Thực hành sinh học đại cương

Nhưng n không được cao hơn chỉ số chiết quang của các thấu kính trong vật kính, nên người ta chỉ nâng n giữa vật kính và mẫu vật bằng một chất dầu gọi là dầu bách hương dầu cede để đạt c

MỤC LỤC

Bài 1: Kính hiển vi quang học và tiêu bản hiển vi 2

Bài 2: Hình thể và cấu trúc tế bào 11

Bài 3: Sự vận động của tế bào 26

Bài 4: Nhiễm sắc thể người và một số động vật, nhiễm sắc thể khổng lồ, chất nhiễm sắc giới tính 33

Bài 5: Một số bào quan và thể vùi trong tế bào 50

Bài 6: Sự vận chuyển vật chất qua màng tế bào 58

Bài 7: Sự sinh sản của tế bào 67

Bài 8: Di truyền học, một số phương pháp nghiên cứu di truyền, một số bài toán di truyền áp dụng qui luật đồng tính của thế hệ lai thứ nhất Qui luật phân li độc lập – Di truyền liên kết với giới tính 81

Bài 1: KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC VÀ TIÊU BẢN HIỂN VI.

I YÊU CẦU

- Nắm được đặc điểm chính về cấu tạo và cách sử dụng kính hiển vi quang học

- Biết cách bảo quản kính hiển vi quang học

- Nắm được những nét chính về tiêu bản hiển vi và cách làm các loại tiêu bản hiển vi

- Tự làm được những tiêu bản đơn giản

II DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT, MẪU VẬT.

1 Dụng cụ, phương tiện.

- Kính hiển vi quang học loại 1 mắt, loại 2 mắt

- Kính lúp

- Khăn mềm để lau kính, bông thấm nước, bông không thấm nước

- Lam kính, lamen, giấy thấm, kim trích máu

- Counter goute, que nạo niêm mạc miệng, băng dính vải

2 Hóa chất.

- Ancol 960, ancol tuyệt đối

- NaCl 90/00, giem sa, acide acetic, đỏ carmin

- Formol, glycerin, phèn chua, xanh methylen

- Xylen hoặc toluen, fuschin, tím geutran, iodua kali

- Dầu cede (Dầu soi kính hiển vi)

- Bome canada

- Xà phòng

3 Mẫu vật.

Gà, Thỏ, máu người, tinh dịch người

III TÓM TẮT NỘI DUNG

- Đặt tiêu bản vào mâm kính

- Quan sát ở vật kính nhỏ rồi mới chuyển sang sử dụng ở vật kính lớn

1.3 Bảo quản

Bảo quản nơi khô ráo có chống ẩm

2 Tiêu bản hiển vi.

Kính hiển vi quang học có nhiều loại, nhiều kiểu Về hình dạng và cách bố trí các bộ phận

có thể khác nhau, song nguyên tắc cấu tạo đều cơ bản giống nhau

1.1 Nguyên tắc quang học của kính hiển vi

Hệ thống phóng to của kính hiển vi quang học gồm hai bộ phận: Vật kính (quay về phía vật quan sát) và thị kính (quay về phía mắt nhìn) Mỗi bộ phận này là một hệ thống thấu kính hội tụ phức tạp, mẫu vật cần quan sát AB được đặt trước vật kính một khoảng cách lớn hơn

tiêu cự của vật kính một chút Ảnh thật đảo ngược A’B’ của vật sẽ thu được ở bên kia vật kính, nằm trong khoảng tiêu cự của thị kính Thị kính hoạt động như một kính lúp Qua thị kính, người ta sẽ thấy ảnh ảo A’’B’’ được phóng to lên của ảnh thật A’B’

Hình 1 Nguyên tắc quang học của kính hiển vi.

1.2 Cấu tạo và chức năng của các bộ phận trong kính hiển vi

Gồm 2 phần:

- Các bộ phận cơ học

- Các bộ phận quang học

14 6

9

Hình 2 Các bộ phận cơ học và quang học của kính hiển vi một mắt.

1 Đế kính; 2 Thân kính; 3 Ốc đại cấp; 4 Ốc vi cấp; 5 Mâm kính;

6 Ống kính; 7 Hệ thống xe đẩy; 8 Kẹp giữ tiêu bản; 9 Mâm xoay;

10 Đèn; 11 Núm điều khiển ánh sáng; 12 Hộp tụ quang;

13 Vật kính; 14 Thị kính

7

1.2.1 Các bộ phận cơ học.

- Chân kính (đế kính): Thường có hình móng ngựa, hình chữ nhật, thường to và nặng để

giữ các phần trên của kính Trong chân kính có bộ phận lắp đèn hoặc gương phản chiếu để cung cấp ánh sáng khi soi kính Ở một số kính hiển vi có bộ phận biến thế điện và có thể điều khiển để tăng hoặc giảm cường độ ánh sáng khi soi kính

- Thân kính: Thường có hình dấu ngoặc Đầu trên thân kính gắn với ống kính và mâm

xoay, đầu dưới gắn với đế kính Giữa thân kính có các bộ phận ốc vi cấp, ốc đại cấp, mâm kính, hộp tụ quang Thân kính còn là chổ tay cầm khi ta di chuyển kính hiển vi

- Ống kính: Là đoạn ống nằm ở phần trên của kính, có 1 ống kính đối với kính 1 mắt và 2 ống kính đối với kính 2 mắt Đầu trên ống kính gắn với thị kính, đầu dưới gắn với thân kính

Dưới hệ thống thấu kính của hộp tụ quang có bộ phận chắn sáng được sắp xếp bởi các lá thép đồng tâm và có que điều chỉnh hệ thống chắn sáng Người ta có thể thay đổi độ sáng khi quan sát tiêu bản bằng cách thay đổi mức độ đóng mở của bộ phận chắn sáng bằng que điều chỉnh hệ thống chắn sáng

Dưới hệ thống chắn sáng có một khay tròn, bên trong có gờ dùng để lắp kính lọc màu

- Mâm kính: Hình chữ nhật hoặc hình vuông Giữa mâm kính có lổ hình tròn hoặc hình

chữ nhật để ánh sáng xuyên qua khi soi kính làm sáng mẫu vật Trên mâm kính có gắn hệ thống xe đẩy và kẹp giữ tiêu bản Mâm kính dùng để dặt tiêu bản

- Hệ thống xe đẩy và kẹp giữ tiêu bản:

Hệ thống xe đẩy được cấu tạo bởi những thanh thép răng cưa trượt lên nhau và được điều khiển bởi hai ốc Hai ốc của hệ thống xe đẩy (có thể cùng trục hoặc khác trục) dùng để di chuyển mẫu vật trên tiêu bản theo hai hướng vuông góc với nhau Nhờ vậy mà ta có thể điều chỉnh mẫu vật về vị trí theo ý muốn Trên các thanh của xe đẩy có chia vạch dùng để xác định tọa độ của hình ảnh đang quan sát trên tiêu bản khi cần thiết

Kẹp giữ tiêu bản gắn với một thanh của xe đẩy dùng để kẹp giữ chặt tiêu bản vào xe đẩy

- Mâm xoay: Hình tròn, xoay được quanh một trục Trên mâm xoay có các điểm để gắn vật

kính Khi muốn thay đổi độ phóng đại của vật kính, ta dùng mâm xoay này

1.2.2 Các bộ phận quang học

- Gương (đèn): Gương dùng để hứng ánh sáng và phản chiếu ánh sáng cho kính hoạt động

Gương có 2 mặt: Mặt phẳng dùng khi ánh sáng mạnh, mặt lõm dùng khi ánh sáng yếu Có thể dùng gương hoặc dùng đèn để cung cấp ánh sáng cho kính hoạt động

Những kính dùng đèn thường có thêm bộ phận điều chỉnh ánh sáng mạnh yếu khi cần thiết

và mặt trên của hộp đèn có bộ phận để lắp kính lọc màu

- Kính lọc màu: Là các tấm thủy tinh hoặc nhựa màu chịu nhiệt Có nhiều loại kính màu

khác nhau dùng để chống mỏi mắt khi quan sát trên kính lâu hoặc dùng để làm nền màu khi cần quan sát rõ nét 1 mẫu vật nào đó

- Tụ quang: Là một hệ thống thấu kính hội tụ để hội tụ ánh sáng thành một chùm sáng

mạnh, tập trung để làm sáng mẫu vật khi soi kính Dưới hệ thống thấu kính hội tụ là hệ thống chắn sáng Bên dưới cùng của hộp tụ quang có thể có gắn bộ phận để lắp kính lọc màu

- Vật kính: Là phần quan trọng nhất trong hệ thống quang học của kính hiển vi, nó quyết

định khả năng nhìn rõ của kính Bên ngoài mỗi vật kính có khắc độ phóng to của vật kính và

+ Vật kính dầu:

- HI 100 / 1,25 - 100 / 0,17 <Độ phóng to / Trị số mở / Chiều dài thân ống kính (mm) /

Độ dày của lamen (mm) >

Các loại vật kính x40, x100 (vật kính có trị số mở cao và vật kính chìm) yêu cầu độ dày của lá kính (Lamen) là 0,17 mm (có thể thay đổi từ 0,15 – 0,19 mm)

Ở những vật kính có độ phóng đại càng lớn thì khoảng cách giữa đầu vật kính đến lamen càng nhỏ Do đó, khi thay đổi vật kính cần chú ý để khỏi chạm vào tiêu bản

Khi quan sát ở kính hiển vi, ngoài độ phóng to của kính, người ta còn chú ý đến khả năng phân ly của vật kính ( là khoảng cách có thể nhìn rõ được giữa hai điểm gần nhau nhất) Khả năng phân ly (d) được tính theo biểu thức sau:

λ

d = 2nsinα

λ : Độ dài bước sóng phát ra từ mẩu vật

n : Chỉ số chiết quang của môi trường giữa mẫu vật và vật kính

α : Nửa góc mở của vật kính

2nsinα : Trị số mở của vật kính

Qua đó, ta thấy muốn có độ phân ly cao phải dùng ánh sáng có bước sóng thật ngắn, hoặc dùng vật kính có trị số mở lớn

Nếu dùng vật kính có trị số mở 0,65 và soi với ánh sáng trắng (có bước sóng trung bình λ

= 0,55 µm) thì khoảng cách nhỏ nhất có thể nhìn thấy rõ được là:

0,55

0,65Với những chi tiết có khoảng cách nhau dưới 0,85 µm thì người ta không phân biệt được Trong khi đó nếu dùng thị kính có độ phóng đại lớn hơn cũng không ích gì mà phải thay vật kính khác có trị số mở lớn hơn

Nếu thay vật kính chìm (vật kính dầu – x100) thì khoảng cách nhỏ nhất giữa các chi tiết của vật soi có thể thấy được là:

0,55

d = = 0,44 µm1,25

Vì λ đã xác định bởi nguồn ánh sáng thấy, muốn giảm d để tăng khả năng phân tích của kính thì chỉ có cách là tăng nsinα Trong số này góc α bị giới hạn bởi nhiều sai lệch khó điều chỉnh, còn lại là chỉ số chiết quang n Nhưng n không được cao hơn chỉ số chiết quang của các thấu kính trong vật kính, nên người ta chỉ nâng n giữa vật kính và mẫu vật bằng một chất dầu gọi là dầu bách hương (dầu cede) để đạt chỉ số chiết quang tối đa mong muốn bằng chỉ số chiết quang của thấu kính

Vì vậy mà kính hiển vi quang học cho tới nay vẫn dừng ở độ phóng đại lý thuyết là 3000

với bộ thấu kính: Thị kính 20x, trung gian 1,5x và vật kính 100x Trong thực tế thì độ phóng đại này không dùng vì tối đa độ phóng đại thường dùng được với ánh sáng thấy là 1000 lần, với khoảng cách phân biệt được là 0,2 Micrômet Những vật kính tốt dùng để nghiên cứu có thể soi đạt ở độ phóng đại 1500 lần.

Kính hiển vi điện tử giúp ta thấy được hình ảnh của mẫu vật trên một màn huỳnh quang hoặc trên bản phim chụp ảnh Về nguyên lý cũng tương tự như kính hiển vi quang học phải có những chùm tia Ở đây không phải là ánh sáng mà là chùm tia điện tử Các chùm tia điện tử

có bước sóng vô cùng ngắn được khuyếch đại bởi các “thấu kính” điện tử hoặc từ để cuối cùng đập lên một màn huỳnh quang hoặc phim ảnh cho hình ảnh của mẫu vật nơi mà các chùm tia điện tử đã xuất phát

Sự tiến bộ kỹ thuật của kính hiển vi điện tử có thể còn nâng cao độ phóng đại của kính hiển

vi điện tử và cũng không phải chỉ là vấn đề độ phóng đại mà còn là ở những hình ảnh nổi cho phép thấy được ảnh có chiều sâu, có độ lồi lõm phức tạp Phương pháp này gọi là phương pháp hiển vi điện tử quét

Kính hiển vi điện tử có độ phóng đại rất lớn (có thể tới trên 60 vạn lần) vì dùng nguồn điện

tử thay cho nguồn ánh sáng thường Chiều dài bước sóng của chùm tia điện tử trong điều kiện chân không ngắn hơn bước sóng của ánh sáng thường khoảng 1000 lần, nghĩa là dao động trong khoảng 0,0004 – 0,0007 µm Vì vậy kích thước vật nhỏ nhất có thể nhìn thấy được dưới kính hiển vi điện tử vào khoảng 0,8 nm ( 1nm = 1/1000 µm)

- Thị kính: Gắn ở đầu trên của ống kính Thị kính có cấu tạo đơn giản hơn vật kính, chỉ

gồm 2 thấu kính và một cái chắn sáng ở giữa Trên mỗi thị kính đều ghi độ phóng đại của nó

Ví dụ: 5x, 6x, 10x, 15x.

Độ phóng đại chung của kính hiển vi (ký hiệu L) sẽ bằng độ phóng đại của vật kính (ký hiệu Lv) nhân với độ phóng đại của thị kính (ký hiệu Lt)

L = Lv x Lt1.3 Cách sử dụng và bảo quản kính hiển vi quang học

1.3.1 Sử dụng

Trước khi sử dụng phải kiểm tra tất cả các bộ phận của kính, dùng khăn mềm để lau các bộ phận của kính (Chú ý: chỉ lau bên ngoài, không tháo rời các bộ phận của kính), để kính ngay ngắn vừa với tầm ngồi, sau đó tiến hành tuần tự các bước tiếp theo để soi tiêu bản

Bước 1: Lấy ánh sáng

+ Đối với kính hiển vi phải dùng gương để lấy ánh sáng từ bên ngoài thì làm như sau: Chọn phía sáng nhất để làm nguồn sáng, quay gương về phía nguồn sáng đã chọn (nếu ánh sáng mạnh thì dùng mặt phẳng, nếu ánh sáng yếu thì dùng mặt lõm của gương), mở que chắn sáng nếu hệ thống chắn sáng bị đóng Mắt nhìn qua lổ trên mâm kính, tay điều khiển gương sao cho thấy mặt trên hộp tụ quang có 1 chùm sáng mạnh là đạt yêu cầu Xoay vật kính nhỏ nhất (vật kính 10) về trục kính (khi nghe tiếng cạch nhẹ là đã đúng vị trí)

Mắt nhìn vào thị kính, thấy vi trường sáng tròn đều là được Nếu vi trường chưa sáng tròn đều thì mắt nhìn vào thị kính, tay điều khiển gương cho đến khi được vi trường sáng tròn đều.+ Đối với kính hiển vi dùng ánh sáng đèn thì cắm dây đèn vào ổ cắm, bật công tắc, điều khiển núm chỉnh ánh sáng ở đế kính để có được ánh sáng thích hợp Xoay vật kính nhỏ nhất (vật kính 10x) về trục kính như trên

Bước 2: Đặt tiêu bản vào mâm kính

Trước khi đặt tiêu bản vào mâm kính, phải chọn mặt phải, mặt trái của tiêu bản Mặt phải của tiêu bản thường có dán lamen, dán nhãn (nếu có lamen và nhãn) hoặc làm giảm bớt độ lóa của gương khi để nghiêng soi ra ánh sáng (nếu không có lamen, không có nhãn)

Để mặt phải của tiêu bản lên trên, tay phải mở kẹp tiêu bản, tay trái cầm phía đầu nhãn tiêu bản, đặt tiêu bản vào mâm kính và tay phải thả kẹp giữ tiêu bản ra Tiêu bản được giữ chặt vào xe đẩy, trên mâm kính

Dùng ốc xe đẩy để điều chỉnh sao cho mẫu vật nằm đúng vào trục kính (giữa lổ mâm kính)

Chú ý: Có thể dùng điểm sáng của hộp tụ quang để làm điểm chuẩn khi điều chỉnh mẫu vật

về điểm trục kính, nếu mẫu vật nhỏ quá

Chú ý Từ vật kính 40x trở lên, khoảng cách giữa vật kính và tiêu bản rất ngắn, nên không được sử dụng ốc đại cấp điều chỉnh kính để tránh làm vỡ tiêu bản

Quan sát ở vật kính 100x

Vật kính 100x còn gọi là vật kính dầu (vật kính chìm) vì vật kính này khi sử dụng nó luôn luôn chìm trong dầu

Nhỏ một giọt dầu cede (dầu soi kính hiển vi) lên mẫu vật trên tiêu bản tại điểm đã quan sát

ở vật kính x40 Để nguyên vị trí đã quan sát được ở vật kính 40x, xoay vật kính 100x về trục kính Đầu vật kính 100 sẽ chạm vào giọt dầu cede Nâng hộp tụ quang lên tối đa (hoặc điều khiển ốc chỉnh sáng cho ánh sáng mạnh nhất) Mắt nhìn vào thị kính, tay điều khiển ốc vi cấp cho đến khi thấy rõ mẫu vật Quan sát ở vật kính 100x

Trong phòng thực tập khi sử dụng vật kính 100x phải có sự chỉ dẫn của cán bộ hướng dẫn thực hành

* Một số điểm cần chú ý khi sử dụng kính hiển vi

- Khi quan sát, cần thường xuyên nhấp nháy ốc vi cấp để thấy được đầy đủ trên các mặt phẳng khác nhau của vi phẩu

- Ốc vi cấp chuyển động được cả 2 chiều, mỗi chiều ít nhất 2 vòng Nếu đang vặn mà thấy

bị kẹt cứng thì phải dừng ngay và quay ngược về chiều kia Tuyệt đối không được dùng sức mạnh để vặn tiếp, vì sẽ làm hỏng bộ phận này Trong trường hợp đó, phải dùng ốc đại cấp để nâng hay hạ mâm kính cho phù hợp rồi mới điều chỉnh ốc vi cấp cho rõ nét

- Ảnh thấy trong kính hiển vi luôn luôn ngược chiều với vật quan sát Vì vậy, để cho hình ảnh trong kính được thuận chiều, dễ quan sát thì khi dặt tiêu bản lên mâm kính phải quay ngược lại với chiều muốn có, khi di chuyển tiêu bản trên mâm kính cũng phải di chuyển ngược chiều với chiều mình muốn

- Nên mở cả hai mắt khi quan sát (kể cả dùng kính một mắt) Mắt trái nhìn vào kính, mắt phải nhìn vào giấy vẽ đặt bên phải kính (ngược lại nếu thuận tay trái) Như thế ta có thể vừa quan sát vừa vẽ mà không cần di chuyển thân mình Không nên nhắm một mắt vì nhìn lâu sẽ mỏi

- Người ta quy ước chia vị trí trên kính trường như trên mặt đồng hồ (cũng từ 1 đến 12 giờ)

để dễ dàng trao đổi ý kiến với nhau

- Khi sử dụng vật kính 40x trở lên tuyệt đối không được dùng ốc đại cấp

- Ở độ phóng đại càng lớn thì cần ánh sáng càng nhiều

1.3.2 Bảo quản

- Sau khi sử dụng xong, xoay tất cả các vật kính ra trước, mở kẹp tiêu bản, lấy tiêu bản ra

trả về chỗ cũ, hạ mâm kính, hạ hộp tụ quang, dùng khăn mềm khô lau lại kính Dùng hai tay

- Nếu sử dụng vật kính 100x thì phải dùng xylen hoặc toluen hoắc Alcol Ethylic (tuỳ theo loại vật kính mà sử dụng dung môi cho phù hợp) thấm vào khăn bông mềm hoặc giấy thấm để lau sạch dầu cede đầu vật kính 100x Một số loại vật kính khi dùng Alcol Ethylic để lau thì sẽ làm tan chất gắn các thấu kính của vật kính Nhưng ngược lại, một số loại vật kính thì xylen

và toluen lại làm tan chất gắn các thấu kính của vật kính

- Tránh mọi sự va chạm mạnh vào kính, không đánh đổ, đánh rơi kính Nếu di chuyển kính

ra khỏi phòng thí nghiệm, nhất thiết phải đưa kính vào hộp của nó có chèn lót cẩn thận

- Nếu phát hiện có 1 hư hỏng nào đó, nhất thiết không được tự ý tháo ra sửa chữa mà phải báo với cán bộ hướng dẫn biết để xử lý

2 Tiêu bản hiển vi.

2.1 Thành phần

- Lam kính (phiến kính): hình chữ nhật, kích thước 20 x 76 mm, dày khoảng 1mm, dùng để mang mẫu vật soi ở kính hiển vi

- Mẫu vật: được dàn đều và mỏng lên lam kính

- Lamen (lá kính): có nhiều hình dạng và kích thước khác nhau Thường có hình vuông với kích thước 10 x 10mm, 22 x 22mm hoặc hình chữ nhật kích thước 22 x 32mm, 25 x 50mm, dày 0,12 – 0,14mm Lamen dùng để đậy mẫu vật trên lam kính

Hình 3 Tiêu bản hiển vi.

2.2 Các loại tiêu bản hiển vi

2.2.1 Tiêu bản soi tươi

Để nghiên cứu những mẫu vật đang còn sống (Tế bào sống hoặc các vi sinh vật đang sống), là một trong những phương pháp cơ bản của kỹ thuật hiển vi Qua đó, người ta biết được thêm các đặc điểm sinh trưởng và phát triển của chúng

Cách làm: Đối với những mẫu nghiệm là chất lỏng mà có đậm độ tế bào thấp , người ta lấy mẫu nghiệm đem ly tâm rồi lấy cặn ly tâm để dàn lên lam kính rồi đậy lamen và quan sát soi tươi Đối với những mẫu nghiệm là chất lỏng có đậm độ tế bào lớn thì người ta lấy nhỏ một giọt nước muối sinh lý nhỏ lên phiến kính sạch, dàn đều, mỏng mẫu vật lên giọt nước muối sinh lý đó Đậy lamen, quan sát ở vật kính 10x và 40x

Những mẫu nghiệm đặc và chất rắn đều phải được cắt mỏng thành lát mỏng, đặt các lát mỏng lên lam kính trong dung dịch sinh lý để quan sát soi tươi

Chú ý:

- Phải làm sạch, khô lam kính và lamen

- Mẫu vật dàn vào giọt nước muối sinh lý phải vừa đủ, không nhiều quá, dày quá mà chồng chất lên nhau khi quan sát không thấy rõ được, nhưng cũng không quá ít thì khó tìm thấy

- Đậy lamen không để tạo thành các bọt không khí dưới lamen bằng cách để 1 cạnh lamen chấm vào giọt mẫu vật, để nghiêng lamen rồi từ từ hạ xuống.

Ngoài phương pháp làm tiêu bản soi tươi không nhuộm màu, người ta còn dùng phương pháp soi tươi có nhuộm màu đối với các mẫu vật đang sống Mục đích của phương pháp này

là nhuộm một vài thành phần của tế bào khi mẫu vật đang sống Nó đóng vai trò quan trọng trong việc nghiên cứu sinh lý của đối tượng quan sát Nguyên tắc của phương pháp này là: Một vài bộ phận của cơ thể sống có một số khả năng tích lũy một số chất màu nhất định Qua

đó sẽ xuất hiện sự tương phản về màu sắc làm cho người ta dễ phân biệt với các bộ phận khác không bắt màu Chất màu được dùng phải ở nồng độ rất loãng để giảm mức thấp nhất sự tác hại của thuốc nhuộm màu với mẫu vật

Người ta thường dùng 2 loại chất màu

+ Chất màu diacrom dùng cho tiêu bản quan sát ở kính hiển vi thông thường

+ Chất màu loại fluorocrom dùng cho tiêu bản quan sát ở kính hiển vi huỳnh quang

+ Chất màu loại Diacrom thường dùng để nhuộm không bào, màng tế bào, thể hạt sợi (chondriosome) và một phần các lạp thể (Plastid) Không dùng để nhuộm nhân tế bào

Thuốc màu Fluorocrom có ưu điểm là được dùng ở nồng độ rất thấp, mà kết quả lại cho hình ảnh tương phản rõ hơn thuốc màu diacrom , vì vậy mà ít độc cho vật sống đang quan sát Nhưng thuốc màu Fluorocrom lại có nhược điểm là khi quan sát phải dùng nguồn sáng xanh hay cực tím, mà loại ánh sáng này lại rất có hại cho cơ thể sống và dần dần làm nhạt màu của thuốc nhuộm

2.2.2 Tiêu bản cố định

Thông thường khi làm tiêu bản cố định, người ta cần nhuộm màu và tiến hành nhiều bước

- Đối với mẫu vật là chất lỏng (như các chất dịch, máu, mủ, đàm …) người ta phết đều và mỏng mẫu vật lên lam kính, để khô, cố định rồi nhuộm màu (nếu mẫu vật là chất lỏng có đậm

độ tế bào thấp thì phải ly tâm, lấy cặn ly tâm để làm tiêu bản)

- Đối với mẫu vật đặc (như mô cơ, mô xương …) người ta chọn mẫu vật thích hợp, cố định mẫu vật khi còn tươi để giết chết mẫu vật tức khắc, ngăn chặn quá trình tự phá hủy do men hay thối rữa trong các mô; đồng thời làm cho các mô cứng hơn để dễ cắt, dễ nhuộm màu hơn, các dung dịch được dùng để làm chất cố định thường là acide cromic, ethanol, formol…

+ Khử nước: Sau khi lấy mẫu vật ra khỏi dung dịch cố định, cần rữa sạch bằng nước rồi ngâm vào các lọ cồn với nồng độ cao dần để loại nước và làm cho mẫu vật khỏi bị co rúm+ Chuyển mẫu vật vào môi trường trung gian: Chất trung gian này vừa phải hòa tan trong cồn, vừa hòa tan được parafin Thường dùng là benzen

Chuyển mẫu vật vào parafin để cho parafin ngấm hoàn toàn vào mẫu vật

+ Đúc khối parafin: Khi parafin đã ngấm hoàn toàn vào mẫu vật, đem đúc thành khối trong những khuôn giấy nhỏ hoặc chén nhỏ bằng thiếc, sứ … được tráng mỏng 1 lớp glycerin và sau đó làm nguội nhanh thỏi parafin

+ Chuẩn bị phiến kính sạch, bôi lên phiến kính chỗ sau này sẽ đặt lát cắt một lớp mỏng chất dính glycerin – lòng trắng trứng để khi đặt các lát cắt vào, nó được dính chặt vào phiến kính, khỏi bị bong ra khi loại parafin và khi nhuộm màu Để phiến kính khô mới đem dùng.Lưu ý: Chất dính này có khả năng phát huỳnh quang riêng nên khi soi bằng kính hiển vi huỳnh quang thì cần phải dùng chất dính khác

+ Cắt mẩu vật qua khối parafin bằng máy cắt và đưa các lát cắt lên phiến kính

+ Loại parafin ở lát cắt và nhuộm màu

+ Gắn Lamen lên mẩu vật bằng bome canada

* Phương pháp nhuộm màu

Tùy theo từng loại mẫu vật và mục đích nghiên cứu mà người ta dùng các chất màu và phương pháp nhuộm khác nhau nhằm làm nổi rõ một số thành phần cấu tạo của từng tế bào hoặc của từng mô trong cơ thể sinh vật Ở đây đề cập đến phương pháp thông thường nhất.Trong nghiên cứu về tế bào và giải phẩu học, người ta thường áp dụng cách nhuộm sau

- Nhuộm đơn: chỉ dùng một loại chất màu Ví dụ nhuộm thể nhiễm sắc ở thực vật bằng dung dịch carmin – acetic; nhuộm tế bào máu bằng giemsa.

- Nhuộm phối hợp: Dùng từ 2 chất màu trở lên

+ Nhuộm giảm dần: Vi phẩu được nhuộm màu quá đậm, sau đó dùng chất lỏng thích hợp

để tẩy bớt màu thừa cho đến khi màu sắc vừa đúng thì dừng lại

Đối tượng cần nhuộm cũng có các loại sau:

+ Vật nhuộm đang sống phải chọn chất màu thích hợp để giữ cho nó tiếp tục sống bình thường khi quan sát

+ Vật nhuộm đã cố định và đã cắt: Áp dụng trong đa số trường hợp nghiên cứu cấu tạo giải phẩu

+ Vật nhuộm đã cố định, rửa sạch rồi nhuộm mà không cắt: Áp dụng đối với các mẩu vật

bé mảnh dẻ, hoặc làm các tiêu bản thực vật ép bẹp trên phiến kính

Kết quả nhuộm màu phụ thuộc vào nhiều yếu tố, tính chất lý hoá của vật nhuộm, chất lượng của thuốc nhuộm, nồng độ pH của dung dịch nhuộm, nhiệt độ và thời gian nhuộm, phương pháp tẩy và rửa sau khi nhuộm, v.v… Thực ra các yếu tố này khó kiểm tra chặt chẽ, cũng có khi không cần thiết, nên phần nhiều vẫn dựa theo kinh nghiệm

Đối với loại tiêu bản cố định có nhuộm màu, thường người ta gắn lamen đậy lên mẫu vật

để bảo quản tiêu bản được lâu dài Nhỏ lên phiến kính chỗ có mẫu vật thích hợp một giọt bome canada pha loãng bằng xylen, đặt lamen nghiêng chấm một cạnh lên giọt bome, để hạ cạnh đối diện xuống từ từ, bome tự dàn đều dưới lamen Để tiêu bản nằm ngang chỗ thoáng mát khoảng 1 tuần cho bome khô cứng là đem dùng được

V CÂU HỎI ĐỂ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ.

1 Trình bày cấu tạo và chức năng của các bộ phận trong kính hiển vi quang học Vẽ và chú thích

2 Thực hành sử dụng thành thạo kính hiển vi

3 Thực hành bảo quản, lau chùi và di chuyển kính hiển vi

4 Tiêu bản hiển vi là gì? Thành phần của tiêu bản hiển vi Phân loại sơ bộ các loại tiêu bản hiển vi ?

5 Trình bày các bước tiến hành làm tiêu bản soi tươi và mục đích của phương pháp này ?

6 Trình bày tổng quát các bước làm tiêu bản nhuộm màu, ý nghĩa mục đích của phương pháp này ?

7 Thực hành làm các loại tiêu bản Tiêu bản soi tươi, tiêu bản niêm mạc miệng, tiêu bản máu người, tiêu bản máu gà, tiêu bản tinh trùng người

8 Kiến tập làm tiêu bản thần kinh tủy sống Thỏ

Bài 2: HÌNH THỂ VÀ CẤU TRÚC TẾ BÀO

I YÊU CẦU

- Nắm được các phương pháp cơ bản nghiên cứu tế bào

- Quan sát và nhận diện được hình dạng và cấu trúc tế bào, nhân tế bào ở một số tế bào của người, động vật, thực vật

- Tự làm một số tiêu bản đơn giản để quan sát hình dạng tế bào và nhân tế bào

II DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, MẪU VẬT.

- Kính hiển vi mỗi sinh viên một cái

- Giấy thấm, kim chích đầu ngón tay để lấy giọt máu

- Giemsa, xanh methylen, dầu cede, hematoxylin, eosine, acide acetic, ether

III TÓM TẮT NỘI DUNG.

1 Các phương pháp nghiên cứu tế bào.

1.1 Phương pháp hiển vi quang học

Với kính hiển vi quang học ta có thể quan sát được tế bào sống và tế bào đã định hình.Muốn xem tế bào sống phải đặt mẫu vật vào môi trường giống hay gần giống với môi trường sống tự nhiên của nó Một số bộ phận của tế bào sống có chỉ số chiết quang bằng nhau nên quan sát theo phương pháp bình thường không thể thấy được nhưng khi cải biến chút ít bằng các phụ kiện thành kính hiển vi nền đen hay kính hiển vi đối pha thì có thể thấy rõ ràng hơn Để quan sát những bào quan và những vật thể trong tế bào có cấu trúc tương tự cấu trúc của tinh thể, người ta dùng kính hiển vi phân cực Để quan sát hình thể không gian ba chiều của tế bào, người ta dùng kính hiển vi soi nổi hoặc kính hiển vi đảo ngược Tế bào sống cũng

có thể nhuộm sống để tăng độ chiết quang của các phần khác nhau Chất màu nhuộm phải loãng, không độc hoặc rất ít độc đối với tế bào Các phẩm nhuộm thường dùng là đỏ trung tính, xanh Janus, lục Trypan, lục Methyl, đỏ Trypan

Phương pháp hay dùng hơn là xem tế bào đã định hình và nhuộm, định hình nhằm làm cho

tế bào chết một cách đột ngột để cho hình dạng tế bào ít thay đổi nhất Sau định hình, một số

bộ phận trong tế bào thường bị co lại, phồng lên hoặc bị đông lại

Để định hình người ta sốc nóng hay đông lạnh hay dùng các hoá chất như alcol, các muối kim loại nặng như Platin clorua, thuỷ ngân biclorua, Uran nitrat, các axit như axit acetic, axit picric, axit cromic, axit focmic Mẫu vật sau khi định hình nếu dày quá thì phải cắt thành từng lát cắt mỏng khoảng vài Micromet Sau đó nhuộm bằng các chất màu thích hợp

Với kính hiển vi giao thoa và các phương pháp giao thoa cũng có thể phần nào xác định được sự tập trung của các chất rắn có trong nhân, hạch nhân và bào tương của các tế bào đang phát triển

Dưới kính hiển vi mà đặc biệt là dưới kính hiển vi đảo ngược và hệ thống vi thao tác, người ta có thể tiến hành phẫu tích gọi là vi phẫu tích với những dụng cụ rất nhỏ, tách được nhân ra khỏi tế bào hoặc cắt tế bào ra thành những mảnh nhỏ, hoặc tiến hành những kỹ thuật khác để nghiên cứu tế bào

1.2 Phương pháp hiển vi điện tử

Phương pháp này thực chất là chùm điện tử được dùng để quan sát tế bào qua các bộ máy phức tạp Nhờ bước sóng ngắn mà kính hiển vi điện tử có độ phóng đại lên hàng chục vạn lần,

có thể phân biệt đến A: Loại kính hiển vi có chùm tia xuyên qua mẩu vật được gọi là xuyên qua (Transmission electron microscope) Kính hiển vi điện tử mà chùm tia không xuyên qua

mẫu vật (đã được bao một màng mỏng bằng vàng), nó ghi nhận các điện tử thứ cấp bắn ra từ

bề mặt của mẫu vật phản ánh cấu trúc không gian ba chiều của mẫu vật

1.3 Phương pháp hoá học tế bào

Phương pháp hoá học tế bào giúp ta xác định được vị trí tập trung của các chất khác nhau trong tế bào và trong nhiều trường hợp có thể định lượng được chúng nhờ những máy quang phổ Nhờ các phương pháp hoá học tế bào mà ta có thể xác định được protide, acide nucleide, lipide, các chất lipoide, hormon, vitamin, các kim loại và các enzyme Người ta có thể dựa trên các phản ứng định tính hoá học, đối với từng loại chất, bằng cách dùng thuốc thử khác nhau, có thể thấy được màu sắc đặc trưng và vị trí của chất được phát hiện Người ta cũng có thể định lượng các chất có trong tế bào bằng phương pháp quang kế tế bào

Các phương pháp sắc kí và điện di ngày nay được áp dụng rộng rãi để phân tích định tính

và định lượng tới acide amin và các thành phần trong dịch tế bào

Trong số các phương pháp hoá học tế bào thì phương pháp hiển vi huỳnh quang có vị trí nổi bật hơn cả Phương pháp này giúp ta nhìn thấy một số chất hoá học trong tế bào chưa bị tổn thương Nguồn sáng của kính hiển vi huỳnh quang là đèn thuỷ ngân tạo ra một chùm nhiễu tia xanh và tia cực tím, các gương lọc ánh sáng và gương tán sắc đặc biệt sẽ phản chiếu lên bản quan sát những tia bước sóng ngắn, các tia UV đó tác động gây ra hiện tượng huỳnh quang và làm cho bản quan sát phát ra những tia sáng huỳnh quang có bước sóng dài hơn; độ dài bước sóng bức xạ huỳnh quang luôn luôn dài hơn độ dài bước sóng bức xạ gây ra nó.Các vật thể có khả năng huỳnh quang bắt đầu phát sáng một cách rõ ràng và mỗi chất có một bức xạ huỳnh quang đặc trưng Chẳng hạn chất diệp lục có bức xạ huỳnh quang màu đỏ tươi

Phương pháp hiển vi huỳnh quang được áp dụng rộng rãi trong vi sinh vật học, miễn dịch học, phương pháp kháng thể huỳnh quang Người ta sử dụng Quinacin và một số dẫn chất để phát hiện các băng huỳnh quang trên nhiễm sắc thể và vật thể giới tính Y ở tế bào lúc gian kỳ.1.4 Phương pháp nuôi cấy tế bào

Trong nhiều trường hợp việc nghiên cứu từng loại tế bào là cần thiết, nhiều trường hợp cần

số lượng lớn tế bào một loại nào đó Các phương pháp tách và nuôi cấy tế bào được cải tiến

và hoàn thiện dần

Các tế bào tách riêng được nuôi cấy trong các bình nuôi cấy chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp Những tế bào như bạch cầu Lympho máu ngoại vi, các tế bào từ bào thai bong ra trong dịch ối, các mô tách ra từ cơ thể như mô lấy từ bào thai, mô lấy từ da… Các tế bào nuôi cấy sau khi rời khỏi cơ thể vẫn sống và sinh sản và về cơ bản vẫn giữ được bản chất sinh học của cá thể nguồn gốc mà chúng được tách ra

Các tế bào nuôi cấy được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như:

- Chẩn đoán trước sinh bằng cách nuôi cấy tế bào nước ối

- Sử dụng tế bào nuôi cấy để làm mô hình thực nghiệm

- Sản xuất các chế phẩm sinh học: sản xuất vaccin virus, sản xuất các hoạt chất sinh học, sản xuất Interferon trong điều trị viêm gan B,C và một số bệnh ung thư, sản xuất kháng thể đơn dòng

- Tế bào động vật sử dụng trong cấy ghép để khắc phục các sai hỏng của cơ thể: cấy ghép các tế bào tụy tạng sản xuất insulin, cấy ghép các tế bào thần kinh để phục hồi chức năng của não, cấy ghép các tế bào nguồn tạo máu để khắc phục tình trạng không hoạt động của tủy xương, cấy ghép các tế bào sụn lành để khắc phục các tổn thương của sụn ở các khớp

- Tạo cơ quan từ tế bào động vật nuôi cấy: Sản xuất mạch máu tự nhiên bằng nuôi cấy tế bào động mạch chủ của bò Tạo dòng trị liệu để có những mô, những cơ quan mới thay thế cho mô, cơ quan bị hư hỏng

Đặc biệt ứng dụng của lĩnh vực này và có triển vọng lớn đó chính là tế bào phôi thai người.Sản xuất các hợp chất tự nhiên hay nhân tạo từ tế bào thực vật nuôi cấy

- Tái sinh cây có đặc tính sinh học mong muốn

- Tạo sinh khối từ tế bào vi sinh vật nuôi cấy.

- Sản xuất các hợp chất phân tử lượng thấp và cao phân tử từ tế bào vi sinh vật nuôi cấy

- Sử dụng tế bào vi sinh vật nuôi cấy trong một số quá trình công nghệ

1.5 Phương pháp tự chụp hình phóng xạ

Phương pháp này dựa vào khả năng phát hiện nhờ phim ảnh, các chất phóng xạ được đưa vào các hợp chất thích hợp rồi đưa các hợp chất đó vào tế bào Chất phóng xạ khi xâm nhập vào tế bào và nằm ở vị trí theo sự chuyển hoá của nó Sau đó lấy mô hoặc tế bào ra định hình, cắt mỏng đặt lên phiến kính và có thể nhuộm Bọc phiến kính bằng nhủ tương ảnh trong tối và giữ trong tối như phim ảnh Sau một thời gian chất phóng xạ nằm trong tế bào sẽ phát ra các điẹn tử, các điện tử này sẽ tác động lên Bromua bạc của nhủ tương ảnh Đem rửa phiến kính như rửa phim ảnh thường, khi soi dưới kính hiển vi sẽ nhìn thấy cả hình tiêu bản bình thường

và ảnh của bộ phận tế bào có chất phóng xạ, chỗ những vệt đen tập trung trên nhủ tương ảnh.Các chất đồng vị phóng xạ thường dùng là 14C, 35S, 3H, 32P, 14C, 35S đưa vào các axit amin

để theo dõi sự tổng hợp protein, 3H được đưa vào timin hoặc uraxin để theo dõi sự tổng hợp AND, ARN

1.6 Phương pháp ly tâm phân tách

Ly tâm phân tách là phương pháp cho phép tách rời các bào quan thành từng loại thuần khiết để nghiên cứu Phương pháp này gồm có hai bước:

- Nghiền tế bào để phá vỡ tế bào sao cho chỉ làm vỡ màng mà không hại tới các bào quan

và các thành phần khác của bào tương Nghiền và để lắng ở nhiệt độ thấp trong môi trường đặc trưng chứa dung dịch đệm để duy trì độ pH ổn định

- Làm lắng bằng máy li tâm Trong máy li tâm, các thành phần khác nhau sẽ bị kéo bởi một lực li tâm khác nhau

1.7 Phương pháp nhiễu xạ tia X

Tia X cũng như ánh sáng đều bị nhiễu xạ khi va chạm vào vật chất Đối với tia X, những tâm gây nhiễu xạ là những nguyên tử cấu tạo nên các phân tử

Khi những tâm gây nhiễu xạ cách đều nhau, những tia X bị nhiễu xạ cùng tia tới làm thành một góc xác định có trị số tỉ lệ nghịch với khoảng cách các tâm gây nhiễu xạ Khoảng cách đó gọi là chu kỳ và những cấu trúc gồm các tâm gây nhiễu xạ được gọi là cấu trúc có chu kỳ Khi chu kỳ có cấu trúc nhỏ hơn vài chục Ăngstron, những góc làm bởi những tia nhiễu xạ và tia tới sẽ lớn hơn 50 trường hợp này gọi là nhiễu xạ với góc lớn Chu kỳ ở vào khoảng từ 40-1000 Angstron, góc đó sẽ nhỏ hơn 50 và gọi là nhiễu xạ góc nhỏ

Sự nhiễu xạ với góc lớn cho phép đo những khoảng cách giữa những nguyên tử cùng phân

tử và xây dựng lại cấu trúc ba chiều của phân tử Nhờ phương pháp này, người ta xây dựng được mô hình không gian của các phân tử axit nucleic, polysaccarit và một số protein

Sự nhiễu xạ với góc nhỏ cho phép đo khoảng cách giữa các phân tử giống nhau sắp xếp thành cấu trúc chu kỳ như sự sắp xếp của những phân tử Photpholipide trong Myelin hoặc sự sắp xếp của các đại phân tử hình sợi trong tế bào cơ

Về thực hành, người ta chiếu một chùm nhỏ tia X trên một mẫu vật, những tia bị nhiễu xạ chiếu hình lên một tấm kính ảnh đặt ở sau nó

Biết khoảng cách giữa mẫu vật và tấm ảnh và hướng của tia tới có thể tính các góc của các tia bị nhiễu xạ so với tia tới Từ những số liệu đó người ta tính ra chu kỳ của những tâm gây nhiễu xạ

Nhờ sức đâm xuyên lớn của tia X, người ta có thể nghiên cứu những mẫu vật tương đối dày và những nhóm tế bào Ví dụ đo khoảng cách của những đại phân tử hình sợi ở trong bào tương của tế bào cơ có thể thực hiện trên một bắp thịt nguyên vẹn kích thước nhỏ như bắp thịt bàn chân ếch, bắp thịt cánh ruồi Phương pháp này còn có thể thực hiện được trên mẫu vật đang sống, cho phép so sánh những cấu trúc siêu vi thể ở trạng thái sống và sau khi định hình Phương pháp nhiễu xạ tia X còn có khả năng theo được dõi sự vận động bên trong phân tử nhờ các kết quả nối tiếp nhau kiểu quay phim

2

Ngoài phương pháp trên một phương pháp lý sinh khác gọi là nhiễu xạ nơtron đã được sử dụng thành công trong nghiên cứu phức hợp các phân tử khác nhau Kỹ thuật nhằm cho một chùm tia nơtron đi qua một tinh thể Phổ thu được cho phép thấy vị trí các nguyên tử trong lưới tinh thể Khi notron nhiễu xạ, độ khuyếch đại của nhiễu xạ sẽ là âm đối với các nguyên

tử Hydro, còn có các yếu tố khác có trong mô sinh vật thì có độ khuyếch đại ấy là dương Prôtein chứa một tỉ lệ Hyđrô cao hơn tỉ lệ ấy ở AND Lợi dụng tính chất này, người ta khám phá ra mô hình liên kết của Prôtein histon với AND tức là cấu trúc của sợi Cromatin, thành phần chính của nhiễm sắc thể của sinh vật bậc cao

2 Phân loại tế bào.

Tế bào là hệ thống sống cơ bản, là cơ sở vật chất của cấu tạo, phát triển và hoạt động của mọi cơ thể động vật và thực vật Người ta chia tế bào các loài sinh vật thành hai kiểu chính.2.1 Tế bào có nhân không điển hình (tế bào Prokaryota hay Prokaryotie cell): virus, vi khuẩn, tảo lam Vùng nhân không có màng bao bọc

2.2 Tế bào có nhân điển hình (tế bào Eukaryota hay Eukaryotie cell) Nhân có màng nhân tách biệt nhân với bào tương

Tùy thuộc vào chức năng sinh lý của tế bào và sự tác động cơ học của các yếu tố tế bào và

mô bao quanh chúng mà tế bào, nhân tế bào có hình dạng, kích thước và sự bắt màu khác nhau

Kích thước, hình dạng, màu sắc tế bào không phụ thuộc vào kích thước cơ thể sinh vật

IV NỘI DUNG.

1 Tế bào sợi nuôi cấy.

1.1 Cách làm tiêu bản

Lấy tế bào phôi thai người trong điều kiện vô trùng và đem nuôi cấy ngay trong môi trường, nhiệt độ, độ pH thích hợp đã có đặt sẵn các tấm lamen vô trùng Sau 72 giờ các tế bào mọc đều trên lamen, lấy ra định hình (cố định), để khô, nhuộm màu bằng Hematoxyline.1.2 Quan sát

Quan sát ở vật kính 10x và vật kính 40x:

Các tế bào sợi có dạng hình thoi, hình tam giác kéo dài nối tiếp nhau; nhân có nhiều chấm hạt nhiễm sắc bắt màu hồng đậm; bào tương bắt màu hồng nhạt hơn Bên cạnh các tế bào ở gian kỳ, các tế bào đang phân chia chuyên nhiễm, có một số ít các tế bào đang phân chia vô nhiễm và ta thường bắt gặp một số dạng: tế bào có nhân thắt lại để chuẩn bị chia đôi, hoặc nhân và bào tương thắt lại nhưng chưa phân chia thành hai, hoặc tế bào có nhân đã phân đôi hoàn toàn và bào tương thắt lại chuẩn bị trở thành hai tế bào

Hình 4 Tế bào sợi nuôi cấy.

1 Thân; 2 Nhân

Hình 5 Tế bào sợi nuôi cấy.

2.2 Quan sát ở vật kính 10x và 40x

Khi quan sát tiêu bản tế bào thần kinh tủy sống ta nhận thấy có hai vùng

Hình 6 Vùng chất xám và vùng chất trắng của thần kinh tủy sống.

- Vùng chất trắng: Bắt màu hồng nhạt, không có các mảnh thân tế bào thần kinh, chỉ có các lát cắt ngang của các sợi trục

- Vùng chất xám: Bắt màu hồng đậm hơn, có nhiều mảnh thân tế bào thần kinh với nhiều hình dạng khác nhau

Do lát cắt rất mỏng nên nó có thể đi qua giữa thân tế bào hoặc một bên thân tế bào cho nên

ở vùng chất xám của tiêu bản tế bào thần kinh tủy sống có các mảnh thân tế bào thần kinh với nhiều hình dạng khác nhau: Hình sao, hình tam giác, hình đa giác, hình vợt … có nhân hoặc không nhân Hiếm khi thấy một tế bào thần kinh nguyên vẹn

12

Nhân tế bào thần kinh có hình tròn nhỏ, bắt màu hồng đậm.

Hình 7 Vùng chất xám của thần kinh tủy sống.

1 Mảnh thân tế bào thần kinh; 2 Nhân

Hình 8 Vùng chất trắng của thần kinh tủy sống.

Bào tương bắt màu tím hoặc xanh tím nhạt; nhân tròn, nhỏ, bắt màu tím đậm hơn

Đặc biệt đối với loại tế bào này ta có thể quan sát thấy hạch nhân

12

Hình 9 Tế bào biểu bì hành.

1 Tế bào chất; 2 Nhân; 3 Hạch nhân

4 Tế bào máu người.

Tiêu bản máu người gồm có 3 loại tế bào:

- Hồng cầu: Hình tròn, kích thước khoảng 7,5µm (Micron), không có nhân, bắt màu hồng nhạt

- Tiểu cầu: Là những thể hình sao nhỏ (và các thể có hình thù khác như hình tam giác, hình

bầu dục) với nhiều hạt Kích thước từ 2 – 5µm nằm thành từng cụm, bắt màu hồng đậm hoặc hồng tím

- Bạch cầu:

Ở máu ngoại vi của người có hai nhóm bạch cầu Hai nhóm bạch cầu này khác nhau về kích thước, hình dạng và tỷ lệ của chúng trong máu Và đặc biệt là khác nhau về số lượng nhân có trong mỗi tế bào bạch cầu: Bạch cầu đơn nhân tế bào chỉ có một nhân, bạch cầu đa nhân tế bào có nhiều nhân

+ Bạch cầu đơn nhân:

Trong nhóm bạch cầu đơn nhân, người ta dựa vào sự khác nhau về kích thước tế bào, hình dạng nhân và chức năng của tế bào bạch cầu để chia thành hai loại:

* Monocyte: Là loại bạch cầu có kích thước lớn nhất trong tất cả các loại bạch cầu, khoảng

15 – 25µm (có khi lên tới 35 µm) có một nhân lớn hình ngọn lửa hoặc hình hạt đậu, bắt màu tím đỏ; nguyên sinh chất bắt màu tro nhạt hoặc hồng nhạt

* Lymphocyte: Hình tròn, kích thước nhỏ tương đương hoặc lớn hơn hồng cầu 1 chút, khoảng 7 – 10µm Có 1 nhân tròn chiếm gần hết khối bào tương, bắt màu tím đỏ; bào tương là một viền mỏng bao quanh nhân, bắt màu tro nhạt hoặc xanh nhạt

+ Bạch cầu đa nhân:

Trong nhóm bạch cầu đa nhân, người ta chủ yếu dựa vào các hạt bắt màu trong bào tương của mỗi tế bào để chia thành ba loại:

* Neutrophyle (Bạch cầu trung tính): Kích thước trung bình, khoảng 12 – 15µm; nhân chia

1

23

nhiều múi, bắt màu tím đậm; bào tương chứa những hạt nhỏ bắt màu hồng nhạt.

* Esinophyle (Bạch cầu ưa acide): Kích thước trung bình, khoảng 12 – 15µm; nhân thường

có hình gọng kính, bắt màu tím đỏ; bào tương chứa những hạt lớn bắt màu đỏ

* Basophyle (Bạch cầu ưa kiềm): Là loại bạch cầu hiếm thấy nhất trong tất cả các loại bạch cầu, kích thước trung bình 12 – 15µm Hình thể tương đối tròn; nhân chia nhiều múi bắt màu tím đậm nhưng khó nhìn thấy vì bị che bởi các hạt lớn hình tròn hay hình vuông bắt màu tím đen ở trong bào tương

Hình 10 Tế bào máu người.

1.Hồng cầu; 2 Bạch cầu trung tính

Hình 11 Tế bào máu người.

1 Bạch cầu Mono; 2 Bạch cầu Lympho; 3 Tiểu cầu

Lấy 1 giọt máu gà, nhỏ lên 2/3 lame kính sạch và khô, dùng một lame khác kéo dàn máu như làm với tiêu bản máu người, để khô, cố định bằng cồn, để khô, nhuộm màu bằng giem sa.5.2 Quan sát

Quan sát ở vật kính 10x và 40x

Các tế bào hồng cầu gà có hình bầu dục, hình xoài; nhân hình xoài, bắt màu tím đậm chiếm gần hết khối bào tương; bào tương bắt màu hồng nhạt bao quanh nhân

Hình 12 Tế bào máu gà.

1 Nhân; 2 Bào tương

6 Tế bào niêm mạc miệng (hoặc niêm mạc âm đạo).

6.1 Cách làm tiêu bản

Hình 13 Tế bào niêm mạc miệng.

1 Nhân; 2 Bào tương

Các tế bào lớp lót của các cơ quan dạng ống, dạng hốc thường bị bong ra và dễ bị thay thế bằng những tế bào lớp dưới

Sau khi súc sạch miệng, dùng que nạo đã sát trùng kỹ, nạo mặt trong má, phết mỏng và đều chất nạo mặt trong má lên lam khô và sạch, để khô, cố định bằng dung dịch carnoy – ancol – ether, để khô, nhuộm màu bằng Hematoxiline – arris – eosine

12

1

2

Hình 14 Tế bào niêm mạc âm đạo.

1.Bào tương; 2 nhân

7 Tế bào có nhân không điển hình ở tảo rung.

tế bào, các chất trong bào tương phân tán xung quanh tế bào nhiều, màu xanh sẩm, giữa tế bào

có một vùng sáng đó là vùng nhân chưa điển hình

Tảo rung trong điều kiện đang hoạt động có cử động uốn lượn hình sin

Hình 15 Tế bào có nhân không điển hình ở tảo rung.

8 Tế bào gan chuột.

8.1 Cách làm tiêu bản

1

2

Làm tiêu bản tế bào gan chuột rất phức tạp, qua nhiều bước, có thể tóm tắt như sau Mổ lấy gan chuột cống trắng, cắt thành từng miếng nhỏ, rửa kỹ bằng nước sinh lý cho hết máu rồi cố định bằng formol, carnoy trong nhiều bước, cuối cùng cắt thành từng lát mỏng bằng máy cắt; nhuộm màu bằng Hematoxyline Fe và gắn lamen bằng nhựa bome canada.

8.2 Quan sát

Quan sát ở vật kính 100x

Hình 16 Tế bào gan chuột Các tế bào gan chuột cống trắng có hình đa giác, ở giữa có 1 hoặc 2 nhân bắt màu tím đỏ; bào tương có nhiều ty thể hình que hay hình cầu bắt màu hồng đậm của Hematoxylin – Fe

9 Tinh trùng người.

9.1 Cách làm tiêu bản

Lấy 1 giọt tinh dịch người bình thường dàn đều lên lame, để khô, cố định bằng ancol 960,

để khô, nhuộm màu bằng phương pháp Papanicolaou

9.2 Quan sát

Quan sát ở vật kính 40x và 100x

Tinh trùng người có cấu tạo điển hình gồm 3 phần: Đầu, cổ và đuôi Vùng đầu dẹt và hình bầu dục, nó chứa nhân và đội một cái mũ chứa đầy enzym, gọi là thể đỉnh, giúp cho nhân tinh trùng có thể đi vào trứng trong quá trình thụ tinh Đoạn giữa của tinh trùng có liên quan đến

sự sản sinh ra năng lượng thể hiện bằng sự có mặt của nhiều ti thể Sự sắp xếp các ống siêu vi

ở vùng đuôi rất giống với sự sắp xếp ở lông rung và lông roi Chuyển động quất mạnh của đuôi giúp cho tinh trùng tiến về phía trước với tốc độ 4mm/giây Đầu tiên, tinh trùng sản sinh

ra chưa hoạt động, chúng được đưa tới mào tinh hoàn một cách thụ động nhờ áp lực gây ra bởi sự sản sinh liên tục các tế bào mới, nhờ tinh dịch trong các ống sinh tinh và nhờ sự chuyển động nhu động của cơ trơn thành ống Tinh trùng được dự trữ trong mào tinh hoàn và

ở đó sẽ thành thục hoàn toàn Sự phát triển của tinh trùng kể từ lần phân chia đầu tiên cho đến khi xuất tinh khoảng 72 ngày, ở đàn ông, sự sinh tinh diễn ra liên tục nhưng ở một số loài động vật có vú khác, nó chỉ hạn chế trong những giai đoạn sinh sản nhất định

11 Tinh trùng ếch.

11.1 Cách làm tiêu bản

Chọn ếch đực, hàm dưới có 2 túi âm thanh (màu xanh hay màu đen)

Mổ lấy tinh hoàn, nghiền trong 2ml dung dịch nước muối sinh lý 90/00. Vứt bỏ màng tinh hoàn và các mảnh to, định hình trong formol 10%, dàn đều lên phiến kính, để khô, nhuộm màu bằng Hematocyline – Eosine

12 Tinh trùng giun đũa lợn.

Hình 20 Tinh trùng giun đũa lợn.

12.1 Cách làm tiêu bản

Chọn giun đũa lợn đực (thường là con nhỏ thon, đuôi cong), mổ lấy ống dẫn tinh; dùng kim phẩu tích nghiền ống dẫn tinh trong 1ml nước muối sinh lý, gạt bỏ màng ống dẫn tinh, cố

định trong dung dịch formol 10%, dàn đều lên phiến kính, nhuộm màu bằng Hematocyline – Eosine.

1

Hình 22 Trứng gà.

1 Đĩa phôi (cực sinh vật); 2 Lòng đỏ (noãn hoàng); 3 Albumin;

4 Dây treo; 5 Vỏ; 6 Buồng khí

V CÂU HỎI ĐỂ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ.

1 Quan sát, vẽ hình và chú thích đối với các loại tiêu bản đã học

2 Đặc điểm của tế bào Prokaryota và tế bào Eukaryota

3 Phân biệt vùng chất trắng và vùng chất xám ở tế bào thần kinh tủy sống

4 Phân biệt hồng cầu chim với hồng cầu người

5 Dựa vào đặc điểm nào để phân loại bạch cầu

6 Dựa vào đặc điểm nào để phân loại bạch cầu đa nhân

7 Tập làm tiêu bản tế bào niêm mạc miệng, tế bào tảo rung

8 Chỉ trên kính hiển vi:

- Phần bào tương tế bào sợi, nhân tế bào sợi

1

2

263

45

- Vùng chất trắng, vùng chất xám, mảnh thân tế bào thần kinh, nhân tế bào thần kinh.

- Hồng cầu người, tiểu cầu, các loại bạch cầu Monocyte, Lymphocyte, Neutrophyle, Esinophyle, Bazophyle

- Bào tương, nhân tế bào biểu bì hành

- Bào tương, nhân tế bào hồng cầu chim

- Bào tương, nhân tế bào niêm mạc miệng

- Vùng nhân của tế bào tảo rung

- Bào tương, nhân tế bào gan chuột

9 Quan sát và nhận diện cấu trúc của các tế bào sinh dục đực và tế bào sinh dục cái

Bài 3: SỰ VẬN ĐỘNG CỦA TẾ BÀO.

- Amibe, Trùng lông, Trùng roi được bảo quản ở 37oC

III TÓM TẮT NỘI DUNG.

Tế bào sinh vật dù ở dạng đơn bào tự do, ở trong cơ thể sinh vật đa bào hay những tế bào nuôi cấy, đều có đặc tính là sự vận động nội tại, tức là có sự vận động liên tục của bào tương Các thành phần của tế bào có thể di chuyển lôi cuốn bởi bào tương, hoặc đôi khi có sự vận động riêng như nhân và lục lạp Trong cơ thể người có những tế bào sống tự do, chúng có khả năng di chuyển trong môi trường để tìm kiếm thức ăn hay di động bởi sự tác động của các yếu

tố vật lý, hoá học (ánh sáng, nhiệt độ, các chất hoá học v.v…) Tế bào có thể vận động bằng roi, lông, chân giả

1 Sự vận động của bào tương.

Khi nghiên cứu sự vận động bào tương của Amibe, tế bào sợi nuôi cấy, một số tế bào các loại tảo Người ta nhận thấy:

- Bào tương có sự tuần hoàn liên tục gọi là dòng nội chất, dòng nội chất chuyển động sát lớp ngoại sinh chất

- Dòng nội chất chuyển động thường là theo một hướng nhất định Dòng có tốc độ lớn nhất khi có hiện tượng thẩm thấu qua màng Các hạt thể vùi và các bào quan cũng chuyển động hoặc do sự tác động của dòng nội chất hoặc vận động theo khả năng chuyển động riêng của mình

- Ti thể có thể chuyển động theo kiểu lượn sóng trong bào tương

- Lục lạp vừa chịu tác động của dòng nội chất vừa có sự vận động riêng Ánh sáng ảnh hưởng tới sự vận động của lục lạp Vị trí của lục lạp trong tế bào cũng ảnh hưởng tới sự vận động của nó

2 Sự vận động của nhân tế bào.

Bình thường, nhân ít bị ảnh hưởng bởi dòng nội chất Trong từng thời kỳ ngắn hay liên tục, nhân có thể tự xoay quanh mình làm cho bề mặt của nhân có thể tiếp xúc với các phần khác nhau của bào tương Thời gian nhân quay quanh mình một vòng mất khoảng 75 giây cho đến

5 phút Ở một số loài nấm nhân có thể di động trong bào tương với tốc độ khoảng 1mm/giờ

(Ví dụ: Nấm Coprinus Lagopus) Sự di động của nhân trong bào tương đôi khi ngược lại với

chiều của dòng nội chất Nếu đặt nhân đã phân lập riêng vào một môi trường điện trường thì nhân sẽ di chuyển về cực dương

Hạch nhân có thể vận động đi ra khỏi nhân Khi hạch nhân tiến tới màng nhân và đính vào mặt trong của màng nhân thì dồng thời các ti thể tiến tới sát màng ngoài của màng nhân và đón hạch nhân Sự liên hệ này có chu kỳ và khi liên hệ chắc có sự trao đổi vật chất (Theo Frederic và Sevemon)

3 Sự vận động của tế bào.

3.1 Sự vận động của vi khuẩn

Vi khuẩn vận động dược nhờ lông hoặc roi của tế bào Vi khuẩn vận động có hướng rõ rệt, chúng vận động về nơi có nồng độ cao của các chất mà chúng cần như Oxy, các axit amin … Roi vi khuẩn gồm có 3 phần: Mũi tận cùng, thân roi và gốc roi gắn liền với màng tế bào vi khuẩn Theo Lowy và Spencer, roi đập theo kiểu “roi” đúng như tên gọi của nó, bằng một chiều chuyển động xung quanh Khởi đầu bằng lực vận động khu trú ở phần gốc roi, ATP được chuyển dọc theo thân roi để tạo nên một lực vận động bên trong thân roi Một chuyển

động xoáy hay dao động sóng của vùng gốc có thể lan truyền đi suốt dọc thân roi nhờ sự biến đổi sắp xếp của các khối cầu trên vỏ của roi.

3.2 Sự vận động của các tế bào Eukaryota

3.2.1 Vận động kiểu Amibe

Đại đa số các động vật đơn bào không có màng cứng bên ngoài (Amibe, bạch cầu, nấm nhầy …) đềi có kiểu vận động Amibe Kiểu vận động Amibe là vận đồng bằng chân giả Phần trước chân giả hình thành do màng sinh chất rất mỏng, tiếp đến là phần ngoại sinh chất tương đối đặc, tiếp đến là phần nội sinh chất lỏng hơn, chảy về phía chân giả lôi cuốn các bào quan

và các vật thể trong nguyên sinh chất Sự vận động kiểu Amibe chủ yếu liên quan đến sự chuyển hoá Sol – Gel của bào tương Khi bào tương lôi chân giả về một hướng nào đó, nếu chạm phải một vật rắn thì dạng Sol (lỏng) sẽ chuyển thành dạng Gel (đặc hơn) và làm điểm tựa cho toàn bộ tế bào rút về vị trí mới này, sau đó dạng Gel lại chuyển thành dạng Sol

Hiện tượng thực bào, hiện tượng xuyên mạch cũng là một sự vận động kiểu Amibe Các bạch cầu có thể đi ra ngoài các mao mạch và các mạch bạch huyết Sự tác động kích thích của

vi khuẩn, các độc tố làm cho bạch cầu phát sinh chân giả, lách giữa hai tế bào của thành mạch

để chui ra ngoài

3.2.2 Sự vận động của các tế bào nuôi cấy của động vật có vú

Ambercrombie, Ambrose và Easty quan sát bằng kỹ thuật quay phim hiển vi chậm các tế bào sợi nuôi cấy đã nhận thấy các tế bào hình thành các nếp nhăn tạm thời tạo thành một làn sóng nhô lên từ phía trước rồi dần dần lan ra phía sau tạo thành sự di động trên mặt kính trong môi trường nuôi cấy Sự di động này có thể là kiểu di động trung gian giữa kiểu vận động Amibe và sự vận động của các tế bào Eukaryota có lông, roi

3.2.3 Sự vận động của các tế bào Eukaryota có lông, roi

Các cơ thể đơn bào trưởng thành, các động bào tử, các tinh trùng đều có bộ phận vận động

là lông hoặc roi, lông dài từ 5 – 10µm Roi dài khoảng 150µm, đường kính của lông và roi ít chênh lệch và khoảng 0,2µm

Lông và roi của tế bào đều là phần kéo dài ra của bào tương và có cấu trúc tương tự nhau

Ở thực vật, tinh trùng của thực vật bậc thấp như tản thực vật, rêu, quyết và một số hạt trần, các động bào tử của tảo, nấm đều có roi

Ở động vật, một số đơn bào có lông, một số đơn bào có roi Nhiều tế bào biểu mô của động vật đa bào có lông như các tế bào trong ống tiêu hoá của nhuyễn thể, tế bào trong ống thực quản của động vật có vú

Lông, roi hay đuôi tinh trùng đều có cấu trúc tương tự (ngoại trừ một số có cấu trúc khác hơn)

Lông, roi vận động theo kiểu đập hình sin (theo Brockshaw Sleigh) Một số lông, roi và đuôi tinh trùng hoạt động đập theo kiểu vận động xoáy dọc thân Ngoài ra chúng cũng có thể vận động theo kiểu xoắn vặn các thành phần cấu trúc trên thân Sleigh cho rằng sự chuyển động sóng dọc theo lông roi có quá trình xuôi ngược theo nguyên lý sợi trượt lên nhau của các

sợ cạnh nhau như sự co của cơ vân

Trùng roi có sự vận động liên hợp nhịp nhàng của bề mặt tế bào làm cho hệ thống lông chuyển động nhấp nhô như làn sóng

Lực vận động của lông, roi, đuôi cũng nằm ở vùng gốc của chúng, ATP có thể khuyếch tán

từ bên trong bào tương ra và đi suốt dọc thân lông, roi, đuôi đủ nhanh để cung cấp năng lượng cho vận động của lông, roi, đuôi, trong chu kỳ vận động của chúng

3.3 Các kiểu vận động khác của tế bào

Một số vi khuẩn có thể vận động được sau khi đã bị lấy mất roi, đó là sự vận động nhờ một

chuyển động sóng của toàn bộ tế bào Ở tảo rung (Oscillatoria), một loại tảo lam đa bào hình

sợi có sự rung động làm sợi tảo có hình lượn sóng Kiểu vận động này tương tự như kiểu vận động của tế bào sợi nuôi cấy, chỉ khác là vách tế bào ở đây cứng hơn và làn sóng liên hoàn chung cho cả sợi tảo

IV NỘI DUNG.

1 Quan sát hoạt động của Amibe.

1.1 Cách làm tiêu bản

- Thu nhận mẫu vật là Amibe trần (Amoeba proteus) ở mặt đáy các thuỷ vực bằng cách

khuấy nhẹ tầng đáy để Amibe nổi lên rồi vớt Và có thể nuôi trong lọ thuỷ tinh rộng miệng với nước và rơm rạ khi đã rửa sạch ở nhiệt độ 25 - 300C Sau 4 – 5 ngày Amibe xuất hiện Hút giọt nước cạnh lớp váng trên mặt nước cho lên lame kính, đậy lamel và quan sát ở vật kính 10x và vật kính 40x

- Thu nhận mẫu vật là Amibe gây bệnh ở người (Etamoeba histolytica) ở những chỗ phân

có nhầy mũi, dàn đều trong dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9% Đậy lamel và quan sát ở vật kính 10x và vật kính 40x

Muốn quan sát rõ hoạt động của Amibe ta có thể làm tiêu bản bằng dung dịch Xanh Methylene 1%

- Dạng Amibe nhỏ hoạt động được coi như là một thể bào nang, kích thước từ 15 – 25µm, hoạt động yếu hơn dạng Amibe trên Nội sinh chất và ngoại sinh chất không phân biệt được rõ ràng Không bào không chứa hồng cầu nhưng có thể có vi khuẩn

Trong chu kỳ không gây bệnh, Amibe từ dạng bào nang chuyển sang dạng Amibe nhỏ hoạt động rồi sinh sôi phát triển hay ngược lại Chu kỳ này có thể tiếp tục mãi mãi ở những người mang Amibe nhưng hoàn toàn không phát bệnh hoặc chỉ xảy ra sau đợt cấp tính

Khi gặp những điều kiện đặc biệt, Amibe hoạt động dạng nhỏ ăn hồng cầu, trở thành Amibe dạng lớn hoạt động và gây bệnh, chu kỳ trở thành chu kỳ gây bệnh Khi điều kiện thay đổi, Amibe dạng lớn hoạt động thôi ăn hồng cầu và chuyển thành Amibe nhỏ hoạt động, đó là thể bào nang

Thể bào nang xuất hiện trong phân thất thường đo đó cần xét nghiệm đi xét nghiệm lại nhiều lần Tỷ lệ < 5%

Hình 23 Amibe trần (Amoeba proteus) Hình 24 Etamoeba histolytica

2 Quan sát hoạt động của trùng roi.

2.1 Trùng roi xanh (Euglena viridis).

- Cách làm tiêu bản: Thu nhận trùng roi và làm tiêu bản như đối với Amibe nhưng khi quan sát muốn thấy rõ roi thì cần nhỏ vào tiêu bản một giọt dung dịch Iode loãng, roi sẽ phồng to

và dễ quan sát

- Quan sát: Cơ thể trùng roi xanh có dạng hình thoi, phần đầu có roi và thuôn hơn phần đuôi (dài khoảng 50 – 6µm) chiều rộng khoảng 15 – 18µm Hình dạng luôn luôn co giãn theo tất cả các hướng

Hình 25 Trùng roi xanh (Euglena viridis).

Hình 26 Trùng roi xanh (Euglena viridis).

1 Roi; 2 Điểm mắt; 3 Hạt diệp lục;

4 Màng phim; 5 Nhân; 6 Hạt á tinh bột

2.2 Quan sát hoạt động của một số trùng roi gây bệnh ở người

2.2.1 Một số trùng roi gây bệnh đường ruột

- Cách làm tiêu bản: Chọn phân chỗ có nhầy mũi hoặc chỗ phân bất thường, dàn đều lên giọt nước muối sinh lý (NaCl 0,9%), đậy lamel và quan sát ở vật kính 10x và vật kính 40x

- Trichomonas intertinalis: Dài 10 – 15µm, rộng 7 – 10µm, có 3 – 5 roi trong đó có một roi

đi về phía sau tạo thành màng vây rõ, ít khi ở thể bào nang, không gây bệnh nhưng có thể gây viêm niêm mạc ruột, ỉa chảy

123456

Hình 27 Trichomonas intertinalis.

- Giarda Intertinalis (lambia): dài 10 –20µm, rộng 1 – 10µm Hình thể đối xứng có hai nhân như hai con mắt kính Tám roi đi về phía sau, kí sinh ở tá tràng và một phần ít ở manh tràng, đôi khi xâm nhập vào túi mật Thể bào nang là thể truyền nhiễm của roi trùng Phân của bệnh nhân mỗi ngày có thể chứa chín triệu bào nang

Hình 28.Giarda Intertinalis

- Chilomastix meslini: Dài 6 – 24µm Rộng 3 – 10µm Hình thể không đối xứng, phía đầu mập và tròn, phía sau quắt và nhọn Có ba roi đi ra phía ngoài cơ thể và một roi đi quay trở lại miệng tạo thành một màng vây thô sơ, kí sinh ở ruột già Thể bào nang hình quả lê hơi tròn

Kí sinh trùng có thể gây viêm ruột mãn tính dai dẳng

Hình 29. Chilomastix meslini.

2.2.2 Một số trùng roi gây bệnh đường sinh dục.

- Trichomonastix vaginalis: Ký sinh trùng gây bệnh đường âm đạo, gây viêm âm đạo, có

thể xâm nhập qua đường tiểu

Cách làm tiêu bản: Lấy dịch âm đạo dàn mỏng và đều trong giọt nước muối sinh lý (NaCl 0,9%), đậy lamel, quan sát ở vật kính 10x, vật kính 40x

Hình 30 Trichomonastix vaginalis.

3 Quan sát hoạt động của trùng lông

3.1 Trùng đế giày (Trùng cỏ - Paramoecium caudatum).

- Cách làm tiêu bản: Thu nhận trùng cỏ và làm tiêu bản như đối với trùng roi xanh, muốn hạn chế hoạt động của trùng cỏ thì trên tiêu bản nên bỏ thêm một vài sợi bông trước khi đậy lamel

- Quan sát: Trùng cỏ có kích thước 100 – 300µm, có thể nhìn thấy bằng mắt thường, hình

đế giày thuôn nhỏ Cơ thể được bao bọc bởi một màng phim có cấu tạo đặc biệt vừa chắc chắn vừa đàn hồi Bên ngoài cơ thể có các tiêm mao là cơ quan vận động của tế bào được phủ kín toàn tế bào, vận động theo kiểu làn sóng, giúp cho tế bào vừa tiến lên phía trước vừa xoạy quanh trục cơ thể

Hình 31 Trùng đế giày (Trùng cỏ - Paramoecium caudatum).

1 Tiêm mao; 2 Không bào tiêu hoá

12

3.2 Trùng lông gây bệnh ở người (Balautidium coli).

Trùng lông là những nguyên sinh động vật cử động bằng lông chuyển mọc xung quanh cơ thể Trong các loại trùng lông chỉ có một loại kí sinh ở người là Balantidium coli dài 20 –

300µm, rộng 20 – 70µm trong có một nhân lớn lép như hình hạt đậu và bên cạnh có một nhân nhỏ Trong cơ thể chứa nhiều thức ăn, đôi khi có cả huyết cầu, kí sinh ở phần cuối ruột non và

ruột già Balautidium coli xâm nhập vào các tuyến của niêm mạc gây kích thích và gây loét,

tạo nên một hội chứng lị rất dai dẳng, có thể gây nên những biến chứng nguy hiểm như viêm

cơ tim cấp tính Trong phân chúng thường tồn tại ở thể bào nang

Hình 32 Thể hoạt động của Balautidium coli

V CÂU HỎI ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ.

1 Tế bào có những dạng vận động nào?

2 Đặc điểm của dạng vận động bằng roi là gì?

Đặc điểm của dạng vận động bằng lông là gì?

Đặc điểm của dạng vận động bằng chân giả là gì?

Đặc điểm của dạng vận động bào tương là gì?

3 Tự làm tiêu bản để quan sát vận động của tế bào

4 Vẽ hình - mô tả, giải thích các loại vận động của tế bào trong bài thực hành tại lớp

Bài 4: NHIỄM SẮC THỂ NGƯỜI VÀ MỘT SỐ ĐỘNG VẬT

- Biết cách xếp bộ nhiễm sắc thể người bình thường

- Xếp bộ nhiễm sắc thể người bệnh lý có rối loạn về số lượng nhiễm sắc thể và kết luận

- Quan sát được nhiễm sắc thể khổng lồ và các chất nhiễm sắc giới tính X, Y và vật thể dùi trống

- Nắm được cơ bản về cách làm tiêu bản nhiễm sắc thể khổng lồ và chất nhiễm sắc giới tính

- Nắm được những trường hợp chỉ định làm xét nghiệm chất nhiễm sắc giới tính

- Thực hành làm tiêu bản đơn giản

II DỤNG CỤ, HÓA CHẤT, MẪU VẬT.

- Các kiểu bộ nhiễm sắc thể người bình thường và có rối loạn số lượng đã in sẵn

- Kéo nhỏ, kim phẩu tích, chuột nhắt trắng

- Hồ dán

- Ống nghiệm 10ml đã tiệt trùng

- Chai tam giác 250ml đã tiệt trùng và xử lý trung tính có nút bông không thấm nước đã tiệt trùng

- Kim trích máu vô trùng, syrin, dây garo

- Cồn tuyệt đối, cồn 960, bông vô trùng, iode, contergute, bàn sấy

- Lam kính, lamen, acide acetic, metanol, dung dịch carnoy, thuốc nhuộm giem sa, thuốc nhuộm formatain, bome canada, thuốc nhuộm xanh toludin, orcein hemsatoxyline

- Dầu soi kính hiển vi

Trong tế bào của người bình thường nam, nữ mỗi tế bào lưỡng bội 2n (diploid) đều chứa

46 nhiễm sắc thể chia thành 23 cặp, trong đó có 22 cặp NST thường (autosome) và một cặp NST giới tính (sex chromosome) Trong đời sống của tế bào, nhiễm sắc thể có hình dạng, kích thước và số lượng đặc trưng nhất ở kỳ giữa (metaphase) Trong gian kỳ, nhiễm sắc thể vẫn tồn tại, nhưng duỗi dài ra tạo thành những sợi rất mảnh không nhìn thấy ở kính hiển vi quang học, chỉ những chỗ nhiễm sắc thể còn xoắn vặn tạo nên chất nhiễm sắc (chromatine) hoặc các trung tâm nhiễm sắc (chromocenter) mới có thể nhìn thấy ở kính hiển vi quang học

Nói chung, tất cả các tế bào đang phân chia đều có thể dùng làm tiêu bản nhiễm sắc thể

Có hai loại phương pháp: Trực tiếp và gián tiếp

- Phương pháp trực tiếp: Dùng các mô bao gồm các tế bào đang phân chia như tủy xương, các mô bào thai, mô tinh hoàn, các khối u ác tính

- Phương pháp gián tiếp: Các tế bào phải qua một quá trình nuôi cấy, để tế bào phân chia nhiều lần rồi mới làm tiêu bản nhiễm sắc thể Loại tế bào hay được dùng nhất trong phương pháp gián tiếp là các lympho bào ở máu ngoại vi vì mẫu vật dễ lấy và dễ bảo đảm điều kiện

vô trùng Ngoài ra, có thể lấy để nuôi cấy các tế bào phôi thai, tế bào cân mạc, tế bào tủy, tế bào trong nước ối thu được qua chọc dò nước ối vào tuần lễ thứ 13-14 của thai kỳ

Các tế bào của lớp nhung mao màng đệm (chorionic villi) lấy từ vách nhau vào tuần lễ thứ 7-8 của thai kỳ, các nguyên bào sợi thu được từ sinh thiết da

Việc lựa chọn tế bào nuôi cấy để làm tiêu bản nhiễm săc thể và lập Karyotype tuỳ thuộc vào yêu cầu chẩn đoán

Cả hai phương pháp đều bao gồm những bước cơ bản sau:

- Những mô để nghiên cứu nhiễm sắc thể phải bao gồm các tế bào đang phân chia, đối với những mô gồm các tế bào ít phân chia hoặc không phân chia đều phải nuôi cấy trong môi trường thích hợp và kích thích cho chúng phân chia

- Làm cho tế bào phân chia dừng lại kỳ giữa, vì nhiễm sắc thể ở kỳ này có hình dạng điển hình nhất Hóa chất tác động lên quá trình này là colchicin, một hoạt chất của cây thủy tiên (Colchicum autumnale) hoặc colcemid, một hóa chất tổng hợp có tác dụng như colchicin

- Dùng sốc nhược trương để làm trương tế bào, phá vỡ màng tế bào, tạo điều kiện cho các nhiễm sắc thể phân tán, không xếp chồng lên nhau, nhờ đó có thể quan sát rõ ràng từng chiếc Dung dịch nhược trương thường dùng là KCl 0,075M, citrat natri 1% …

- Định hình nhiễm sắc thể bằng dung dịch carnoy (3 phần metanol + 1 phần acide acetic)

- Nhuộm nhiễm sắc thể bằng các loại phẩm nhuộm nhân Giêm sa, orcein, carmin

- Quan sát và đánh giá nhiễm sắc thể ở vật kính 100x về hình thái, số lượng và cấu trúc

- Chụp ảnh hiển vi nhiễm sắc thể

- Xếp bộ nhiễm sắc thể, đánh giá trên bộ nhiễm sắc thể

- Kết luận

2 Nhiễm sắc thể ruồi giấm.

Nhiễm sắc thể của ruồi giấm (Drosophila) chỉ có 8 cái, 4 cặp và khác nhau ở cặp thứ 4 ở

con đực và con cái Triển lãm tiêu bản bộ nhiễm sắc thể ruồi giấm

3 Nhiễm sắc thể chuột nhắt trắng.

Triển lãm bộ nhiễm sắc thể chuột nhắt trắng gồm 40 chiếc xếp thành 20 cặp

4 Nhiễm sắc thể khổng lồ ở tế bào tuyến nước bọt của ấu trùng ruồi giấm (Chironomus sp).

Thông thường, kích thước của nhiễm sắc thể ở kỳ giữa là lớn nhất nhưng chỉ quan sát được

rõ ở vật kính 100x và chỉ thấy được các băng sáng, băng tối khi nhuộm band

Ở ấu trùng ruồi giấm (Chironomus sp) có bốn nhiễm sắc thể ở tế bào tuyến nước bọt, có

kích thước lớn, có thể quan sát rõ ở vật kính 10x, 40x và có thể thấy rõ ở các vật kính này những băng sáng, băng tối trên nhiễm sắc thể khi nhuộm formatain

5 Chất nhiễm sắc giới tính.

Chất nhiễm sắc giới tính là những vật thể đặc biệt nằm trong nhân tế bào lúc gian kỳ, bắt màu những phẩm nhuộm đặc hiệu, chúng có liên quan đến các nhiễm sắc thể giới tính Vật thể Barr (1951) còn gọi là vật thể X, vật thể Yvà vật thể dùi trống

IV NỘI DUNG

1 Nhiễm sắc thể người.

1.2 Cách làm tiêu bản

Bình thường bạch cầu lympho ở máu ngoại vi không phân chia Lấy 2cc-5cc máu vào syrin

vô trùng đã có tráng heparin để chống đông, để lắng, hút lấy bạch cầu Lympho (lớp phân cách giữa huyết cầu và huyết tương), đem nuôi cấy trong điều kiện vô trùng; có môi trường, độ pH, nhiệt độ thích hợp, có chất kích thích phân bào phytohemaglutinin (PHA) thì bạch cầu lympho ở máu ngoại vi sẽ non hóa và phân chia trở lại Giờ thứ 70 của quá trình nuôi cấy, cho colchicin vào môi trường với nồng độ thích hợp, làm cho các tế bào đang phân chia dừng lại ở

kỳ giữa Thu hoạch vào giờ thứ 72 Dùng sốc nhược trương bằng KCl 0,075M để phá vỡ màng tế bào và phân tán các nhiễm sắc thể Định hình nhiễm sắc thể bằng dung dịch carnoy

và nhuộm màu bằng giemsa hoặc nhuộm band

1.2 Quan sát và đánh giá

Tìm và chọn cụm nhiễm sắc thể ở vật kính 10x Chọn các cụm nhiễm sắc thể bung đều, tách rời từng chiếc một, co ngắn vừa phải để quan sát và đánh giá trên vật kính 100x.

Hình 33 Một cụm 46 nhiễm sắc thể của người ở kỳ giữa.

1.2.1 Quan sát và đánh giá những rối loạn về số lượng

- Đa bội: Đa bội hiếm gặp ở người Là những trường hợp bất thường toàn bộ số lượng của các nhiễm sắc thể Số lượng NST trong bộ NST đa bội là một bội số của n và lớn hơn 2n

- Lệch bội: Những bất thường về số lượng của một hoặc một số NST

+ Trên lưỡng bội: > 46 VD: 47XXY

+ Dưới lưỡng bội: < 46 VD: 45XO

- Tỷ lệ lưỡng bội / rối loạn số lượng NST

1.2.2 Quan sát và đánh giá những rối loạn về hình thái

Quan sát đánh giá tỷ lệ các dạng thay đổi về hình thái của NST đang khảo sát so với NST của người bình thường

Tỷ lệ: NST teo, NST nhòe, NST bắt màu không đều, NST lìa tâm sớm, NST băng giả, hợp đoàn

1.2.3 Quan sát đánh giá những rối loạn về cấu trúc

Mất đoạn (deletion): Mất đoạn là hiện tượng NST bị đứt rời ra một hoặc nhiều đoạn, đoạn

bị đứt rời không có tâm sẽ tiêu biến đi hoặc gắn sang NST khác Phần còn lại mang tâm sẽ ngắn hơn bình thường

+ NST có thể bị đứt một chỗ của một nhánh gọi là mất đoạn cuối đơn

+ NST có thể bị đứt ở cả hai nhánh gọi là mất đoạn cuối kép Các đoạn đứt không có tâm

bị tiêu biến đi, đoạn đứt có tâm sẽ uốn cong lại nối hai đầu đứt với nhau tạo thành NST hình vòng (ring Chromosome)

+ NST có thể bị đứt hai chỗ trên cùng một nhánh, gọi là mất đoạn giữa Đoạn nằm giữa hai chỗ đứt bị rời ra và tiêu tan, hai phần còn lại của NST nối với nhau tại chỗ đứt

Các NST bị mất đoạn ngắn hơn lúc bình thường, các gen ở đoạn đứt bị mất đi, do đó các alen đơn độc ở đoạn tương ứng trên NST tương đồng nguyên vẹn dù ở trạng thái lặn cũng biểu hiện được tính chất của mình

- Chuyển đoạn (Translocation): Chuyển đoạn là sự biến đổi cấu trúc của NST, trong đó có

sự thay đổi vị trí của một đoạn NST từ nơi này sang nơi khác trên cùng một NST hoặc chuyển sang một NST khác Có nhiều kiểu chuyển đoạn khác nhau:

+ Chuyển đoạn trong là sự thay đổi vị trí của một đoạn từ nơi này sang nơi khác trên

cùng một NST.

+ Chuyển đoạn ngoài (chuyển đoạn không tương hỗ hay chuyển đoạn một bên): Hai NST bị đứt, chỉ có một đoạn đứt của NST này chuyển sang nối với NST kia, không có sự trao đổi ngược lại

+ Chuyển đoạn lẫn nhau (chuyển đoạn tương hỗ): là hiện tượng trao đổi các đoạn giữa hai NST Hai NST bị đứt, trao đổi đoạn đứt cho nhau và hình thành hai NST cấu trúc lại Cả hai NST có thể thay đổi hình thái nếu đoạn trao đổi khác nhau về kích thước

Người mang NST chuyển đoạn có thể bình thường, nhưng con cái của họ có thể bình thường mang NST chuyển đoạn giống bố mẹ nhưng cũng có thể bị bệnh vì trong bộ NST có hai NST cấu trúc lại

+ Chuyển đoạn hoà nhập tâm: Chuyển đoạn hoà nhập tâm chỉ xảy ra đối với các NST tâm đầu và cũng là một kiểu chuyển đoạn lẫn nhau Trong kiểu chuyển đoạn này hai NST bị đứt ngang qua miền gần tâm, các đoạn đứt chuyển cho nhau, kết quả tạo ra một NST bất thường khá lớn do sự kết nối của hai nhánh dài và một NST rất nhỏ do sự kết nối của hai nhành ngắn, NST này bị tiêu tan, như vậy chất liệu di truyền của tế bào bị mất đi một ít

- Nhân đoạn (duplication): Nhân đoạn là hiện tượng một đoạn nào đó của NST được nhân đôi lên Nhân đôi đoạn xảy ra khi hai NST tương đồng ghép đôi với nhau ở kỳ đầu 1 của giảm phân Các locut gen xếp không tương ứng với nhau và tại một điểm bắt chéo bị đứt ra rồi nối lại nhầm từ bên nọ sang bên kia, do đó xảy ra sự chuyển một đoạn từ NST này sang NST kia, kết quả là có hai NST thay đổi cấu trúc, một NST dài bất thường do tăng thêm một đoạn và lặp lại một số gen, một NST kia ngắn hơn bình thường vì đã mất đi một đoạn cho chiếc tương đồng kia và thiếu đi một số gen

- Đảo đoạn (invension): Đảo đoạn là hiện tượng do NST bị đứt hai chỗ, đoạn giữa hai chỗ đứt quay 1800 rồi nối lại ngược với vị trí cũ

+ Đảo đoạn ngoài tâm: Hai chỗ đứt cùng trên một nhánh NST và đoạn đảo không chứa phần tâm NST này cấu trúc lại, không thay đổi hình thái nhưng đảo ngược vị trí một số gen.+ Đảo đoạn quanh tâm đối xứng: Hai chỗ đứt ở hai nhánh, khoảng cách từ hai chỗ dứt của hai nhánh đến phần tâm dài bằng nhau NST cấu trúc lại không thay đổi về hình thái nhưng một số gen bị đảo ngược vị trí

+ Đảo đoạn quanh tâm không đối xứng: Hai chỗ đứt ở hai nhánh, khoảng cách từ hai chỗ đứt đến tâm không bằng nhau NST cấu trúc lại không thay đổi về hình thái nhưng một số gen bị đảo ngược vị trí

- NST đều - đẳng NST (Iso chromosome): Là một kiểu NST cấu trúc lại có hai nhánh hoàn toàn giống nhau về kích thước và về các locut gen Nó hình thành do chỗ đứt ngang qua phần tâm của NST Sau khi bị đứt thành hai NST chúng duỗi ra và nhân đôi Kết quả hình thành hai NST tâm giữa Đây là trường hợp nhân đôi một nhánh đồng thời mất nhánh kia Có thể bình thường hai nhiễm sắc tử tách nốt phần tâm để tạo thành hai NST nhưng có khi phần tâm lại tách theo chiều thẳng góc với chiều dọc của nhiễm sắc tử Tạo thành hai NST bất thường, mỗi NST có hai nhánh đối xứng nhau hoàn toàn

- NST hai tâm (Dicentrie): Hai NST bị đứt hai phần có tâm nối lại với nhau tạo nên NST hai tâm Các đoạn không tâm sẽ bị tiêu biến đi Bản chất của hiện tượng này cũng là chuyển đoạn lẫn nhau

- Chèn đoạn (insertion): Một đoạn NST được chuyển từ NST này đến chèn vào NST khác1.3 Danh pháp

Các danh pháp được sử dụng phổ biến khi mô tả NST trong Karyotype:

- Dấu (+), dấu (-): Đặt trực tiếp sau số kí hiệu NST hoặc ký hiệu của nhóm, biểu thị rằng NST đã cho thừa hoặc thiếu Trực tiếp sau kí hiệu nhánh biểu thị rằng nhánh đã cho lớn hoặc

ace: Không tâm (acentric) Ví dụ: 46,XY,18q-,ace+

- Cen: Phần tâm (centromera)

- Dic: Hai tâm (dicentric)

- End: Nội nhân đôi

- i: Đẳng NST (NST đều – isochromosome)

- inv: Đảo đoạn (inversion)

- ins: Chèn đoạn (Insertion)

- Dup: Nhân đoạn (Duplication)

- Del: Mất đoạn (Deletion)

- t: Chuyển đoạn (translocation)

- Ter: Đầu tận cùng (Có thể được viết pter để mô tả đầu tận cùng nhánh ngắn, qter để mô

Để mô tả một Karyotype người ta thường tuân theo thứ tự sau:

- Số lượng NST trong một tế bào, tiếp đến là dấu phẩy

- NST giới tính

- Các NST thừa hoặc thiếu và dấu (+) hoặc dấu (-) sau NST đó để minh họa thừa hoặc thiếu NST đó

Nếu cần mô tả chi tiết các rối loạn về cấu trúc NST thì thứ tự được ghi như sau:

- Phần mô tả số lượng NST được ghi trước, tiếp theo là dấu phẩy

- Số của NST

- Tên nhánh dài (q) hoặc nhánh ngắn (p)

Các chữ số Ả rập mô tả vùng xảy ra các rối loạn trên NST Các rối loạn này được ghi theo hướng từ tâm động ra hai đầu

* Một số ví dụ minh hoạ:

- 47,XX,21+: Người nữ thừa một NST 21 Hội chứng Down

- 47,XY,21+/46XY: Người nam dạng khảm với một dòng tế bào thừa một NST 21 và một dòng tế bào bình thường

- 46,XY,del(5)p(15): Người nam mất đoạn nhánh ngắn NST số 5, vùng band 15 (band 5 của vùng 1)

- 46,XX,dup(8p): Người nữ bị nhân đoạn nhánh ngắn của NST số 8

- 45,XY,14-,15-,t(14q,15q): Người nam bị chuyển đoạn hòa nhập tâm Robertson của NST

14 và NST 15 Karyotype thiếu hai NST 14 và NST 16

1.4 Phân loại NST.

Xác định và phân loại từng NST được thực hiện dựa vào các đặc điểm sau đây của mỗi NST:

- Chiều dài: So sánh chiều dài tương đối của các NST với nhau

- Vị trí của tâm động (Centromere): Tâm động chia NST thành hai nhánh gồm: Nhánh ngắn p (petite) và nhánh dài q Tuỳ theo vị trí của tâm động trên NST mà người ta chia thành

- Sự phân bố của các band sáng tối (trong kỹ thuật nhuộm band)

- Sự bắt màu của huỳnh quang trên NST (trong kỹ thuật nhuộm màu huỳnh quang)

1.5 Xếp bộ nhiễm sắc thể người (Lập Karyotype người)

1.5.1 Nguyên tắc

- Dựa vào chiều dài tương đối của nhiễm sắc thể

- Dựa vào vị trí phần tâm của nhiễm sắc thể

22 cặp NST thường được xếp thành 7 nhóm Các NST thường trong mỗi nhóm có kích thước gần giống nhau nên dễ nhầm lẫn Các NST được sắp xếp từ lớn đến nhỏ dần

- Nhóm I (nhóm A); gồm các cặp nhiễm sắc thể 1, 2, 3, là các cặp nhiễm sắc thể lớn nhất Cặp nhiễm sắc thể số 1 và 3 tâm giữa, cặp số 2 tâm gần giữa

- Nhóm II (nhóm B): gồm các cặp nhiễm sắc thể số 4, 5 là các cặp nhiễm sắc thể lớn, tâm gần đầu

- Nhóm III (Nhóm C): gồm các cặp nhiễm sắc thể từ số 6 đến số 12 và nhiễm sắc thể giới tính X Có kích thước trung bình, phần tâm gần giữa; trong đó các cặp nhiễm sắc thể số 6, 7, 8,

11 và nhiễm sắc thể X có tâm gần giữa hơn các cặp nhiễm sắc thể số 9, 10 và 12

- Nhóm IV (nhóm D): gồm các cặp nhiễm sắc thể số 13, 14, 15 kích thước dưới trung bình, tâm đầu

- Nhóm V (nhóm E): gồm các cặp nhiễm sắc thể số 16, 17, 18, kích thước hơi nhỏ Trong

đó, cặp nhiễm sắc thể số 16 tâm giữa, 17 tâm gần giữa và 18 tâm gần đầu

- Nhóm VI (nhóm F) gồm các cặp nhiễm sắc thể 19, 20, kích thước nhỏ, tâm giữa

- Nhóm VII (nhóm G): gồm các cặp nhiễm sắc thể số 21, 22 và nhiễm sắc thể giới tính Y, kích thước nhỏ nhất, tâm đầu Trong đó, nhiễm sắc thể giới tính Y có 2 nhánh dài gần nhau hơn so với các cặp nhiễm sắc thể 21 và 22

1.5.2 Tiến hành xếp bộ nhiễm sắc thể người bình thường

- Bước 1: Đếm số lượng nhiễm sắc thể trên bộ đã in

- Bước 2: Cắt rời từng chiếc nhiễm sắc thể trong bộ nhiễm sắc thể theo hình chữ nhật theo khuôn của nó

- Bước 3: Kẻ 4 dòng và xếp bộ nhiễm sắc thể theo trình tự

+ Dòng 1: xếp nhóm I bên trái, xếp nhóm II bên phải

+ Dòng 4: xếp nhóm VII bên phải, xếp nhóm VI bên trái

+ Dòng 3: xếp nhóm V bên phải, xếp nhóm IV bên trái

+ Dòng 2: xếp nhóm III

Cặp nhiễm sắc thể giới tính xếp dưới nhóm VII, hoặc NST X được xếp với nhóm III (nhóm C) NST Y được xếp với nhóm VII (nhóm G)

Chú ý: Xếp nhánh ngắn lên trên, nhánh dài xuống dưới

Tâm nhiễm sắc thể trùng với đường kẻ

Cắt NST đúng như hướng dẫn

Hình 34 Bộ nhiễm sắc thể người nam bình thường.

Hình 35 Bộ nhiễm sắc thể người nữ bình thường

1.6 Xếp bộ nhiễm sắc thể người bệnh có rối loạn về số lượng nhiễm sắc thể

Dựa vào tiêu chuẩn xếp bộ nhiễm sắc thể và cách xếp bộ nhiễm sắc thể người bình thường

để xếp bộ nhiễm sắc thể bệnh lý có rối loạn số lượng nhiễm sắc thể

Hình 36 Bộ nhiễm sắc thể người nam Clinefelter.

Hình 37 Bộ nhiễm sắc thể người nam Clinefelter.

Hình 38 Bộ NST người nam mắc bệnh Down.