Nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng gây độc tế bào một số dẫn chất mới lai hóa khung benzimidazol và 1,3,4oxadiazol

Trải qua thời gian dài làm việc tại phòng nghiên cứu Tổng hợp Hóa Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội, với sự giúp đỡ tận tình của các thầy giáo và bạn bè, tôi đã hoàn thành khóa luận tốt n

CHẤT MỚI LAI HÓA KHUNG BENZIMIDAZOL VÀ

1,3,4-OXADIAZOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016

CHẤT MỚI LAI HÓA KHUNG BENZIMIDAZOL

VÀ 1,3,4-OXADIAZOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 PGS TS Nguyễn Đình Luyện

2 Ds Nguyễn Xuân Sang

Nơi thực hiện:

Bộ môn Công nghiệp Dược

Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2016

Trải qua thời gian dài làm việc tại phòng nghiên cứu Tổng hợp Hóa Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội, với sự giúp đỡ tận tình của các thầy giáo và bạn bè, tôi đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp “NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT LAI HÓA CỦA BENZIMIDAZOL VÀ OXADIAZOL”

Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Nguyễn Đình Luyện và

DS Nguyễn Xuân Sang đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều

kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu tại bộ môn Công Nghiệp Dược

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Văn Hải và Ths

Nguyễn Văn Giang, hai thầy cũng đã luôn quan tâm sát sao và có những hướng

dẫn quan trọng trong suốt quá trình làm nghiên cứu tại bộ môn

Tôi xin chân thành cảm ơn Ths Phạm Thị Hiền, ThS Ngô Quang Trung vì

đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Trong quá trình thực hiện khóa luận tôi cũng đã nhận được nhiều sự giúp đỡ

từ các anh chị bên Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc Gia, Khoa Hóa học - Trường Đại học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội và Phòng Công Nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cùng toàn thể các thầy giáo cô giáo đã dạy dỗ tôi trong suốt 5 năm học vừa qua

Lời cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và đặc biệt là các bạn cùng nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa Dược – Bộ Môn Công Nghiệp Dược đã gắn bó, động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu này

Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Hồ Ngọc Phú

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Khái quát về benzimidazol 2

1.2 Tổng quan về tác dụng sinh học của các dẫn chất lai hóa Benzimidazol và Oxadiazol 4

1.2.1 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 4

1.2.2 Tác dụng kháng ung thư: 7

1.2.3 Tác dụng chống viêm: 10

1.2.4 Tác dụng chống oxi hóa 12

1.3 Các phản ứng tổng hợp nhân 1H-benzo[d]imidazol và 1,3,4-oxadiazol 14

1.3.1 Đóng vòng tạo nhân 1H-benzimidazol và các dẫn chất 14

1.3.1.1 Đi từ o-phenyldiamin 15

1.3.1.2 Đi từ o-aminoazo 16

1.3.1.3 Các tác nhân khác 16

1.3.2 Đóng vòng tạo dẫn chất 1,3,4-oxadiazol 16

1.3.2.1 Phản ứng loại H2O của diacyhydrazin 16

1.3.2.2 Phản ứng oxy hóa đóng vòng từ N-acylhydrazon 16

1.3.2.3 Đóng vòng oxadiazol bằng phản ứng giữa acylhydrazid và carbon disulfid 17

1.3.2.4 Các phương pháp tổng hợp khác 17

1.3.3 Phản ứng alkyl hóa 17

1.4 Lựa chọn hướng tổng hợp và thử tác dụng sinh học cho đề tài 17

2.1 Nguyên liệu và thiết bị 18

2.2 Nội dung nghiên cứu 20

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết 21

2.3.2 Xác định cấu trúc 22

2.3.3 Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư 22

2.3.3.1 Mẫu nghiên cứu 22

2.3.3.2 Hóa chất 22

2.3.3.3 Các dòng tế bào ung thư 23

2.3.3.4 Phương pháp tiến hành Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay) 23

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Tổng hợp hóa học 25

3.1.1 Tổng hợp 2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol (1) 26

3.1.2 Tổng hợp Ethyl 2-(2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetat (2) 27

3.1.3 Tổng hợp 2-(2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetohydrazid (3) 28

3.1.4 Tổng hợp 1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)methyl]-2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol (4) 29

3.1.5 Tổng hợp Ethyl-2-([5-{(2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl}-1,3,4-oxadiazol-2-yl]thio)acetat (4a) 30

3.1.6 Tổng hợp 2-([5-{(2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl}-1,3,4-oxadiazol-2-yl]thio)acetamid (4b) 31

3.2 Kiểm tra độ tinh khiết 32

3.3 Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được 33

3.3.1 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR) 33

3.3.2 Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS) 34

3.4 Thử tác dụng sinh học 38

3.5 Bàn luận 38

3.5.1 Về tổng hợp hóa học 38

3.5.2 Về cấu trúc phân tử 41

3.5.3 Về thử hoạt tính sinh học 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton nuclear magnetic

resonance)

concentration)

T Nhiệt độ nóng chảy

Bảng 2.3 Công thức các chất dự kiến tổng hợp được 20

Bảng 3.1 Kết quả tổng hợp hóa học 32

Bảng 3.2 Giá trị R f và nhiệt độ nóng chảy (t° nc ) của 6 chất trong nghiên cứu 32

Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của 4, 4b, 4c 33

Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ khối lượng của 4a, 4b, 4c 34

Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR) của 3 chất 4, 4a, 4b 35

Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C của 4,4a, 4b 36

Bảng 3.7 Thử tác dụng sinh học 38

Bảng 3.8 So sánh độ chuyển dịch δ giữa các Hydro ở 2 chất 4 và 4a 42

Hình 1.2 Một số thuốc đã được tổng hợp là dẫn chất của benzimidazol 3

Hình 1.3 Cấu trúc vòng oxadiazol 3

Hình 1.4 Các thuốc là dẫn chất của oxadiazol 4

Hình 1.5 Các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol được tổng hợp bởi Ansari 4

Hình 1.6 Các dẫn chất trong nghiên cứu của R V Patel 5

Hình 1.7 Các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol trong nghiên cứu của Salahuddin 6

Hình 1.8 Công thức cấu tạo các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol mang khung oxadiazol trong nghiên cứu của N.C Desai 7

Hình 1.9 Công thức cấu tạo của các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol mang khung oxadiazol trong nghiên cứu của Salahuddin 8

Hình 1.10 Các dẫn chất benzimidazol lai hóa oxadiazol được tổng hợp trong nghiên cứu của Asif Husain 9

Hình 1.11 Các dẫn chất được tổng hợp trong nghiên cứu của Rajasekaran 10

Hình 1.12 Các dẫn chất benzimidazol lai hóa oxadiazol trong nghiên cứu của 11

Hình 1.13 Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất Benzimidazol trong nghiên cứu của Ayhan-Kılcıgil 13

Hình 1.14 Các dẫn chất được tổng hợp trong nghiên cứu của Ayhan-Kılcıgil 14

Hình 3.1 Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất lai hóa giữa 1H-benzo[d]imidazol và 1,3,4-oxadiazol 25

Hình 3.2 Sơ đồ tổng hợp 2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol (1) 26

Hình 3.3 Sơ đồtổng hợp ethyl 2-(2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetat (2) 27

Hình 3.4 Sơ đồ tổng hợp 2-(2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetohydrazid (3) 28 Hình 3.5 Sơ đồ tổng hợp 1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)methyl]-2-ethyl (4) 29

Hình 3.6 Sơ đồ tổng hợp Ethyl-2-([5-{(2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl}-1,3,4-oxadiazol-2-yl]thio)acetat (4a) 30

Hình 3.7 Sơ đồ tổng hợp 2-([5-{(2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl}-1,3,4-oxadiazol-2-yl]thio)acetamid (4b) 31

Hình 3.8 Cơ chế phản ứng ngưng tụ giữa o-phenyldiamin với acid propionic 39

Hình 3.12 Cơ chế phản ứng tổng hợp chất 4b 41

ĐẶT VẤN ĐỀ

Xã hội phát triển, con người ngày càng quan tâm đến vấn đề chăm sóc sức khỏe thì vai trò của ngành y dược ngày càng trở nên quan trọng trong đời sống, nhu cầu sử dụng thuốc trong phòng ngừa và chữa trị ngày càng lớn Là một nước đang phát triển, Việt Nam tuy đã đạt được nhiều thành tựu tích cực trong cải thiện việc khám chữa bệnh cho người dân, nhưng vẫn còn gặp phải nhiều khó khăn, mức sống bình quân thấp, khả năng chi trả cho y tế còn hạn chế, trong khi giá thuốc nhập khẩu lại cao gấp hàng chục lần so với mặt bằng chung ở trong nước Tất cả những điều này đòi hỏi ngành Dược trong nước phải tự mình sản xuất và cung ứng các loại thuốc mới để hạ giá thành sản phẩm, nâng cao chất lượng chữa bệnh cho người dân

Vì vậy, việc tìm kiếm thuốc mới là rất cần thiết Hướng nghiên cứu và phát triển thuốc mới dựa vào thuốc sẵn có hoặc các chất có tác dụng sinh học đang chiếm một

tỉ lệ chủ yếu trong ngành tổng hợp hóa dược

Benzimidazol và oxadiazol là hai dị vòng đã và đang thu hút nhiều nhà khoa học trên khắp thế giới tiến hành nghiên cứu Từ hai dị vòng này, rất nhiều các dẫn chất đã được tổng hợp và cho thấy các tác dụng sinh học đa dạng như: kháng khuẩn,

Với những triển vọng khả quan đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu

tổng hợp và thử tác dụng gây độc tế bào một số dẫn chất mới lai hóa khung benzimidazol và 1,3,4-oxadiazol” với các mục tiêu sau:

1 Tổng hợp một số dẫn chất lai hóa của 1H-benzo[d]imidazol và

1,3,4-oxadiazol

2 Thử tác dụng gây độc tế bào của các chất tổng hợp được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Khái quát về benzimidazol

Benzimidazol là một hợp chất hữu cơ thơm dị vòng Nó là một mang dược tính quan trọng và là một cấu trúc đặc biệt trong hóa dược Hợp chất này làbicyclic trong tự nhiên trong đó bao gồm sự hợp nhất của nhân benzen và nhân imidazol

Hình 1.1 Cấu trúc vòng 1H-benzo[d]imidazol

Hợp chất benzimidazol nổi bật nhất trong tự nhiên là N-ribosyl dimethylbenzimidazol, mà được dùng như một phối tử cho coban Vitamin B12 Benzimidazol đã thu hút sự nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thể giới để đánh giá tiềm năng trị bệnh của nó Vì vậy benzimidazol là hạt nhân có vai trò quan

Năm 1990, nhiều dẫn chất của benzimidazol đã được tổng hợp với sự thay thế của flo, propylen, tetrahydroquinolin với kết quả là những hợp chất tăng sự ổn định, tác dụng sinh học Nó cũng cho thấy rằng sự thay thế trên pyridin bởi nhóm cho điện tử làm tăng tác dụng sinh học Năm 1991, dẫn chất benzimidazol được tổng hợp ở vị trí N-H của benzimidazol bởi nhóm cho điện tử bằng sự thế propyl, acetamid, thio , thiazol-amino, tetramethyl piperidin trên pyridin với kết quả cho tác dụng chống loét tốt

Do sự tương đồng với cấu trúc của purin, khả năng kháng khuẩn của benzimidazol được giải thích bởi sự cạnh tranh với purin, kết quả là ức chế sự tổng hợp acid nucleic và protein của vi khuẩn

Một số oxadiazol-1H-benzo[d]imidazol khác cũng được nghiên cứu có hoạt

Hình 1.2 Một số thuốc đã được tổng hợp là dẫn chất của benzimidazol

Oxadiazol là một dị vòng thu hút được sự chú ý rộng rãi của các nhà hóa dược để phát triển các loại thuốc mới Oxadiazol có nguồn gốc từ furan bằng sự

thay thế của hai nhóm =CH- bằng hai nguyên tử N (Hình 1.3)

Hình 1.3 Cấu trúc vòng oxadiazol

Có bốn đồng phân của oxadiazol: 1,2,4-oxadiazol, 1,3,4-oxadiazol, oxadiazol, 1,2,3-oxadiazol được biết đến Trong số chúng, các dẫn chất của 1,3,4-oxadiazol đã được biết đến với một loạt các đặc tính sinh học như: chống viêm, chống virus, chống nấm, chống ung thư, chống kí sinh trùng, chống co giật và tác dụng đường huyết Những tiềm năng sinh học rất lớn của dị vòng 1,3,4-oxadiazol là

1,2,5-do khả năng phản ứng đa dạng và cấu trúc đặc biệt của nó đem lại [9, 11, 16, 22]

Các dẫn xuất của oxadiazol được sử dụng trong các thị trường như

Raltegravir, Nosapidil, Furamizol,… (Xem hình 1.4).

BENZIMIDAZOL

Thuốc kháng

Histamin

Thuốc ức chế bơm Proton

Thuốc trợ tim

Thuốc trị giun sán

Thuốc kháng virus

Oxibendazol Oxfendazol

Hình 1.4 Các thuốc là dẫn chất của oxadiazol

Nhìn vào tầm quan trọng của 2 cấu trúc benzimidazol và oxadiazol, người ta nghĩ rằng sẽ có giá trị để thiết kế và tổng hợp một số dẫn xuất benzimidazol mới mang oxadiazol và tìm ra những tác dụng sinh học tiềm năng của chúng

1.2 Tổng quan về tác dụng sinh học của các dẫn chất lai hóa Benzimidazol và Oxadiazol

1.2.1 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

Năm 2009, K.F Ansari cùng cộng sự đã tổng hợp được một số dẫn chất

1H-benzo[d]imidazol mang khung oxadiazol (1a÷1l) (xem hình 1.5), sau đó thử tác

dụng ức chế in vitro vi sinh vật theo phương pháp pha loãng liên tiếp Tác dụng kháng khuẩn được thử với 3 dòng Gram(+): Staphylococcus aureus ATCC 29213, Bacillus subtilis MTCC 121, Streptococcus mutans MTCC 890 và 3 dòng vi khuẩn Gram(-) là: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa MTCC 741, Salmonella typhi MTCC733 Ciprofloxacin và ampicillin được sử dụng làm thuốc đối chiếu Trong khi đó tác dụng chống nấm được thử với nấm: Candida albicans MTCC 1637, Aspergillus niger, Aspergillus flavus với thuốc đối chiếu là

amphotericin B [7]

Hình 1.5 Các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol được tổng hợp bởi Ansari

Kết quả cho thấy các chất tổng hợp được đều có tác dụng kháng khuẩn tốt với nồng độ ức chế tối thiểu MIC<64 𝜇g/ml, trong đó có hai chất 1-{[5-(4-

clorophenyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-2-methyl}-1H-benzo[d]midazol (1g) và chất {[5-(4-methoxyphenyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-2-methyl}-1H-benzo[d]imidazol (1k)

1-có nồng độ ức chế tối thiểu đối với S.aureus rất thấp (MIC=2 𝜇g/ml) Hầu hết các

chất đều cho tác dụng tốt với vi khuẩn Gram(+), tuy nhiên không có chất nào có tác

dụng với E coli cũng như P aeruginosa và S typhii Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các dẫn chất có chứa nhóm thế ở vị trí para trên vòng benzen có tác dụng tốt hơn so

với các chất còn lại

Đối với tác dụng kháng nấm, các chất 1a, 1g, 1l, 1k cho tác dụng tốt hơn với

nấm C albicans Bên cạnh đó, các chất còn lại ít có tác dụng đối với A niger và A flavus

Năm 2012, Rahul V Patel và cộng sự tiến hành tổng hợp và thử tác dụng

sinh học một số dẫn chất (benzimidazolyl-1,3,4-oxadiazol-2yl)thio-N-phenyl (benzothiazolyl)acetamid (xem hình 1.6) Sử dụng phương pháp khuếch tán trên

thạch với 8 chủng vi khuẩn và 4 chủng nấm với các thuốc đối chiếu là ciprofloxacin với các chủng vi khuẩn và ketoconazol với các chủng nấm, kết quả cho thấy nhiều hợp chất có khả năng kháng khuẩn và chống nấm tốt Kết quả cho thấy các dẫn chất

N-benzothiazolylacetamid có tác dụng tốt hơn các dẫn chất N-phenylacetamid [18]

Hình 1.6 Các dẫn chất trong nghiên cứu của R V Patel

Hai hợp chất 2c (nhóm thế là –Cl), 2d (nhóm thế là –F) có tác dụng ức chế

tốt với S aureus (MIC=3,12 µg/ml), S.typhi (MIC=25µg/ml), B.cereus (2c

MIC=25µg/ml, 2d MIC=6,25µg/ml) Các chất 2b, 2c, 2d với nhóm thế halogen

cũng có tác dụng mạnh với vi khuẩn P Aeruginosa với giá trị MIC=12,5µg/ml Với

tác dụng kháng nấm 3f, 3k cho thấy tác dụng tốt chống lại A.niger (MIC=12,5µg/ml), 3f cũng có hiệu quả chống lại A clavatus tiềm năng (MIC=25µg/ml) Đối với C albican, các hợp chất 3i, 3j và2i với nhóm thế alkoxy

thể hiện tác dụng mạnh nhất với MIC=25µg/ml

Cũng trong năm 2012, nghiên cứu của Salahuddin cùng cộng sự trong việc tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học các dẫn chất 1,3,4-oxadiazol mang khung

1H-benzo[d]imidazol trên các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Escherichia coli, và nấm men Candida albicans, Aspergillus flavus, thực hiện theo phương pháp

khuếch tán trên thạch (ofloxacin và ketoconazol được dùng làm thuốc đối chiếu)

[24](Hình 1.7)

Hình 1.7 Các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol trong nghiên cứu của Salahuddin

Kết quả thu được cho thấy hầu hết các hợp chất đều có tác dụng kháng

khuẩn, trong đó các chất 4d, 4f, 4h có tác dụng mạnh nhất chống lại vi khuẩn E coli ở nồng độ 100 μg/ml, các hợp chất 4d, 4f, 4l hoạt động tốt chống lại S aureus

cũng ở nồng độ này

Về khả năng chống nấm, các chất tổng hợp 4d, 4f, 4l có hoạt tính mạnh nhất

chống lại nấm A flavus và C albicans ở nồng độ 100 μg/ml Thử nghiệm cho thấy

dụng mạnh nhất Thêm vào đó nghiên cứu cũng chỉ ra rằng dẫn chất có chứa nhóm

nấm A flavus và C albicans

Gần đây nhất, năm 2014, N C.Desai cùng G M.Kotadiya đã tổng hợp được

một số dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol mang khung 1,3,4-oxadiazol, đồng thời thử

tác dụng ức chế sinh vật in vitro theo phương pháp pha loãng (xem hình 1.8) Tác dụng kháng khuẩn được thử với 2 dòng vi khuẩn Gram(+): Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes, 3 dòng vi khuẩn Gram(-): Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa Tác dụng kháng nấm được thử với 3 dòng: Candida albicans, Aspergillus niger, Aspergillus clavatus Chất đối chiếu được dùng

làcloramphenicol và griseofulvin [10]

Đánh giá các dẫn chất tổng hợp cho kết quả khả quan Đặc biệt với vi khuẩn

E coli và nấm A clavatus, dẫn chất 5h cho MIC rất thấp, lần lượt là 6,25 μg/ml và

12,5 μg/ml, thấp hơn chất đối chiếu rất nhiều lần (với cloramphenicol có MIC=50

μg/ml, griseofulvin có MIC=100μg/ml) Các hợp chất 5b, 5c, 5d, 5g, 5h với nhóm

thế hút điện tử (nitro, fluoro) cho thấy hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm mạnh,

trong đó tác dụng sinh học mạnh nhất khi các nhóm thế này ở vị trí para hoặc meta

5d, 5h

Hình 1.8 Công thức cấu tạo các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol mang khung

oxadiazol trong nghiên cứu của N.C Desai

Hình 1.9 Công thức cấu tạo của các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol mang khung

oxadiazol trong nghiên cứu của Salahuddin

Các hợp chất được thử nghiệm với 60 dòng tế bào ở một nồng độ duy nhất

dòng buồng trứng, thận, tuyến tiền liệt, và tế bào ung thư vú Các kết quả được báo cáo là giá trị trung bình phần trăm tăng trưởng (growth percent- GP) của các dòng tế bào được thử nghiệm và số liệu cho từng dòng được so sánh với cùng dòng đấy khi không dùng thuốc Bảy phép đo sẽ được thực hiện: thời điểm bắt đầu (Tz), sự tăng trưởng khi không dùng thuốc (C) và sự tăng trưởng khi có mặt của thuốc ở năm nồng độ khác nhau (Ti) Phần trăm tăng trưởng được tính toán cho mỗi nồng độ thuốc như sau:

[(Ti - Tz) / (C – Tz)] × 100 nếu Ti ≥ Tz [(Ti - Tz) / Tz] × 100 nếu Ti < Tz Thí nghiệm được đánh giá qua phần trăm tăng trưởng (growth percent- GP)

của tế bào ung thư Kết quả cho thấy hợp chất 1c cho kết quả hoạt động mạnh nhất

với 72,85 phần trăm tăng trưởng (GP) và tác dụng mạnh nhất trên dòng ung thư vú MDA-MB-468 và tế bào u sắc tố SK-MEL-28 (GP lần lượt là 36,23 và 47,56) Hợp

chất 1d cũng cho tác dụng cao với dòng ung thư phổi không tiểu bào NCI-H522

(GP = 32,73) và tế bào ung thư thận UO-31 (GP=40,53) Các hợp chất còn lại cho

Cũng trong năm 2012, một nghiên cứu khác được thực hiển bởi Asif Husain

và các cộng sự từ Ấn Độ và Hàn quốc nhằm nghiên cứu và tổng hợp các hợp chất benzimidazol lai hóa với oxadiazol và triazol-thiadiazol Các hợp chất tổng hợp sau

đó được đem thử hoạt tính chống ung thư tại Viện ung thư quốc gia Mỹ với nồng độ thử duy nhất là 10µM trên 60 dòng tế bào ung thư: bệnh bạch cầu, ung thư phổi, đại tràng, vú, buồng trứng, thận, tuyến tiền liệt [14]

Hình 1.10 Các dẫn chất benzimidazol lai hóa oxadiazol được tổng hợp trong

nghiên cứu của Asif Husain

Kết quả của nghiên cứu cho thấy các dẫn chất benzimidazol lai hóa oxadiazol cho tác dụng chống ung thư tốt hơn dẫn chất lai hóa triazol-thiadiazol Tác dụng chống ung thư được tăng lên bởi sự có mặt của các nhóm hút điện tử như

–Br ở các vị trí trên vòng thơm Hợp chất 3j có hai nhóm thế -Br ở vị trí ortho làm

tăng tính nhạy cảm trên tế bào (70,63%) Trong khi đó các nhóm đẩy điện tử như –

OH gắn vào vòng thơm lại làm giảm tác dụng Trong 14 hợp chất được đánh giá tác dụng chống ung thư in vitro, tất cả các hợp chất đều cho thấy hiệu quả chống ung

thư tốt và phổ tác dụng rộng Riêng 3j có tác dụng ức chế tế bào ung thư hiệu quả

NSLC HOP-92 (Non small lung cancer HOP-92) [14]

Như vậy, các dẫn chất dẫn chất benzimidazol lai hóa oxadiazol trong thí nghiệm của Salahuddin có tiềm năng trong hoạt động chống ung thư và sự thay đổi cấu trúc sẽ giúp tổng hợp nhiều dẫn chất có tác dụng chống ung thư

1.2.3 Tác dụng chống viêm

Năm 2012, Rajasekaran và cộng sự đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất

1H-benzo[d]imidazol mang khung oxadiazol (Hình 1.11), các dẫn chất được thử tác

dụng chống viêm trên chuột bằng phương pháp sử dụng mô hình giảm phù chân chuột Trong các dẫn chất được tổng hợp có 3 chất được mang đi thử tác dụng chống viêm và so sánh với thuốc đối chứng là indomethacin

Hình 1.11 Các dẫn chất được tổng hợp trong nghiên cứu của Rajasekaran

Kết quả là các chất mang đi thử đều có tác dụng chống viêm, các dẫn chất

được thế với nhóm chức Pyridin hoặc phenyl vào dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol

mang khung oxadiazol qua cầu nối thioacetamid cho tác dụng chống viêm tốt, còn

những hợp chất thế với phenyl vào dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol mang khung

oxadiazol qua cầu nối qua cầu nối acetamid cho hoạt tính kém hơn [19]

Năm 2014, Ankita Rathore cùng đồng sự tiến hành thiết kế và tổng hợp các

dẫn chất benzimidazol lai hóa oxadiazol có tác dụng ức chế COX-2 chọn lọc (xem hình 1.9) Các hợp chất tổng hợp được được thử tác dụng in vitro để xác định khả

năng ức chế COX-1 và COX-2 Những dẫn chất có tác dụng tốt nhất lại tiếp tục

được thử tác dụng chống viêm bằng phương pháp sử dụng mô hình giảm phù chân chuột [20]

Hình 1.12 Các dẫn chất benzimidazol lai hóa oxadiazol trong nghiên cứu của

AnkitaRathore

Hầu hết các chất có khả năng ức chế COX, và ức chế COX-2 chọn lọc hơn

COX-1 Trong các hợp chất tổng hợp được, 6l là chất có tác dụng ức chế COX-2

vào tính chất điện tử của các nhóm thế Các nhóm hút điện tử làm tăng khả năng ức

chế và chọn lọc COX-2 Các hợp chất 6m-r có các nhóm thế đẩy điện tử nên có

Trong 18 hợp chất tổng hợp, 6 chất được đem thử hoạt tính chống viêm, kết quả có 3 hợp chất cho thấy có tác dụng chống viêm hứa hẹn so với thuốc đối chứng

indomethacin Chất 6l thể hiện tác dụng chống viêm tốt nhất 68,4% Các chất 6b, 6j

cũng thể hiện khả năng chống viêm đáng chú ý (59,2% và 65,2%) so với indomethacin là 57,9% Từ kết quả thu được có thể kết luận rằng, các chất có khả

năng ức chế COX-2 tốt cũng cho hiệu quả chống viêm đầy hứa hẹn (Xem bảng 1.1)

Bảng 1.1 Tỉ lệ ức chế viêm của các chất trong nghiên cứu của Ankita Rathore

Năm 2007, Ayhan-Kılcıgil và các cộng sự đã thực hiện các thí nghiệm tổng

hợp một số dẫn chất benzimidazoltừ nhân

o-phenylendiamin/4,5-diclo-1,2-phenylendiamin

Hình 1.13 Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất Benzimidazol trong nghiên cứu của

Ayhan-Kılcıgil

Năm dẫn chất 16-20 và 23 sau đó được thử tác dụng chống oxi hóa trong

nghiên cứu in vitro bằng phương phápxác định microsom NADPH-phụ thuộc mức

độ ức chế peroxid hóa lipid (LP), các hoạt động của microsom ethoxyresorufin

O-deethylase (EROD) BTH là chất chống oxi hóa cổ điển được sử dụng là chất so sánh với các dẫn chất benzimidazol khi thí nghiệm trên mức độ ức chế peroxid hóa lipid (LP) ở gan chuột Cafein được so sánh với các dẫn chất ở tác dụng ức chế trên EROD

Hình 1.14 Các dẫn chất được tổng hợp trong nghiên cứu của Ayhan-Kılcıgil

nhẹ trên LP (28%) và bằng một nửa so với tác dụng ức chế của BHT (65%) Trên ethoxyresorufin O-deethylase (EROD), các hợp chất thể hiện mức độ ức chế khác

nhau và được sắp xếp theo thứ tự: 20 > 17 > 23 > 18 ≈ 19 > 16 Hợp chất 16 ức chế

trên EROD khi so sánh với hợp chất mang nhóm nhận điện tử [8]

1.3 Các phản ứng tổng hợp nhân 1H-benzo[d]imidazol và 1,3,4-oxadiazol

1.3.1 Đóng vòng tạo nhân 1H-benzo[d]imidazol và các dẫn chất

Nghiên cứu cho thấy hầu hết các phương pháp tổng hợp benzo[d]imidazol và dẫn chất đều đi từ benzen với các nhóm thế của N ở vị trí ortho

1H-với nhau

1.3.1.1 Đi từ o-phenylendiamin

Phản ứng với acid carboxylic và các dẫn xuất: tổng hợp benzimidazol và các

dẫn chất của nó thường đi từ nguyên liệu o-phenylendiamin Hầu hết các acid carboxylic đều phản ứng với o-phenylendiamin cho các dẫn chất 1H- benzo[d]imidazol tại vị trí C2 với hiệu suất rất tốt Hơn nữa, o-phenylendiamin

cũng phản ứng được với các dẫn xuất của acid carboxylic như các anhydrid, ester, amid… để tạo các hợp chất tương ứng [15]

Phản ứng với vòng lacton: Valerolacton được ngưng tụ với

o-phenylendiamin cho dẫn chất 1,2-(1-methyltrimethyl)benzimidazol với hiệu suất

Phản ứng với các nitril: Sử dụng phương pháp của Leonard cùng cộng sự để tạo ra dẫn chất 2-nitrobenzimidazol với hiệu suất cao Phản ứng được thực hiện bằng cách trộn một tỷ lệ thích hợp các chất phản ứng trong môi trường ethanol-

Phản ứng với các aldehyd: Phản ứng giữa o-phenylendiamin và các aldehyd

cần có chất oxy hóa làm xúc tác, các chất oxy hóa thường dùng như: nitrobenzen,

Ngoài những hợp chất đã nêu, o-phenylendiamin còn phản ứng với rất nhiều các tác nhân khác nhau để tạo dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol, có thể kể đến như:

ceton, imino-ether và imino-thioether, amid và guanid, ure, carbon disulfid, thiophosgen, 2-aminobenzimidazol…[23]

1.3.1.2 Đi từ o-aminoazo

Hợp chất o-aminoazo được ngưng tụ với aldehyd để tạo các base nitơ, sau đó

các base nitơ này được chuyển dạng đồng phân (bằng cách đun sôi với acid acetic)

1.3.2.1 Phản ứng loại H 2 O của diacylhydrazin

Một trong những phương pháp phổ biến nhất của phản ứng này là sử dụng tác nhân phosphoryl clorid (tuy nhiên đã dần được thay thế do là chất rất độc), ngoài ra các tác nhân khác cũng hay được sử dụng như: acid sulfuric, acid phosphoric, acid trifluoroacetic, phosphoryl pentaclorid, thionyl clorid phosphoryl pentoxid [9]…

1.3.2.2 Phản ứng oxy hóa đóng vòng từ N-acylhydrazon

Tác nhân được sử dụng nhiều là brom trong acid acetic Có thể thay thế tác nhân này bằng LiClO/MeCN [9]

1.3.2.3 Đóng vòng oxadiazol bằng phản ứng giữa acylhydrazid và carbon disulfid

Phản ứng xảy ra trong môi trường kiềm, dung môi phản ứng là EtOH [9]

1.3.2.4 Các phương pháp tổng hợp khác

Có thể kể đến một số phương pháp khác như tổng hợp một giai đoạn từ acid carboxylic và hydrazid sẵn có, phản ứng giữa hydrazid với orthoester hoặc đi từ tetrazol với dung dịch HCl [9]

vô cơ chứa oxy, ester của acid sulfonic, muối amoni bậc 4 [2, 5]

1.4 Lựa chọn hướng tổng hợp và thử tác dụng sinh học cho đề tài

Thông qua các tài liệu tham khảo được, chúng tôi nhận thấy rằng các dẫn

chất 1H-benzo[d]imidazol mang khung 1,3,4-oxadiazol có nhiều tác dụng sinh học

như kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm, chống ung thư, chống oxi hóa…Tiếp

nối các nghiên cứu đó, chúng tôi dự kiến tổng hợp một số dẫn chất lai hóa của benzo[d]imidazol và 1,3,4-oxadiazol, và thử tác dụng gây độc dòng tế bào ung thư

1H-của chúng

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và thiết bị

Khóa luận đã sử dụng một số hóa chất, dung môi và thiết bị của phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa Dược – Bộ môn Công Nghiệp Dược – Trường Đại học Dược

Hà Nội

Bảng 2.1 Danh mục các dung môi, hóa chất

STT Dung môi, hóa chất Nguồn gốc

19 Tủ sấy Memmert Đức

2.2 Nội dung nghiên cứu

Tổng hợp 2 dẫn chất của

1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)methyl]-2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol theo sơ đồ như sau:

Bảng 2.3 Công thức các chất dự kiến tổng hợp được

1

benzo[d]imidazol

2-ethyl-1H-2

2-(2-ethyl-1H-

benzo[d]imidazol-1-yl)acetat

3

benzo[d]imidazol-1-

2-(2-ethyl-1H-yl)acetohydrazid

4

oxadiazol-5-yl)methyl]-2-

1-[(2-mercapto-1,3,4- benzo[d]imidazol

ethyl-1H-4a

benzo[d]imidazol-1-

Ethyl-2-([5-{(2-ethyl-1H-oxadiazol-2-yl]thio)acetat

yl)methyl}-1,3,4-4b

benzo[d]imidazol-1-

2-([5-{(2-ethyl-1H-oxadiazol-2-yl]thio)acetamid

yl)methyl}-1,3,4 Kiểm tra độ tinh khiết các chất bằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy, xác định cấu trúc các chất tổng hợp được bằng phổ hồng ngoại IR, phổ khối lượng MS,

- Thử tác dụng chống ung thư các dẫn chất 4, 4a, 4b

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết

Sử dụng các phản ứng hóa học hữu cơ cơ bản để tổng hợp các chất trung gian và sản phẩm: phản ứng ngưng tụ đóng vòng, phản ứng S-alkyl hóa, N-alkyl hóa, phản ứng hydrazid hóa

Theo dõi tiến triển của phản ứng bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng

ngoại bước sóng 254nm

Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm được đánh giá sơ bộ qua SKLM dựa

vào sắc kí đồ và nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm qua khoảng nhiệt độ nóng chảy

đo bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt

2.3.2 Xác định cấu trúc

Cấu trúc của các chất tổng hợp được xác định dựa trên kết quả phân tích phổ

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR và 13 C-NMR)

Được ghi tại Phòng thí nghiệm Hóa dược, Khoa Hóa học, Đại học Khoa học

tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, trên máy Bruker 500 MHz Ascend, sử dụng

2.3.3 Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú (MCF7) và dòng tế bào ung thư phổi (LU-1) được tiến hành tại Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.3.3.1 Mẫu nghiên cứu

Các dẫn chất benzimidazol lai hóa oxadiazol được tổng hợp trong nghiên cứu

Các hóa chất thông thường khác

2.3.3.3 Các dòng tế bào ung thư

Do GS TS J M Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp

2.3.3.4 Phương pháp tiến hành

Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay)

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro (phương pháp SRB) được Viện Ung

thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát

phương pháp của Monks (1991) [17] Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng

tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

- Chất thử (10 l) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ nồng độ 100g/ml, 20 g/ml; 4 g/ml; 0.8 g/ml; 0.16

- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có TBUT (180l) sẽ được

sử dụng làm đối chứng ngày 0 Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng Trichloracetic acid – TCA

SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng

- Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút

và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

chế 50% sự phát triển của tế bào) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy

tính TableCurve

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Tổng hợp hóa học

Thông qua các tài liệu tham khảo và điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi đã

tiến hành tổng hợp một số dẫn chất lai hóa của 1H-benzo[d]imidazol và

1,3,4-oxadiazol theo sơ đồ sau:

Hình 3.1 Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất lai hóa giữa 1H-benzo[d]imidazolvà

1,3,4-oxadiazol

Điều kiện phản ứng: a) acid propionic, HCl đặc, 145°C, 2h; b) Ethylcloroacetat,

aceton khan, K 2 CO 3 , 70°c, 20h; c) Hydrazin hydrat, EtOH, 90 0 C, 4h; d) CS 2 , EtOH,

90 0 C, 7h; e) Ethylcloroacetat, DMF, Aceton, K 2 CO 3 , KI, 75 0 C, 2h; f) Iodoacetamid, DMF, Aceton, 75°C, 1h

3.1.1 Tổng hợp 2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol (1)

Sơ đồ phản ứng:

Hình 3.2 Sơ đồ tổng hợp 2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol (1)

Tiến hành:

Thêm 10,80g (0,10 mol) o-phenylendiamin, 17ml acid propionic (0,18

mol) và 17ml dung dịch HCl đặc vào bình cầu 250ml Lắp sinh hàn kết hợp khuấy từ, đun hồi lưu trong 2h

Theo dõi phản ứng bằng sắc kí lớp mỏng với pha động ethylacetat: hexan = 7:3, hiện màu bằng đèn tử ngoại bước sóng 254nm (cần loại muối bằng

Sau khi kết thúc phản ứng, hỗn hợp được đổ từ từ vào cốc có mỏ có chứa

tinh thể hình kim, rửa tinh thể 3 lần với 10ml nước, hút kiệt và sấy khô thu sản phẩm

Kết quả:

- Khối lượng: 8,86 g (Hiệu suất 82,03%)

- Cảm quan: tinh thể hình kim màu trắng

3.1.2 Tổng hợp ethyl 2-(2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetat (2)

Sơ đồ phản ứng

Hình 3.3 Sơ đồ tổng hợp ethyl 2-(2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetat(2) Tiến hành:

Hòa tan hỗn hợp gồm 4,40g (0,03mol) 2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol(1) và

thêm từ từ 3,2ml ethylcloroacetat (ECA) (0,03mol) (d=1,1450g/ml) vào hỗn hợp

khuấy ở nhiệt độ phòng trong 12h Sau đó, đun hồi lưu hỗn hợp trên ở nhiệt độ 70°C trong vòng 20h

Theo dõi tiến triển phản ứng bằng SKLM với pha động cloroform: methanol = 9:1, hiện màu bằng đèn tử ngoại bước sóng 254nm

Sau khi kết thúc phản ứng, hỗn hợp phản ứng được lọc loại bỏ muối vô cơ,

cất quay đến kiệt thì thu được dịch nhầy Rửa phần dịch nhầy bằng n-hexan để loại

tạp, thu được chất rắn màu trắng 2 Chất rắn 2 thu được hòa tan lại và kết tinh trong

cồn 20% Lọc tinh thể rồi rửa bằng nước lạnh 2 lần, mỗi lần 10ml, hút kiệt và sấy ở

Kết quả:

- Khối lượng: 2,96 g (Hiệu suất 42,52%)

- Cảm quan: tinh thể màu trắng

3.1.3 Tổng hợp 2-(2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetohydrazid (3)

Sơ đồ phản ứng

Hình 3.4 Sơ đồ tổng hợp 2-(2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetohydrazid (3) Tiến hành:

Hòa tan hỗn hợp gồm: 3,50g (0,015mol) ethyl

2-(2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol)acetat (2) vào 20ml EtOH tuyệt đối trong bình cầu 100ml Thêm

tiếp 12ml (0,20 mol) hydrazin monohydrat 80% Lắp sinh hàn, khuấy từ và đun hồi

lưu trong 4h

Theo dõi tiến triển phản ứng bằng SKLM với pha động n-BuOH: AcOH:

Sau khi kết thúc phản ứng, dung dịch phản ứng được cất bớt dung môi đến khi thu được dung dịch đục, hỗn hợp sau đó được làm lạnh trong vòng 30 phút, xuất

hiện sản phẩm tủa 3 màu trắng, lọc qua phễu Buchner và rửa tủa 2 lần với 10ml

3.1.4 Tổng hợp benzo[d]imidazol (4)

1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)methyl]-2-ethyl-1H-Sơ đồ phản ứng

Hình 3.5 Sơ đồ tổng hợp 1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)methyl]-2-ethyl

-1H-benzo[d]imdazol (4)

Tiến hành:

2-(2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetohydrazid(3), 10ml EtOH tuyệt đối và 1,09g (19,5mmol) KOH vào trong

vào hỗn hợp phản ứng Lắp sinh hàn, đun hồi lưu trong 7h

Theo dõi tiến triển phản ứng bằng SKLM với pha động n-butanol: methanol: nước = 10:1:3, hiện màu bằng đèn tử ngoại bước sóng 254nm

Sau khi phản ứng kết thúc, làm lạnh hỗn hợp và trung hòa về pH=5-6 bằng dung dịch acid hydrocloric 1M, tiếp tục khuấy trong 15 phút, xuất hiện tủa trắng Lọc thu tủa qua phễu Buchner và rửa lại bằng nước