Các phường pháp sắc ký cột

Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách riêng các thành phần trong một hỗn hợp bằng cách phân chia chúng thành 2 pha: pha động và pha tĩnh. Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống thủy tinh thẳng đứng gọi là “cột” với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ.

NGUYÊN TẮC

Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách riêng các thành phần trong một hỗn hợp bằng cách phân chia chúng thành 2 pha: pha động và pha tĩnh

Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống thủy tinh thẳng đứng gọi

là “cột” với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất hấp phụ

Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp, tùy theo khả năng hấp phụ

và khả năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để được lấy ra lần lượt trước hoặc sau

Chất hấp phụ trong sắc ký cột thừơng dùng là oxid nhôm, silicagel,

CaCO3 , than hoạt tính, polyamid, …Các chất này phải được tiêu chuẩn hóa

Dung môi dùng có thể là 1 hoặc hỗn hợp 2, 3 loại dung môi có tỉ lệ thích hợp.

Với các chất hấp phụ cổ điển, dung môi sử dụng có độ phân cực tăng dần

Cột là những ống làm bằng thủy tinh, đầu dưới có khóa, đầu trên có nút mài để nối với một phễu chứa dung môi, loại này thường được bán sẵn trên thị trường với nhiều loại kích cỡ lớn nhỏ

Việc lựa chọn kích thước cột rất quan trọng Thông thường cột có đường kính nhỏ và chiều dài càng dài thì sự tách càng tốt

NGUYÊN TẮC

KỸ THUẬT TRIỂN KHAI

a Chuẩn bị cột

Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô

Cho bông gòn vào đáy cột (có thể cho thêm một lớp cát mịn sạch).Kẹp cột thẳng đứng trên giá

Cho chất hấp phụ vào cột thường được gọi là nhồi cột

Có 2 cách nhồi cột: nhồi cột ướt và nhồi cột khô

- Nhồi cột ướt: Dùng các chất hấp phụ có khả năng trương

phình như Silicagel, Sephadex …

- Nhồi cột khô: Dùng các chất hấp phụ không có khả năng

trương nở như Al2O3, CaCO3

b Đưa chất phân tích vào cột

Khi đưa chất phân tích vào cột là phải phân tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt thoáng phẳng

Có nhiều phương pháp để đưa chất phân tích vào cột:

- Phương pháp dùng đĩa giấy

- Cho thẳng dung dịch thử lên cột

- Trộn chất thử với một lượng chất hấp phụ:

Trộn dung dịch cần phân tích với một lượng nhỏ chất hấp phụ, trộn đều, sấy khô dung môi rồi cho vào cột bằng cách trải thành một lớp đều trên mặt cột

Trong 3 cách trên, cách cho thẳng dung dịch vào cột là gọn và nhanh hơn cả, nhưng phải đảm bảo các yếu tố sau:

• Chất thử hoà tan hoàn toàn

• Dung dịch chất thử phải nạp vào cột đều

• Khi toàn bộ chất thử đã ngấm hết vào cột mới cho tiếp dung môi mới

• Cho dung môi nhẹ nhàng, không làm xáo trộn mặt cột Nếu chất thử ngấm vào cột tạo thành những lớp có bề dày đều nhau là chứng tỏ kỹ thuật đảm bảo

RỬA CỘT

Rửa cột còn được gọi là giải ly chất ra khỏi cột

Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà có thể tiến hành giải ly cột bằng áp suất thường hoặc áp suất nén

Rửa cột bằng áp suất thường: nghĩa là dung môi chảy ra nhờ vào trọng lực

Rửa cột bằng áp suất nén: Thường cho một dòng khí nén (khí nitrogen hoặc không khí) vào đầu cột

Việc lựa chọn các phương pháp rửa cột khác nhau tùy thuộc vào việc sử dụng kích thước hạt gel làm pha tĩnh và việc sử dụng áp lực để giải ly dung môi ra khỏi cột

Một hợp chất có thể bị chất hấp phụ giữ lại mạnh hay yếu còn tùy thuộc vào độ phân cực của dung môi giải ly

Ở sắc ký cột cổ điển, thường dùng dung môi tinh khiết có độ phân cực tăng dần để rửa cột

Khi sử dụng silicagel đảo pha làm pha tĩnh, thì pha tĩnh có tính hấp thu tỉ lệ với tính thân dầu của hợp chất được sắc ký Pha động sử dụng thường là nước hoặc các hỗn hợp dung môi có chứa nước Như vậy các thành phần phân cực sẽ được giải ly ra trước thành phần không phân cực Phương pháp này được ứng dụng rất hiệu quả đối với các hợp chất có độ phân cực mạnh cao trong thực vật như: saponin hay triterpen

Sự thay đổi từ dung môi này sang dung môi khác phải chuyển từ từ bằng cách pha tỉ lệ tăng dần hoặc giảm dần

Nếu tăng tính phân cực nhanh và đột ngột thì sẽ làm gãy cột Nguyên nhân do các chất hấp phụ như Al2O3 hoặc silicagel khi được trộn với bất kỳ một loại dung môi nào cũng sẽ sinh ra nhiệt làm cho dung môi bốc hơi cục bộ sẽ tạo nên bọt khí làm nứt gãy cột, hiệu quả tách sẽ không tốt

Vận tốc chảy của dung môi rửa cột cũng phải điều chỉnh cho phù hợp; Tốc độ di chuyển của một chất trên mặt hấp phụ phụ thuộc vào dung môi

Bảng sắp xếp dưới đây của Trappe theo thứ tự tăng dần lực phản hấp phụ của một số dung môi:

Ether dầu hỏa - cyclohexan - carbon tetraclorur - tricloroetylene - toluen - benzen - methylclorur - chloroform - ether ethylic -

ethylacetat - pyridin- aceton - n-propanol - ethanol - methanol - nước

Trên thực tế, nhiều khi dùng những dung môi đơn thuần không tách được nên người ta thường dùng hỗn hợp nhiều dung môi

Một số hỗn hợp dung môi thường dùng cho các hợp chất phân cực (dùng cho sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng)

Theo dõi quá trình giải ly cột:

Với các chất cần phân tích có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột

có thể được theo dõi bằng mắt thường

Tuy nhiên, phần lớn các hợp chất thiên nhiên không màu nên việc hứng và kiểm tra các phân đoạn giải ly ra khỏi cột thường bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

Trước khi tiến hành sắc ký cột, người ta dựa vào tài liệu tham khảo

để chọn chất hấp phụ và dung môi, thăm dò bằng SKLM để chọn hệ dung môi tách tốt nhất

Khi chọn được chất hấp và hệ dung môi thích hợp, việc ấn định thể tích của mỗi phân đoạn hứng hay thể tích của mỗi loại dung môi giải

ly cột tùy thuộc vào thực nghiệm và kinh nghiệm của người thực hành

SẮC KÝ CỘT NHANH (Flash chromatography)

Xuất phát từ yêu cầu thực tế là cần phải có một phương pháp tách

và tinh chế các hợp chất thiên nhiên với một lượng mẫu nhỏ, thời gian tiến hành nhanh chóng và làm giảm bớt khả năng phân hủy của các chất có thể gặp trong trường hợp sắc ký cổ điển

Phương pháp sắc ký nhanh đã được nghiên cứu và công bố đầu tiên bởi W CLARK STILL , MICHEAL KAHN, ABHIJIT MITRA vào năm 1978 và được đăng ký bằng phát minh vào năm 1981 (US Patent 4293422)

Sắc ký nhanh là kỹ thuật sắc ký lỏng có sự tác dụng của áp suất không khí, thực hiện trên một cột thủy tinh ngắn.

Nguyên tắc của phương pháp sắc ký nhanh (FC) rất đơn giản, dụng cụ rẻ tiền, sự tách được thực hiện nhanh chóng và có hiệu quả cao

Trong phương pháp sắc ký cột nhanh, người ta sử dụng cột thủy tinh ngắn với các đường kính thích hợp từ 10-50mm tùy thuộc vào lượng mẫu phân tích Dưới đáy cột có gắn một vòi có khóa để dẫn dung dịch ra ngoài

Bộ phận điều chỉnh áp suất và tốc độ dòng chảy gồm bộ phận dẫn khí nén có lắp một van điều chỉnh tốc độ chảy

Chất nhồi cột:

Trong FC, chất hấp phụ chủ yếu là silicagel với các cỡ hạt nhỏ 60mm (230-400 mesh)

40-Dung môi rửa cột:

Dung môi nên có độ nhớt thấp như: CHCl3 , EtOAc, MeOH

Dùng SKLM để tìm hệ dung môi thích hợp sao cho Rf ≥ 0,35

Việc tách đạt hiệu quả tốt nếu sự khác biệt về hằng số Rf của các chất trong hỗn hợp đạt điều kiện Rf >0,15 Nếu không đạt yêu cầu trên thì có thể dùng giải pháp tăng chiều dài cột và giảm lượng mẫu phân tích và điều chỉnh hệ dung môi

Hệ dung môi dùng cho pha thường là các dung môi có độ phân cực thấp như ether dầu hỏa, hexan, ethyl acetat

Hệ dung môi dùng cho pha đảo thường là các dung môi có độ phân cực cao như MeOH, H2O, MeOH-H2O

Áp dụng FC để tách các hợp chất tự nhiên

Hợp chất Nguồn thực vật Chất hấp phụ Dung môi rửa

Neolignans Piperfuto Kasura

Piperaceae SiO2 Hexan-EtOAc

Sesquiterpen Canelle Winterane

Canellaceae SiO2 Ether -Hexanethyl

mm

MeOHMeOH-H2O

Alcaloid

quinolizidin Lipinus argentens Fabaceae Al(Merck)2O3 baz Ether EthylEther

ethyl-MeOH

Nhồi cột:

Đầu tiên cho một lớp bông thủy tinh lót dưới đáy cột, sau đó cho một lớp cát biển Cho từ từ silicagel khô 40-63 mm vào cột, sau đó cho một lớp cát biển lên trên bề mặt lớp silicagel.

Đổ dung môi giải ly lên trên bề mặt của lớp cát biển đến đầy cột, gắn bộ phận điều chỉnh tốc độ chảy lên đỉnh cột Van kim luôn được mở, mở nhẹ nhàng cho dòng khí chảy qua, tay bịt air gió Áp suất trong cột sẽ gia tăng, nén lớp dung môi chảy qua cột nhanh Áp suất được duy trì như vậy đến khi tất cả không khí trong cột bị đuổi ra ngòai Chú ý không được để lớp Silicagel trên đỉnh cột bị khô.

Cho chất phân tích vào cột cũng giống như sắc ký cột thường nghĩa là chất cần sắc ký cũng hòa tan vào dung môi rửa cột, điều chỉnh dòng chảy để nén tất cả dung dịch mẫu vào lớp silicagel, sau đó dùng vài ml dung môi tinh chế

để rửa quanh thành cột Rót dung môi đầy cột, mở van điều chỉnh áp và bắt đầu hứng các phân đoạn Lượng dung môi rửa cột và thể tích các phân đoạn hứng tùy thuộc vào lượng mẫu tương ứng

SẮC KÝ CỘT NHANH KHÔ (Dry-column flash chromatography)

Sắc ký cột nhanh khô là một cải biên của sắc ký cột nhanh, dùng áp suất kém để gia tăng tốc độ giải ly của pha động Kỹ thuật này khác với

FC là cột sắc ký được rút khô sau mỗi phân đoạn thu được

Dụng cụ gồm phễu lọc xốp bằng thủy tinh và áp suất vừa phải

Chất hấp phụ thường dùng là silicagel hoặc Al2O3 dùng cho SKLM

Nạp chất hấp phụ vào phễu lọc ở trạng thái khô, có tạo áp suất kém, gõ nhẹ vào thành phễu để chất hấp phụ được nén đều, tạo thành một khối cứng, đồng nhất, chặt chẽ, có bề mặt phẳng…

Chiều cao của chất hấp phụ không được quá cao, nếu muốn tách một lượng chất nhiều thì dùng phễu có đường kính to

Chất cần sắc ký được nạp vào đầu cột ở dạng khô hoặc ướt để có một lớp mỏng và đều

Lần lượt triển khai từ dung môi không phân cực đến dung môi phân cực Theo dõi quá trình giải ly và thay đổi hệ dung môi thích hợp bằng sắc ký lớp mỏng.

Với những cao trích từ cây cỏ, thường chứa rất nhiều thành phần khác nhau nên thường phải thực hiện sắc ký cột nhiều lần để thu được cấu tử sạch mong muốn

Ưu điểm của sắc ký cột nhanh và sắc ký cột nhanh khô là:

- Tiết kiệm: so với sắc ký cột cổ điển, kỹ thuật này dùng ít chất hấp phụ và ít dung môi hơn Thời gian tiến hành cũng nhanh hơn

- Đơn giản, dễ thực hiện, các dụng cụ thường có sẵn trong phòng thí nghiệm

Một số dụng cụ dùng trong sắc ký cột: