy, sắc ký cột, Sắc ký lỏng – khí, Sắc lý lực miễn dịch, Sắc ký lực, Sắc ký trao đổi ion, Sắc ký cao áp lỏng…)  Điện di protein (điện gel Agarose, điện di gel Polyacrylamide, điện di protein theo điểm đẳng điện… ) Phương pháp tốt để phân đoạn protein sắc ký cột (column chromatography)     Sắc ký (Chromatography) phương pháp phân tách quan trọng sinh học phân tử thích hợp với nhiều loại hợp chất sản phẩm tinh sử dụng cho việc định lượng định danh Sắc ký cột phương pháp mà chất nhồi (là pha tĩnh: hấp phụ, trao đổi ion, phân bố gen) nhồi vào cột, dùng để phân chia chất hỗn hợp tinh chế chất Thông thường, người ta hoà tan hỗn hợp chất nghiên cứu vào dung môi (pha động) với lượng vừa đủ, nạp lên cột theo cách phù hợp cho chất nghiên cứu lan thành lớp phẳng lên cột; sau đó, tiến hành sắc ký Phương pháp sắc ký dựa vào phân bố khác chất hai pha động tĩnh Có nhiều nguyên nhân đưa đến phân bố khác chất, lặp lặp lại tượng hấp phụ - phản hấp phụ chất dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh nguyên nhân chủ yếu việc tách sắc ký K=Cs/Cm=Nồng độ hợp chất pha tĩnh/Nồng độ hợp chất pha động  Dụng cụ:  Cột sắc kí ( giống buret), gồm ống thủy tinh khóa, không cần vạch chia độ, kích thước lớn nhỏ tùy yêu cầu sử dụng  Chất nhồi cột (pha tĩnh, stationary phase, thường dùng silicagel,) Chất nhồi cột định trình sắc kí  Dung môi: thông thường chọn dung môi phụ thuộc vào chất nhồi cột  Thực hiện: Bước nhồi cột: Sau chọn cột, làm khô cân silicagel cần dùng, pha dung môi chạy hệ hòa tan silicagel vào dung môi Bước nạp mẫu chất vào: Có loại nạp mẫu nạp mẫu khô nạp mẫu ướt Bước 3: sau hoàn tất việc nạp mẫu lót miếng gòn bên mẫu chất để ổn định hệ tiếp tục châm dung môi vào, từ từ thay đổi độ phân cực hệ, Bước mở khóa: lúc cột bắt đầu tách chất, hứng lượng dung môi chảy ra, lần hứng khoảng 1/5 hũ Sau đem chấm hủ bi, hủ có vệt tương tự gom lại, chất Tiếp tục cuối ta tách chất mong muốn Hình học Cấu hình sắc ký Chiều di chuyển pha động Loại sắc ký Phẳng Giấy Đi lên, xuống, từ tâm lan tỏa tròn Phân chia Phẳng Lớp mỏng Cột Cột hở Đi xuống Hấp thu, phân chia, trao đổi ion, lọc gel Cột Sắc ký khí (GC) Nhờ vào ngoại lực Hấp thu, phân chia Cột HPLC Nhờ vào ngoại lực Hấp thu, phân chia, trao đổi ion, lọc gel Đi lên, xuống, Hấp thu, phân từ tâm lan tỏa chia, trao đổi ion, tròn lọc gel VI CÁC LOẠI PHA TĨNH SỬ DỤNG TRONG SẮC KÝ: a Silica gel pha thường:  Silica gel làm pha tĩnh sắc ký chế tạo cách thủy giải silica natri (cho tác dụng với acid sulfiric) để thành acid polysilisic, ngưng tụ polymer hóa để đạt tiêu vật lý cần thiết có hạt với kích cỡ hạt, thể tích lỗ rỗng bề mặt, diện tích bề mặt… yêu cầu  Có thể hiệu chỉnh tính hấp thu silica gel cho silica gel kết hợp với hợp chất khác bazo, dung dịch đệm mức pH xác định Cũng thêm nitrat bạc để làm gia tăng khả tách hợp chất, alcen b Silica gel chế hóa:  Silica gel- tạo nối dùng cho pha đảo Loại silica gel pha đảo có tính phân cực nên có lực mạnh với hợp chất phân cực, giữ chặt hợp chất lại cột Pha động thường nước  Silica gel- tạo nối dùng cho pha thường Thực phản ứng điều chế tương tự nhóm chất cuối dãy thường phenyl, cyano, amino, diol,…  Silica gel – tạo nối dùng cho sắc ký thủ tính Hoạt tính sinh học hợp chất thủ tính đặc trưng tùy theo hóa lập thể chúng Có đối phân có hoạt tính chữa bệnh khí đối phân lại dược tính đó, mà gây độc, thiết phải tách riêng chúng Loại pha tĩnh thủ tính Pirkle Polymer hình xoắn ốc- thủ tính (polysacarid) Cyclodextrin eter vòng (crown ether) Enzyme bị giữ cố định (Immobilised enzymes) Phức amino acid kim loại Cơ chế bắt giữ chất pha tĩnh Tương qua ba điểm Các nối kỵ nước (hydrophobic bond) Tương tác chủ- khách (tương tác chất tan lỗ rỗng có tính thủ tính chủ cyclodextrin) Ái lực thủ tính Phức xuyên lập thể phân Alumina oxid aluminium Al2O3 điều chế với hydroxid aluminium, điều chỉnh độ pH dung dịch phản ứng để sản xuất hạt alumina với bề mặt có tính acid, tính kiềm hay trung tính Nhiệt độ lúc hoạt hóa trình điều chế đặc điểm khác alumina silica gel Muốn có alumina hoạt tính mạnh, cần phải đun nóng 400- 500oC 12- 16 Muốn làm giảm hoạt tính, thêm nước vào  Với sắc ký giấy, thuận tiện sử dụng tờ giấy lọc làm pha tĩnh, việc sử dụng trực tiếp có nhiều nhược điểm  Ngược lại, pha tĩnh làm bột giấy, hạt nhuyễn mịn kích thước tạo nên pha tĩnh đồng nên pha động di chuyển dễ dàng chất tan không lan rộng bề mặt pha tĩnh Gel tên gọi chung cho loại pha tĩnh điều chế từ tinh bôt, agar (polysaccarid) polyacrylamid, chuỗi dây dài nối mạng ngang để tạo thành mạng không gian ba chiều Gel thường sử dụng sắc ký cột điện di Tên thương mại Gel P-2 P-4 P-6 P-10 Gel thích hợp Thể tích gel để tách hợp trương nở chất có trọng nước (ml lượng phân tử /g gel khô) (đơn vị C) 100 – 2.000 800 – 4.000 1.000 – 6.000 1.500 - 20.000 6,5 7,5 Loại gel Sephadex G -10 G – 15 G – 25 G – 50 G- 100 Gel thích hợp Thể gel trương để tách hợp nở nước chất có trọng (ml/g gel khô) lượng phân tử ( đơn vị C) – 700 – 1.500 100 – 5.000 500 – 10.000 1.000 – 100.000 2,5 10 15 Sắc ký cột khô (Dry – column chromatography)  Sắc ký nhanh ( gọi sắc ký chớp nhoáng) (Flash chromatography)  Sắc ký nhanh- cột khô (Dry – column flash chromatography; Vacuum liquid chromatography)  Sắc ký nhanh cột khô biến đổi sắc ký chớp nhoáng, với vài khác biệt sau:  Để gia tăng vận tốc giải ly pha động, sắc ký chớp nhoáng sử dụng lực đẩy từ đầu cột xuống, sắc ký nhanh – cột khô dùng lực hút tạo chân không đầu cột nhờ máy bơm hút loại nhẹ  Sắc ký chớp nhoáng sử dụng pha tĩnh silica gel loại dùng cho sắc ký cột, sắc ký nhanh- cột khô sử dụng silica gel dùng cho loại sắc ký lớp mỏng, cỡ hạt 15- 40 micromet  Trong trình giải ly, sắc ký chớp nhoáng giữ lớp dung môi đầu cột (cột không khô), với sắc lý nhanh- cột khô cột sắc ký rút khô san phân đoạn thu  [1] Nguyễn Kim Phi Phụng; Phương pháp cô lập hợp     chất hữu cơ; nhà xuất ĐHQG Tp.HCM – 2007 [2] A Braithwaite, F.J.Smith Chromatographic methods Kluwer Academic Publishrs Boston- london, 45-501,1999 [3] W.Clark Still, Michael Kahn Abhijit Mitra Rapid chromatographic technique for preparative separations with moderate resolution J Org chem, 1978 http://academics.vmi.edu/chem_aa/CH402/experiment s/ion_exchange.htm http://courses.cm.utexas.edu/jrobertus/ch339k/overhea ds-1/ch5_ion-exchange.jpg [...]... trong cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kế cộng hóa trị Một protein có ái lực với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyển sẽ bị cản trở  Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein  Một dạng rất phổ biến của sắc ký ái lực là sắc ký ái lực miễn dịch Sắc ký lỏng cao áp: Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột. .. cellulose Pha động : là chất lỏng  Trong sắc ký lớp mỏng: Chất hấp thu thông dụng torng sắc ký lớp mỏng là silica gel, là loại pha tĩnh với tính chất rất phân cực Pha động: luôn luôn là chất lỏng  Trong sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng, kiểu triển khai sắc ký thông dụng nhất là pha động di chuyển từ dưới thấp lên trên cao Sắc ký cột hở cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ, được đặt...Đây là phương pháp sắc ký đơn giản nhất ví dụ, hai chất A và B liên tục chảy qua cột có nạp sẵn các các chất hấp phụ Người ta xác định nồng độ các cấu tử trong dung dịch chảy ra khỏi cột và xây dựng đồ thị theo hệ toạ độ: nồng độ cấu tử- thể tích dung dịch chảy qua cột đồ thị này thường gọi là sắc ký đồ hay đường cong thoát (có tác giả gọi là đường cong xuất) Trong phương pháp rửa giải, đầu... động là chất khí: thí dụ trong kỹ thật sắc ký khí Trong trường hợp này chất khí được gọi là khí mang hay khí vecto  Pha động là chất lỏng: thí dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột Trong trường hợp này chất lỏng được gọi là dung môi giải ly (eluant) Sắc ký phân chia (Partition chromatography)  Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí)  Pha tĩnh là chất lỏng, lớp... chất không bị cột giữ lại  Độ phân giải(Resolution ,R)  Từ sắc ký đồ, người ta biết được độ phân giải, ký hiệu R  Độ phân giải của cột sắc ký cho biết cột có khả năng tách các chất riêng ra hay không, được định nghĩa là sự khác nhau về thời gian lưu của hai pic kề sát nhau chia cho giá trị trung bình bề rộng đáy của 2 pic đó Hình học Cấu hình sắc ký Chiều di chuyển của pha động Loại sắc ký Phẳng Giấy... mỏng Cột Cột hở Đi xuống Hấp thu, phân chia, trao đổi ion, lọc gel Cột Sắc ký khí (GC) Nhờ vào ngoại lực Hấp thu, phân chia Cột HPLC Nhờ vào ngoại lực Hấp thu, phân chia, trao đổi ion, lọc gel Đi lên, đi xuống, Hấp thu, phân từ tâm lan tỏa chia, trao đổi ion, tròn lọc gel VI CÁC LOẠI PHA TĨNH SỬ DỤNG TRONG SẮC KÝ: a Silica gel pha thường:  Silica gel làm pha tĩnh trong sắc ký được chế tạo bằng cách... B Trong phương pháp rửa đẩy, sau khi đưa mẫu vào cột, ta cho chảy qua cột một dung dịch rửa chứa chất có ái lực với pha tĩnh lớn hơn các cấu tử cần tách Các cấu tử cần tách sẽ bị chuyển dần xuống phía dưới khi ta tiến hành quá trình rửa cột và tuần tự thoát ra khỏi cột Cấu tử thoát ra khỏi cột đầu tiên là cấu tử tương tác với pha tĩnh yếu nhất, sau đó dần dần đến các cấu tử có ái lực với cột mạnh... dịch chứa hỗn hợp các cấu tử (ví dụ, hỗn hợp hai cấu tử A và B, trong đó A có ái lực với cột nhỏ hơn B) chạy qua cột Các cấu tử A, B chứa trong Vml trước hết sẽ bị giữ lại ở phần trên của cột Sau đó cho dung dịch rửa (thường là dung môi hoà tan các cấu tử) chảy qua cột Lúc đó các cấu tử bị giữ ở phần trên của cột sẽ bị dung môi “rửa” và đưa dẫn xuống phía dưới Cấu tử A có ái lực với cột nhỏ hơn B nên... vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy thích hợp Kết quả thực có sự phân giải cao và phân tách nhanh Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng (paper and thin- layer chromatography):  Trong sắc ký giấy: Pha... mang các nhóm chức hóa học ở dạng ion Có hai loại nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa trao đổi cation Sắc ký lọc gel ( Size exclusion chromatography; gel filtration chromatography)  Pha động chỉ có thể là chất lỏng  Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polymer, trên bề mặt có nhiều lỗ rỗng Sắc ký ái lực (affinity chromatography):  Sắc ký ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các