THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN (2–CLOROPHENYL)DIPHENYLMETHANOL

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Theo qui định của WHO, ASEAN - phải xây dựng quy trình phân tích có độ chính xác và độ lặp lại cao, ổn định để đánh giá đúng chất lượng nguyê

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ QUỲNH GIANG

THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN (2–CLOROPHENYL)DIPHENYLMETHANOL

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ QUỲNH GIANG

THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN (2–CLOROPHENYL)DIPHENYLMETHANOL

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC & ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 60720410

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đoàn Cao Sơn

HÀ NỘI 2016

Lời cảm ơn

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn đầu tiên đến PGS.TS Đoàn

Cao Sơn – Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, người thày đã

trực tiếp hướng dẫn và tạo điều kiện về mọi mặt cho tôi trong suốt quá trình thực

hiện luận văn này

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn tới ThS Nguyễn Văn Giang và các thầy cô

trong Bộ môn Công nghiệp dược - Trường Đại học Dược Hà nội đã tận tình chỉ

bảo để tôi có thể tiến hành thực nghiệm và hoàn thiện luận văn

Cũng nhân đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với các

thầy cô của trường Đại học Dược Hà nội, đặc biệt là các thầy cô trong Bộ môn

Hóa Phân tích và độc chất, những người đã dành trọn tâm huyết và tri thức để

giảng dạy cho tôi trong suốt quá trình tôi học tập tại trường

Cảm ơn ThS Tạ Mạnh Hùng, TS Trần Hồng Anh – Viện Kiểm nghiệm thuốc

Trung ương, TS Sameer G Navalgund – Hội đồng Dược điển Mỹ đã có rất

nhiều góp ý trực tiếp cho luận văn

Xin cảm ơn ThS Lê Thị Thu cùng toàn thể đồng nghiệp tại Viện Kiểm

nghiệm Thuốc Trung ương đã giúp đỡ và phối hợp với tôi trong quá trình thực

thực hiện

Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã cổ vũ, đỡ động viên để tôi có thể

hoàn thành hoàn thành khóa học này

Hà Nội, ngày 23 tháng 03 năm 2016

DS Nguyễn Thị Quỳnh Giang

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 (2–CLOROPHENYL)DIPHENYLMETHANOL 2

1.2 TẠP CHẤT VÀ KIỂM SOÁT TẠP CHẤT TRONG THUỐC 2

1.3 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 6

1.4 QUI TRÌNH ĐIỀU CHẾ (2-CLOROPHENYL)DIPHENYLMETHANOL 8 1.5 CHẤT CHUẨN VÀ QUI TRÌNH THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN 9

1.5.1 Khái quát về chất chuẩn 9

1.5.2 Qui trình thiết lập chất chuẩn hóa học 12

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 16

2.1.1 Nguyên liệu 16

2.1.2 Dung môi, hóa chất, chất chuẩn 16

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.2.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích 17

2.2.2 Điều chế nguyên liệu 19

2.2.3 Thiết lập chất chuẩn 21

2.2.4 Kiểm tra tạp chất của clotrimazol 22

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23

3.1 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 23

3.1.1 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và quy trình phân tích 23

3.1.2 Thẩm định phương pháp phân tích 25

3.1.2.1 Định tính 25

3.1.2.2 Định lượng 25

3.1.2.3 Tạp chất liên quan 39

3.2 CHUẨN BỊ NGUYÊN LIỆU THIẾT LẬP CHUẨN 49

3.2.1 Điều chế (2-clorophenyl)diphenylmethanol 49

3.2.2 Xác định cấu trúc của sản phẩm bằng phân tích phổ 52

3.2.2.1 Phổ hồng ngoại (IR) 52

3.2.2.2 Phổ khối (MS) 52

3.2.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 52

3.3 THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN (2-CLOROPHENYL) DIPHENYLMETHANOL 54 3.3.1 Xây dựng quy trình thiết lập chất đối chiếu 54

3.3.2 Kiểm tra chất lượng nguyên liệu sau tinh chế (NC1.2015) 54

3.3.3 Đóng lọ 58

3.3.4 Đánh giá đồng nhất quá trình đóng gói 58

3.3.5 Kết quả đánh giá bán thành phẩm 59

3.3.6 Kiểm tra độ ổn định 62

3.4 KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG NGUYÊN LIỆU CLOTRIMAZOL 64

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 67

4.1 Tính mới và hiệu quả kinh tế, xã hội 67

4.2 Quy trình điều chế nguyên liệu 68

4.3 Xác định cấu trúc, nhận dạng nguyên liệu 68

4.4 Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích 69

4.5 Thiết lập chất chuẩn DĐVN 71

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt:

ASEAN Association of Southeast Asian Nations DAD Diod array detector

DSC Differential scanning calorimetry

EPCRS European Pharmacopoeia Reference

NIST National Institute of Standards and

TGA Thermal gravimetric analysis

TLC Thin layer chromatography

TLCC-CĐC Thiết lập chất chuẩn và chất đối chiếu

USPRS United States Pharmacopeia reference

standard UV-VIS Ultraviolet–visible spectroscopy

VKNTTW Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

WHO World Health Organization

Danh mục các bảng, biểu:

Bảng 2.1: Các chỉ tiêu thẩm định cho từng phép thử 18

Bảng 3.2: Kết quả thẩm định độ đặc hiệu 26

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống 29

Bảng 3.4: Cách pha dung dịch thẩm định độ tuyến tính 30

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát độ tuyến tính 31

Bảng 3.6: Cách chuẩn bị dung dịch thẩm định độ đúng 32

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ đúng 32

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát độ lặp lại 34

Bảng 3.9: Kết quả thẩm định độ chính xác trung gian 35

Bảng 3.10: Kết quả đánh giá độ tái lặp theo t-Test 36

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ ổn định của dung dịch chuẩn 37

Bảng 3.12: Kết quả khảo sát độ ổn định của dung dịch thử 37

Bảng 3.13: Kết quả định lượng trên cột khác nhau 38

Bảng 3.14: Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống 42

Bảng 3.15: Giới hạn phát hiện của tạp imidazole 43

Bảng 3.16: Giới hạn phát hiện của tạp triphenylmethanol 44

Bảng 3.17: Giới hạn phát hiện của tạp clotrimazol 45

Bảng 3.18: Giới hạn phát hiện của clotrimazol tạp A 45

Bảng 3.19: Kết quả đánh giá hệ số đáp ứng của các tạp chất 47

Bảng 3.20: Kết quả đánh giá độ ổn định của dung dịch đối chiếu 48

Bảng 3.21: Bảng theo dõi độ ổn định kết quả tạp chất của dung dịch thử 48

Bảng 3.22: Kết quả đánh giá qui trình điều chế 50

Bảng 3.23: Bảng kết quả theo dõi độ ổn định của nguyên liệu 51

Bảng 3.24: Kết quả xác định hàm lượng nước 55

Bảng 3.25: Hệ thống sắc kí xác định tạp chất liên quan 55

Bảng 3.26: Kết quả xác định tạp chất trong nguyên liệu 56

Bảng 3.27: Kết quả định lượng nguyên liệu 57

Bảng 3.28: Kết quả đánh giá đồng nhất hàm lượng 59

Bảng 3.29: Kết quả đánh giá thành phẩm 60

Bảng 3.30: Bảng kết quả T-test 60

Bảng 3.31: Tập hợp kết quả của các khoa thử nghiệm 61

Bảng 3.32: Kết quả theo dõi độ ổn định hàm lượng của chất chuẩn 62

Bảng 3.33: Kết quả theo dõi độ ổn định về tạp chất 63

Bảng 3.34: Kết quả xác định giới hạn tạp A trong clotrimazol 65

Bảng 4.35: Bảng tóm tắt kết quả thẩm định định lượng 70

Bảng 4.36: Tóm tắt kết quả thẩm định xác định tạp chất liên quan 71

Danh mục các hình vẽ, đồ thị:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của (2-clorophenyl)diphenylmethanol 2

Hình 1.2: Sơ đồ điều chế (2-clorophenyl)diphenylmethanol 9

Hình 2.3: Sơ đồ phản ứng điều chế (2-clorophenyl)diphenylmethanol 20

Hình 3.4: Sắc kí đồ m u trắng, m u thử, m u chuẩn, m u hỗn hợp 27

Hình 3.5: Kết quả xác định độ tinh khiết của pic clotrimazol tạp A 27

Hình 3.6: Kết quả chồng phổ UV của pic clotrimazol tạp A 28

Hình 3.7: Sắc kí đồ dung dịch phân giải 29

Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ 31

Hình 3.9: Sắc k đồ thẩm định độ đặc hiệu 41

Hình 3.10: Sắc kí đồ của dung dịch đối chiếu và dung dịch phân giải 42

Hình 3.11: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ tạp chất và diện tích píc đáp ứng 46

Hình 3.12: Sơ đồ phản ứng điều chế clotrimazol tạp A 49

Hình 3.13: Phổ IR của (2-clorophenyl)diphenylmethanol 52

Hình 3.14: Phổ MS của (2-clorophenyl)diphenylmethanol 52

Hình 3.15 Phổ 1 H-NMR của (2-clorophenyl)diphenylmethanol 53

Hình 3.16: Phổ 13 C-NMR của (2-clorophenyl)diphenylmethanol 53

Hình 3.17: Kết quả phân tích DSC của (2-clorophenyl)diphenylmethanol 55

Hình 3.18: Sắc kí đồ xác định tạp chất liên quan trong nguyên liệu 57

Hình 3.19: SKĐ định lượng nguyên liệu (2-clorophenyl)diphenylmethanol 58

Hình 3.20: SKĐ xác định giới hạn clotrimazol tạp A trong Clotrimazol 66

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Clotrimazol được sử dụng rất rộng rãi để điều trị nấm với nhiều dạng bào chế khác nhau như kem bôi da, viên đặt âm đạo, dung dịch dùng ngoài, viên ngậm, [1],[15] Từ năm 2010 đến năm 2015, có khoảng 130 số đăng kí lưu hành tại Việt Nam do các công ty trong nước sản xuất hoặc nhập khẩu từ nước ngoài Để kiểm soát chất lượng của nguyên liệu cũng như các chế phẩm chứa hoạt chất này, bên cạnh chất chuẩn clotrimazol, Dược điển Việt Nam IV, Dược điển Mỹ 38, Dược điển Anh 2014 và nhiều Dược điển hiện hành khác còn qui định phải sử dụng chất chuẩn tạp (2-clorophenyl)diphenylmethanol (tên gọi khác: clotrimazol tạp A, 2-clorotritanol) để kiểm tra chỉ tiêu tạp chất [2],[12],[13],[15] Tuy nhiên, chất chuẩn tạp chất này chưa được thiết lập tại Việt Nam [19],[20] Khi muốn sử dụng, phải nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao hơn rất nhiều so với chất chuẩn hoạt chất thông thường, đồng thời mất nhiều thời gian và thủ tục nhập khẩu rất phức tạp, các đơn hàng nhỏ lẻ nên rất khó đặt hàng Vì vậy, Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương - với vai trò là một trong hai đơn vị có đủ năng lực và có nhiệm vụ thiết lập chất chuẩn theo qui định của Bộ Y tế cần tiến hành thiết lập chất chuẩn tạp (2-clorophenyl)diphenylmethanol bằng cách sử dụng các điều kiện khả thi ở Việt Nam Từ đó, đảm bảo tính sẵn có để đáp ứng nhu cầu sử dụng chất chuẩn tạp này trong kiểm tra chất lượng dược phẩm của các công ty sản xuất cũng như của các đơn vị nghiên cứu, kiểm nghiệm trong cả nước

Đề tài "Thiết lập chất chuẩn (2-Clorophenyl)diphenylmethanol" với mục tiêu:

Thiết lập 150 lọ (50 mg/lọ) chất chuẩn (2-Clorophenyl)diphenylmethanol đạt yêu cầu là chất chuẩn Dược điển Việt Nam

2

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 (2–CLOROPHENYL)DIPHENYLMETHANOL

Công thức phân tử: C19H15ClO

Khối lượng phân tử: 294,7 g/mol

Công thức cấu tạo:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của (2-clorophenyl)diphenylmethanol

Tính chất: Bột tinh thể, màu trắng Rất tan trong dicloromethan, dễ tan trong

diethyl ether, tan trong methanol và thực tế không tan trong nước Nhiệt độ nóng chảy: 92 – 96o

C [12],[16]

1.2 TẠP CHẤT VÀ KIỂM SOÁT TẠP CHẤT TRONG THUỐC

Thuốc là một sản phẩm đặc biệt có liên quan trực tiếp đến cơ thể con người,

vì vậy chất lượng thuốc cần phải kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo là an toàn và có hiệu quả cho người sử dụng Chất lượng thuốc được đánh giá dựa vào độ đồng nhất, độ ổn định và hàm lượng/độ tinh khiết của sản phẩm, và tạp chất là một trong các tiêu chí kiểm tra để xác định thuốc có đạt chất lượng hay không

Đối với nguyên liệu làm thuốc, tạp chất là bất kỳ thành phần nào không phải

là hoạt chất Còn trong các chế phẩm, tạp chất là các thành phần không có mặt trong công thức bào chế Tạp chất bao gồm tạp chất hữu cơ, tạp chất vô cơ hoặc dung môi tồn dư Nguồn gốc xuất hiện của tạp chất có thể từ tất cả yếu tố tham gia vào qui trình sản xuất như nguyên liệu đầu vào, sản phẩm trung gian, sản phẩm phụ, sản phẩm phân hủy, dung môi, chất xúc tác, sản phẩm phân hủy, [6],[15]

Việc kiểm soát các tạp chất trong nguyên liệu và đặc biệt là trong thành phẩm tương ứng chưa được quan tâm nhiều tại Việt Nam vì nhiều lí do Một trong số

3

các lí do đó là một số tạp chất chuẩn vẫn chưa có hoặc nếu có thì thường phải nhập khẩu nên rất đắt tiền Trong khi đó, phần lớn các chuyên luận của các Dược điển hiện hành đều bắt buộc phải kiểm soát tạp chất Gần đây, cục Quản lí dược Việt Nam đã có yêu cầu phải kiểm soát tạp chất một cách chặt chẽ hơn trong nguyên liệu và thành phẩm đăng kí cho sản xuất và lưu hành [3]

Muốn kiểm soát tạp chất thì cần phải sử dụng tạp chuẩn trong nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và kiểm nghiệm Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay,

số lượng tạp chuẩn được thiết lập còn rất ít, khoảng 10 chất, do Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh thiết lập Như tạp chất của paracetamol (4-aminophnol, 4-chloroacetanilid), tạp chất của metronidazol (tạp A: 2-methyl-4(5)-nitroimidazol), tạp chất của amlodipin (tạp D: (3-ethyl 5-methyl 2 - [(2-aminoethoxy)methyl] – 4 - (2-clorophenyl) – 6 – methyl - pyridin-3,5-dicarboxylat), tạp chất của nifedipin (tạp A: Dimethyl 2,6-dimethyl-4-(2-nitrophenyl)-pyridin-3,5-dicarboxylat, tạp B: Dimethyl 2,6-dimethyl-4-(2-nitrosophenyl)-pyridin-3,5-dicarboxylat) So sánh với nhu cầu sử dụng chuẩn tạp chất thì số lượng này là quá ít Đồng thời các chất chuẩn nói trên chủ yếu là chuẩn làm việc, chưa phải là chất chuẩn Dược điển Việt Nam [19],[20] Nguyên nhân có thể do việc thiết lập tạp chuẩn chất khó hơn nhiều so với chất chuẩn hoạt chất thông thường, chi phí nghiên cứu và thiết lập lớn, không có nguồn nguyên liệu có chất lượng cao và ổn định để tiến hành thiết lập chuẩn, Do không có nguồn tạp chuẩn sẵn có trong nước, khi các đơn vị có nhu cầu sử dụng phải nhập khẩu từ nước ngoài nên giá thành rất cao, mất nhiều thời gian, thủ tục nhập khẩu phức tạp, đơn hàng thường rất nhỏ lẻ nên khó đặt hàng Thực tế đó đã đặt ra thách thức lớn cho các đơn vị có chức năng thiết lập chuẩn tại Việt Nam cần phải có nghiên cứu thiết lập các chất chuẩn là tạp chất bên cạnh các chất chuẩn hoạt chất Khi có nguồn chất chuẩn sẵn có, dễ tiếp cận với giá thành hợp lí sẽ mang lại hiệu quả kinh tế xã hội cao Tạo điều kiện cho các công ty trong nước đẩy mạnh sử dụng chuẩn tạp trong nghiên cứu phát triển sản phẩm, xây dựng tiêu chuẩn và kiểm

Theo yêu cầu Dược điển Việt Nam IV, Dược điển Mỹ 38, Dược điển Anh

2014 và các Dược điển hiện hành khác đều yêu cầu phải sử dụng tạp chuẩn để kiểm soát lượng tạp chất (2-clorophenyl)diphenylmethanol trong cả nguyên liệu

và thành phẩm của Clotrimazol bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao hoặc sắc kí lớp mỏng [2],[12],[13],[15]

Dược điển Việt Nam IV:

Chuyên luận Clotrimazol: chỉ tiêu giới hạn Clorophenyl)diphenylmethanol

(2-Giới hạn: Không được lớn hơn 0,2%

Tiến hành theo phương pháp sắc kí lớp mỏng (Phụ lục 5.4)

Bản mỏng: Silica gel GF254

Dung môi khai triển: Toluen - propanol - amoniac đậm đặc (90 : 10 : 0,5)

Dung dịch thử (1): Hòa tan 0,50 g chế phẩm trong ethanol 96% và pha loãng thành 5 ml với cùng dung môi

Dung dịch thử (2): Pha loãng 1 ml dung dịch thử (1) đến 10 ml bằng ethanol 96%

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi dung dịch Triển khai sắc

kí đến khi dung môi đi được ít nhất 15 cm Để khô bản mỏng ngoài không khí, phun lên bản mỏng dung dịch acid sulfuric 10% (tt/tt) trong ethanol 96% và sấy bản mỏng ở 100oC đến 105o

C trong 30 phút

Trên sắc kí đồ của dung dịch thử (1), vết tương ứng với vết của clorophenyl)diphenylmethanol không được đậm hơn vết chính trên sắc kí đồ của dung dịch đối chiếu (2)

(2-Dược điển Anh 2014:

Chuyên luận clotrimazol: chỉ tiêu tạp chất liên quan bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao có sử dụng dung dịch clotrimazole for peak identification CRS (có chứa tạp A, B và F) để định tính tạp chất và đánh giá sự phù hợp của hệ thống Chuyên luận kem clotrimazol: chỉ tiêu giới hạn 2-chlorotritanol (tạp A) và chuyên luận viên đặt âm đạo clotrimazol: chỉ tiêu tạp chất liên quan, tiến hành bằng phương pháp HPLC có sử dụng dung dịch clotrimazol tạp A ở nồng độ 0,0002% kl/tt để làm dung dịch chuẩn để so sánh tạp chất

Chuyên luận clotrimazol: chỉ tiêu định lượng bằng phương pháp HPLC sử dụng dung dịch có chứa hỗn hợp clotrimazol và clotrimazol tạp A làm dung dịch phân giải kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc kí Chỉ tiêu giới hạn clotrimazol tạp A bằng phương pháp HPLC sử dụng dung dịch tạp clotrimazol tạp A chuẩn

50 µg/ml làm dung dịch chuẩn so sánh tạp chất

Các chuyên luận kem clotrimazol, lotion clotrimazol, clotrimazol, dung dịch dùng ngoài clotrimazol, viên đặt âm đạo sử dụng dung dịch chứa hỗn hợp có chứa clotrimazol tạp A làm dung dịch kiểm tra hệ thống sắc kí dùng cho định

(2-£/ lọ 20 mg). Còn hóa chất (2-clorophenyl)diphenylmethanol do công ty TRC (Canada) sản xuất có giá 150 USD/250 mg, do công ty SCBT (Mỹ) sản xuất có giá 450 USD/100 mg, Đồng thời các nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới lại chủ yếu tập trung vào xác định tạp chất trong nguyên liệu và thành phẩm chứa clotrimazol, chưa thấy có nghiên cứu để ứng dụng trong thiết lập chuẩn tạp chất (2-clorophenyl)diphenylmethanol Còn qui trình sản xuất chất chuẩn của các đơn vị cung cấp chuẩn tạp này trên thế giới là bảo mật, không thể tiếp cận Vì vậy, cần thiết phải tiến hành nghiên cứu để thiết lập tạp chuẩn này sử dụng nguồn nguyên liệu tự điều chế trong nước đáp ứng nhu cầu sử dụng để kiểm soát chất lượng thuốc

1.3 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

Theo qui định của WHO, ASEAN - phải xây dựng quy trình phân tích có độ chính xác và độ lặp lại cao, ổn định để đánh giá đúng chất lượng nguyên liệu dự kiến thiết lập chất chuẩn và phù hợp với mục đích sử dụng trong đánh giá liên phòng, kiểm tra độ ổn định của chất chuẩn Qui trình phải bao gồm các nhóm phép thử định tính, xác định độ tinh khiết và định lượng [7],[14],[18]

Một số phương pháp thường được sử dụng trong xây dựng qui trình phân tích dùng trong thiết lập chất chuẩn như:

- Định tính, xác định cấu trúc: có thể sử dụng các phương như phổ hồng ngoại, sắc kí lỏng hiệu năng cao, sắc kí lớp mỏng (so sánh với chất chuẩn gốc),

đo điểm chảy, sử dụng các phản ứng hóa học, đo góc quay cực riêng,

7

- Xác định độ tinh khiết: có thể lựa chọn sử dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao; sắc kí lớp mỏng, sắc kí khí, phổ hấp thụ UV-VIS, đo điểm chảy, phương pháp TGA, phương pháp DSC, xác định hàm lượng cắn sau nung, mất khối lượng do làm khô, xác định hàm lượng nước, Đối với phép thử tạp chất,

có thể là định lượng tạp chất hoặc giới hạn tạp chất trong mẫu thử

- Định lượng: để đo lượng chất phân tích có mặt trong mẫu thử Sử dụng các phương pháp như sắc kí lỏng hiệu năng cao, chuẩn độ đo thế, phương pháp phổ hấp thụ UV-VIS, sắc kí khí, Có thể sử dụng chất chuẩn gốc để so sánh

Quy trình phân tích sử dụng trong thiết lập chất chuẩn phải được thẩm định, đây là một quá trình mà qua đó các thông số phản ánh đặc trưng của quy trình được thiết lập bằng thực nghiệm, để chứng minh rằng quy trình đáp ứng được yêu cầu ứng dụng dự kiến [5]

Dựa trên qui định về thẩm định phương pháp phân tích theo ICH Q2B, USP

38, ASEAN Guidelines, các phép thử cần thẩm định: định tính, xác định tạp

chất, định lượng [5],[15] Tùy theo từng phép thử cụ thể và mục đích sử dụng của phép thử mà các chỉ tiêu cần thẩm định cũng khác nhau với các chỉ tiêu cần thẩm định có thể là:

- Độ đặc hiệu

- Sự phù hợp của hệ thống sắc kí

- Độ đúng

- Độ chính xác (độ lặp lại, độ chính xác trung gian, độ tái lặp)

- Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

- Độ tuyến tính

- Khoảng xác định

- Độ thô

Độ đặc hiệu: Chứng minh đáp ứng của chất phân tích ở điều kiện phân tích đã

xây dựng Chứng minh các chất khác không ảnh hưởng đến chất phân tích Đối

8

với phép thử định tính, chứng minh mẫu có chất phân tích thì dương tính, không

có chất phân tích thì âm tính

Sự phù hợp của hệ thống: Chứng minh hệ thống thiết bị, môi trường, là phù

hợp để tiến hành phân tích trên mẫu phân tích

Độ đúng: được thiết lập trong khoảng xác định của qui trình phân tích Tiến

hành phân tích trên chất chuẩn hoặc được suy ra một khi độ chính xác, tính tuyến tính và tính đặc hiệu đã được thiết lập

Độ tái lặp: tiến hành ở phòng thử nghiệm khác

Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng: Có thể dựa vào quan sát đáp ứng,

vào tỉ lệ đáp ứng so với nhiễu hoặc căn cứu vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và

độ dốc

Độ tuyến tính: Để đảm bảo sự phụ thuộc tuyến tính giữa các đại lượng đo

được và nồng độ hoặc hàm lượng chất cần phân tích

Khoảng xác định: Để khẳng định qui trình đã xây dựng có tính tuyến tính, độ

đúng và độ chính xác chấp nhận được khi áp dụng định lượng chất phân tích với hàm lượng nằm trong khoảng hoặc ở 2 cực của khoảng xác định

Độ thô: để đánh giá độ ổn định của phương pháp khi có những thay đổi nhỏ

có chủ đích các thông số của qui trình phân tích, đảm bảo phương pháp là phù hợp để phân tích

1.4 QUI TRÌNH ĐIỀU CHẾ (2-CLOROPHENYL)DIPHENYLMETHANOL

Theo Macnau Hoogerheide và Wvka (1982), Clotrimazol có khả năng thủy phân trong môi trường acid hydrocloric để tạo ra (2-clorophenyl)diphenylmethanol [10] Sử dụng phương pháp kết tinh lại bằng

9

dung môi thích hợp để tinh chế Đây là nguyên tắc chung để điều chế tạp chất này từ nguyên liệu clotrimazol

Hình 1.2: Sơ đồ điều chế (2-clorophenyl)diphenylmethanol

Dựa trên nguyên tắc chung này, McNaughton - Smith và cộng sự đã tiến hành điều chế (2-clorophenyl)diphenylmethanol theo qui trình sau: Cho 0,5 g clotrimazol vào 2 ml dung dịch HCl 1,0M, đun hồi lưu trong 2 giờ, để nguội Chiết bằng ethyl acetat 2 lần, mỗi lần với 10 ml Cô loại dung môi thu được cắn Kết tinh lại cắn bằng dung môi hexan thu được (2-clorophenyl)diphenylmethanol [9]

Theo dược điển Nhật XVI, sản phẩm (2-clorophenyl)diphenylmethanol thu được sau phân hủy được sử dụng cho phép thử giới hạn tạp chất bằng phương pháp TLC với qui trình cụ thể như sau: Lấy 5 g clotrimazol, thêm 300 ml dung dịch HCl 0,2M, đun sôi trong 30 phút, để nguội, chiết với 100 ml diethyl ether Làm sạch dịch chiết 2 lần, mỗi lần bằng 10 ml dung dịch HCl 0,2 M, sau đó với

10 ml nước Lắc dịch chiết diethyl ether với 5 g natri sulfat khan, lọc

Tinh chế bằng phương pháp kết tinh lại: bay hơi dịch lọc, hòa tan cắn trong 200

ml methanol, làm nóng, khuấy đều Để nguội trong nước đá, lọc lấy tinh thể, làm khô trong bình hút ẩm trong 24 giờ [12]

Để sử dụng cho thiết lập tạp chuẩn, thì nguyên liệu sử dụng phải tinh khiết và

ổn định Theo qui định, độ tinh khiết của nguyên liệu cho tạp chuẩn phải lớn hơn 95% [18].

1.5 CHẤT CHUẨN VÀ QUI TRÌNH THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN

1.5.1 Khái quát về chất chuẩn

Khái niệm

Theo Dược điển Việt Nam IV, chất chuẩn là chất đồng nhất đã được xác định

là đúng để dùng trong các phép thử đã được qui định về hóa học, vật lý và sinh

10

học Trong các phép thử đó các tính chất của chất đối chiếu được so sánh với các tính chất của các chất cần thử Chất chuẩn phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng [2]

Theo Thủ tục thiết lập và hiệu chuẩn chất chuẩn của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, chất chuẩn được mô tả là vật liệu đủ đồng nhất và ổn định đối với một hoặc nhiều tính chất qui định, được thiết lập phù hợp với việc sử dụng dự kiến của một quá trình đo [3],[11]

Chất chuẩn được dùng trong các phép thử sau [4],[7],[11],[18]

- Định tính bằng phương pháp phổ hấp thụ hồng ngoại

- Định lượng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến, quang phổ huỳnh quang

- Các phép thử định tính và định lượng bằng phương pháp sắc kí

- Định lượng bằng phương pháp vi sinh vật

- Các phương pháp chuẩn độ đo thể tích, phân tích khối lượng

- Các phép thử sinh học

- Hiệu chuẩn thiết bị, thẩm định phương pháp

- Một số phép thử khác có hướng dẫn trong các chuyên luận riêng

Phân loại chất chuẩn [4],[7],[8],[18]

- Chất chuẩn gốc: Chất chuẩn được ấn định hoặc thừa nhận rộng rãi là có chất lượng đo lường cao nhất và giá trị của nó được chấp nhận mà không qui chiếu về các chất chuẩn khác của cùng đại lượng, trong tình huống cụ thể

Một số chất chuẩn được coi là chuẩn gốc như chuẩn Quốc tế (ICRS), chuẩn Dược điển Mỹ (USPRS), chuẩn Dược điển châu Âu (EPCRS), chất chuẩn

do Viện tiêu chuẩn và công nghệ quốc gia Mỹ (NIST) thiết lập

- Chuẩn thứ cấp: chuẩn có giá trị được ấn định bằng cách so sánh với chuẩn gốc của cùng một đại lượng Ví dụ như chuẩn Asean (ARS), chuẩn Dược điển Việt Nam, chuẩn làm việc,

11

Nguồn chất chuẩn thường sử dụng ở Việt Nam:

Hiện nay, các chất chuẩn sử dụng cho công tác kiểm nghiệm và nghiên cứu thường có nguồn gốc như sau:

- Chất chuẩn do Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương và Viện Kiểm nghiệm Thuốc thành phố Hồ Chí Minh thiết lập

- Chất chuẩn của hội đồng Dược điển nước ngoài: USPRS, BPCRS, EPCRS, ICRS, ARS,

- Chuẩn của các hãng hóa chất: Merck, Sigma Aldrich,

- Chuẩn làm việc do các phòng thử nghiệm tự thiết lập

Theo qui định Phụ lục 2, Dược điển Việt Nam IV, cho phép sử dụng các chất đối chiếu quốc gia Việt Nam được thiết lập, bảo quản và phân phối tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (48 Hai Bà Trưng, Quận Hoàn Kiếm, TP Hà Nội) hoặc Viện Kiểm nghiệm thuốc TP Hồ Chí Minh (200 Cô Bắc, Quận 1, TP

Hồ Chí Minh) theo sự phân công của Bộ Y tế [2] Như vậy, các chất chuẩn do Viện Kiểm nghiệm Thuốc TW thiết lập theo qui trình được phê duyệt, tại phòng thử nghiệm đạt tiêu chuẩn nên đáp ứng được yêu cầu để sử dụng cho các chuyên luận của Dược điển Việt Nam IV (chuẩn Dược điển Việt Nam)

"Thủ tục thiết lập và hiệu chuẩn chất chuẩn" - VKN/TT/21.20 (2014) của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương qui định, chuẩn Dược điển Việt Nam được đánh giá bởi ít nhất 2 khoa thử nghiệm, gồm khoa Thiết lập chất chuẩn & chất đối chiếu và một khoa thử nghiệm khác của Viện Kiểm nghiệm thuốc TW Theo hướng dẫn thực hiện Thông tư 22/2009/TT-BYT về đăng kí thuốc, chấp nhận các chất chuẩn của các dược điển tham chiếu: Dược điển Việt Nam, Dược điển Anh, Dược điển Mỹ, Dược điển châu Âu, Dược điển quốc tế Các nguồn chất chuẩn khác cần có xem xét, đánh giá

Tuy nhiên, việc tiếp cận với các chất chuẩn nói chung và đặc biệt là tạp chuẩn tạp ở Việt Nam còn rất hạn chế do số lượng chất chuẩn thiết lập được trong nước còn ít, ít hơn nhiều so với lượng hoạt chất đang lưu hành trên thị trường

12

Vì vậy, công tác thiết lập chuẩn đang được đẩy mạnh và đặc biệt, thiết lập chất chuẩn là tạp chất đang là hướng nghiên cứu và phát triển mới tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

1.5.2 Qui trình thiết lập chất chuẩn hóa học

Theo hướng dẫn của WHO và ASEAN, quy trình thiết lập chất chuẩn bao gồm các hướng dẫn cụ thể để thiết lập chất chuẩn phù hợp với mục đích sử dụng Về cơ bản, quá trình trình thiết lập chất chuẩn bao gồm các bước sau: [4],[7],[18]

- Lựa chọn nguyên liệu

- Tập hợp và xử lý số liệu, hoàn thành hồ sơ

- Phê duyệt kết quả

- Đóng gói, bảo quản, phân phối

- Kiểm tra định kỳ

Lựa chọn nguyên liệu

Nguyên liệu làm chất đối chiếu phải tinh khiết, đồng nhất và ổn định Tùy thuộc vào mục đích sử dụng của chất chuẩn mà yêu cầu về độ tinh khiết của nguyên liệu cũng khác nhau Đối với nguyên liệu để thiết lập chất chuẩn sử dụng cho phép thử định lượng, độ tinh khiết thường phải lớn hơn 99% Chất chuẩn sử dụng cho định tính và các phép thử có độ chọn lọc không cao thường yêu cầu mức độ tinh khiết thấp hơn do sự có mặt của tạp chất ở một hàm lượng nhất định thường sẽ không ảnh hưởng đến kết quả của phép thử [7] Ví dụ, đối với các tạp chuẩn, độ tinh khiết phải lớn hơn 95%, đối với chất chuẩn dùng cho phép thử TLC, độ tinh khiết yêu cầu lớn hơn 90% [18]

13

Kiểm tra chất lượng nguyên liệu sử dụng làm chất đối chiếu thường phức tạp, tốn kém, đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, hóa chất, chất chuẩn chất lượng tốt, đặc biệt người làm phân tích phải có trình độ, kinh nghiệm

Xây dựng qui trình (protocol):

Đưa ra qui trình đánh giá phù hợp với mục đích sử dụng của chất chuẩn, đảm bảo các phương pháp sử dụng phải là các phương pháp chính thức trong các Dược điển hoặc là phương pháp phân tích được xây dựng và thẩm định Đồng thời yêu cầu các điều kiện con người, thiết bị, dung môi hóa chất, chất chuẩn, môi trường, của phòng thử nghiệm phải đáp ứng cho phòng thử nghiệm thiết lập chất chuẩn [4],[7],[18]

Các phương pháp phân tích sử dụng trong phân tích thiết lập chất chuẩn [6,8]

- Định tính: phổ IR, phổ UV-VIS, sắc kí, điểm chảy, góc quay cực riêng,

- Xác định độ tinh khiết:

+ Sắc kí: TLC, HPLC, GC

+ Quang phổ: UV-VIS

+ Điểm chảy, LOD, góc quay cực riêng,

- Định lượng: Sắc kí, UV-VIS, đo thế,

Đánh giá nguyên liệu [4]

- Đánh giá nguyên liệu theo protocol đã xây dựng

- Kết quả phân tích nguyên liệu được lưu trong hồ sơ kiểm nghiệm theo biểu mẫu

Đóng lọ: [4],[7],[18]

- Lọ đựng chất đối chiếu phải đảm bảo kín, tránh được ẩm, ánh sáng, đảm bảo độ ổn định của chất chuẩn Thuận tiện sử dụng, thống nhất về kiểu dáng và kích thước, đánh số thứ tự lên từng lọ [18]

- Đóng gói trong glove-box kiểm soát được kiểm soát điều kiện đóng gói

- Các bước trong quá trình đóng gói phải kiểm soát chặt chẽ tránh nhiễm chéo, tạp, sai nhãn…

14

- Lượng chất đối chiếu đóng trong một lọ phải đủ cho 1 lần kiểm tra và chỉ

sử dụng một lần

- Sau khi đóng gói, bán thành phẩm được bảo quản ở điều kiện phù hợp

Kiểm tra độ đồng nhất của quá trình đóng gói: [4]

- Lấy n đơn vị đóng gói theo công thức

Đánh giá liên phòng thí nghiệm [4]

- Phòng thử nghiệm tham gia đánh giá liên phòng phải đạt điều các yêu cầu của một đơn vị thiết lập chất chuẩn

- Ít nhất 2 phòng thử nghiệm tham gia đánh giá, mỗi phòng sẽ tiến hành đánh giá hàm lượng nguyên liệu bán thành phẩm ít nhất trên 6 lọ theo protocol

- Xử lý số liệu theo thống kê để tính giá trị công bố trên chứng chỉ của chất chuẩn

Bảo quản [3],[8]

- Nhiệt độ thông thường 2 oC – 8oC

- Tránh ẩm, ánh sáng

- Các chất cần bảo quản đặc biệt sẽ có qui định riêng

Đóng gói, phân phối chất chuẩn:

Cung ứng cho hệ thống cơ sở nghiên cứu và kiểm nghiệm dược phẩm Đánh giá độ ổn định [4],[18]

- Kiểm tra chỉ tiêu tạp chất liên quan và định lượng theo protocol

- Tần suất kiểm tra phụ thuộc vào nhiều yếu tố: độ ổn định, điều kiện bảo quản, đóng gói,…và mục đích sử dụng của chất chuẩn

Hồ sơ chuẩn [4]

15

- Thông tin trên nhãn:

Tên chất đối chiếu Tên đơn vị thiết lập Khối lượng đóng gói Giá trị công bố

Số kiểm soát Điều kiện bảo quản Các thông tin khác

- Thông tin trên chứng chỉ phân tích:

Tên chất đối chiếu

Số kiểm soát Kết quả phân tích Mục đích sử sụng Điều kiện bảo quản Hướng dẫn sử dụng Các thông tin khác Lưu hồ sơ của toàn bộ quá trình thiết lập chuẩn theo qui định

16

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Tiêu chuẩn chất lượng:

Đạt yêu cầu chất lượng theo tiêu chuẩn nhà sản xuất

- Cân phân tích Mettler MS105, Satorius AB204

- Cân kỹ thuật: Metller 302

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy Buchi M565

- Máy đo pH Metrohm 780

- Máy đo phổ hồng ngoại 670-FTIR Nicolet-NEXUS

- Máy quét nhiệt vi sai Shimadzu DSC 60

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AV500 –Khoa Hóa học - Đại học khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội

- Máy HPLC Agilent 1200, Agilent 1260, Shimadzu 20A

- Bếp cách thủy

- Máy khuấy từ điều nhiệt

- Máy cất quay chân không

- Buồng đóng chuẩn Glove box Labconco, …

- Dụng cụ thủy tinh

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích

- Tham khảo tài liệu kết hợp với thực nghiệm để xây dựng tiêu chuẩn chất lượng kèm theo yêu cầu chấp nhận, qui trình phân tích kiểm tra chất lượng của nguyên liệu sử dụng để thiết lập chuẩn cũng như trong đánh giá liên phòng, kiểm tra độ ổn định của tạp chuẩn (2-clorophenyl)diphenylmethanol

Định tính: Sử dụng phương pháp IR, HPLC (so sánh với chuẩn USPRS)

Định lượng: Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector DAD, tiến

hành song song với chuẩn gốc (2-clorophenyl)diphenylmethanol (USPRS) Đối với phương pháp HPLC dùng trong định tính, xác định tạp chất và định lượng, nghiên cứu lựa chọn và tối ưu hóa các thông số về pha tĩnh, pha động, bước sóng phát hiện, thể tích tiêm, tốc độ dòng, cách chuẩn bị các dung dịch tiêm sắc kí, cách tiến hành (tiêm riêng rẽ hay tiêm lặp lại với từng dung dịch sắc

kí, thời gian chạy sắc kí, cách kiểm tra sự phù hợp của hệ thống), đánh giá kết quả (căn cứ vào diện tích, chiều cao píc sắc kí, so sánh với đáp ứng của dung dịch đối chiếu),…

- Thẩm định phương pháp phân tích cho các phép thử định tính và định lượng, xác định giới hạn tạp chất bằng phương pháp HPLC với các chỉ tiêu như sau:

19

Độ đặc hiệu: sử dụng chuẩn gốc để so sánh, đánh giá độ tinh khiết của píc,

chồng phổ UV-VIS và đánh giá hệ số match Sử dụng các mẫu thử có thể đánh giá khả năng phân tách trong sắc kí, đánh giá mức độ ảnh hưởng của các chất khác tới kết quả phân tích như dung dịch tự tạo có cho thêm các tạp chất có thể

có của mẫu thử (2-clorophenyl)diphenylmethanol (imidazol, clotrimazol,…), dung dịch phân hủy ở một điều kiện khắc nghiệt,

Sự phù hợp của hệ thống sắc kí: Đánh giá trên các chỉ tiêu số đĩa lý thuyết, độ

phân giải, hệ số kéo đuôi, giá trị RSD diện tích của các lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn,

Độ đúng: tiến hành áp dụng qui trình phân tích đối với chất chuẩn

Clotrimazole related compound A USPRS đã biết hàm lượng Xác định lượng Clotrimazol tạp A thu hồi theo đường hồi quy tuyến tính Độ đúng được xác định dựa vào tỉ lệ thu hồi của chất chuẩn

Độ lặp lại: Tiến hành phân tích tối thiểu 6 lần trên cùng 1 đối tượng mẫu thử,

đánh giá độ lặp lại của kết quả hàm lượng thu được dựa vào giá trị RSD

Độ tái lặp: So sánh kết quả phân tích thu được từ 2 phòng thử nghiệm khác

nhau, sử dụng test T để đánh giá

Giới hạn phát hiện: Dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc của đường

chuẩn

Độ tuyến tính: Sử dụng mẫu chuẩn, quan sát đồ thị của tín hiệu đáp ứng với

nồng độ của chất phân tích, xây dựng đường hồi qui tuyến tính dựa trên phương pháp bình phương tối thiểu và xác định hệ số tương quan tuyến tính

Khoảng xác định: Được suy ra từ nghiên cứu độ đúng

Độ ổn định: đánh giá độ ổn định của dung dịch chuẩn và dung dịch thử, dung

dịch đối chiếu

2.2.2 Điều chế nguyên liệu

Tiến hành điều chế tạp chất (2-clorophenyl)diphenylmethanol có độ tinh khiết cao để làm nguyên liệu thiết lập tạp chuẩn dựa vào qui trình đã tham khảo Xác

20

định cấu trúc, đánh giá sơ bộ chất lượng nguyên liệu bằng phương pháp đo IR, NMR, điểm chảy, TLC Sản phẩm sau tinh chế phải đảm bảo đủ số lượng (>10g) với độ tinh khiết > 95%

- Điều chế (2-Clorophenyl)diphenylmethanol được điều chế từ clotrimazol theo phản ứng thủy phân trong môi trường acid

Hình 2.3: Sơ đồ phản ứng điều chế (2-clorophenyl)diphenylmethanol

Lựa chọn tiến hành theo phương pháp điều chế đơn giản, phù hợp với điều kiện hiện có tại phòng thử nghiệm theo qui trình của McNaughton - Smith: Cho 0,5 g clotrimazol vào dung dịch 2ml HCl 1,0M, đun hồi lưu trong 2 giờ, để nguội Chiết bằng ethyl acetat 2 lần, mỗi lần với 10 ml Cô loại dung môi thu được cắn (2-clorophenyl)diphenylmethanol

- Tinh chế và thử độ tinh khiết sơ bộ:

Sử dụng phương pháp kết tinh lại bằng dung môi n-hexan Kiểm tra độ tinh khiết sơ bộ bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng tiến hành trên bản mỏng Silica gel 60 F254 với hệ dung môi thích hợp, phát hiện vết dưới đèn tử ngoại 254 nm

và đo nhiệt độ nóng chảy của nguyên liệu

- Xác định cấu trúc, nhận dạng chất

Sản phẩm điều chế được khẳng định cấu trúc bằng các phương pháp phân tích phổ hiện đại: phổ hồng ngoại (nén viên KBr), phổ khối (MS) với chế độ ESI-MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR với chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS)

21

2.2.3 Thiết lập chất chuẩn

- Xây dựng quy trình thiết lập chất chuẩn: theo VKN/TT/21.20 "Thủ tục thiết lập và hiệu chuẩn chất chuẩn" của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, ban hành năm 2014 mô tả đầy đủ các bước thiết lập chuẩn, sử dụng phương pháp phân tích đã được xây dựng và thẩm định

- Đánh giá nguyên liệu: tiến hành theo qui trình đã xây dựng

- Đóng lọ: trong Glove box có kiểm soát nhiệt độ, độ ẩm, nạp khí Nitơ

+ Số lượng: 200 lọ + 50 mg/ lọ

- Kiểm tra độ đồng nhất của quá trình đóng gói: Lấy mẫu ngẫu nhiên, tiến hành định lượng từng lọ và đánh giá kết quả

- Đánh giá liên phòng: Tiến hành 2 lần thử nghiệm định lượng độc lập

- Tập hợp và xử lý số liệu, hoàn thành hồ sơ

- Phê duyệt kết quả: ban hành chứng chỉ của chất chuẩn

- Dán nhãn

- Đóng gói, bảo quản, phân phối

- Kiểm tra định kỳ: dự kiến 3 tháng/ lần đến khi thời gian thực hiện luận văn kết thúc, tiếp tục theo dõi độ ổn định theo qui định của "Thủ tục thiết lập và hiệu chuẩn chất chuẩn" - VKN/TT/21.20 (2014) của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

Quá trình thiết lập chuẩn: tiến hành theo qui trình đã xây dựng tại phòng thử nghiệm đạt tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và GLP, có hồ sơ đầy đủ theo qui định trong "Thủ tục thiết lập và hiệu chuẩn chất chuẩn" - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

22

2.2.4 Kiểm tra tạp chất của clotrimazol

Sử dụng chất chuẩn DĐVN (2-clorophenyl)diphenylmethanol đã thiết lập

để kiểm tra chất lượng của nguyên liệu hoặc thành phẩm chứa hoạt chất clotrimazol, đối chiếu với kết quả thu được khi sử dụng chuẩn Clotrimazol related compound A USPRS

23

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

3.1.1 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và quy trình phân tích

Tiến hành khảo sát bằng thực nghiệm để xây dựng tiêu chuẩn chất lượng bao gồm các chỉ tiêu định tính, xác định độ tinh khiết, định lượng kèm theo giới hạn chấp nhận của từng chỉ tiêu Qui trình này được để sử dụng trong đánh giá nguyên liệu, đánh giá liên phòng và kiểm tra độ ổn định Các chỉ tiêu cụ thể như sau:

Định tính:

A Phổ hồng ngoại

Tiến hành song song với chuẩn (2- Clorophenyl)diphenylmethanol

Yêu cầu: phổ IR của mẫu thử phải trùng với phổ IR của mẫu chuẩn

B HPLC

Điều kiện tiến hành như phần định lượng

Yêu cầu: thời gian lưu của píc chính trên sắc kí đồ của dung dịch thử phải trùng với thời gian lưu của píc chính trên sắc kí đồ của dung dịch chuẩn

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

Pha động, dung dịch kiểm tra hệ thống và hệ sắc kí: như phần định lượng

Dung dịch thử: Hòa tan 25 mg nguyên liệu trong pha động, pha loãng

bằng pha động vừa đủ 50,0 ml

Dung dịch đối chiếu: Pha loãng 2,0 ml dung dịch thử bằng pha động vừa

đủ 20,0 ml Hút 1,0 ml dung dịch này, pha loãng bằng pha động vừa đủ 20,0 ml

Tiến hành: Tiến hành tiêm sắc kí riêng rẽ 20 µl pha động, dung dịch đối

chiếu và dung dịch thử, ghi lại sắc kí đồ

24

Yêu cầu: Trên sắc kí đồ của dung dịch mẫu thử, tổng diện tích pic của tất

cả các tạp chất không lớn hơn 2,0 lần diện tích của pic chính trên sắc kí đồ thu được của dung dịch đối chiếu (1,0%)

Định lượng

Hàm lượng của (2- Clorophenyl)diphenylmethanol không được nhỏ hơn 98,0% và không được lớn hơn 102,0% của C19H15ClO, tính theo chế phẩm khan

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

Pha động: Hỗn hợp Acetonitril và dung dịch natri dihydro phosphat 5mM

đã điều chỉnh pH về 6,8 bằng dung dịch natri hydroxyd (tỉ lệ: 70 – 30)

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 25 mg nguyên liệu vào bình định

mức 50 ml, hòa tan và pha loãng bằng pha động vừa đủ thể tích Hút 1,0

ml dung dịch này, pha loãng bằng pha động thành 20,0 ml

Dung dịch chuẩn: Hòa tan một lượng chính xác (2-

clorophenyl)diphenylmethanol chuẩn và pha loãng bằng pha động để thu được dung dịch có nồng độ khoảng 0,025 mg/ ml

Dung dịch kiểm tra hệ thống: Dung dịch có chứa hỗn hợp (2-

clorophenyl)diphenylmethanol và clotrimazole có nồng độ 0,025 mg/ml cho từng chất

3.1.2 Thẩm định phương pháp phân tích

Tiến hành thẩm định phép thử định tính, định lượng và xác định tạp chất bằng phương pháp HPLC

3.1.2.1 Định tính

Qui trình phân tích: phương pháp HPLC, theo phần định lượng

Thẩm định: độ đặc hiệu (như trình bày trong phần thẩm định độ đặc hiệu, phép thử định lượng)

chuẩn

- Pic của hoạt chất cần phân tích trong sắc kí đồ dung dịch thử, dung dịch chuẩn phải tinh khiết Hệ số chồng phổ UV của pic hoạt chất cần phân tích thu được trong sắc kí đồ dung dịch thử và phổ UV của pic tương ứng

trong sắc kí đồ dung dịch chuẩn xấp xỉ 1,0

- Dung dịch hỗn hợp: Các tạp chất imidazol, triphenylmethanol, clotrimazol

phải tách hoàn toàn khỏi píc clotrimazol tạp A

Kết quả: được thể hiện trong bảng sau:

Bảng 3.2: Kết quả thẩm định độ đặc hiệu

Mẫu trắng - Không xuất hiện các pic có thời gian lưu trùng

với pic phân tích

Dung dịch chuẩn

- Xuất hiện 1 píc chính có thời gian lưu 10,9 phút

- Độ tinh khiết của píc clotrimazol tạp A bằng 1,0000

Dung dịch thử

- Xuất hiện 1 píc chính có thời gian lưu 10,9 phút

- Độ tinh khiết của píc clotrimazol tạp A bằng 1,0000

Mẫu hỗn hợp

- Các píc tạp chất imidazol, triphenylmethanol, clotrimazol tách hoàn toàn khỏi píc clotrimazol tạp A

Hệ số chồng phổ UV của pic clotrimazol tạp A trong sắc kí đồ mẫu thử và

mẫu chuẩn bằng 1,000000

27

Mẫu chuẩn Mẫu thử

Hình 3.4: Sắc kí đồ m u trắng, m u thử, m u chuẩn, m u hỗn hợp

Hình 3.5: Kết quả xác định độ tinh khiết của pic clotrimazol tạp A

50 100 150 200 250

mAU 210nm,4nm (1.00)

28

Hình 3.6: Kết quả chồng phổ UV của pic clotrimazol tạp A

* Nhận xét: Kết quả trên sắc kí đồ của các dung dịch cho thấy, dung môi pha

mẫu và các tạp chất không ảnh hưởng đến píc clotrimazol tạp A Các píc chất

tinh khiết và tách rời nhau.Vậy, phương pháp đạt yêu cầu về độ đặc hiệu

 Độ thích hợp của hệ thống

Tiến hành sắc kí theo qui trình các dung dịch sau:

- Dung dịch chuẩn: Hòa tan 25,33 mg clotrimazol tạp A chuẩn vào bình định mức 50 ml Hòa tan và pha loãng bằng pha động vừa đủ thể tích Hút 1,0 ml dung dịch này, pha loãng bằng pha động thành 20,0 ml (0,025 mg/ml)

- Dung dịch phân giải: dung dịch có chứa hỗn hợp clotrimazol và clotrimazol tạp A có nồng độ 0,025 mg/ml mỗi chất trong pha động

- Tiến hành sắc kí dung dịch phân giải theo qui trình định lượng, ghi lại sắc

kí đồ, xác định hệ số phân giải giữa píc clotrimazol và píc clotrimazol tạp

A

- Tiến hành tiêm sắc kí lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn, ghi lại sắc kí đồ, xác định các thông số thời gian lưu, diện tích píc, số đĩa lý thuyết, hệ số kéo đuôi của píc chính, tính RSD của các thông số trên

Yêu cầu:

Kết quả: được thể hiện trong bảng sau

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống

Hình 3.7: Sắc kí đồ dung dịch phân giải

0 50 100 150 200 250 300 mAU

Hệ số đuôi

Số đĩa lí thuyết

(đĩa)

Hệ số phân giải

30

Nhận xét: Kết quả cho thấy hệ thống HPLC sử dụng cho sắc kí đồ có píc chất

phân tích gọn, cân đối, thời gian lưu và diện tích píc có độ lặp lại cao (RSD ≤ 0,3%) Như vậy, hệ thống sắc kí phù hợp để tiến hành phân tích định lượng

 Độ tuyến tính:

Tiến hành thực nghiệm như sau:

- Chuẩn bị 05 dung dịch chuẩn có nồng độ 12 µg/ml; 20 µg/ml; 25 µg/ml; 30 µg/ml và 37 µg/ml tương ứng với khoảng 50%; 80%; 100%; 120% và 150% nồng độ định lượng

Pha dung dịch gốc: cân 25,33 mg clotrimazol tạp A chuẩn vào bình định mức

50 ml Hòa tan và pha loãng bằng pha động vừa đủ đến vạch

Hút một lượng thích hợp dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức, pha loãng vừa đủ thể tích, mỗi khoảng nồng độ pha 3 mẫu riêng biệt theo bảng sau:

Bảng 3.4: Cách pha dung dịch thẩm định độ tuyến tính

31

Kết quả:

Khảo sát sự tương quan giữa y (diện tích pic) và x (nồng độ); kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic với hệ số tương quan r là 1,000 và % hệ số chắn bằng 0,8% Nồng độ định lượng nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát độ tuyến tính

y = 136563x + 27193 R² = 0.9999

1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000