Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
3.1.2. Thẩm định phương pháp phân tích
3.1.2.3. Tạp chất liên quan
Qui trình xác định tạp chất liên quan được tiến hành thẩm định trên các chỉ tiêu độ đặc hiệu, giới hạn phát hiện và sự phù hợp của hệ thống sắc kí.
Độ đặc hiệu: Tiến hành sắc kí các mẫu sau đây theo quy trình phân tích:
- Mẫu trắng: Dung môi pha mẫu
- Dung dịch thử: Dung dịch Clotrimazol tạp A nồng độ 0,5 mg/ml trong pha động.
- Dung dịch chuẩn: dung dịch Clotrimazol tạp A chuẩn nồng độ 0,5 mg/ml trong pha động.
- 3 dung dịch tạp chất đơn thành phần: dung dịch imidazole, dung dịch clotrimazol, dung dịch triphenylmethanol trong pha động.
- Dung dịch hỗn hợp: dung dịch chứa hỗn hợp clotrimazol tạp A và các tạp chất trong pha động với nồng độ clotrimazol tạp A 0,5 mg/ml, imidazole 1 àg/ml, clotrimazol 1 àg/ml, triphenylmethanol 1 àg/ml.
- Dung dịch phân hủy ở các điều kiện khác nhau: UV 254/365nm trong 24 giờ, H2O2 3% trong 5 giờ.
Yêu cầu:
- Sắc kí đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của các píc tạp chất.
- Sắc kí đồ của dung dịch mẫu hỗn hợp cho các píc clotrimazol tạp A, clotrimazol, triphenylmethanol, imidazol có thời gian lưu giống với thời gian lưu của các píc chất này trong sắc kí đồ của các dung dịch đơn thành phần. Các píc chất phải tách riêng rẽ với nhau. Các píc phải tinh khiết.
- Trên sắc kí đồ dung dịch thử, dung dịch chuẩn, dung dịch phân hủy nếu xuất hiện thêm các pic tạp thì phải tách hoàn toàn khỏi các píc của chất phân tích.
Kết quả:
40
- Sắc kí đồ của mẫu trắng, không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic chính và píc tạp chất.
- Sắc kí đồ của dung dịch mẫu hỗn hợp cho các píc imidazol, clotrimazol, triphenylmethanol, clotrimazol tạp A có thời gian lưu giống với thời gian lưu của các píc chất này trong sắc kí đồ đơn lẻ của các dung dịch imidazol, clotrimazol, triphenylmethanol, clotrimazol tạp A với thời gian lưu tương ứng là 2,9 phút; 8,1 phút; 8,8 phút và 10,8 phút. Các píc chất tách riêng rẽ với nhau. Các píc chất tinh khiết.
- Trên sắc kí đồ dung dịch thử, dung dịch chuẩn, dung dịch phân hủy: các pic tạp tách hoàn toàn khỏi các píc clotrimazol tạp A và dung môi, các píc chất tinh khiết. Dung dịch phân hủy 254nm/365nm xuất hiện thêm píc tạp chất ở thời gian lưu 6,6 phút. Dung dịch phân hủy H2O2/5 giờ xuất hiện thêm píc tạp chất ở 5,8 phút.
- Trên sắc kí đồ của dung dịch chuẩn xuất hiện píc tạp clotrimazol, dung dịch thử xuất hiện píc triphenylmethanol.
Mẫu trắng Mẫu triphenylmethanol
Mẫu Imidazol Mẫu Clotrimazol
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 min
-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
mAU 210nm4nm (1.00)
/2.653 /4.600
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min
0 100 200 300 400 500
mAU 210nm4nm (1.00)
/2.400 /2.663 /4.612 /8.053
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 min
0 50 100 150 200 250
mAU 210nm4nm (1.00)
2.892
1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 min
0 50 100 150 200 250 300
mAU 210nm,4nm (1.00)
3.172 8.835
41
Mẫu hỗn hợp
Mẫu chuẩn Mẫu thử
Phân hủy UV/24 giờ Phân hủy H2O2/5 giờ Hình 3.9: Sắc k đồ thẩm định độ đặc hiệu
Nhận xét: Hệ thống sắc kí có thể tách được các tạp chất imidazole, clotrimazol, triphenyl methanol và các tạp chất phân hủy ở các điều kiện khác nhau. Như vậy, phương pháp phân tích đạt yêu cầu về độ đặc hiệu.
Độ thích hợp của hệ thống
- Tiến hành phân tích dung dịch phân giải có chứa clotrimazol và clotrimazol tạp A trong pha động với nồng độ 0,025mg/ml từng chất.
- Dung dịch đối chiếu: clotrimazol tạp A trong pha động có nồng độ 2,5 àg/ml (tương ứng với hàm lượng 0,5% tạp chất).
- Ghi lại các SKĐ, xác định hệ số phân giải, tính giá trị RSD của thời gian lưu, diện tích píc chính, xác định các thông số T, N
2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min
0 10 20 30 40 50
mAU 210nm4nm (1.00)
/2.293 /2.459imidazol/2.781 /4.634 triphenylmethanol/8.122 clotrimazol/8.821 /10.866 /13.262 /14.894 /15.545 /17.018
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min
0 10 20 30 40
mAU 210nm,4nm (1.00)
/2.442/2.925/3.165 /3.814 /4.760 /6.267 /8.152 /8.828 /10.845 /16.774 /18.514
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 min
0 10 20 30 40 mAU
210nm4nm (1.00)
/2.355 /2.950/3.410 /4.175 /4.742 /8.151 /10.849 /14.792 /15.435 /16.754 /23.398 /25.672
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min
-5 0 5 10 15 20 25 30 35mAU
210nm,4nm (1.00)
/2.424 /2.668 /4.615 /6.669 /8.062 /10.787 /12.456
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 min
0 5 10 15 20 25 30
mAU 210nm,4nm (1.00)
/2.933 /4.734 /5.739 /5.858 /8.184 /10.850 /15.389 /16.794
42 Yêu cầu:
- Trên sắc kí đồ thu được từ dung dịch phân giải: Các thông số T, N phải đáp ứng yêu cầu: T ≤ 2,0; N ≥ 5000, hệ số phân giải giữa píc clotrimazol và píc clotrimazol tạp A không được nhỏ hơn 3.
- Trên sắc kí đồ của dung dịch đối chiếu: giá trị RSD của diện tích pic chính phải ≤ 2,0%, RSD% của thời gian lưu phải ≤ 1,0%
Kết quả: được thể hiện trong bảng sau
Bảng 3.14: Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống TT Thời gian
lưu (phút)
Diện tích píc (mAU.s)
Số đĩa lý thuyết
Hệ số kéo đuôi
Hệ số phân giải
1 10,054 717455 13416 1,175
5,633
2 10,067 718822 13405 1,177
3 10,057 715940 13442 1,176
4 10,061 714853 13451 1,175
5 10,043 714762 13419 1,176
6 10,061 715715 13427 1,174
T.bình 10,057 716258 13427 1,176
RSD (%) 0,1 0,2
Yêu cầu RSD ≤ 1,0% RSD ≤ 2,0% N ≥ 5000 T ≤ 2,0 R ≥ 3,0 Nhận xét: Phương pháp đạt yêu cầu về tính thích hợp hệ thống
Dung dịch đối chiếu Dung dịch phân giải Hình 3.10: Sắc kí đồ của dung dịch đối chiếu và dung dịch phân giải
LOD
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp 4 thành phần imidazole, triphenylmethanol, clotrimazol, clotrimazol tạp A trong pha động có nồng độ
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 min
0 10 20 30 40 50
mAU 210nm,4nm (1.00)
/2.428 /4.531 /10.043
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 min
0 50 100 150 200
mAU 210nm4nm (1.00)
/2.427 /4.593 /5.503 /7.548 clotrimazol/8.172 clotrimazol tap A/10.020 /11.506
43
từng thành phần thấp và giảm dần đến gần giá trị LOD. Tiến hành sắc kí lặp lại 2 lần với mỗi dung dịch và ghi lại sắc kí đồ, xây dựng phương trình hồi qui, xác định hệ số tương quan tuyến tính giữa nồng độ của từng chất và đáp ứng diện tích trung bình của pic thu được trên các sắc kí đồ.
Dựa vào độ lệch chuẩn của chênh lệch giữa đáp ứng thu được và đáp ứng theo đường chuẩn (σ), độ dốc của đường chuẩn (S) ở các nồng độ nằm gần giới hạn phát hiện, tính giới hạn phát hiện bằng công thức:
LOD = 3,3σ/S Trong đó:
σ: độ lệch chuẩn của đáp ứng S: độ dốc của đường chuẩn Kết quả:
Giới hạn phát hiện của tạp imidazol:
Dung dịch gốc: Cân 11,03 mg imidazol, hòa tan và pha loãng bằng pha động vừa đủ 100,0 ml, hút 1,0 ml dung dịch này pha loãng bằng pha động vừa đủ 100,0 ml. Cứ tiếp tục pha loãng dung dịch vừa thu được 2 lần để có dãy dung dịch cú nồng độ giảm dần từ khoảng 1àg/ml đến 0,05 àg/ml của imidazol.
Bảng 3.15: Giới hạn phát hiện của tạp imidazole
Nồng độ
(àg/ml) 1,10 0,55 0,28 0,14 0,07
Diện tích píc trung bình (mAu.s)
157902 82612 44614 25918 16829
Diện tích píc tính theo đường chuẩn (mAu.s)
157886 82530 44852 26013 16593
Độ lệch (mAu.s) 16 82 238 95 236
Phương trình hồi qui: y = 136638,8x + 7173,7
σ: 99,3 LOD: 0,002 àg/ml
44
Giới hạn phát hiện của tạp triphenylmethanol:
Dung dịch gốc: Cân 20,07 mg triphenylmethanol, hòa tan và pha loãng bằng pha động vừa đủ 100,0 ml, hút 1,0 ml dung dịch này pha loãng bằng pha động vừa đủ 100,0 ml. Cứ tiếp tục pha loãng dung dịch vừa thu được 2 lần để có dãy dung dịch cú nồng độ giảm dần từ khoảng 2àg/ml đến 0,1 àg/ml của triphenylmethanol.
Bảng 3.16: Giới hạn phát hiện của tạp triphenylmethanol
Nồng độ
(àg/ml) 2,01 1,00 0,50 0,25 0,13
Diện tích píc trung bình (mAu.s)
313791 158876 79176 38809 19421
Diện tích píc tính theo đường chuẩn (mAu.s)
314521 157373 78799 39512 19868
Độ lệch (mAu.s) 729,9 1502,8 377,3 703,1 447,1 Phương trình hồi qui: y = 156600,1x + 224,6
σ: 447,2 LOD: 0,009 àg/ml Giới hạn phát hiện của clotrimazol:
Dung dịch gốc: Cân khoảng 20,04 mg clotrimazol, hòa tan và pha loãng bằng pha động vừa đủ 100,0 ml, hút 1,0 ml dung dịch này pha loãng bằng pha động vừa đủ 100,0 ml. Cứ tiếp tục pha loãng dung dịch vừa thu được 2 lần để có dãy dung dịch cú nồng độ giảm dần từ khoảng 2àg/ml đến 0,1 àg/ml của clotrimazol.
45
Bảng 3.17: Giới hạn phát hiện của tạp clotrimazol
Nồng độ
(àg/ml) 2,00 1,00 0,50 0,25 0,13
Diện tích píc trung bình (mAu.s)
281520 141860 71079 34427 16803
Diện tích píc tính theo đường chuẩn (mAu.s)
282080 140903 70314 35020 17372
Độ lệch (mAu.s) 560 957 765 592 570
Phương trình hồi qui: y = 140895,8x – 275,0
σ: 171,7 LOD: 0,004 àg/ml Giới hạn phát hiện tính theo clotrimazol tạp A:
Dung dịch gốc: Cân khoảng 21,01 mg clotrimazol tạp A, hòa tan và pha loãng bằng pha động vừa đủ 100,0 ml, hút 1,0 ml dung dịch này pha loãng bằng pha động vừa đủ 100,0 ml. Cứ tiếp tục pha loãng dung dịch vừa thu được 2 lần để có dóy dung dịch cú nồng độ giảm dần từ khoảng 2àg/ml đến 0,1 àg/ml của clotrimazol tạp A.
Bảng 3.18: Giới hạn phát hiện của clotrimazol tạp A
Nồng độ
(àg/ml) 2,10 1,05 0,53 0,26 0,13
Diện tích píc
(mAu.s) 313523 156177 79235 38689 19070
Diện tích píc tính theo đường chuẩn (mAu.s)
313497 156633 78201 38985 19377
Độ lệch
(mAu.s) 26 456 1034 297 307
Phương trình hồi qui: y = 149323,2x – 230,9
σ: 374,7 LOD: 0,008 àg/ml
46
Hình 3.11: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ tạp chất và diện tích píc đáp ứng
y = 136638.81x + 7173.7 R² = 1
0 50000 100000 150000 200000
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20
diện tích píc (mAu.s)
nồng độ (àg/ml)
Imidazol
y = 156600.05x + 224.58 R² = 0.9999
0 100000 200000 300000 400000
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50
diện tích (mAu.s)
nồng độ (àg/ml
Triphenylmethanol
y = 140895.83x - 274.96 R² = 0.9999
0 100000 200000 300000
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50
diện tích (mAu.s)
nồng độ (àg/ml
Clotrimazol
y = 149323.23x - 230.94 R² = 1
0 100000 200000 300000 400000
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50
diện tích (mAu.s)
nồng độ (àg/ml)
Clotrimazol tap A
47 Đánh giá hệ số đáp ứng của các tạp chất:
Hệ số đáp ứng tương đối của tạp chất imidazol, triphenylmethanol, clotrimazol so với đáp ứng của clotrimazol tạp A được xác định bằng tỉ số giữa hệ số góc của phương trình hồi qui tuyến tính của tạp chất và hệ số góc của phương trình hồi qui tuyến tính của clotrimazol tạp A. Nếu hệ số đáp ứng tương đối trong khoảng 0,8 – 1,2; coi các tạp chất và clotrimazol tạp A có đáp ứng như nhau và có thể sử dụng diện tích của píc clotrimazol tạp A trong dung dịch đối chiếu làm chuẩn so sánh để xác định lượng tạp chất.
Kết quả được thể hiện trong bảng 3.19
Bảng 3.19: Kết quả đánh giá hệ số đáp ứng của các tạp chất
Thành phần Hệ số góc Hệ số đáp ứng tương đối
Imidazol 136638,8 0,92
Triphenylmethanol 156600,1 1,05
Clotrimazol 140895,8 0,94
Clotrimazol tạp A 149323,2 1,00
Độ ổn định
Độ ổn định của dung dịch đối chiếu:
Chuẩn bị dung dịch clotrimazol tạp A nồng độ 2,5 àg/ml. Tiến hành sắc kớ dung dịch này theo qui trình sau từng khoảng thời gian xác định và ghi lại sắc kí đồ. Tính giá trị RSD của diện tích píc sau các lần tiêm lặp lại, dung dịch đối chiếu được coi là ổn định khi giá trị RSD này nhỏ hơn 2,0%.
48
Bảng 3.20: Kết quả đánh giá độ ổn định của dung dịch đối chiếu Thời gian Diện tích píc (mAu.s)
Ngay sau pha 371736
Sau 30 phút 372405
Sau 1 giờ 369859
Sau 6 giờ 373014
Sau 11 giờ 370407
Trung bình 371484,2
RSD (%) 0,4
Độ ổn định của dung dịch thử:
Pha dung dịch thử tạp chất nồng độ 0,5 mg/ml trong pha động, tiêm vào hệ thống sắc kí sau mỗi khoảng thời gian xác định. Đánh giá số lượng tạp chất và tổng diện tích của các píc tạp chất trên sắc kí đồ thu được của dung dịch thử. Kết quả được thể hiện trên bảng sau.
Bảng 3.21: Bảng theo dõi độ ổn định kết quả tạp chất của dung dịch thử Thời gian Số lượng
píc tạp chất
Tổng diện tích píc tạp (mAu.s)
Hàm lượng tạp chất (%)
Sau khi pha 8 82764 0,11
2 giờ 7 70312 0,09
6 giờ 8 94679 0,13
12giờ 8 88040 0,12
Kết luận: dung dịch chuẩn đối chiếu và dung dịch thử ổn định trong khoảng thời gian khảo sát.
49 Thay đổi cột sắc kí:
Tiến hành xác định tạp chất theo qui trình, sử dụng cột sắc kí của hãng khác. Kết quả cho thấy kết quả tạp chất không khác nhau khi sử dụng cột của 2 hãng sản xuất khác nhau.
Bảng 3.22: Kết quả xác định tạp chất trên cột khác
Stt
Cột: Gemini (C18, 250*4,6mm, 5àm)
NSX: Phenomenex Diện tích đối chiếu:
370846 mAu.s
Xuất hiện 8 píc tạp chất
Cột: Nucleosil (C18, 250*4,6mm, 5àm)
NSX: Grace
Diện tích đối chiếu:
307665 mAu.s
Xuất hiện 8 píc tạp chất m (mg) Tổng Stạp
(mAu.s) HL (%) m (mg) Tổng Stạp
(mAu.s) HL (%)
1 25,02 82764 0,11 25,12 52991 0,09
2 25,06 70155 0,09 25,04 63490 0,10
3 24,99 70572 0,10 25,02 58460 0,10
Đạt Đạt
Kết luận: Quy trình phân tích tạp chất đạt yêu cầu về độ đặc hiệu, tính thích hợp của hệ sắc kí và giới hạn phát hiện để xác định giới hạn tạp chất trong (2- clorophenyl)diphenylmethanol.