PP KLTN NGUYỄN PHƯƠNG NAM

Trong tình hình nuôi tôm thâm canh và bán thâm ngày càng khó khăn, người nông dân thường lạm dụng việc sử dụng hóa chất và thuốc kháng sinh, gây ra suy thoái môi trường và tạo ra các vi khuẩn đa kháng thuốc . . .(Cục Thủy sản, 2014) Xu hướng hiện nay là sử dụng các chủng vi khuẩn cụ thể được phân lập từ các trang trại nuôi tôm bị ô nhiễm để nâng cao hiệu quả xử lý ô nhiễm môi trường ở các khu vực nông nghiệp (Kumar, 2009), Trong môi trường nước, xạ khuẩn tiết ra các loại kháng sinh làm ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn gây bệnh trong ao nuôi, đặc biệt là Vibrio harveyi, V. alginolitycus, V. Vulnificus (Mohanraj và Sekar, 2013)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ KHOA THỦY SẢN - - BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: Nghiên cứu phân lập số chủng xạ khuẩn có khả kháng khuẩn Thừa Thiên Huế SVTH : Nguyễn Phương Nam Lớp : Ngư Y 46 GVHD : TS Nguyễn Ngọc Phước NĂM 2016 NỘI DUNG THUYẾT TRÌNH I ĐẶT VẤN ĐỀ II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I ĐẶT VẤN ĐỀ Trong tình hình nuôi tôm thâm canh bán thâm ngày khó khăn, người nông dân thường lạm dụng việc sử dụng hóa chất thuốc kháng sinh, gây suy thoái môi trường tạo vi khuẩn đa kháng thuốc (Cục Thủy sản, 2014) Xu hướng sử dụng chủng vi khuẩn cụ thể phân lập từ trang trại nuôi tôm bị ô nhiễm để nâng cao hiệu xử lý ô nhiễm môi trường khu vực nông nghiệp (Kumar, 2009), Trong môi trường nước, xạ khuẩn tiết loại kháng sinh làm ức chế tăng trưởng vi khuẩn gây bệnh ao nuôi, đặc biệt Vibrio harveyi, V alginolitycus, V Vulnificus (Mohanraj Sekar, 2013) II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Xạ khuẩn (Actinobacteria) 2.2 Phạm vi nghiên cứu - Thời gian nghiên cứu: 05/01/2016 đến 08/05/2016 - Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm môn bệnh Thủy Sản, khoa Thủy Sản, trường Đại học Nông Lâm Huế II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phân lập chủng xạ khuẩn từ ao nuôi công nghiệp tôm thẻ chân trắng vùng đất ngập mặn (Rú Chá) Thừa Thiên-Huế 2.1 Nội dung nghiên cứu Đánh giá khả kháng khuẩn chủng xạ khuẩn phân lập với vi khuẩn gây bệnh tôm (Vibrio parahaemolyticus) Đánh giá khả sản xuất enzyme chủng xạ khuẩn phân lập 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập xạ khuẩn Phân lập chọn lọc xạ khuẩn theo Laskshmi, (2008) Thu mẫu Cấy truyền MT2 xử lý 55°C 60 phút Cấy trang MT1 Xử lý CaCO3, ủ 28°C/ ngày Pha loãng,10^-3 2.2.2 Thử khả kháng khuẩn chủng xạ khuẩn 2.2.2.1 Phương pháp đục lỗ thạch Tăng sinh Vibrio parahaemolyticus 20 ml môi tường TSA % NaCl, ủ 28oC 4-5 ngày Cấy trang 20 μl dịch nuôi cấy lên TSA % NaCl Đục lỗ 100 μl dịch xạ khuẩn vào lỗ, để khô ủ 280C – ngày đọc kết 2.2.2 Thử khả kháng khuẩn chủng xạ khuẩn 2.2.2.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) dung dịch - Tăng sinh Vibrio parahaemolyticus TSB 28oC , sau 24h, 5000 vòng/phút 15 phút, pha loãng với nước muối sính lý 10^5 cfu/ml dung dịch - Tăng sinh xạ khuẩn môi trường lỏng MT2 ,33oC, - ngày, 5000 vòng/phút 15 phút, phần lỏng sau ly tâm sử dụng thí nghiệm 150 μl (dd1) + 150 μl (dd2) 1(-) (dd 1) 2(2-1) Khuấy đều, 150 μl 3(2-2), , 11(2-9) 12(+) (dd 2) ủ 33oC 24 giờ, kiểm tra phát triển vi khuẩn giếng Đối chứng 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.3 Khảo sát khả phân giải enzyme xạ khuẩn Dùng khuẩn lạc xạ khuẩn ống thạch nghiêng cấy lên môi trường, ủ 4-5 (28 ± 2°C) ngày đọc kết Amylase Lipase Gelatinase Cellulase Thạch tinh bột Harigan Maccance (1972) Tributyrin Agar (Rhodes, 1959) pH Fraziers gelatin pH 7.0 Cellulose Riviere, (1961) pH 6.8 Xuất vòng có dạng xung quanh khuẩn lạc xạ khuẩn Ngâm giấy với Fraziers có chlorua thủy ngân đặt vào đĩa có xạ khuẩn phát triển, xuất vòng Xuất vòng xung quanh khuẩn lạc xạ khuẩn Nhỏ dung dịch Iodine lên khuẩn lạc xạ khuẩn phát triển, dung dịch không đổi sang màu xanh III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Phân lập xạ khuẩn từ mẫu bùn đáy Bảng 3.1.1 Kết phân lập xạ khuẩn vùng nuôi thời gian thu mẫu Lần Thời gian thu mẫu Địa điểm thu mẫu Chủng xạ khuẩn 20/01/2016 Phong Hải Chủng PH 1.3 20/01/2016 Rú Chá Không có 23/02/2016 Phong Hải Chủng PH 5.1 23/02/2016 Điền Lộc Không có 27/02/2016 Phú Vang Không có 27/02/2016 Phú Mỹ Không có 01/03/2016 Phong Điền Không có 01/03/2016 Phú Hải Không có 25/04/2016 Phú Thanh Không có 25/04/2016 Phú Thuận Không có 10 III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Bảng 3.1.2 Đặc điểm hình thái hai chủng xạ khuẩn phân lập môi trường nuôi cấy MT1 MT2 Môi trường Đặc điểm Khuẩn lạc MT1 Nhuộm Gram Khuẩn lạc MT2 Nhuộm Gram Chủng PH 1.3 Đều, tròn màu trắng đục,khuẩn lạc phẳng, khô mặt không trơn, thời gian xuất ngày , đường kính mm (hình 3.1) Chủng PH 5.1 Đều, khuẩn lạc ăn sâu vào môi trường, màu trắng, mặt không trơn, thời gian xuất khuẩn lạc ngày, đường kính 10 mm ( hình 3.3) +, dang sợi, vách +, dạng sợi mảnh, dính ngăn, có sinh nhánh không chùm (Hình 3.7) bị đứt (hình 3.5) Đều, nhô cao, màu trắng đục tròn, khô mặt không trơn, thời gian xuất ngày, đường kính 12 mm (hình 3.2) Đều, nhô cao, màu trắng tròn, khô mặt không trơn, thời gian xuất ngày, đường kính 18 mm ( hình 3.4) +, dang sợi, vách +, dạng sợi mảnh, dính ngăn, có sinh nhánh không chùm (hình 3.8) bị đứt (hình 3.6) 11 III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1.1 Khuẩn lạc hai chủng PH 1.3 PH 5.1 mt MT1 MT2 Hình 3.1 Khuẩn lạc PH 1.3 môi trường MT Hình 3.3 Khuẩn lạc PH 3.3 môi trường MT Hình 3.2 Khuẩn lạc PH 1.3 môi trường MT Hình 3.4 Khuẩn lạc PH 3.4 môi trường MT 12 3.1.2 Kết nhuộm Gram hai chủng PH 1.3 PH 5.1 Hình 3.5 Tiêu nhuôm Gram PH 3.1 môi Hình 3.6 Tiêu nhuôm Gram PH 3.1 môi trường MT2 soi vật kính 100x trường MT1 soi vật kính 100x Hình 3.7 Tiêu nhuôm Gram PH 5.1 môi trường MT1 soi vật kính 100x Hình 3.8 Tiêu nhuôm Gram PH 5.1 môi trường MT2 soi vật kính 100x 13 III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.2 Kết thử khả kháng khuẩn chủng xạ khuẩn phân lâp 3.2.1 Kết thử khả kháng khuẩn chủng xạ khuẩn phương pháp đục lỗ thạch Hình 3.9 Kết kháng chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus chủng xạ khuẩn PH 1.3 Hình 3.10 Kết kháng chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus chủng xạ khuẩn PH 5.1 14 III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.2.2 Kết xác định nồng độ tối thiểu (MIC) Bảng 3.2.2.2 Sự phát triển chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus với nồng độ pha loãng chủng xạ khuẩn PH 1.3 PH 5.1 Nồng độ pha loãng xạ khuẩn Chủng ĐC - 1:2 1:4 1:8 1:16 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 ĐC + PH 1.3 - - - - - - - + + + + + - - - - - - + + + + + + PH 5.1 - : Có xuất vi khuẩn chết + : Không có xuất vi khuẩn chết ĐC (-) chủng xạ khuẩn ban đầu ĐC (+) chủng vi khuẩn không bổ sung xạ khuẩn 15 III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.3 Khảo sát khả phân giải enzyme xạ khuẩn Bảng 3.3.1 Kết khảo sát khả phân giải enzyme chủng xạ khuẩn PH 1.3 PH 5.1 Chủng xạ khuẩn cellulase amylase lipase gelatinase PH 1.3 + - - + PH 5.1 + + - - Ghi chú: (+) Có khả sinh enzyme; (-) Không có khả sinh enzyme 16 IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ 20 mẫu bùn thu từ ao nuôi tôm Thừa Thiên Huế, phân lập chủng xạ khuẩn PH 1.3 PH 5.1 chủng xạ khuẩn phân lập sản xuất enzyme cellulase, chủng PH 1.3 sản xuất enzyme gelatinase, chủng PH 5.1 sản xuất enzyme amylase Nồng độ tối thiểu ức chế chủng xạ khuẩn PH 1.3 P.H 5.1 với chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus 1/128 1/64 17 IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kiến nghị Nghiên cứu sâu đặc điểm, tính chất chủng xạ khuẩn để phát triển đưa vào ứng dụng thực tế Nghiên cứu tìm phương pháp thích hợp cho kết xác thí nghiệm thử khả kháng khuẩn xạ khuẩn phương pháp đục lỗ 18 Một số hình ảnh trình làm đề tài Hố ga thu mẫu Phong Hải Nuôi xạ khuẩn tủ ấm Ly tâm xạ khuẩn Pha loãng mẫu bùn đáy 19 Nhuộm Gram Hấp môi trường Đo OD Kết MIC 20 XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN QUÝ THẦY CÔ VÀ TẤT CẢ CÁC BẠN ĐÃ CHÚ Ý THEO DÕI 21 [...]... KIẾN NGHỊ 5.1 Kiến nghị Nghiên cứu sâu hơn đặc điểm, tính chất của 2 chủng xạ khuẩn để phát triển và đưa vào ứng dụng trong thực tế Nghiên cứu tìm phương pháp thích hợp và cho kết quả chính xác hơn trong thí nghiệm thử khả năng kháng khuẩn của xạ khuẩn bằng phương pháp đục lỗ 18 Một số hình ảnh trong quá trình làm đề tài Hố ga thu mẫu tại Phong Hải Nuôi xạ khuẩn trong tủ ấm Ly tâm xạ khuẩn Pha loãng... PH 5.1 trên môi trường MT2 soi vật kính 100x 13 III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.2 Kết quả thử khả năng kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn phân lâp 3.2.1 Kết quả thử khả năng kháng khuẩn của 2 chủng xạ khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch Hình 3.9 Kết quả kháng chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus của chủng xạ khuẩn PH 1.3 Hình 3.10 Kết quả kháng chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus của chủng xạ khuẩn PH 5.1