Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích
- Tham khảo tài liệu kết hợp với thực nghiệm để xây dựng tiêu chuẩn chất lượng kèm theo yêu cầu chấp nhận, qui trình phân tích kiểm tra chất lượng của nguyên liệu sử dụng để thiết lập chuẩn cũng như trong đánh giá liên phòng, kiểm tra độ ổn định của tạp chuẩn (2-clorophenyl)diphenylmethanol.
Định tính: Sử dụng phương pháp IR, HPLC (so sánh với chuẩn USPRS)
18 Xác định độ tinh khiết:
+ Xác định tạp chất liên quan bằng phương pháp HPLC: xác định giới hạn tạp chất trong mẫu thử (2-clorophenyl)diphenylmethanol
+ Xác định nhiệt độ nóng chảy + Hàm lượng nước
Định lượng: Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector DAD, tiến hành song song với chuẩn gốc (2-clorophenyl)diphenylmethanol (USPRS).
Đối với phương pháp HPLC dùng trong định tính, xác định tạp chất và định lượng, nghiên cứu lựa chọn và tối ưu hóa các thông số về pha tĩnh, pha động, bước sóng phát hiện, thể tích tiêm, tốc độ dòng, cách chuẩn bị các dung dịch tiêm sắc kí, cách tiến hành (tiêm riêng rẽ hay tiêm lặp lại với từng dung dịch sắc kí, thời gian chạy sắc kí, cách kiểm tra sự phù hợp của hệ thống), đánh giá kết quả (căn cứ vào diện tích, chiều cao píc sắc kí, so sánh với đáp ứng của dung dịch đối chiếu),…
- Thẩm định phương pháp phân tích cho các phép thử định tính và định lượng, xác định giới hạn tạp chất bằng phương pháp HPLC với các chỉ tiêu như sau:
Bảng 2.1: Các chỉ tiêu thẩm định cho từng phép thử
Chỉ tiêu Định tính Định lượng Giới hạn tạp chất
Độ đặc hiệu + + +
Sự phù hợp của hệ
thống sắc kí - + +
Độ đúng - + -
Độ lặp lại - + -
Độ tái lặp - + -
LOD - - +
Độ tuyến tính,
khoảng xác định - + -
Ghi chú: (+): Thực hiện (-): Không thực hiện
19
Độ đặc hiệu: sử dụng chuẩn gốc để so sánh, đánh giá độ tinh khiết của píc, chồng phổ UV-VIS và đánh giá hệ số match. Sử dụng các mẫu thử có thể đánh giá khả năng phân tách trong sắc kí, đánh giá mức độ ảnh hưởng của các chất khác tới kết quả phân tích như dung dịch tự tạo có cho thêm các tạp chất có thể có của mẫu thử (2-clorophenyl)diphenylmethanol (imidazol, clotrimazol,…), dung dịch phân hủy ở một điều kiện khắc nghiệt,...
Sự phù hợp của hệ thống sắc kí: Đánh giá trên các chỉ tiêu số đĩa lý thuyết, độ phân giải, hệ số kéo đuôi, giá trị RSD diện tích của các lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn,...
Độ đúng: tiến hành áp dụng qui trình phân tích đối với chất chuẩn Clotrimazole related compound A USPRS đã biết hàm lượng. Xác định lượng Clotrimazol tạp A thu hồi theo đường hồi quy tuyến tính. Độ đúng được xác định dựa vào tỉ lệ thu hồi của chất chuẩn.
Độ lặp lại: Tiến hành phân tích tối thiểu 6 lần trên cùng 1 đối tượng mẫu thử, đánh giá độ lặp lại của kết quả hàm lượng thu được dựa vào giá trị RSD.
Độ tái lặp: So sánh kết quả phân tích thu được từ 2 phòng thử nghiệm khác nhau, sử dụng test T để đánh giá.
Giới hạn phát hiện: Dựa vào độ lệch chuẩn của đáp ứng và độ dốc của đường chuẩn.
Độ tuyến tính: Sử dụng mẫu chuẩn, quan sát đồ thị của tín hiệu đáp ứng với nồng độ của chất phân tích, xây dựng đường hồi qui tuyến tính dựa trên phương pháp bình phương tối thiểu và xác định hệ số tương quan tuyến tính.
Khoảng xác định: Được suy ra từ nghiên cứu độ đúng.
Độ ổn định: đánh giá độ ổn định của dung dịch chuẩn và dung dịch thử, dung dịch đối chiếu.
2.2.2. Điều chế nguyên liệu
Tiến hành điều chế tạp chất (2-clorophenyl)diphenylmethanol có độ tinh khiết cao để làm nguyên liệu thiết lập tạp chuẩn dựa vào qui trình đã tham khảo. Xác
20
định cấu trúc, đánh giá sơ bộ chất lượng nguyên liệu bằng phương pháp đo IR, NMR, điểm chảy, TLC. Sản phẩm sau tinh chế phải đảm bảo đủ số lượng (>10g) với độ tinh khiết > 95%.
- Điều chế (2-Clorophenyl)diphenylmethanol được điều chế từ clotrimazol theo phản ứng thủy phân trong môi trường acid.
Hình 2.3: Sơ đồ phản ứng điều chế (2-clorophenyl)diphenylmethanol Lựa chọn tiến hành theo phương pháp điều chế đơn giản, phù hợp với điều kiện hiện có tại phòng thử nghiệm theo qui trình của McNaughton - Smith: Cho 0,5 g clotrimazol vào dung dịch 2ml HCl 1,0M, đun hồi lưu trong 2 giờ, để nguội. Chiết bằng ethyl acetat 2 lần, mỗi lần với 10 ml. Cô loại dung môi thu được cắn (2-clorophenyl)diphenylmethanol.
- Tinh chế và thử độ tinh khiết sơ bộ:
Sử dụng phương pháp kết tinh lại bằng dung môi n-hexan. Kiểm tra độ tinh khiết sơ bộ bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng tiến hành trên bản mỏng Silica gel 60 F254 với hệ dung môi thích hợp, phát hiện vết dưới đèn tử ngoại 254 nm và đo nhiệt độ nóng chảy của nguyên liệu.
- Xác định cấu trúc, nhận dạng chất
Sản phẩm điều chế được khẳng định cấu trúc bằng các phương pháp phân tích phổ hiện đại: phổ hồng ngoại (nén viên KBr), phổ khối (MS) với chế độ ESI-MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR với chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS).
21 2.2.3. Thiết lập chất chuẩn
- Xây dựng quy trình thiết lập chất chuẩn: theo VKN/TT/21.20 "Thủ tục thiết lập và hiệu chuẩn chất chuẩn" của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, ban hành năm 2014 mô tả đầy đủ các bước thiết lập chuẩn, sử dụng phương pháp phân tích đã được xây dựng và thẩm định.
- Đánh giá nguyên liệu: tiến hành theo qui trình đã xây dựng
- Đóng lọ: trong Glove box có kiểm soát nhiệt độ, độ ẩm, nạp khí Nitơ + Số lượng: 200 lọ
+ 50 mg/ lọ
- Kiểm tra độ đồng nhất của quá trình đóng gói: Lấy mẫu ngẫu nhiên, tiến hành định lượng từng lọ và đánh giá kết quả.
- Đánh giá liên phòng: Tiến hành 2 lần thử nghiệm định lượng độc lập - Tập hợp và xử lý số liệu, hoàn thành hồ sơ
- Phê duyệt kết quả: ban hành chứng chỉ của chất chuẩn - Dán nhãn
- Đóng gói, bảo quản, phân phối
- Kiểm tra định kỳ: dự kiến 3 tháng/ lần đến khi thời gian thực hiện luận văn kết thúc, tiếp tục theo dõi độ ổn định theo qui định của "Thủ tục thiết lập và hiệu chuẩn chất chuẩn" - VKN/TT/21.20 (2014) của Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương
Quá trình thiết lập chuẩn: tiến hành theo qui trình đã xây dựng tại phòng thử nghiệm đạt tiêu chuẩn ISO/IEC 17025 và GLP, có hồ sơ đầy đủ theo qui định trong "Thủ tục thiết lập và hiệu chuẩn chất chuẩn" - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương.
22 2.2.4. Kiểm tra tạp chất của clotrimazol
Sử dụng chất chuẩn DĐVN (2-clorophenyl)diphenylmethanol đã thiết lập để kiểm tra chất lượng của nguyên liệu hoặc thành phẩm chứa hoạt chất clotrimazol, đối chiếu với kết quả thu được khi sử dụng chuẩn Clotrimazol related compound A USPRS.
23