Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số dẫn chất Nhydroxypropenamid mang khung 3spiro1,3dioxolan2oxoindolin hoặc 3spiro1,3ditholan2oxoindolin

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  PHẠM THỊ HẢO Mã sinh viên: 1101150 TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT NHYDROXYPROPENAMID MANG KHUNG 3-SPIRO[1,3]DIOXOLAN-2OXOINDOLIN HOẶC 3SPIRO[1,3]DITHIOLAN-2OXOINDOLIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  PHẠM THỊ HẢO Mã sinh viên: 1101150 TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT NHYDROXYPROPENAMID MANG KHUNG 3-SPIRO[1,3]DIOXOLAN-2OXOINDOLIN HOẶC 3SPIRO[1,3]DITHIOLAN-2OXOINDOLIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn DS Đỗ Thị Mai Dung Nơi thực Bộ môn Hóa Dược HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian nghiên cứu, tìm hiểu thực đề tài với rât nhiều cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận lúc xin phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành với người dạy dỗ, hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian qua Với lòng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới GS.TS Nguyễn Hải Nam DS Đỗ Thị Mai Dung - Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy trực tiếp hướng dẫn tận tình bảo thời gian thực khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo, cô giáo anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược - Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thực khóa luận tốt nghiệp Cuối xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình, anh chị, bạn em nhóm tổng hợp môn Hóa Dược động viên khích lệ giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 09 tháng 05 năm 2016 Người viết Phạm Thị Hảo MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH LỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 HISTON DEACETYLASE 1.1.1 Khái niệm histon deacetylase 1.1.2 Phân loại HDAC: 1.1.3 Cơ chế tác động HDAC đến ung thư 1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 1.2.1 Cơ chế tác dụng chất ức chế HDAC 1.2.2 Phân loại chất ức chế HDAC 1.2.3 Cấu trúc chất ức chế HDAC 1.3 MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI 1.3.1 Liên quan cấu trúc - tác dụng acid hydroxamic ức chế HDAC 1.3.2 Các hướng nghiên cứu dựa cấu trúc SAHA 1.3.2.1 Thay đổi nhóm khoá hoạt động 1.3.2.2 Thay đổi cầu nối 10 1.3.2.3 Thay đổi phần cầu nối nhóm khóa hoạt động 12 1.4 CÁC ACID HYDROXAMIC ĐƯỢC THIẾT KẾ TỔNG HỢP TRONG NƯỚC 13 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 15 2.1.1 Hóa chất 15 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 15 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 16 2.2.1 Tổng hợp hóa học 16 2.2.2 Đánh giá tác dụng sinh học chất tổng hợp 16 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.3.1 Tổng hợp hóa học 16 2.3.2 Thử tác dụng sinh học 17 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 HÓA HỌC 21 3.1.1 Tổng hợp hóa học 21 3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết 29 3.1.3 Xác định cấu trúc 30 3.2 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 35 3.2.1 Thử tác dụng ức chế HDAC 35 3.2.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro 36 3.3 BÀN LUẬN 37 3.3.1 Hóa học 37 3.3.1.1 Tổng hợp hóa học 37 3.3.2 Tác dụng sinh học 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 I KẾT LUẬN 44 1.1 Về tống hợp khẳng định cấu trúc 44 1.2 Về hoạt tính sinh học 44 II KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13 C-NMR : Cộng hưởng từ hạt nhân 13C (Carbon nuclear magnetic resonance) H-NMR : Cộng hưởng từ hạt nhân 1H (proton nuclear magnetic resonance) DCM : Dicloromethan DMF : Dimethyl formamid HDAC : Histon deacetylase IR : Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) MeOH : Methanol MS : Phổ khối lượng (Mass spectrometry) SAHA : Acid suberoylanilid hydroxamic HCG : Nhóm khóa hoạt động (Hydrohobic capping group) HYL- : Vùng cầu nối sơ nước (Hydrophobic linker) ZBG : Nhóm kết thúc gắn với kẽm (Zinc binding group) T°nc : Nhiệt độ nóng chảy TLC : Phương pháp sắc ký lớp mỏng TSA : Trichostatin A TsOH : Acid p-toluensulfonic IC50 : Nồng độ ức chế 50% phát triển tế bào DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại HDAC Bảng 1.2 Phân loại chất ức chế HDAC Bảng 1.3 Tác dụng sinh học số acid hydroxamic thiết kế, tổng hợp nước 14 Bảng 2.1 Pha mẫu thí nghiệm định lượng HDAC2 Error! Bookmark not defined Bảng 3.1 Chỉ số lý hóa hiệu suất tổng hợp acid hydroxamic từ ester 29 Bảng 3.2: Giá trị Rf nhiệt độ nóng chảy (tonc) dẫn chất 30 Bảng 3.3: Kết phân tích phổ IR chất IVa-d 31 Bảng 3.4: Kết phân tích phổ MS dẫn chất IVa-d 32 Bảng 3.5: Kết phân tích phổ 1H-NMR chất IVa-d 32 Bảng 3.6: Kết phân tích phổ 13C-NMR chất IVa-d 34 Bảng 3.7: Kết nồng độ ức chế tối thiểu IC50 HDAC dẫn chất IVa-d 36 Bảng 3.8: Kết thử hoạt tính kháng tế bào ung thư dẫn chất IVa-d 37 Bảng 3.9: Kết thử hoạt tính acid hydroxamic có khung 3hydroxyimino-2-oxoindolin 3-methoxyimino-2-oxoindolin 40 Bảng 3.10: Kết thử hoạt tính acid hydroxamic mang cầu nối heptanamid 41 Bảng 3.11: Kết thử hoạt tính dẫn chất N-hydroxypropenamid mang khung 3-spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin khác 41 DANH LỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Mô tả hoạt động HDAC Hình 1.2 Mô hình chất ức chế HDAC Hình 1.3 Cấu trúc hóa học acid hydroxamic mang khung indol amid Hình 1.4 Các acid hydroxamic mang khung 2,4'-diaminobiphenyl phenylthiazol Hình 1.5 Acid hydroxamic mang khung phenylalanin Hình 1.6 Acid hydroxamic mang nhân quinolin 10 Hình 1.7 Acid hydroxamic mang khung 3-phenyl-N-hydroxy-2-propenamid 11 Hinh 1.8 Cấu trúc hóa học hoạt tính sinh học acid hydroxamic chứa nhân 3-piperidin-3-ylindol 11 Hình 1.9 Acid hydroxamic mang khung aryloxopropenyl pyrrolyl 12 Hình 1.10 Cấu trúc hóa học kết thử hoạt tính sinh học acid hydroxamic mang nhân purin 12 Hình 1.11 Cấu trúc chung số dãy chất nghiên cứu môn Hóa Dược 13 Hình 3.1: Kết thử tác dụng ức chế HDAC dẫn chất IVa-c 35 Hình 3.2: Hình ảnh 3D khung cấu trúc 42 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng hợp chung 21 Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp chất IIa 21 Sơ đồ 3.3: Quy trình tổng hợp chất IIIa 22 Sơ đồ 3.4: Quy trình tổng hợp chất IVa 23 Sơ đồ 3.5: Quy trình tổng hợp chất IVb 25 Sơ đồ 3.6: Quy trình tổng hợp chất IVc 26 Sơ đồ 3.7: Quy trình tổng hợp chất IVd 28 ĐẶT VẤN ĐỀ Kể từ histon deacetylase (HDAC) chứng minh có liên quan mật thiết đến chu trình tế bào phát triển tế bào ung thư, enzym trở thành mục tiêu đầy hứa hẹn cho phát triển thuốc chống ung thư Acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA, Zolinza®) chất ức chế histon deacetylase Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Mỹ (US-FDA) phê duyệt điều trị u lympho da tế bào lympho T Sau đó, thuốc nhóm ức chế HDAC liên tục đời gân FDA cấp phép cho panobinostat (Farydak) với định điều trị u tủy Trên tảng đó, nhóm nghiên cứu môn Hóa Dược trường Đại học Dược Hà Nội thiết kế, tổng hợp công bố nhiều dãy chất định hướng ức chế HDAC cho kết khả quan Những nghiên cứu gần cho thấy thiết kế nhóm nhận diện bề mặt acid hydroxamic vòng thơm 3spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin thu nhiều hợp chất triển vọng [25] Bên cạnh đó, việc thay cầu nối mạch thẳng acid hydroxamic cầu nối có chứa nhân thơm thu số ứng viên có hoạt tính kháng ung thư cao hơn, đồng thời có tác dụng chọn lọc HDAC [16, 21] Dựa sở này, tiếp tục thiết kế dẫn chất mang khung 3-spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin, đồng thời khảo sát hợp chất mang khung 3-spiro[1,3]dithiolan-2-oxoindolin với cầu nối 3-phenyl-2propenamid tiến hành đề tài: “Tổng hợp thử độc tính tế bào số dẫn chất N-hydroxypropenamid mang khung 3-spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin 3-spiro[1,3]dithiolan-2-oxoindolin” với hai mục tiêu: Tổng hợp N-hydroxy-3-(4-((2'-oxospiro[[1,3]dioxolan-2,3'-indolin]-1'- yl)methyl)phenyl)prop-2-enamid dẫn chất N-hydroxy-3-(4-((2'oxospiro[[1,3]dithiolan-2,3'-indolin]-1'-yl)methyl)phenyl)prop-2-enamid Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro tác dụng ức chế HDAC chất tổng hợp Phụ lục 10: Phổ 1H-NMR chất IVb Phụ lục 10: Phổ 1H-NMR chất IVb (mở rộng) Phụ lục 11: Phổ 1H-NMR chất IVc Phụ lục 11: Phổ 1H-NMR chất IVc (mở rộng) Phụ lục 12: Phổ 1H-NMR chất IVd Phụ lục 12: Phổ 1H-NMR chất IVd (mở rộng) Phụ lục 13: Phổ 13C-NMR chất IVa Phụ lục 13: Phổ 13C-NMR chất IVa (mở rộng) Phụ lục 14: Phổ 13C-NMR chất IVb Phụ lục 14: Phổ 13C-NMR chất IVb (mở rộng) Phụ lục 15: Phổ 13C-NMR chất IVc Phụ lục 15: Phổ 13C-NMR chất IVc (mở rộng) Phụ lục 16: Phổ 13C-NMR chất IVd Phụ lục 16: Phổ 13C-NMR chất IVd (mở rộng) Kết thử hoạt tính sinh học dẫn chất Chú thích: Chất 40A = Chất IVa Chất 40C = Chất IVb Chất 40H = Chất IVc Chất 41A = Chất IVd Chất Phụ lục 17: Kết thử hoạt tính sinh học dẫn chất = Chất I [...]... trúc của các chất tổng hợp được 2.2.2 Đánh giá tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được - Thử tác dụng ức chế HDAC - Thử độc tính trên một số tế bào ung thư: ung thư đại tràng (SW620), ung thư biểu mô tuyền tiền liệt (PC-3), ung thư tuyến tụy (AsPC-1) 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Tổng hợp hóa học 2.3.1.1 Tổng hợp - Dựa trên những nguyên tắc và phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tổng hợp. .. a Tổng hợp chất IIb Để tổng hợp chất IVb cần tổng hợp chất 5'-clorospiro[[1,3]dioxolan-2,3'indolin]-2'-on (IIb) Quá trình tổng hợp chất IIb từ 0,27 g (1,5 mmol) chất 5-Cloro isatin (Ib) được thực hiện tương tự như tổng hợp chất IIa Kết quả như sau: + Cảm quan: bột kết tinh màu vàng + Khối lượng: 0,26 g + Hiệu suất: 76,8% + Tonc: 160,1-160,9oC + Rf = 0,31 (DCM/ MeOH = 90/ 1) b Tổng hợp chất IIIb Tổng. .. Tổng hợp chất IIc Để tổng hợp chất IVc cần tổng hợp chất 7'-clorospiro[[1,3]dioxolan-2,3'indolin]-2'-on (IIb) Quá trình tổng hợp chất IIc từ 0,27 g (1,5 mmol) chất 7-Chloro isatin (Ic) được thực hiện tương tự như tổng hợp chất IIa Kết quả như sau: + Cảm quan: bột kết tinh màu vàng + Khối lượng: 0,29 g 27 + Hiệu suất: 85,7% + Tonc: 161,1-162,2oC + Rf = 0,35 (DCM/ MeOH = 90/ 1) b Tổng hợp chất IIIc Tổng. .. 2003, một loạt các acid hydroxamic mang khung indol amid được tổng hợp bởi Yujia Dai và cộng sự Những chất này đã thể hiện hoạt tính ức chế HDAC mạnh và tác dụng chống tăng sinh trên 2 dòng tế bào ung thư tổ chức xơ và ung thư mô mềm vú [10] 1 Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của acid hydroxamic mang khung indol amid - Năm 2008, Dr Alan P Kozikowski và cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp acid hydroxamic mang cấu... khi gắn thêm vòng thơm vào vị trí C2 của nhân purin thì hiệu lực ức chế HDAC tăng đến 60 lần [35] Chất IC50 (µmol/L) HDAC1&2 HDAC1 HDAC6 HDAC8 5r 0.075 0.035 0.0026 0.15 SAHA 0.14 0.051 0.032 0.23 Hình 1.10 Cấu trúc hóa học và kết quả thử hoạt tính sinh học của các acid hydroxamic mang nhân purin 13 Kết quả thử thử hoạt tính sinh học cho thấy tác dụng ức chế HDAC 1 và 2 của những chất này tốt hơn so với... 2,4'-diaminobiphenyl hoặc phenylthiazol được gắn một cách thích hợp với gốc acid amin tạo nên nhóm nhận diện bề mặt có đặc tính khác biệt [18] Hình 1.4 Các acid hydroxamic mang khung 2,4'-diaminobiphenyl hoặc phenylthiazol 9 Kết quả thử hoạt tính sinh học đã chỉ ra tác dụng vượt trội của các chất trên so với các acid hydroxamic mang các amino acid ban đầu, các hợp chất này cũng có tác dụng ức chế mạnh HDAC và có... với SAHA (IC50= 0,14 mmol/L), đặc biệt chúng có tác dụng tốt chống tăng sinh tế bào khối u, bao gồm MDA-MB231, KG1, PC3 và U937 1.4 CÁC ACID HYDROXAMIC ĐƯỢC THIẾT KẾ TỔNG HỢP TRONG NƯỚC Cùng với xu hướng chung của thế giới, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội đã và đang thiết kế, tổng hợp, khảo sát tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic mới hướng ức chế histon deacetylase... mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS) 2.3.2 Thử tác dụng sinh học 2.3.2.1 Thử tác dụng ức chế HDAC Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất được đánh giá tại Khoa Dược Trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc bằng 2 phương pháp: - Đánh giá theo phương pháp Western blot: Tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất tổng hợp được đánh giá gián tiếp thông qua xác định mức độ acetyl hóa histon... hoạt động và cầu nối dựa trên cấu trúc của SAHA (hình 1.11) [24] Hình 1.11 Cấu trúc chung của một số dãy chất đã được nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược Kết quả cho thấy nhiều chất tổng hợp được có tác dụng rất tốt khi thử khả năng ức chế HDAC và độc tính tế bào in vitro trên một số dòng tế bào ung thư [24, 25] (bảng 1.3) Các nghiên cứu cũng cho thấy việc sử dụng dị vòng làm nhóm khoá hoạt động và phenylpropenamid... Cho và cộng sự đã tiến hành tổng hợp một dãy các acid hydroxamic với nhóm khóa hoạt động chứa nhân 3-piperidin-3-ylindol, sự kết hợp này đã tạo ra một cấu trúc thích hợp cho sự tương tác với HDAC, từ đó đem lại hoạt tính sinh học cao [30] Hinh 1.8 Cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của các acid hydroxamic chứa nhân 3-piperidin-3-ylindol Kết quả nghiên cứu cho thấy hợp chất có cầu nối phenyl propenamid