Nghiên cứu tính đa hình và sự liên quan của đột biến Gly972Arg trên gen IRS1 với hội chứng chuyển hóa ở người trung niên tỉnh Hà Nam

Xuất phát từ tính cần thiết và ứng dụng từ đề tài luận văn, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: Nghiên cứu tính đa hình và sự liên quan của đột biến Gly972Arg trên gen IRS1 với hội chứng chuyển hóa ở người trung niên tỉnh Hà Nam” với các nội dung chính được đề cập trong 59 trang luận văn bao gồm 3 phần và 3 chương như sau:  Phần I: Mở đầu (3 trang) 1. Lý do chọn đề tài 2. Mục tiêu nghiên cứu 3. Nội dung nghiên cứu 4. Phạm vi nghiên cứu 5. Những đóng góp mới  Phần II. Nội dung (53 trang) Chương I. Tổng quan tài liệu (24 trang) Chương II. Phương pháp nghiên cứu (10 trang) Chương III. Kết quả nghiên cứu và thảo luận (20 trang)  Phần III. Kết luận và khuyến nghị (1 trang) 1. Kết luận 2. Khuyến nghị

Xuất phát từ tính cần thiết ứng dụng từ đề tài luận văn, tiến hành nghiên cứu: Nghiên cứu tính đa hình liên quan đột biến Gly972Arg gen IRS1 với hội chứng chuyển hóa người trung niên tỉnh Hà Nam” với nội dung đề cập 59 trang luận văn bao gồm phần chương sau:  Phần I: Mở đầu (3 trang) Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu Những đóng góp  Phần II Nội dung (53 trang) Chương I Tổng quan tài liệu (24 trang) Chương II Phương pháp nghiên cứu (10 trang) Chương III Kết nghiên cứu thảo luận (20 trang)  Phần III Kết luận khuyến nghị (1 trang) Kết luận Khuyến nghị PHẦN I MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Hội chứng chuyển hóa (HCCH) tập hợp yếu tố nguy quan trọng bệnh tim mạch đái tháo đường, gồm: tăng huyết áp, béo bụng, giảm HDLcholesterol, tăng triglyceride, tăng glucose huyết Tần suất tỷ lệ HCCH ngày tăng gây ảnh hưởng lớn đến chất lượng sống tăng thêm gánh nặng ngân sách y tế nhiều nước giới Hội chứng chuyển hóa bệnh phức hợp nhiều yếu tố gây nên, như: chế độ ăn uống nhiều chất béo giàu lượng, hoạt động thể lực, béo phì, tăng huyết áp Ngoài ra, những năm gần yếu tố di truyền (gen) được xem là một yếu tố quan trọng có liên quan đến HCCH Gen IRS1 mã hóa cho protein thụ thể insulin IRS1 phosphoryl hóa thụ thể insulin tyrosine kinase Các đột biến gen có liên quan đến bệnh đái tháo đường týp tính nhạy cảm với insulin Đáng chú ý, một số nghiên cứu gần chỉ rằng đa hình Gly972Arg gen IRS1 có liên quan đến đề kháng insulin đái tháo đường týp số quần thể người gốc Âu Á Tuy nhiên cho đến chưa có nhiều nghiên cứu nào mối liên quan giữa đa hình Gly972Arg gen IRS1 với HCCH ở người trung niên giới cũng ở Việt Nam Xuất phát từ lý thực đề tài:“ Nghiên cứu tính đa hình liên quan đột biến Gly972Arg gen I nsulin Receptor Substrate với hội chứng chuyển hóa người trung niên tỉnh Hà Nam” Mục tiêu nghiên cứu  Xác định tần số alen thành phần kiểu gen đa hình Gly972Arg gen IRS1 nhóm đối tượng nghiên cứu  Xác định mối liên quan đa hình Gly972Arg nguy mắc hội chứng chuyển hóa người trung niên tỉnh Hà Nam Nội dung nghiên cứu  Xác định một số đặc điểm nhân trắc và một số chỉ số sinh lý máu đối tượng nghiên cứu  Thiết kế thử nghiệm để xây dựng quy trình phân tích đa hình Gly972Arg gen IRS1  Sử dụng quy trình phân tích để xác định kiểu gen đối tượng nghiên cứu, từ xác định phân bố alen kiểu gen đa hình Gly972Arg nhóm đối tượng mắc hội chứng chuyển hóa nhóm bình thường  Phân tích liên quan kiểu gen đa hình Gly972Arg hội chứng chuyển hóa người trung niên tỉnh Hà Nam Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành 2296 đối tượng người trung niên độ tuổi từ 40-60 tỉnh Hà Nam Những đóng góp Đây nghiên cứu vai trò đa hình Gly972Arg gen IRS1 nguy mắc hội chứng chuyển hóa người trung niên ở Việt Nam Kết quả của nghiên cứu này có thể góp phần cung cấp dữ liệu về mối liên quan giữa yếu tố di truyền (gen) với các bệnh liên quan đến HCCH Bên cạnh đó, nghiên cứu này còn xây dựng một quy trình mới phương pháp xác định đa hình Gly972Arg gen IRS1 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ HỘI CHỨNG CHUYỂN HÓA 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu thuật ngữ “hội chứng chuyển hóa” Khoảng 250 năm trước, trước hội chứng chuyển hóa mô tả, bác sĩ nhà phẫu thuật người Italia xác định mối liên quan béo phì nội tạng, tăng huyết áp, chứng xơ vữa mức cao acid uric máu Năm 1923, hội chứng chuyển hóa (HCCH) mô tả bước đầu Kylin với biểu hiện: tăng huyết áp (HA), tăng glucose máu gout Năm 1988, Reaven G lần xác định mối liên quan số yếu tố nguy bệnh tim mạch với tình trạng đề kháng insulin phối hợp với tăng insulin máu Ông đề xuất danh từ “hội chứng X”, X ẩn số mà khoa học phải giải đáp Sau với nhiều nghiên cứu chuyên sâu nội tiết nêu thêm số biểu khác HCCH tiểu albumin vi thể, bất thường tiêu sợi huyết đông máu Do nghiên cứu nhiều tác giả mục đích nghiên cứu khác nhau, biểu lâm sàng không hoàn toàn giống hội chứng có tên gọi khác Cho đến năm 1998, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đề nghị thống định nghĩa chọn tên gọi hội chứng chuyển hóa (metabolism syndrome) để trạng thái rối loạn phức tạp tạo nên yếu tố có liên quan với làm tăng nguy mắc bệnh xơ vữa động mạch vành đái tháo đường týp 2, đồng thời khuyến cáo không nên gọi “Hội chứng kháng insulin” tình trạng kháng insulin nguyên nhân tất yếu tố nguy tạo nên hội chứng 1.1.2 Chẩn đoán hội chứng chuyển hóa Các định nghĩa HCCH công nhận rộng rãi giới công bố WHO (World Health Organization), EGIR (European Group for the Study of Insulin Resistance), NCEP-ATP III (National Cholesterol Education Program - Third Adult Treatment Panel), AACE (American Association of Clinical Endocrinology) Tất tổ chức cho thành tố cốt lõi HCCH bao gồm: béo phì, đề kháng insulin, rối loạn chuyển hóa lipid tăng huyết áp Tuy nhiên, tổ chức lại cung cấp tiêu chuẩn lâm sàng khác để chẩn đoán mắc HCCH 1.1.2.1 Tiêu chuẩn Tổ chức Y tế giới 1.1.2.2 Tiêu chuẩn nhóm nghiên cứu kháng Insulin Châu Âu 1.1.2.3 Tiêu chuẩn Hội Nội tiết học Lâm sàng Mỹ 1.1.2.4 Tiêu chuẩn Liên đoàn Đái tháo đường quốc tế 1.1.2.5 Tiêu chuẩn NCEP-ATP III 1.1.3 Đặc điểm dịch tễ học hội chứng chuyển hóa Trên giới có nhiều nghiên cứu xác định tỷ lệ mắc HCCH quần thể khác Theo Hiệp hội đái tháo đường quốc tế (IDF), ước tính khoảng 20-25% dân số trưởng thành giới mắc hội chứng chuyển hóa Kết Khảo sát Kiểm tra Sức khỏe dinh dưỡng Quốc gia lần thứ III 8814 đối tượng bao gồm nam nữ, sử dụng tiêu chuẩn chẩn đoán HCCH ATP III giai đoạn 1988-1994 cho thấy tỷ lệ mắc HCCH người trưởng thành chưa hiệu chỉnh hiệu chỉnh theo tuổi 21,8% 23,7% Tỷ lệ mắc HCCH tăng dần theo tuổi: 6,7% đối tượng 20 – 29 tuồi mắc HCCH số tăng lên 43,5% độ tuổi từ 60 – 69 42% đối tượng 70 tuổi Theo Báo cáo thống kê sức khỏe quốc gia năm 2009 cuả NHANES giai đoạn 2003 – 2006, khoảng 34% người trưởng thành chẩn đoán mắc HCCH, đó: nam giới nữ giới 40 -59 tuổi có tỷ lệ mắc HCCH cao gấp lần so với đối tượng từ 20 đến 39 tuổi; nam giới từ 60 tuổi trở lên có tỷ lệ mắc bệnh cao gấp lần phụ nữ độ tuổi gấp lần so với nhóm tuổi nghiên cứu Tại Việt Nam, nghiên cứu Viện dinh dưỡng Quốc gia năm 2000 620 đối tượng từ 25-64 tuổi cho thấy tỷ lệ mắc HCCH 13,1% Hà Nội Thành phố Hồ Chí Minh 18% 1.1.4 Các yếu tố nguy hội chứng chuyển hóa HCCH bệnh đa yếu tố nhiều yếu tố nguy gây nên, bao gồm: thừa cân béo phì, tuổi, tiền sử gia đình, yếu tố gen, hoạt động thể lực, chế độ dinh dưỡng số yếu tố khác 1.1.4.1.Thừa cân béo phì Chỉ số khối thể (BMI) – số đo thể dựa chiều cao cân nặng BMI > 23 kg/m2, tình trạng béo bụng với dáng người dạng táo (không phải dạng lê) làm tăng nguy mắc HCCH 1.1.4.2 Tuổi Nguy mắc HCCH tăng lên với tuổi, tỷ lệ mắc bệnh < 10% lứa tuổi 20, tăng lên đến 40% lứa tuổi 60 Tuy nhiên, dấu hiệu báo trước HCCH thấy tuổi thiếu niên 1.1.4.3 Tiền sử gia đình Nguy mắc HCCH cao người có tiền sử gia đình có người bị đái tháo đường týp thân có tiền sử bị đái tháo đường mang thai 1.1.4.4 Yếu tố gen Ước tính yếu tố di truyền giải thích gần 40% khác phân bố mỡ thể lên đến 70% khác béo bụng Ngoài ra, tỷ lệ phù hợp bất dung nạp glucose, béo bụng giảm HDL-cholesterol cao cách đáng kể cặp sinh đôi trứng so với cặp sinh đôi khác trứng 1.1.4.5 Hoạt động thể lực Nhiều nghiên cứu chứng minh thiếu hoạt động thể lực yếu tố góp phần gây HCCH Hoạt động thể lực, cụ thể tập thể dục làm tăng khối lượng nạc thể, cholesterol lipoprotein tỷ trọng cao giảm mỡ tổng số mỡ bụng 1.1.4.6 Chế độ dinh dưỡng Sự thay đổi chế độ ăn uống theo hướng giảm chất béo cho thấy hiệu đáng kể tính kháng insulin Ở đối tượng mắc HCCH có chế độ ăn đa dạng loại carbohydrate, chất béo cải thiện mức cholesterol tổng số, triglyceride khối lượng thể so với đối đượng đối chứng với chế độ ăn chất béo có loại carbohydrate - Chủng tộc: Tỷ lệ mắc HCCH khác dân tộc Người Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha nước nói tiếng Tây Ban Nha, người châu Á dường có nguy mắc HCCH chủng tộc khác - Các tình trạng bệnh lý khác: Tăng huyết áp, hội chứng buồng trứng đa nang ảnh hưởng đến hệ thống sinh sản hormone sinh dục nữ,…làm tăng nguy mắc HCCH 1.1.5 Cơ chế bệnh sinh hội chứng chuyển hóa Hiện nay, việc xác định chế bệnh sinh HCCH tiếp tục nghiên cứu HCCH có nhiều yếu tố liên quan, đan xen lẫn 1.1.5.1 Sự đề kháng insulin Nguyên nhân chủ yếu gây tiến triển tình trạng kháng insulin tải trình tuần hoàn acid béo giải phóng từ khối tế bào mô mỡ Acid béo tự (FFA) giảm tính nhạy cảm insulin cách ức chế hấp thu glucose qua trung gian insulin Ở gan, acid béo tự làm tăng sản xuất glucose, triglyceride tiết lipoprotein tỷ trọng thấp (VLDLs) Tình trạng tiền viêm thấy tình trạng góp phần vào chế bệnh sinh kháng insulin có nhiều FFAs tuần hoàn Các tế bào mỡ đại thực bào tăng tiết interleukin (IL-6) yếu tố hoại tử u (TNF-ɑ), yếu tố gây kháng insulin tăng ly giải lipid từ kho dự trữ lipid mô mỡ chứa trigycerid thành acid béo tựdo tuần hoàn IL-6 cytokine khác thúc đẩy gan sản xuất glucose tăng sản xuất VLDL gan tăng kháng insulin 1.1.5.2 Béo phì tăng chu vi vòng eo Về mặt chế, vòng eo lớn dẫn đến tăng mô mỡ da với mỡ nội tạng, tỷ lệ lớn dòng acid béo tự chuyển hóa từ mô mỡ tới gan thông qua trình lưu thông nội tạng xảy ra, gia tăng mỡ nội tạng bụng giải phóng sản phẩm phân hủy lipid vao hệ tuần hoàn tránh ảnh hưởng trực tiếp trình trao đổi gan (quá trình sản xuất glucose, tổng hợp lipid tiết protein fibrinogen chất ức chế hoạt hóa plasminogen 1.1.5.3 Rối loạn chuyển hóa lipid Thông thường, với gia tăng dòng acid béo tự tới gan, tăng trình tạo thành lipoprotein tỷ trọng thấp giàu triglyceride chứa apo B xảy Trong trình tạo nên kháng insulin, dòng acid béo tự tới gan tăng làm tăng tổng hợp triglyceride gan, nhiên, điều kiện sinh lý, insulin ức chế tăng tiết VLDL vào hệ tuần hoàn Ngoài ra, kháng insulin làm giảm nồng độ lipoprotein lipase mô ngoại vi (ví dụ, mô mỡ nhiều mô cơ) Sự biến đổi lipoprotein lipase dường đóng góp tới tăng triglyceride so với sản xuất mức VLDL 1.1.5.4 Bất dung nạp glucose Mối liên quan rối loạn glucose lúc đói rối loạn dung nạp glucose tình trạng kháng insulin chứng minh nghiên cứu người động vật thuộc họ Linh trưởng Sự kháng insulin tế bào β đảo tụy dẫn đến tín hiệu gây tiết insulin phụ thuộc vào glucose bị thay thổi theo hướng bất lợi 1.1.5.5 Tăng huyết áp Sự liên quan tình trạng kháng insulin tăng huyết áp biết đến có liên quan với chế khác Sự kháng insulin góp phần làm gia tăng phổ biến tăng huyết áp HCCH 1.1.5.6 Các biểu khác Sự gia tăng apo B C-III, acid uric, yếu tố đông máu (fibrinogen, chất ức chế hoạt hóa plasminogen 1), lượng tế bào bạch cầu, cytokine phản ứng viêm, có mặt microalbumin niệu, bệnh buồng trứng đa nang có liên quan với đề kháng insulin.Tình trạng hút thuốc lối sống tĩnh nguy hội chứng 1.1.6 Hậu cách phòng tránh 1.1.6.1 Hậu HCCH gây biến chứng nguy hiểm bao gồm bệnh tim mạch, tiền đái tháo đường, đái tháo đường biến chứng béo phì HCCH làm gia tăng nguy tử vong bệnh mạch vành kể có đái tháo đường không đái tháo đường, có nhiều yếu tố nguy HCCH nguy tử vong tim mạch cao 1.1.6.2 Cách phòng tránh Béo phì nguyên nhân sâu xa dẫn tới HCCH, giảm cân biện pháp để điều trị rối loạn cải thiện tính nhạy cảm với insulin cải thiện số thành phần của HCCH Các khuyến nghị giảm cân bao gồm kết hợp việc hạn chế lượng đưa vào thể kết hợp với hoạt động thể lực 1.2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU GEN IRS1 1.2.1 Vị trí cấu trúc gen IRS1 Ở người, gen IRS1 nằm cánh dài nhiễm sắc thể số với kích thước 67,47 kb, vị trí 2q36 [22], từ cặp base số 226.731.316 đến cặp base số 226.799.828 gồm intron nằm exon 1.2.2 Protein IRS1 Cơ chất thụ thể insulin (IRS) phân tử trung gian quan trọng tín hiệu insulin đóng vai trò trung tâm việc trì chức tế bào tăng trưởng, tồn tại, trao đổi chất Cấu trúc protein IRS1 tương tự protein IRS khác Chúng bao gồm đầu amin (-NH 2) theo sau đuôi carboxyl (-COOH) có chiều dài thay đổi, có chứa nhiều vị trí phosphoryl hóa tyrosine serine tham gia điều hòa phân tử tham gia ngược dòng Mô hình cấu trúc tinh thể protein IRS1 cho thấy, vùng PH PTB gồm chuỗi polypeptide dạng gấp nếp β chuỗi polypeptide dạng xoắn α IRS1 protein trung gian đáp ứng sinh học để kích thích insulin cách liên kết kích hoạt enzyme phân tử tín hiệu khác 1.2.3 Chức gen IRS1 Gen IRS1 sau trình dịch mã hoàn tất tạo IRS1 protein thích nghi với tín hiệu nội bào mà tích hợp phối hợp nhiều tín hiệu ngoại bào quan trọng mặt sinh học bên tế bào 1.2.3.1 Vai trò tổng hợp glycogen, protein RNA Trong sinh tổng hợp RNA, IRS1 hoạt hóa tiến hành phosphoryl hóa protein Shc, protein xúc tác cho phản ứng gắn SOS vào Grb2 tạo nên phức hợp Grb2/SOS hoạt hóa protein kinase hoạt hóa 5’AMP (MAPK) tiến hành trình phiên mã để tạo RNA 1.2.3.2 Vai trò tăng trưởng biệt hóa tế bào Nghiên cứu gần biểu mức thể đột biến Akt nhiều loại tế bào thúc đẩy chuyển dịch tế bào theo chế khác nhau: thúc đẩy tăng sinh điều kiện tế bào ngừng tăng trưởng ức chế chương trình tự chết tế bào hầu hết tác nhân làm giảm chết từ thúc đẩy tồn tế bào khồi u 1.2.4 Sự điều hòa biểu gen IRS1 Các nghiên cứu mARN gen IRS1 cho thấy IRS1 biểu tất loại mô, quan mức độ biểu khác IRS1 biểu mức độ cao tuyến cận giáp, tuyến giáp, hệ thần kinh, tế bào mô mỡ, mô cơ, buồng trứng tế bào hệ tiết Trạng thái sinh lý bệnh lý khác có liên quan đến mức độ biểu mRNA loại mô 1.2.5 SNP rs1801278 bệnh liên quan SNP rs1801278 nằm vị trí 226.795.828 mạch DNA xuôi nhiễm sắc thể số với alen gốc alen C Sự chuyển alen C thành alen A/G/T mạch DNA dẫn đến thay đổi acid amin Glycine codon 972 thành Arginine (Gly972Arg) chứng minh có liên quan với số bệnh như: đái tháo đường týp 2, đái tháo đường thai trạng kháng insulin suy giảm tiết insulin, xơ vữa động mạch, buồng trứng đa nang 10 PHẦN II NỘI DUNG CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu chọn từ cộng đồng với nhóm bệnh gồm người mắc HCCH nhóm chứng có người bình thường thuộc dân tộc Kinh có độ tuổi từ 40-64 sống tỉnh Hà Nam qua giai đoạn: giai đoạn điều tra sàng lọc ban đầu giai đoạn chọn nhóm bệnh nhóm chứng Kết 2296 đối tượng nghiên cứu đã được lựa chọn từ giai đoạn một có 423 đối tượng mắc HCCH 1873 đối tượng không mắc HCCH làm đối chứng 2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.2.1 Hóa chất Trong nghiên cứu này, sử dụng hóa chất sau: Hóa chất để tách chiết AND, hóa chất sử dụng để PCR, hóa chất để ủ enzyme giới hạn Eco88I (AvaI) hóa chất để điện di 2.2.2 Trang thiết bị nghiên cứu Trong nghiên cứu có sử dụng thiết bị dùng cho điều tra cộng đồng (cân điện tử, thước gỗ đo chiều cao, thước dây), thiết bị dùng cho phân tích gen vật liệu tiêu hao 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thiết kế theo phương pháp nghiên cứu cắt ngang có đối tượng nghiên cứu chọn từ cộng đồng, phần đề tài "Nghiên cứu tính đa hình nhạy cảm gen với hội chứng chuyển hóa người Việt Nam" mã số 106.092014.04 Quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia (NAFOSTED) tài trợ 2.3.2 Các phương pháp thu thập thông tin 2.3.2.1 Thu thập thông tin đối tượng Thông tin đối tượng thu thập hình thức vấn theo câu hỏi bao gồm tuổi, trình độ học vấn, nghề nghiệp, tình trạng hôn nhân, mức thu nhập, tiền sử bệnh tật, tiền sử hút thuốc, uống rượu, thời gian làm việc tĩnh tại, xem tivi ngủ trưa 11 2.3.2.2 Đo số nhân trắc, huyết áp Các số nhân trắc bao gồm chiều cao, cân nặng, số đo vòng eo chu vi vòng mông, tỷ lệ phần trăm mỡ thể đo lần người tính giá trị trung bình để sử dụng cho phân tích 2.3.3 Các phương pháp sinh học phân tử 2.3.3.1 Tách ADN Máu tĩnh mạch đối tượng nghiên cứu chống đông EDTA ADN tổng số tách từ tế bào bạch cầu sử dụng Kit Wizard® Genomic ADN Purification (Promega Corporation, USA) 2.3.3.2 Xác định kiểu gen phương pháp AS-PCR Phương pháp AS - PCR tiến hành dựa hai phản ứng PCR song song riêng biệt, phản ứng sử dụng cặp mồi đặc hiệu đầu 3’ để nhận biết alen mong muốn với: Mồi xuôi F, mồi ngược phát alen A mồi ngược phát alen G Sản phẩm sau phản ứng PCR điện di 100V 30 phút thạch Agarose 2,5%, sử dụng đệm TBE 0,5X Băng sản phẩm nhuộm RedSafe chụp máy GelDoc (Hình 3.1) Kết quả: băng sản phẩm băng có kích thước 190bp để phát alen A alen G 2.3.3.3 Xác định kiểu gen phương pháp RFLP-PCR Chọn ngẫu nhiên 10% số mẫu, sử dụng phương pháp RFLP - PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism - Polymerase Chain Reaction) để kiểm tra xác phương pháp AS-PCR bao gồm bước sau: Bước Dùng phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen chứa SNP, thu sản phẩm có kích thước 311bp chứa SNP cần xác định Bước Ủ sản phẩm PCR với enzym giới hạn đặc hiệu Eco88I (AvaI) Bước Nhận định kiểu gen từ kết điện di 2.3.4 Phương pháp phân tích thống kê 12 Số liệu nhập phần mềm Epidata 3.0 Sử dụng phần mềm SPSS 16.0 để phân tích thống kê, lựa chọn mô hình phù hợp cho phân tích đa biến phần mềm SNPstat Ý nghĩa thống kê xác định với giá trị P < 0,05 theo phía 2.3.5 Đạo đức nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Hội đồng y đức Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương thông qua Tất đối tượng tham gia vào nghiên cứu giải thích rõ mục đích, nội dung thực quyền lợi tham gia nghiên cứu, đồng thời ký giấy đồng ý tham gia trước tiến hành lấy máu Những thông tin cá nhân thu thập mã hóa bảo mật Các số liệu thu thập sử dụng cho mục tiêu nghiên cứu, không phục vụ cho mục đích khác 13 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu Các đặc điểm nhân trắc đối tượng nghiên cứu trình bày Bảng 3.1 Bảng 3.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu Đặc điểm Nhóm HCCH Nhóm BT (n = 423) (n= 1873) Tuổi (năm) 54 (50-59) 51 (46-56) Nữ (%*) 298 (12,98) 1207 (64,4) Nam (%*) 125 (5,44) 666 (28,2) 0,019 Chiều cao (cm) 154,9(150,1-160) 155,7 (150,6-160,3) 0,07b Cân nặng (kg) 54,54 (53,7-55,4) 50,56 (50,2-50,9) < 0,001a BMI (kg/m2) 22,76 (22,5-23,1) 20,89 (20,8-21,0) < 0,001a Phần trăm mỡ thể (%) 30,37 (26,2-34,8) 26,7 (22,8-31,0) < 0,001b Chu vi vòng eo (cm) 79,64 (74,5-84,5) 73,29 (68,0-83,0) < 0,001b Chu vi vòng mông (cm) 90,35 (86,5-94,0) 87,49 (84,0-91,0) < 0,001b Tỷ lệ eo/mông (WHR) 0,88 (0,87-0,88) 0,84 (0,83-0,84) < 0,001a Huyết áp tối đa (mmHg) 138,8 (120-142,7) 114,6 (100-120) < 0,001b Huyết áp tối thiểu (mmHg) 82,2 (75,0-90,0) 71,9 (60,0-80,0) < 0,001b LDL-C (mmol/L) 3,39 (2,83-3,90) 2,84 (2,30-3,30) < 0,001b HDL-C (mmol/L) 1,13 (0,90-1,21) 1,40 (1,02-1,66) < 0,001b Triglyceride (mmol/L) 2,50 (1,72-2,89) 1,58 (0,98-1,90) < 0,001b Cholesterol (mmol/L) 4,61 (4,00-5,07) 4,39 (3,90-4,90) < 0,001b a P < 0,001b Các biến không tuân theo phân phối chuẩn biểu diễn trung vị 25 th – 75th percentile, P nhận từ kiểm định Mann – Withney U test b Các biến không theo phân phối chuẩn biểu diễn trung bình nhân, 95%CI * Phần trăm tính theo toàn mẫu nghiên cứu Kết phân tích cho thấy đối tượng mắc HCCH có tuổi, BMI, phần trăm mỡ thể, chu vi vòng eo, chu vi vòng mông, huyết áp tối đa, huyết áp tối thiểu, LDL-C, triglyceride, cholesterol cao đáng kể so với nhóm bình thường số HDL-C nhóm HCCH thấp so với nhóm bình thường (P< 0,05) Giá trị BMI nhóm HCCH nhóm bình thường nằm ngưỡng xác định thừa cân 14 (BMI > 23 kg/m2 cho người châu Á) Không có khác biệt chiều cao nhóm HCCH nhóm bình thường (P > 0,05) 3.2 Kết xác định kiểu gen phương pháp AS-PCR Kết thử nghiệm xác định kiểu gen số đối tượng thể Hình 3.1 Sau trình kiểm tra số mẫu nghiên cứu, tiến hành kiểm tra xác định kiểu gen tất đối tượng phương pháp AS - PCR Kết xác định kiểu gen phương pháp AS - PCR thể Hình 3.2 Hình 3.1 Kết xác định kiểu gen đa hình Gly972Arg gen IRS1 phương pháp AS-PCR số mẫu nghiên cứu (M: Marker PhiX174 HaeIII, số thứ tự từ – mẫu) Hình 3.2 Kết xác định kiểu gen đa hình Gly972Arg gen IRS1 phương pháp AS–PCR (Các số từ – 15 thứ tự mẫu, P: chứng dương (có kiểu gen AT), N: chứng âm (H2O) 3.3 Kết xác định kiểu gen phương pháp RFLP-PCR 15 Kết thử nghiệm quy trình xác định kiểu gen thể Hình 3.3 Sau thử nghiệm quy trình thành công, kết xác định kiểu gen phương pháp RFLP-PCR 10% mẫu nghiên cứu thể Hình 3.4 Kết phương pháp AS-PCR RFLP-PCR tương đồng 100% Hình 3.3 Kết xác định kiểu gen đa hình Gly972Arg gen IRS1 phương pháp RFLP-PCR số mấu nghiên cứu (A: Kết điện di lần sau phản ứng PCR, B: Kết điện di lần sau ủ enzyme giới hạn, M: Marker PhiX174 HaeIII, số thứ tự từ 1-7 mẫu) Hình 3.4 Kết xác định kiểu gen đa hình Gly972Arg gen IRS1 phương pháp RFLP–PCR (A: Kết điện di lần sau phản ứng PCR, B: 16 Kết điện di lần sau ủ enzyme giới hạn, Các số thứ tự từ 1-14 mẫu, P: chứng dương (kiểu gen AG), N: chứng âm (H2O) 3.4 Tần số alen thành phần kiểu gen đa hình Gly972Arg gen IRS1 nhóm đối tượng nghiên cứu Kết tỷ lệ kiểu gen tần số alen nhóm HCCH nhóm bình thường trình bày Bảng 3.2 Bảng 3.2 Phân bố tỷ lệ kiểu gen tần số alen gen IRS1 SNP rs1801278 Nhóm HCCH (n = 423) Kiểu gen AA AG GG Alen A G P cho HWE Nhóm bình thường (n = 1873) Tổng (n = 2296) P (0%) 26 (6,1%) 397 (93,9%) (0,2%) 66 (3,5%) 1803 (96,3%) (0,2%) 92 (4%) 2200 (95,8%) 0,03 26 (0,031) 820 (0,969) 0,514 74 (0,02) 3672 (0,98) < 10-4 100 (0,022) 4492 (0,978) 0,004 0,02 Giá trị P thu từ kiểm định χ2test Tỷ lệ kiểu gen tần số alen mẫu nghiên cứu không tuân theo quy luật Hardy-Weinberg toàn mẫu (P = 0,004) nhóm bình thường (P < 0,001); tuân theo quy luật nhóm HCCH (P = 0,514) Trong toàn mẫu có đối tượng (0,2%) mang kiểu gen AA, 92 đối tượng (4%) mang kiểu gen AG 2200 đối tượng (95,8%) mang kiểu gen GG Trong nghiên cứu này, nhóm HCCH đối tượng có kiểu gen AA, tỷ lệ kiểu gen AG GG 6,1% 93,9%; tỷ lệ kiểu gen tương ứng nhóm bình thường 0,2%; 3,5% 96,3% Có khác phân bố kiểu gen hai nhóm HCCH bình thường (P = 0,03; χ2 test) 3.4 Phân tích đặc điểm đối tượng nghiên cứu theo kiểu gen nhóm bệnh nhóm chứng Đặc điểm đối tượng nghiên cứu theo kiểu gen nhóm bệnh nhóm mắc HCCH thể Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.3 cho thấy nhóm bình thường, có khác có ý nghĩa thống kê cân nặng, BMI vòng eo người bình thường (P< 0,05), 17 giá trị nhóm người có kiểu gen AG GG cao so với người mang kiểu gen AA không thấy có khác có ý nghĩa thống kê số, bao gồm: tuổi, chiều cao, huyết áp tối thiểu, huyết áp tối đa, HDL-C, LDL-C, triglyceride cholesterol tổng số (P> 0,05) Bảng 3.3 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu theo kiểu gen nhóm chứng Đặc điểm Kiểu gen nhóm bình thường AA (n = 4) 57,6(56,2-59,0) 149 (144-154) 40,8 (37,3-44,3) 18,3 (18,0-18,7) 65,0 (64,0-66,0) 82,8 (78,5-87,0) 0,79 (0,76-0,82) 110 (100-120) 65,0 (60,0-70,0) 2,90 (2,66-3,15) 1,61 (1,24-1,89) Tuổi (năm) Chiều cao (cm) Cân nặng (kg) BMI (kg/m2) Vòng eo (cm) Vòng mông (cm) Tỷ lệ eo - mông HATD (mmHg) HATT (mmHg) LDL-C (mmol/L) HDL-C (mmol/L) Triglyceride(mmol/L 1,25 (1,09-1,41) ) Cholesterol (mmol/L) 4,27 (3,79-475) AG (n = 66) 50,8 (44,4-50,2) 156 (151-160) 51,2 (45,4-55,3) 21,1 (18,8-22,6) 72,9 (67,5-78,0) 87,3 (82,0-91,0) 0,84 (0,80-0,87) 115 (100-120) 71,0 (60,0-80,0) 2,67 (2,29-3,03) 1,34 (1,09-1,50) GG (n =1803) 50,9 (46,0-56,0) 156 (151-160) 51,1 (46,0-56,0) 21,0 (19,2-22,6) 73,3 (68,0-78,0) 87,5 (84,0-91,0) 0,84 (0,80-0,87) 115 (100-120) 72,0 (61,0-80,0) 2,84 (2,30-3,32) 1,40 (1,02-1,66) 1,41 (0,99-1,79) 1,59 (0,98-1,90) P 0,092 0,170 0,024 0,039 0,037 0,214 0,194 0,815 0,287 0,232 0.434 0,752 4,17 (3,80-4,70) 4,39 (3,90-4,90) 0,210 Bảng 3.4 trình bày đặc điểm đối tượng nghiên cứu theo kiểu gen nhóm HCCH cho thấy đối tượng mắc HCCH có kiểu gen AA Khi so sánh kiểu gen AG, GG nhóm HCCH cho thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê tuổi, cân nặng, chiều cao, BMI, vòng mông, tỷ số eo – mông, huyết áp tối thiểu, huyết áp tối đa, HDL-C, LDL-C, triglyceride cholesterol tổng số (P> 0,05) Bảng 3.4 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu theo kiểu gen nhóm HCCH Đặc điểm Tuổi (năm) Chiều cao (cm) Cân nặng (kg) BMI (kg/m2) Vòng eo (cm) Vòng mông (cm) Tỷ số eo - mông HATD (mmHg) HATT (mmHg) Kiểu gen nhóm HCCH AG GG (n = 66) (n =1803) 54,7 (51,0-60,0) 53,9 (50,0-59,0) 153,0 (149,0-156) 155,1 (150,4-160) 53,9 (48,0-59,8) 53,3 (49,4-60,5) 23,0 (21,4-25,0) 22,9 (21,2-24,9) 79,9 (70,5-86,0) 79,6 (75,0-84,5) 89,9 (85,5-95,0) 90,4 (86,8-94,0) 0,89 (0,85-0,91) 0,88 (0,84-0,92) 128,4 (117,5-140) 134,2 (120,0-145) 79,4 (75,0-80,0) 82,4 (75,0-90,0) 18 P-value 0,414 0,131 0,376 0,942 0,781 0,957 0,875 0,307 0,157 LDL-C (mmol/L) HDL-C (mmol/L) Triglyceride Cholesterol (mmol/L) (mmol/L) 3,52 (2,94-3,98) 1,03 (0,90-1,19) 2,60 (1,50-3,24) 4,49 (4,00-4,90) 3,38 (2,81-3,90) 1,14 (0,90-1,22) 2,49 (1,72-2,88) 4,62 (4,00-5,10) 0,529 0,717 0,584 0,883 3.5 Phân tích ảnh hưởng đơn gen đa hình Gly972Arg gen IRS1 mô hình di truyền khác với nguy mắc hội chứng chuyển hóa Các số liệu liên quan kiểu gen IRS1 SNP rs1801278 nguy mắc HCCH với mô hình giả định alen G alen nguy để phân tích trình bày bảng 3.5 Kết cho thấy mô hình siêu trội, người mang kiểu gen AG có xu hướng làm tăng nguy mắc HCCH so với người mang kiểu gen AA GG (OR = 1,79, 95%CI:1,12-2,86, P = 0,014) người mang kiểu gen AA có xu hướng giảm nguy mắc HCCH so với người mang kiểu gen GG AG mô hình lặn (OR = 0,59, 95%CI: 0,37-0,94, P = 0,027) Bảng 3.5.Các mô hình phân tích đơn biến ảnh hưởng SNP rs1801278 với G alen nguy Nhóm bình Mô hình Kiểu gen thường (n = 1873) Đồng AA (0,2) trội AG 66 (3,5) GG 1803 (96,3) Trội GG 1803 (96,3) AG – AA 100 (3,7) Lặn GG – AG 1860 (98,8) AA (0,2) Siêu trội AA-GG 1807 (96,5) AG 66 (3,5) Cộng hợp với alen G Nhóm HCCH ( n = 423) (0) 26 (6,1) 397 (93,9) 397 (93,9) 26 (6,1) 423 (100) (0) 397 (93,9) 26 (6,1) OR (95%CI) 1,00 0,00 (0,00-NA) 0,00 (0,00-NA) 1,00 0,00 (0,00-NA) 1,00 0,59 (0,37-0,94) 1,00 1,79 (1,12-2,86) 0,65 (0,42-1,01) P AIC 0,999 0,999 2187,4 0,999 2187,9 0,027 2187,2 0,014 0,057 2186,9 2189,0 n(%), P nhận từ phân tích hồi quy logistic NA: giá trị chưa xác định 3.6 Phân tích ảnh hưởng đa hình Gly972Arg gen IRS1 yếu tố xã hội, lối sống nguy mắc hội chứng chuyển hóa Các mô hình có số AIC thấp lựa chọn để phân tích đa biến với yếu tố xã hội, lối sống thể Bảng 3.6 3.7 19 Bảng 3.6 Ảnh hưởng SNP rs1801278 với yếu tố nguy HCCH mô hình lặn Mô hình OR (95%CI) Mô hình chưa hiệu chỉnh 0,59 (0,37-0,94) Mô hình hiệu chỉnh với tuổi, huyết áp tối thiểu, 0,51 (0,29-0,90) P 0,027 0,020 huyết áp tối đa, HDL-C, LDL-C, triglyceride cholesterol Mô hình hiệu chỉnh mô hình biến sau: BMI 0,49 (0,27-0,90) Phần trăm mỡ thể 0,54 (0,30-0,97) WHR 0,49 (0,27-0,89) Mô hình hiệu chỉnh mô hình tình trạng kinh tế-xã hội, lối sống biến sau: BMI 0,022 0,040 0,019 0,54 (0,29-0,99) 0,045 Phần trăm mỡ thể 0,52 (0,29-0,94) 0,031 WHR 0,53 (0,29-0,97) 0,038 Qua phân tích, rút kết luận sau: Mô hình 1: Ảnh hưởng đa hình Gly972Arrg mô hình lặn với nguy mắc bệnh HCCH: người có kiểu gen AA làm giảm nguy mắc bệnh HCCH (OR = 0,59, 95%CI: 0,37-0,94, P = 0,027) Mô hình 2: Ảnh hưởng đa hình Gly972Arg mô hình trội với nguy mắc bệnh HCCH hiệu chỉnh với tuổi, giới tính, huyết áp tối đa, huyết áp tối thiểu, HDL-C, LDL - C, triglyceride cholesterol Kết sau hiệu chỉnh với yếu tố kể cho thấy người có kiểu gen AA làm giảm nguy mắc bệnh HCCH so với người mang kiểu gen AG GG (OR = 0,51, 95%CI: 0,29-0,90, P = 0,02) Mô hình 3: Ảnh hưởng đa hình Gly972Arg mô hình lặn với nguy mắc bệnh HCCH hiệu chỉnh với tuổi, giới tính, huyết áp tối đa, huyết áp tối thiểu, HDL-C, LDL - C, triglyceride, cholesterol với biến BMI, WHR, phần trăm mỡ thể Kết phân tích cho thấy người mang kiểu gen AA có xu hướng giảm nguy mắc bệnh HCCH so với người mang kiểu gen AG GG (P< 0,05) 20 Mô hình 4: Ảnh hưởng đa hình Gly972Arg mô hình trội với nguy mắc bệnh HCCH hiệu chỉnh với tuổi, giới tính, huyết áp tối đa, huyết áp tối thiểu, HDL-C, LDL - C, triglyceride, cholesterol, yếu tố kinh tế-xã hội (trình độ học vấn, nghề nghiệp, tình trạng hôn nhân) yếu tố lối sống (hút thuốc, uống rượu, có người thân bị đái tháo đường, ăn đồ ngọt, thời gian xem ti vi, thời gian ngủ trưa, thời gian ngồi tĩnh tại) với biến : BMI, WHR, phần trăm mỡ thể Kết phân tích cho thấy người mang kiểu gen AA giảm nguy mắc bệnh HCCH so với người mang kiểu gen AG GG (P< 0,05) Bảng 3.7 Ảnh hưởng SNP rs1801278 với yếu tố nguy HCCH mô hình siêu trội Mô hình Mô hình chưa hiệu chỉnh Mô hình hiệu chỉnh với tuổi, huyết áp tối thiểu, huyết áp tối đa, HDL-C, LDL-C, triglyceride cholesterol Mô hình hiệu chỉnh mô hình biến sau: BMI Phần trăm mỡ thể WHR Mô hình hiệu chỉnh mô hình tình trạng kinh tế-xã hội, lối sống biến sau: BMI Phần trăm mỡ thể WHR OR (95%CI) 1,79 (1,12-2,86) 2,06 (1,16-3,70) P 0,014 0,014 2,07 (1,13-3,80) 1,93 (1,06-3,50) 2,12 (1,16-3,87) 0,018 0,031 0,015 1,92 (1,04-3,54) 1,99 (1,09-3,62) 1,97 (1,07-3,63) 0,038 0,025 0,031 P từ phân tích mô hình hồi quy logistic regression Tình trạng kinh tế - xã hội lối sống bao gồm: Trình độ học vấn, nghề nghiệp, lao động chân tay hay nhiều, tình trạng hôn nhân, gia đình có người bị đái tháo đường, hút thuốc, uống rượu, ăn đồ ngọt, thời gian ngồi tĩnh tại, thời gian xem ti vi, thời gian ngủ trưa Từ bảng 3.7 rút kết luận sau: Mô hình 1: Ảnh hưởng đa hình Gly972Arg mô hình siêu trội nguy mắc bệnh HCCH: người mang kiểu gen AG làm tăng nguy mắc bệnh HCCH 1,79 lần so với người có kiểu gen AA GG (P = 0,014) 21 Mô hình 2: Ảnh hưởng đa hình Gly972Arg mô hình siêu trội nguy mắc HCCH hiệu chỉnh tuổi, giới tính, huyết áp tối đa, huyết áp tối thiểu, HDL-C, LDL - C, triglyceride cholesterol Sau hiệu chỉnh với yếu tố cho thấy người mang kiêu gen AG làm tăng nguy mắc bệnh HCCH (OR = 2,06, 95%CI: 1,16-3,70, P = 0,014) Mô hình 3: Ảnh hưởng đa hình Gly972Arg mô hình siêu trội nguy mắc bệnh HCCH hiệu chỉnh tuổi, giới tính, huyết áp tối đa, huyết áp tối thiểu, HDL-C, LDL-C, triglyceride, cholesterol với biến: BMI, WHR, phần trăm mỡ thể Kết phân tích cho thấy người mang kiêu gen AG làm tăng nguy mắc bệnh HCCH (P