TIỂU LUẬN TÌM HIỂU VỀ PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHẾT,

MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU .5 PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME PECTINASE 1.1 Khái niệm 1.2 Cơ chất Pectin 1.3 Phân loại pectinase 1.4 Đặc điểm pectinase CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT PECTINASE 13 2.1 Nguồn gốc thu nhận .13 2.2 Phương pháp nuôi cấy 13 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt 13 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy bề sâu 14 2.3 Tách làm 16 2.3.1 Phương pháp tách 16 2.3.1.1 Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề mặt 16 2.3.1.2 Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề sâu 17 2.3.2 Phương pháp tinh 19 2.3.2.1 Phương pháp kết tủa 20 2.3.2.2 Phương pháp thẩm tích .21 2.3.2.3 Kết tủa lực 21 2.3.2.4 Phương pháp sắc ký .22 2.3.2.5 Phương pháp lọc gel, màng 22 CHƯƠNG 3: XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CỦA PECTINASE 25 CHƯƠNG 4: CÁC ỨNG DỤNG CỦA PECTINASE .26 4.1 Tình hình ứng dụng enzyme thế giới .26 4.2 Ứng dụng công nghệ thực phẩm 26 4.2.1 Ứng dụng sản xuất nước rượu vang .26 4.2.2 Các ứng dụng khác lĩnh vực thực phẩm 26 4.3 Ứng dụng các ngành khác 33 KẾT LUẬN 35 LỜI MỞ ĐẦU Hiện nước ta thời kỳ phát triển mạnh, với xu hội nhập kinh tế quốc tế, ngành khoa học kỹ thuật dịch vụ ngày phát triển, theo ngành công nghệ thực phẩm bước cải tiến để cung cấp sản phẩm đầy đủ chất dinh dưỡng, đẹp mắt, tiện lợi đáp ứng nhu cầu ngày cao người Sử dụng enzyme sản xuất đời sống trở thành phổ biến ngành sản xuất thực phẩm mang lại lợi ích lớn Qua nhiều nghiên cứu gần cho thấy enzym pectinase ngày có nhiều ứng dụng quan trọng lĩnh vực sống, công nghiệp chế biến thực phẩm (như sản xuất rượu vang nước giải khát, sản xuất nước quả, sản xuất cà phê), y học, công nghiệp dệt sợi, sản xuất giấy, xử lý nước thải… Thế nhưng, thực tế việc ứng dụng pectinase sản xuất chiếm tỷ lệ khơng đáng kể Theo thống kê tình hình ứng dụng pectinase cơng nghiệp giới chiếm 3% tổng số enzym sử dụng , enzym có nhiều ý nghĩa sản xuất Ngày nay, người ta nghiên cứu tìm nguồn enzyme từ vi sinh vật phong phú đa dạng rẻ tiền Và ứng dụng rộng rãi ngành sản xuất khác Để hiểu sâu nguồn enzyme nhóm em thực đề tài tiểu luận “Nghiên cứu pectinase về phương pháp tách chiết, xác định hoạt độ và ứng dụng của pectinase” Vì thời gian hồn thành tiểu luận khơng nhiều, kiến thức cịn hạn chế nên khơng tránh khỏi sai sót, em kính mong nhận đóng góp ý kiến để báo cáo em hoàn thiện giúp em tiến làm tới PHẦN NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME PECTINASE 1.1 Khái niệm Enzim chất xúc tác sinh học khơng có ý nghĩa cho q trình sinh trưởng,sinh sản sinh vật mà cịn đóng vai trị quan trọng cộng nghệ chế biến thực phẩm,trong y học,trong kĩ thuật phân tích,trong công nghệ gen bảo vệ môi trường Pectinase enzyme phân hủy pectin, polysaccharide tìm thấy thực vật thành tế bào Thường gọi men pectic, chúng bao gồm pectolyase , pectozyme polygalacturonaza Pectinase bao gồm nhóm pectin -degrading enzyme , quan trọng polygalacturonaza Pectinase phá vỡ phiến kính trung gian tế bào thực vật , bao gồm pectin , cách thủy phân liên kết 1,4-α-Dgalactosiduron Các phiến kính tường hai tế bào, mà cytokinesis hình thành sau dày lên Nhiều vi sinh vật pectinase cho xuống cấp mô thực vật, nơi họ sinh sống, chẳng hạn nấm Aspergillus niger Một nghiên cứu nhiều sử dụng rộng rãi pectinase thương mại polygalacturonase Nó hữu ích pectin ma trận thạch giống giúp tế bào nhà máy xi măng với thành phần tế bào khác, chẳng hạn sợi cellulose, nhúng Vì enzyme pectinase thường sử dụng trình liên quan đến xuống cấp nguyên liệu thực vật, chẳng hạn đẩy nhanh tiến độ khai thác nước ép trái từ hoa Pectinase sử dụng sản xuất rượu vang từ năm 1960.Chức pectinase sản xuất bia hai lần, lần giúp phân hủy nhà máy (thường trái cây) vật chất giúp việc khai thác hương vị từ nghiền Thứ hai diện chất pectin rượu vang hoàn thành gây đám mây mây nhẹ, pectinase sử dụng để phá vỡ 1.2 Cơ chất Pectin Pectin polysaccarit có nhiều quả, củ thân Pectin polysaccharide dị thể, chủ yếu mạch gồm gốc acid –α–D–1,4 galacturonic, liên kết với liên kết 1,4–O glucozic gọi acid polygalacturonic hay acid pectic Pectine hòa tan tự nhiên ester metylic acid pectic Trong thực tế tất nhóm –COOH đường galactose bị metyl hóa (tạo ester metylic), mà đơi số nhóm –COOH bị decacboxyl hóa (khử CO 2), số nhóm –COOH thay -H kim loại, có lúc giữ nguyên dạng –COO Người ta cho protopectine hợp chất pectine araban, galactose hay tinh bột Trọng lượng phân tử từ 20.000 – 200.000 đvC Ở thực vật, pectin tồn ba dạng: pectin hoà tan, pectin acid và protopectin ♦ Pectin hoà tan là ester methylic của acid polygalacturonic pectin, tự nhiên có khoảng 2/3 nhóm carboxyl của polygalacturonic acid được ester hoá bằng methanol Pectin được ester hoá cao sẽ tạo gel đặc dung dịch acid và dung dịch đường có nồng độ 65% Enzyme pectinase tác động lên các hợp chất pectin có khối lượng phân tử khác và có cấu trúc hoá học không đồng dạng Cấu trúc hoá học bản của pectin là α-D-galacturonan hay α-D-galacturonoglycan, mạch thẳng có cấu tạo từ các đơn vị Dgalactopyranosyluromic acid (lien kết theo kiểu α-1,4) Mặt khác mức độ oxy hoá các phân tử polymer này cũng khác nhau, đó một số nhất định các nhóm carboxyl bị ester hoá bởi nhóm methoxyl Trong một số trường hợp chẳng hạn pectin củ cải đường, có sự ester hoá giữa các nhóm carboxyl và acetyl ♦ Pectinic acid là polygalacturonic acid có một phần tử nhỏ các nhóm carboxyl được ester hoá bằng methanol Pectinase là muối của pectinic acid Pectic acid là polygalacturonic acid đã hoàn toàn giải phóng khỏi một đơn vị galacturonic acid Pectate là muối của pectic acid ♦ Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan nước và có cấu tạo hoá học phức tạp Trong pectin có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và các ion Ca 2+, Mg2+, các gốc phosphoric acid, acetic acid và đường Protopectin bị thuỷ phân bằng acid thì giải phóng pectin hoà tan 1.3 Phân loại pectinase Theo chế tác dụng Pectinase chia làm hai loại chính: • Pectinemathyllestarase enzyme xúc tác thủy phân liên kết este phân tử pectine hay acid pectinic Khi tồn nhóm metoxyl bị tách khỏi chất sản phẩm tạo thành methanol acid polygalacturonic Sự thủy phân xảy liên kết este phân tử pectine acid polygalacturonic bị thủy phân phần hồn tồn • Polygalacturonase enzyme xúc tác thủy phân liên kết 1-4 glucozic phân tử pectine có nhiều polygalacturonase có tính đặc hiệu khác nhau: +Polymethulgalacturonase: enzyme tác dụng acid polygalacturonic metoxyl hóa, chia làm dạng nhỏ: * Endo-glucosidase-polymethylesterase kiểu I xúc tác thủy phân liên kết glucozic nội mạch phân tử acid polygalacturonic este hóa mức độ cao * Exo-glucosidase-polymethylesterase kiểu III: xúc tác thủy phân liên kết glucozic đầu mạch để tách gốc acid galacturonic khỏi phân tử pectine, khơng khử Enzyme có lực với gốc galacturonic metoxyl hóa +Polygalactuironase enzyme tác dụng chủ yếu lên axit pectic (acid polygalacturonic không bị este hóa) acid pectinic (các acid polygalactironic bị este hóa mức độ thấp) enzyme chia thành dạng nhỏ: * Endo–glucosidase-polygalacturonase kiểu II: xúc tác thủy phân liên kết glucozic mạch phân tử acid pectic acid pectinic Các enzyme tác dụng vị trí liên kết đầu nhóm cacboxyl tự * Exo- glucosidase- polygalacturonase kiểu IV: xúc tác thủy phân liên kết glucozit đầu mạch acid pectic acid pectinic Enzyme có lực với liên kết glucozic đầu mạch gần với nhóm cacboxyl tự Ngồi enzyme chủ yếu kể trên, tham gia phân giải hợp chất pectine cịn có: enzyme protopectinase xúc tác thủy phân protopectine khơng tan thành pectine hịa tan enzyme transeliminase xúc tác phân cắt hợp chất pectine đường khác đường thủy phân tạo thành galacturonit mạch ngắn với liên kết kép C4 C5 1.4 Đặc điểm Enzyme pectinase Pectinase thực vật Bên cạnh pectinase vi sinh vật, hầu hết các loại cho trái đều chứa enzyme PE Enzyme này thường tồn tại dưới nhiều hình thức khác nhau, nằm phần vỏ tế bào PE ở thực vật nói chung có hoạt độ tối ưu khoảng pH kiềm Các cation kim loại ở nồng độ thấp, Ca2+ chẳng hạn, có khuynh hướng làm tang nồng độ hoạt động của enzyme ● Pectinesterase Cà chua chứa hai loại PE Cả PE1 PE2 tăng giai đoạn đầu trình chín Khi bước vào giai đoạn chín, nồng đ ộ enzyme PE1 giảm xuống, PE2 tích luỹ dần trái có màu đặc trưng trái chín PE2 có khối lượng phân tử 23kD, pH tối ưu 7,6 Enzyme bị bất hoạt 50% sau phút đun 67 oC Các ion Ca2+ Na+ làm tăng hoạt độ enzyme lên tối đa nồng độ 0,005M 0,05M, theo thứ tự PE đậu nành protein có khối lượng phân tử 33kD, hoạt động tối ưu pH gần Polygalacturonic acid, sản phẩm hình thành trình để methyl hoá phân tử galacturonic acid Trong thịt chuối có hai isoenzyme PE Cả hai có khối lượng phân tử 30kD, có điểm đẳng điện khác nhau: 8,8 9,3 Các enzyme hoạt động pH tối đa 7,5 Hoạt độ enzyme tăng lên thêm vào dung dịch NaCl nồng độ 0,2M, đưa pH dung dịch 6,0 Các enzyme bị ức chế nhiều loại Polyol có khối lượng phân tử thấp, glycerol, sucrose, glucose, maltose galactose PE cam có hai loại: hai isoenzyme PE1 PE2 có khối l ượng phân tử 36,kD, có điểm đẳng điện khác - 10,05 11,0, theo thứ tự pH tối ưu PE1 7,6, PE2 8,0 Trong thành phần nhiều thịt khác chứa hai isoenzyem, hai enzyme có tính bền nhiệt hơn, cịn enzyme mẫn cảm bị tác động protease Độ ổn định enzyme liên quan đến mức độ glycosyl hoá phân tử enzyme Enzyme bền nhiệt enzyme cịn lại có khối lượng 51kD 36kD, theo thứ tự Các isoenzyme kiwi có khối lượng phân tử 57kD điểm đẳng điện 7,3 Tuy nhiên, chúng khác mức độ bền nhiệt ●Polygalacturonase Hầu hết nghiên cứu PG sở nguồn VSV PG thường tìm thấy phần tiết ngoại bào loài nấm vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn Sacchromyces gragilis, Aspergillus niger, Lactobacillus plantarum, Cochiliobolus carbonum, Neurospora crassa, loài Ascomycete, Phizopus arrchizus, Fusarium osyporum Tuy nhiên, thực tế, PG thực vật bậc cao nghiên cứu nhiều cà chua chín Các enzyme PG cà chua chín tồn hai dạng, hai endoenzyme.PG1 có khối lượng phân tử 84kD có khoảng 50% bị bất hoạt nhiệt độ78 0C PG2 có khối lượng phân tử 44kD có khoảng 50% bị bất hoạt 57 0C PG1 có độ ổn định tối đa pH 4,3, trái lại PG2 ổn định tối đa pH 5,6 Exo-PG thủy phân đầu không khử chuỗi polygalacturonic, tạo galacturonic acid sản phẩm thủy phân chiếm ưu thế.Sự thủy phân polymer bị gián đoạn tồn mạch nhánh chất Mức độ thuỷ phân tăng tỉ lệ với kích thước chất, đạt tối đa với mức polymer hoá 20 exo-PG cà rốt đào Hoạt động exo- enzyme làm tăng nhanh tạo thành nhóm khử làm tăng chậm độ nhớt dung dịch chất Sự phân hủy polyuronide q trình chín khơng gây tích lũy galacturonic acid, có endo-enzyme PG có liên quan Enzym pectinase từ vi sinh vật Nguồn giàu enzyme pectinase nấm mốc, nấm men, vi khuẩn Nấm mốc: penicillium glaucum, p.ehrlichii, p.chrysogenum, p.expanam, p.cilrimim, aspergillus awamori, a.foetidus, a.niger, a.terrus, a.saitoi, a.aureus, a.oryzae, a.wentii, fusarium moniliforme,… Nấm men: saccharomyces fragilis Vi khuẩn: bacillus polymyxa, flavobacterium pectinovorum, klebsiella aerogenes… Các lồi vi sinh vật thường có bề mặt tất loại quả, phận khác thực vật bị hư hỏng, thực vật chết, chúng loài vi sinh vật khác phá huỷ nhanh phận thực vật Người ta thường thu pectinase từ canh trường bề mặt từ canh trường bề sâu nấm mốc Các vi khuẩn nấm men tổng hợp enzime a.niger chủ yếu tổng hợp pectinnesterase con.diplodiella, pen.citrimin tạo chủ yếu polygalacturonase Nấm men sacch.fragilis dường tạo endopectintraseliminase Vi khuẩn bac.polymyxa, bac.species lại chủ yếu tạo transeliminase ●Pectinesterase Pectinesterase thu từ nguồn khác có giá trị pH tối ưu khác nhau: pH tối ưu pectinesterase từ nguồn nấm mốc 4,5 đến 5,5 chế phẩm loại bỏ enzime polygalacturonase có pH tối ưu từ 2,0 đến 6,5 Trái lại ph tối ưu pectinesterase từ nguồn thực vật thượng đẳng từ đến 7,5 – Nhiệt độ tối ưu pectinesterase từ nấm mốc 40 đến 450C.từ 55 đến 620C enzime bị vơ hoạt, nhiệt độ tối ưu enzime pectinesterase từ thực vật thượng đẳng cao hơn: từ 55 – 600C Pectinesterase nhận từ canh trường nấm mốc A.niger có nhiệt độ tối ưu 30 – 450C, pHopt = 4,5-5,5 bị vô hoạt 55- 620C từ thực vật pHopt=7,5-8 T0opt = 55-600C) khả hoạt động chúng phụ thuộc vào nguồn thu nhận, mức độ ester hoá pectin Ion natri đặc biệt ion canxi, chlorua Na, K Ca hoạt hóa pectinesterase từ nấm mốc conithyrium diplodiella từ A.niger trái lại cation hóa trị (thủy ngân nitrat, chì nitrat, nhơm sunfat sắt clorua) kìm hãm tác dụng pectinesterase Ngồi ra, người ta thu enzime pectinesterase trạng thái đông thể người ta xác lập n-axit cuối phân tử enzime phenylalanin Pectinesterase nấm mốc thủy phân trước nhóm methylester nằm hai nhóm carboxyl tự enzime thủy phân cắt liên kết ester dọc theo phân tử pectin hoạt động pectinesterase phụ thuộc nhiều vào mức độ ester hóa pectin tỷ lệ thuận vào mức độ ester hóa Chẳng hạn, tác động pectinesterase từ nấm mốc A.niger, cần thiết phải có pectin ester hóa mức độ cao khơng 70% ● Polygalacturonase Hầu hết nghiên cứu Polygalacturonase sở nguồn Vi sinh vật Polygalacturonase thường tìm thấy phần tiết ngoại bào loài nấm vi khuẩn gây bệnh, chẳng hạn như: saccharomyces fragilis, asperigillus niger, lactobacillus plantarum, cochlibolus carbonum, neurosrora crassa, loài ascomycete, rhizopus arrchizus fusarium oxysrorum pH tối ưu polygalacturonase khác nhau, phụ thuộc vào nguồn thu chất Chẳng hạn polygalacturonase dịch hóa (endopolygalacturonase) tác dụng acid pectinic ph tối ưu nằm khoảng từ 4,0 – 5,5 Cũng enzime tác dụng pectin lại có ph tối ưu khoảng 5,5 – Cịn polygalacturonase đường hóa tác dụng pectin ph tối ưu từ – tác dụng acid pectinic pH tối ưu cao vùng 4,4 - Các polygalacturonase chủ yếu bền vững vùng pH từ – Polygalacturonase đường hóa chủ yếu từ A.niger hoạt hóa thủy ngân bền vững pH= 2,5 Nhiệt độ tối ưu đa số polygalacturonase nằm khoảng từ 40 -450C.trong khoảng nhịệt độ đó, chúng thường bền vững, bị vơ hoạt hóa nhiệt độ 50 55 - 650C CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT PECTINASE 2.1 Nguồn gốc thu nhận • Từ thực vật: Pectinase có nhiều lá, than, củ thực vật như: củ khoai tây, củ cà rốt, táo, vỏ cam, vỏ bưởi… thực vật người ta thấy enzyme pectinsterase • Từ vi sinh vật: Nếu thực vật người ta thấy có loại enzyme vi sinh vật loại enzyme phong phú.Vi sinh vật phân giải pectine có mặt đại diện nấm mốc, nấm men, vi khuẩn như: + Nấm mốc: Asp.niger, Asp oryase, Asp.terreus, Asp.saito, Asp.japonicus… + Nấm men: sac.ellipsoideus, sac.fragilis, sac.ludwigii … + Vi khuẩn: Bac.polymixa, Bac.felseneus, Clostridium roseum… 2.2 Phương pháp nuôi cấy 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt Nuôi cấy nấm mốc số vi khuẩn theo phương pháp bề mặt để sản xuất enzyme thường dùng môi trường rắn, dùng môi trường lỏng Môi trường rắn thường nguyên liệu tự nhiên: cám mì, cám gạo, ngơ mảnh, bột đậu tương… Mơi trường lỏng thường mật rỉ đường, dịch thủy phân từ thóc mầm, nước bã rượu… có pha thêm muối khống Mơi trường lỏng dung để ni cấy nấm mốc theo phương pháp Môi trường rắn thường dùng cám, đặt biệt cám mì có tương đối đầy đủ chất dinh dưỡng làm ẩm tạo cấu trúc cần thiết cho nấm mốc phát triển, sinh nhiều enzyme Muốn nâng cao hoạt tính số enzyme cần thêm vào cám chất cảm ứng bã củ cải đường giàu pectine Trong nhiều trường hợp, để tạo khả thoáng khí tốt hơn, người ta thường cho thêm trấu với lượng khoảng 20 – 30% Để đảm bảo đủ chất dinh dưỡng mơi trường người ta bổ sung nguồn nitơ, phospho, kali chất dinh dưỡng (như mầm mạ, nước khoai tây, cao ngô…) Môi trường rắn cần làm ướt tới độ ẩm 60% Độ ẩm 58 – 60% độ ẩm tương đối thích hợp với nhiều mốc ni bề mặt khay hở, độ ẩm 60% vi khuẩn dễ dàng phát triển, dễ gây tạp nhiễm, khó thơng khí, cịn trường hợp độ ẩm môi trường 45 – 50% ni cấy mơi trường khơ nhanh, sinh bào tử mạnh làm giảm hoạt tính enzyme tạo thành Trong thời gian nuôi cấy nên 10 Thuật ngữ sắc ký dùng để kỹ thuật phân tích điều chế cho phép tách biệt hợp chất khác hỗn hợp Phép phân tích sắc ký dựa vào di chuyển khác pha động chất hoà tan gắn pha tĩnh trạng thái rắn Người ta thường chọn chất có khả kết gắn với chất định phân tách làm pha tĩnh Tương tác chất hoà tan pha tĩnh tương tác hấp phụ, tương tác trao đổi ion, tương tác kị nước, tương tác kiểu rây phân tử tương tác đặc hiệu sinh học Dựa vào kiểu liên kết người ta chia thành kiểu sắc ký sau:Sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion: liên kết ion., sắc ký lực (liên kết kỵ nước), sắc ký hấp phụ (liên kết yếu liên kết kỵ, nước, liên kết Van der Waals) Sắc ký lọc gel: Sắc ký lọc (sắc ký loại trừ không gian, loại trừ khuếch tán hay phương pháp loại trừ phân tử) cho phép phân đoạn số hỗn hợp protein theo khối lượng phân tử chúng Thực tế ngồi kích thước ra, hình dạng phân tử có ảnh hưởng Tuy nhiên thơng số bỏ qua protein hỗn hợp hình cầu Theo phương pháp này, loại gel nạp vào cột dùng để tách enzyme, phân tử tách dựa theo kích thước hình dạng chúng Pha tĩnh: hạt gel xốp chứa đầy cột Khi cho dung dịch protein chảy qua cột phân tử lớn hỗn hợp có đường kính lớn lỗ pha tĩnh, khuếch tán vào bên hạt nên bị loại trừ chúng khỏi cột với thể tích dịch rửa thể tích hạt gel (Vo) Các phân tử bé, ngược lại, khuếch tán tối đa vào torng hạt gel thể tích dịch rửa chúng tổng thể tích pha lỏng cột (V1) Cịn phân tử có kích thước trung gian khuếch tán hạn chế vào hạt, thể tích dịch rửa chúng lớn quãng đường (của chúng) vào bên hạt dài kích thước chúng nhỏ Phương pháp lọc gel thường ứng dụng để tách phân tử nhỏ muối vô phân tử nước thông qua cấu trúc mạng lưới sephadex Thường phương pháp làm tăng độ cô đặc giảm hiệu suất thu hồi sản phẩm phân tử protein bị kẹt lại hạt gel Sắc ký trao đổi ion: 20 Nguyên tắc: dựa tích điện phân tử protein Phương pháp trao đổi ion sử dụng rộng rãi sản xuất ezyme quy mơ cơng nghiệp Tính chất tích điện phân tử protein chịu ảnh hưởng nhiều giá trị pH, từ người ta chọn chất trao đổi anion hay cation Trong sắc ký trao đổi ion, việc gắn protein enzyme vào nhựa trao đổi ion phụ thuộc vào trạng thái ion hoá potein, trạng thái ion hoá nhựa trao đổi, pH, lực ion nhiệt độ Quá trình phân tách bao gồm hai giai đoạn: + Hấp thụ thuận nghịch protein-enzyme cần tinh (và protein có điện tích gần giống nhau) vào nhựa trao đổi ion + Khử hấp phụ ion hấp thụ Bằng cách thay đổi pH dịch rửa dẫn tới thay đổi ion hố thay đổi điện tích tổng protein Hoặc cách tăng lực ion tăng nồng độ ion đối cạnh tranh Các protein –enzyme có lực với nhựa trao đổi ion yếu bị đẩy trước tiên ngược lại 2.3.2.5 Phương pháp lọc gel, màng Chế phẩm enzyme pectinase sản xuất từ chủng nấm mốc Aspergillus niger mơi trường có chứa chất cảm ứng bột cà rốt sau 48 đạt hoạt độ cao 30,01(UI/g) Phân tích chế phẩm enzyme phương pháp lọc gel sử dụng cột Bio Gel P 30 thu peak có hoạt độ pectinase với tốc độ chảy qua cột 15ml/giờ có khả phân tách tạp chất tốt tốc độ 30 ml/giờ Tinh chế phẩm enzyme phương pháp lọc màng (cross flow membrane) với tốc độ bơm đầu vào 150rpm độ tinh (tăng 3,1 lần trước lọc) cao tốc độ 200rmp có độ tinh (chỉ tăng 2,2 lần so với trước lọc) Phân tích chế phẩm enzyme phương pháp lọc gel Bio Gel P 30 Hịa tan chế phẩm enzyme thơ đệm Mc Ilvaine pH 4,5 ly tâm bỏ cặn thu dung dịch enzyme sau hút 0,5ml cho chạy qua cột Bio Gel P 30 (0,8 x 30cm) (hãng Biorad – Mỹ) cân với đệm Mc Ilvaine pH 4,5 Tốc độ chảy qua cột 30ml/giờ 15ml/giờ Mỗi phân đoạn thu 2ml 1,5ml Đo độ hấp thu A phân đoạn bước song 280nm Vẽ đồ thị ghi nhận peak tạo thành xác định hiệu suất thu hồi enzyme hoạt độ tính tương ứng Tinh enzyme pectinase phương pháp lọc màng (cross flow membrane) 21 Tiến hành tủa enzyme từ 500ml dịch chiết thu ethanol 9600C, nhiệt độ tủa 40C, thời gian tủa Sau đó, ly tâm 5000 vịng/phút 15 phút thu enzyme thơ Hịa tan enzyme thơ 500ml dung dịch đệm Mc Ilvaine pH 4,5 Tiến hành lọc 500ml dung dịch enzyme vừa hòa tan hệ thống lọc QuixStand Benchtop Systems (hang Amersham Biosciences) với l ọc màng (membrane) có khoảng phân đoạn 50kDa Tốc độ bơm mẫu đầu vào 150rpm & 200rpm điều chỉnh cho áp suất bề m ặt màng không Psi Thu dịch qua lọc xác định hiệu suất thu hồi enzyme hoạt độ tương ứng 22 CHƯƠNG XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỢ CỦA PECTINASE Xác định hoạt tính pectinase tiến hành phương pháp sau đây: • Phương pháp nhớt kế: Độ nhớt dung dịch chứa pectine thay đổi sau thời gian bị pectinase tác dụng Độ nhớt đo nhớt kế, thơng qua thời gian dịch chuyển thể tích định dung dịch chứa pectine Sử dụng bình tam giác, bình cho vào 50ml dung dịch pectin 0.6% vào tủ ấm 50 độ C, thời gian 15 phút, sau cho enzyme vào với lượng từ 0.1-0.9 ml bổ sung nước cất cho đủ 1ml Duy trì mẫu nhiệt độ 50 độ C, thời gian 1h, sau làm lạnh xuống 2-3 độ C, lọc qua vải lần Lấy 5ml dung dịch nghiệm cho qua nhớt kế để đo độ nhớt thông qua thời gian chảy mẫu dung dịch chứa pectine đem thí nghiệm nói • Phương pháp đông chung(Cu-pectat): Nguyên tắc: thủy phân pectin tác dụng pectinase Sau dùng CuS04 5% để kết tủa axit pectin dạng đồng pectat(Cu-pectat) Hòa tan kết tủa NH4OH 25% Xác địng lượng đồng nhờ iốt Một đơn vị họat động pectinase theo phương pháp lượng emzyme có khả xúc thủy phân hết mg pectin thời gian điều kiện tiêu chuẩn • Phương pháp so màu: Theo phương pháp này: Một đơn vị họat động pectinase lượng emzyme có khả xúc tác thủy phân hết g pectine thời gian 1giờ thành acid galacturonic điều kiện tiêu chuẩn 23 CHƯƠNG CÁC ỨNG DỤNG CỦA PECTINASE 4.1 Tình hình ứng dụng enzyme thế giới Từ phát hiện enzyme và khả chuyển hoá của enzyme loài người đã tang nhanh quá trình sản xuất và ứng dụng enzyme công nghiệp Số lượng enzyme phát hiện ngày càng nhiều và số lượng enzyme được ứng dụng vào công nghiệp cũng ngày càng nhiều Số lượng enzyme được ứng dụng công nghiệp thực phẩm chủ yếu ở các nước châu Mỹ, châu Âu Trong năm qua, pectinaza sử dụng số quy trình cơng nghiệp thơng thường, chẳng hạn dệt may, chế biến sợi thực vật, trà, cà phê, khai thác dầu, xử lý nước thải công nghiệp, chứa nội dung pectinacious, làm việc tinh chế vi rút việc đưa giấy… 4.2 Ứng dụng công nghệ thực phẩm Trong sản xuất thực phẩm, người ta thường sử dụng các chế phẩm pectinase dưới dạng tinh khiết Tỉ lưởng chế phẩm pectinase cô đặc lượng nguyên liệu đem chế biến vào khoảng từ 0.03 – 0.05 đến 0.10% Pectinase thường được sử dụng các ngành công nghiệp thực phẩm sau: sản xuất rượu vang , sản xuất nước quả và nước uớng khơng rượu, sản xuất các mặt hàng từ quả: nước quả đặc, mứt , sản xuất nước giải khát, sản xuất cà phê và cà phê hòa tan… 4.2.1 Ứng dụng pectinase sản xuất nước rượu vang Trong sản xuất rượu vang, sản xuất nước nước uống khơng rượu, sử dụng pectinase cách hiệu Nhờ tác dụng pectinase mà trình ép, làm lọc dịch dễ dàng, làm tăng hiệu suất sản phẩm Chẳng hạn đưa pectinase vào khâu nghiền quả, làm tăng hiệu suất nước sau ép lên tới 15 – 25% Bởi lẽ có pectin khối nghiền có trạng thái keo, ép dịch khơng Nhờ pectinase phân giải chất pectin, làm chất chiết dịch bào dễ ngồi hơn, làm tăng hiệu suất chất chiết, dịch 24 suốt không bị vẩn đục lọc dễ dàng Không vậy, enzym pectinase cịn góp phần chiết rút chất màu, tanin chất hòa tan nữa, làm tăng thêm chất lượng thành phẩm Pectinase còn góp phần chiết rút được các chất màu, tanin và những chất hòa tan, làm tăng thêm chất lượng của sản phẩm Trong sản xuất các mặt hàng từ quả nhờ pectinase có thể thu được dịch quả có nồng độ đậm đặc Ví dụ: dịch táo cô đặc đến 72 độ Brix, nếu không tách các pectin tự nhiên thì sản phẩm sẽ bị keo tụ môt cách mạnh mẽ và không thể cô đặc thêm nữa,trong sản xuất cà phê, người ta dùng pectinaza dể tách lớp keo ở bề mặt hạt cà phê thay thế cho việc dùng vi sinh vật ♦ Các chế phẩm pectinase dùng sản xuất phải có yêu cầu sau: - Chế phẩm không làm giảm chất lượng vang, không gây ảnh hưởng xấu đến hương vị màu sắc sản phẩm; nghĩa chế phẩm phải làm tới mức tối đa khỏi tạp chất có ảnh hưởng xấu đến chất lượng vang - Chế phẩm đưa vào dịch hay bã nghiền để tăng cường trình sơ chế quả, tăng nhanh làm dịch, nâng cao tốc độ lọc, tăng hiệu suất chung đặc biệt hiệu suất phần tự chảy có chất lượng cao Đ ể tăng nhanh tốt trình làm dịch tương quan hoạt độ c enzym endo – PMG 55,0.102 đơn vị/mg protein chứa chế phẩm, enzym Cx 57,5 đơn vị/mg protein lít dung dịch Trong trường hợp khơng cần có mặt PE Nhưng hoạt độ endo – PMG chế phẩm 31,0.102 đơn vị/mg protein cần có mặt PE với hoạt độ 4,1 đơn vị/mg protein Trong sản xuất vang nho hàm lượng enzym endo – PMG va Cx phải có tương quan định Khi chế phẩm có hoạt độ endo – PMG 28,2.102 đơn vị/mg protein Cx 28,7 đơn vị/mgP trình làm xảy nhanh có hoạt độ endo – PMG 25,4.102 đơn vi/mg P Cx 55,0 đơn vị/mgP - Chế phẩm pectinase phải tăng độ ổn định vang nghĩa phải chứa enzym proteinase với hoạt độ không thấp 120 đơn vị/g theo globulin 140 đơn vị/g theo anbumin - Để tránh gây tổn thất chất màu cùa vang đỏ tránh xuất màu tối vang trắng hoạt độ enzym oxy hoá chế phẩm không vượt 0,1 đơn vị/mg axit ascorbic phút gam chế phẩm - Chế phẩm pectinase dùng 25 ... hưởng đến sinh tổng hợp enzyme pectinase 2.3 Tách làm 2.3.1 Phương pháp tách Có loại enzyme: nội bào ngoại bào, enzyme địi hỏi phải có phương pháp tách thu nhận riêng: Enzyme ngoại bào: (gồm pectinase)... Bac.polymixa, Bac.felseneus, Clostridium roseum… 2.2 Phương pháp nuôi cấy 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt Nuôi cấy nấm mốc số vi khuẩn theo phương pháp bề mặt để sản xuất enzyme thường dùng môi trường... Một đơn vị họat động pectinase theo phương pháp lượng emzyme có khả xúc thủy phân hết mg pectin thời gian điều kiện tiêu chuẩn • Phương pháp so màu: Theo phương pháp này: Một đơn vị họat động pectinase