nghiên cứu vi nấm và cách điều trị bệnh nấm trên cá

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN PHẠM MINH TRÚC NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH TRƢƠNG BÓNG HƠI TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VẶN TỐT NGHIỆP CAO HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2012 i TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THUỶ SẢN PHẠM MINH TRÚC NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH TRƢƠNG BÓNG HƠI TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VẶN TỐT NGHIỆP CAO HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN Ts TỪ THANH DUNG Ts PHẠM MINH ĐỨC 2012 ii LỜI CẢM TẠ Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ts Từ Thanh Dung Ts Phạm Minh Đức giúp đỡ, động viên tận tình hƣớng dẫn suốt thời gian triển khai thí nghiệm, phân tích phòng thí nghiệm hoàn thành luận văn tốt nghiệp Đồng thời tạo điều kiện thuận lợi hội học tập giúp nâng cao kiến thức Xin gửi lời cám ơn chân thành đến anh chị Bộ môn Sinh học Bệnh thủy sản nhƣ thầy cô Khoa Thủy sản lời khuyên quý báu hƣớng dẫn nhiệt tình trình học tập thực đề tài Cám ơn em sinh viên lớp Bệnh học thủy sản K34 giúp đỡ nhiệt tình suốt trình phân tích triển khai thí nghiệm khoa Chân thành cám ơn anh chị lớp Cao học Nuôi trồng thủy sản K17 bạn tạo điều kiện thuận lợi động viên trình học tập Cuối cùng, xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, mẹ chồng chia sẻ khó khăn, giúp đỡ, động viên tạo điều kiện tốt để học tập nghiên cứu trƣờng Xin chân thành cám ơn! i TÓM TẮT Nghiên cứu đƣợc tiến hành nhằm xác định tác nhân gây bệnh đặc điểm bệnh học bệnh trƣơng bóng cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) Tổng 59 cá bệnh thu từ 11 ao nuôi cá tra có dấu hiệu bóng trƣơng to, chứa chất dịch bọt khí Tất mẫu bóng đƣợc soi tƣơi dƣới kính hiển vi phân lập môi trƣờng GYA, sau ủ 28ºC từ 1-4 ngày cho nấm phát triển Dựa đặc điểm hình thái khuẩn lạc, sợi nấm, bào tử kích thƣớc sợi nấm, bào tử xác định đƣợc 49 chủng nấm phân lập thuộc giống Fusarium sp với tần suất xuất 100% Kết giải trình tự gen 28S rRNA cho thấy chủng vi nấm F1P2 F1P2-tái phân lập tƣơng đồng 100% với loài Fusarium oxysporum; F12P2 F12P2-tái phân lập tƣơng đồng 100% với loài Fusarium subglutinans Hai chủng vi nấm Fusarium sp F1P2 Fusarium sp F12P2 đƣợc chọn gây thí nghiệm cảm nhiễm Thí nghiệm đƣợc tiến hành với nhóm cá tra giống khỏe tiêm mật độ bào tử nấm khác nhóm cá đối chứng tiêm nƣớc muối sinh lý tiệt trùng với lần lặp lại Kết tỉ lệ biểu trƣơng bóng cá tiêm F1P2 mật độ 8x106 8x103 bào tử/ml lần lƣợt 46,67 3,33%; tiêm F12P2 mật độ 6x106 6x103 bào tử/ml lần lƣợt 13,33 0% Kiểm tra mô học quan mang, gan, thận, tỳ tạng bóng chủ yếu tƣợng xung huyết, xuất huyết, liên kết hoại tử nhiều vùng mô tế bào Đồng thời phát rải rác bào tử nấm hình thuyền mô bóng ii ABSTRACT The purpose of the study was to determine the causative agents and pathological characteristics of swim bladder inflammation disease on striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) In 59 diseased fish from difference farms with the clinical signs of listless swimming, swollen swim bladder with ascites and air-bubbles inside were collected and sampled All swimbladders of the diseased fish were examined fungus on microscopy before cultured on GYA medium, then incubated for 1-4 days at 28ºC Basing on the morphological characteristics, colony pigmentation, hyphae, conidiopores and conidia, all 49 fungal isolates were identified such as Fusarium sp Two Fusarium sp F1P2 and Fusarium sp F12P2 isolates were chosen for infection experiments The experiments were devided into groups of the healthy striped catfish fingerling Experimental fish were injected at the different concentrations of conidia suspension, and control group with saline sterilewater The experiments were done with triplicate Results showed that fish with swim bladder inflammation injected at high dose (8x106 conidia ml-1) and a low dose (8x103 conidia ml-1) of the Fusarium sp F1P2 isolate reached 46,67 and 3,33%, respectively While, the Fusarium sp F12P2 isolate with swim bladder inflammation at a high dose (6x106 conidia ml-1) and a low dose (6x103 conidia ml-1) reached 13,33 and 0%, respectively Most of infected fish in the experiments showed clinical signs as those in the natural infection Molecular techniques with 28S rRNA genes partial sequencing was used to identify the causative agents Fusarium sp was found as causative agent of the swim bladder inflammation disease on striped catfish Histopathologically, gill, liver, spleen, kidney and swim bladder tissue of infected fish were congestive phenomena, hemorrhage, cell necrosis appeared; and the presence of fungal conidia in swim bladder tissue iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam kết luận văn đƣợc hoàn thành dựa kết nghiên cứu kết chƣa đƣợc dùng cho luận văn cấp khác Cần thơ, ngày 27 tháng 12 năm 2012 Ký tên Phạm Minh Trúc iv MỤC LỤC Lời cảm tạ i Tóm tắt ii Abstract iii Lời cam đoan iv Mục lục v Danh sách bảng vii Danh sách hình viii Danh mục từ viết tắt ix CHƢƠNG I: ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung đề tài CHƢƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổ ng quan nghiên cƣ́u bê ̣nh nấ m động vật thủy sản 2.1.1 Cách tiếp cận nghiên cứu bệnh nấm 2.1.2 Bệnh nấm thƣờng gặp cá 2.1.3 Một số nghiên cứu bệnh liên quan đến Fusarium 2.2 Một số phƣơng pháp nghiên cứu bệnh nấm 2.3 Một số nghiên cứu bóng 2.3.1 Cấu trúc vai trò bóng 2.3.2 Cấu trúc bóng cá tra 2.3.3 Nghiên cƣ́u bệnh bóng động vật thủy sản 2.4 Những nghiên cứu mô học động vật thủy sản 12 CHƢƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Địa điểm thời gian thực đề tài 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu 15 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 15 3.3.1 Phƣơng pháp thu mẫu cá 15 3.3.2 Phƣơng pháp giải phẫu kiểm tra kí sinh trùng 16 3.3.3 Phƣơng pháp phân lập định danh nấm 16 3.3.4 Phƣơng pháp kiểm tra vi khuẩn cá tra trƣơng bóng 18 3.3.5 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm gây cảm nhiễm 19 v 3.3.6 Phƣơng pháp mô học 20 3.3.7 Phƣơng pháp xƣ̉ lý số liê ̣u 20 CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 4.1 Kết thu thập thông tin bệnh trƣơng bóng cá tra 21 4.1.1 Thông tin kỹ thuật nuôi 21 4.1.2 Tình hình bệnh trƣơng bóng cách xử lý ngƣời nuôi 22 4.2 Hiện trạng ao thu mẫu cá tra bệnh trƣơng bóng 23 4.3 Dấu hiệu bệnh lý cá tra bệnh trƣơng bóng 23 4.4 Kết kiểm tra kí sinh trùng cá tra bệnh trƣơng bóng 24 4.5 Kết kiểm tra vi khuẩn cá tra bệnh trƣơng bóng 25 4.6 Kết phân lập định danh nấm 25 4.7 Kết gây cảm nhiễm vi nấm Fusarium sp 29 4.7.1 Dấu hiệu bệnh lý 29 4.7.2 Mức độ nhiễm bệnh 30 4.8 Kết giải trình tự gen 28S rRNA 31 4.9 Biến đổi cấu trúc mô học cá tra bệnh trƣơng bóng 33 4.9.1 Mang 34 4.9.2 Gan 35 4.9.3 Thận, tỳ tạng 38 4.9.4 Bóng 40 CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Đề xuất 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC 50 vi DANH SÁCH BẢNG Bảng 4.1: Kết nhiễm kí sinh trùng cá tra bệnh trƣơng bóng 25 vii DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1: Phƣơng pháp nuôi nấm lam kính 18 Hình 4.1: Cá bệnh bơi lờ đờ tầng mặt 23 Hình 4.2: Bệnh lý cá trƣơng bóng 24 Hình 4.3: Khuẩn lạc nấm Fusarium sp môi trƣờng GYA sau ngày nuôi cấy 26 Hình 4.4: Đặc điểm hình thái Fusarium sp (F1P2): 27 Hình 4.5: Cá cảm nhiễm bơi mặt bể thăng ngửa bụng 29 Hình 4.6: Cá cảm nhiễm bóng trƣơng to 30 Hình 4.7: Tỉ lệ cá chết tích lũy sau 30 ngày cảm nhiễm chủng vi nấm Fusarium sp F1P2 Fusarium sp F12P2 30 Hình 4.8: Tỉ lệ trƣơng bóng nhiễm nấm thí nghiệm cảm nhiễm chủng vi nấm F1P2 F12P2 31 Hình 4.9: Kết tra cứu BLAST search chủng vi nấm F1P2 F1P2tái phân lập 32 Hình 4.10: Kết tra cứu BLAST search chủng vi nấm F12P2 F12P2- tái phân lập 33 Hình 4.11: Mang cá khỏe 34 Hình 4.12: Mang cá bệnh 35 Hình 4.13: Gan cá khỏe 35 Hình 4.14: Gan cá bệnh 37 Hình 4.15: Thận cá khỏe 38 Hình 4.16: Thận sau cá bệnh 39 Hình 4.17: Bóng cá khỏe 40 Hình 4.18: Bóng cá bệnh 42 viii PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phiếu thu thập thông tin thu mẫu Số TT Ngày thu mẫu: Họ tên ngƣời nuôi: Địa chỉ: Điện thoại: Loài cá: Tuổi hay cỡ cá: Trọng lƣợng (g): Chiều dài (cm): Chiều Cao (cm): Kích thƣớc ao: Dài (m): Rộng (m): Sâu (m): Kích thƣớc bè: Dài (m): Rộng (m): Sâu (m): Số lƣợng cá thả ao hay bè: Mật độ cá thả (con/m2, con/m3): Ngày thả cá: Nguồn giống: Vệ sinh, cải tạo ao/bè (có/không): Hóa chất sử dụng, liều lƣợng: Vôi: Thuốc tím: Các loại khác: Loại thức ăn: Ngày mua thức ăn: Thức ăn tƣơi sống: % thức ăn/trọng lƣợng thể: Tần số cho ăn: 50 Thức ăn chế biến: % thức ăn/trọng lƣợng thể: Tần số cho ăn: Nguồn nƣớc: Chất lƣợng nƣớc: Các tiêu môi trƣờng: pH: NH4+: Độ kiềm: Màu nƣớc ao hay bè: Có thay nƣớc hay không: Thời giant hay nƣớc: Ngày xuất bệnh: Số cá chết hàng ngày: Tăng/giảm: Dấu hiệu bệnh lý:  Bên ngoài: Hoạt động bơi lội: Màu sắc thể: Vết thƣơng da: Tập tính bắt mồi (bình thƣờng, giảm, bỏ ăn) (%): Hoạt động mang: Triệu chứng khác:  Bên trong: Có dịch nhầy xoang thể: Có dịch nhầy ruột: Màu sắc hình dạng gan, thận, tỳ tạng: Màu sắc hình dạng quan khác: Triệu chứng khác: 51 Ngày bắt đầu dung thuốc: Các loại thuốc sử dụng, liều lƣợng: Loại thuốc sử dụng có hiệu không: Hƣớng chẩn đoán: Đề nghị: Tên ngƣời thu mẫu 52 Phụ lục 2: Kết phân lập nấm kiểm tra vi khuẩn, kí sinh trùng Chủng nấm Đợt thu mẫu STT Trọng lƣợng Dấu hiệu Dấu hiệu 27/08/2011 Bến Tre Mật độ: 62con/m2 S: 6.000 m2 Cá bệnh sau tháng 350g Lờ đờ 750g Lờ đờ 750g Lờ đờ Bóng trƣơng to, nhiều dịch Bóng rƣơng to, nhiều dịch Xoan nội quan dịch vàng 800g 350g Bình thƣờng Lờ đờ Bình thƣờng Bóng trƣơng to, nhiều dịch 350g Lờ đờ F2P2 400g 450g Bình thƣờng Lờ đờ 500g Lờ đờ 380g Lờ đờ Bóng trƣơng to, nhiều dịch Bình thừơng Bóng trƣơng to, nhiều dịch Bóng trƣơng to, nhiều dịch Bóng trƣơng to, nhiều dịch 350g Lờ đờ F7P2 400g Lờ đờ 460g Lờ đờ Bóng trƣơng to, nhiều dịch Bóng trƣơng to, nhiều dịch Bóng trƣơng to, 2/11/2011 Cần Thơ Mật độ: 60 con/m2 S: 6.000 m2 Cá bệnh sau 2,5 tháng 53 Chủng vi khuẩn F1P1 F2P1 F1P2 F4P2 F5P2 F6P2 F9P2 A2C1 Loài kí sinh trùng CĐN KST Trichodina Dactylogyrus Ichthionyctus Trichodina Ichthionyctus Trichodina Dactylogyrus 2 1 Trichodina Ichthionyctus Dactylogyrus Trichodina Ichthionyctus 1 Trichodina Dactylogyrus Trichodina Ichthionyctus Dactylogyrus Ichthionyctus Trichodina Ichthionyctus Trichodina Ichthionyctus Trichodina Dactylogyrus 5 01/02/2012 Cần Thơ Mật độ: 50 con/m2 S: 4.000 m2 Cá bệnh sau tháng 05/02/2012 Cần Thơ Mật độ: 50 con/m2 S: 6.000 m2 Cá bệnh sau 2,5 tháng 10 370g Lờ đờ 11 400g Lờ đờ 12 450g Lờ đờ 13 300g Lờ đờ 250g Lờ đờ 900g Lờ đờ 900g Lờ đờ 900g Lờ đờ 850g Lờ đờ 950g 280g Bình thƣờng Bình thƣờng 300g 330g Bình thừơng Lờ đờ 400g Lờ đờ 350g Lờ đờ 380g Lờ đờ nhiều dịch Bóng trƣơng to, nhiều dịch F10P2 Trichodina Dactylogyrus Ichthionyctus Bóng trƣơng to, nhiều dịch Bóng trƣơng to, nhiều dịch Bóng trƣơng to, nhiều dịch Bóng trƣơng to, nhiều dịch F11P2 Trichodina F12P2 Dactylogyrus F13P2 Trichodina F1P3 Bóng trƣơng to, nhiều dịch Bóng trƣơng to, nhiều dịch Bóng trƣơng to, nhiều dịch Bóng trƣơng to, nhiều dịch Bình thƣờng Xoan nội quan mùi thối Bình thƣờng Bóng trƣơng to, nhiều dịch Bóng trƣơng to, nhiều dịch Bóng trƣơng to, có dịch Bóng trƣơng to, F2P3 Trichodina Ichthionyctus Dactylogyrus Trichodina 1 Dactylogyrus Trichodina Ichthionyctus Trichodina Dactylogyrus 3 Trichodina Dactylogyrus Ichthionyctus Dactylogyrus Ichthionyctus Trichodina Trichodina 2 54 F3P3 F4P3 F5P3 F3P4 F4P4 F5P4 05/02/2012 Cần Thơ Mật độ: 50 con/m2 S: 6.000 m2 Cá bệnh sau 2,5 tháng 05/02/2012 Cần Thơ Mật độ: 50 con/m2 S: 6.000 m2 Cá bệnh sau 2,5 tháng 22/02/2012 An Giang Mật độ: 50 con/m2 S: 3.000 m2 Cá bệnh sau 400g 380g Bình thƣờng Lờ đờ 300g Lờ đờ 350g Lờ đờ 400g Lờ đờ 380g Lờ đờ 400g 300g Bình thƣờng Lờ đờ 320g Lờ đờ 200g Lờ đờ 200g Lờ đờ 180g Lờ đờ 500g 700g 650g Bình thƣờng Bình thƣờng Lờ đờ 500g Lờ đờ 200g Lờ đờ có dịch Bình thƣờng Bóng trƣơng có dịch, dịch vàng xoan bụng Bóng trƣơng, có dịch Bóng trƣơng, có dịch Bóng trƣơng, có dịch Bóng trƣơng, có dịch Bình thƣờng Bóng trƣơng, có dịch Bóng trƣơng to, có dịch Bóng trƣơng, có dịch Bóng trƣơng, có dịch Bóng trƣơng, có dịch Bình thƣờng Bình thƣờng Bóng trƣơng, có dịch Bóng trƣơng, có nhiều dịch Bóng trƣơng, 55 Dactylogyrus Trichodina Ichthionyctus Dactylogyrus Ichthionyctus Trichodina Dactylogyrus F6P5 Ichthionyctus Trichodina F2P6 Dactylogyrus Ichthionyctus Trichodina Dactylogyrus 1 Trichodina F5P6 Dactylogyrus F6P6 Ichthionyctus F3P7 Trichodina Ichthionyctus 2 Dactylogyrus F2P5 F3P5 F3P6 F4P7 F5P7 2,5 tháng 22/02/2012 An Giang Mật độ: 50 con/m2 S: 3.000 m2 Cá bệnh sau 2,5 tháng 15/03/2012 Cần Thơ Mật độ: 50 con/m2 S: 6.000 m2 Cá bệnh sau tháng 18/03/2012 Cần Thơ Mật độ: 50 con/m2 S: 6.000 m2 Cá bệnh sau 300g Lờ đờ 460g Lờ đờ 300g 350g Bình thƣờng Lờ đờ 450g Lờ đờ 500g Lờ đờ 400g Lờ đờ 500g 250g Bình thƣờng Lờ đờ 450g Lờ đờ 300g Lờ đờ 400g Lờ đờ 400g 470g Bình thƣờng Lờ đờ 500g Lờ đờ 300g Lờ đờ có dịch Bóng trƣơng, nhiều dịch Bóng trƣơng, có dịch Bình thƣờng Bóng trƣơng, có dịch Bóng trƣơng, có dịch Bóng trƣơng, có dịch Bóng trƣơng, có dịch Bình thƣờng Bóng trƣơng, có dịch Bóng trƣơng, có dịch Bóng trƣơng, có dịch Bóng trƣơng, có dịch Bình thƣờng Bóng trƣơng, có dịch Bóng trƣơng, có dịch Bóng trƣơng, 56 F6P7 F7P7 F2P8 F4P8 F5P8 F2P9 F4P9 F5P9 F3P10 F4P10 Trichodina Dactylogyrus Trichodina Dactylogyrus 1 Trichodina Ichthionyctus Dactylogyrus Trichodina Dactylogyrus Trichodina Dactylogyrus 1 1 Trichodina Ichthionyctus Trichodina Dactylogyrus Ichthionyctus Dactylogyrus Ichthionyctus Trichodina Dactylogyrus Ichthionyctus 2 1 1 Ichthionyctus Trichodina Dactylogyrus Ichthionyctus Trichodina Ichthionyctus 1 tháng 08/04/2012 Đồng Tháp Mật độ: 56 con/m2 S: 4.000 m2 Cá bệnh sau tháng 500g Lờ đờ 480g Lờ đờ 500g 400g 560g Bình thƣờng Bình thƣờng Lờ đờ 300g Lờ đờ 400g Lờ đờ 350g Lờ đờ 470g Lờ đờ 560g Lờ đờ 400g Lờ đờ có dịch Bóng trƣơng, có dịch Bóng trƣơng, có dịch Bình thƣờng Bình thƣờng Bóng trƣơng, có dịch Bóng trƣơng, có dịch Bóng trƣơng, có dịch Bóng trƣơng, có dịch Bóng trƣơng, có dịch Bóng trƣơng, có dịch Bóng trƣơng, có dịch 57 F5P10 Trichodina Dactylogyrus Trichodina F5P11 Dactylogyrus Ichthionyctus Trichodina 1 F6P11 Ichthionyctus F7P11 Dactylogyrus F8P11 Trichodina Dactylogyrus Ichthionyctus 2 F6P10 F4P11 F9P11 A11C4 A11C9 Phụ lục 3: Thuốc – hóa chất sử dụng xử lý bệnh trƣơng bóng ngƣời nuôi Ao STT Thuốc – hóa chất Liều lƣợng Cách dùng Hiệu Không hết bệnh Chlorine 50% 1ppm Hòa tan tạt mặt ao Sulfamethoxazole 1g/kg thức ăn Trộn vào thức ăn 1g/kg thuc ăn Trộn vào thức ăn Amoxicillin Vimenro 1ml/2kg thức ăn Trộn vào thức ăn Vitamin C 100g/3 cá Trộn vào thức ăn Chlorine 1ppm Hòa tan tạt mặt ao Enrofloxacine 1g/2kg thức ăn Trộn vào thức ăn Kanamicine 1g/kg thức ăn Trộn vào thức ăn Chlorine ppm Hòa tan tạt mặt ao Sortbitol 2g/1kg thức ăn Trộn vào thức ăn Chlorine ppm Hòa tan tạt mặt ao Sortbitol 2g/1kg thức ăn Trộn vào thức ăn 1 58 Không hết bệnh Không hết bệnh Không hết bệnh Không hết bệnh Chlorine ppm Hòa tan tạt mặt ao Sortbitol 2g/1kg thức ăn Trộn vào thức ăn Yucca 2,5kg/1.000m3 ngày/1lần Muối 300 kg Tạt khắp ao Vôi 450 kg Tạt khắp ao Chlorin 1,5 ppm Tạt khắp ao Vitamin C 1g/2kg thức ăn Trộn vào thức ăn Sorbitol 2g/kg thức ăn 100g/10 cá Trộn vào thức ăn 7 Methionine Không hết bệnh Trộn vào thức ăn Yucca 2,5kg/1.000m3 ngày/1lần Muối 300 kg Tạt khắp ao Vôi 450 kg Tạt khắp ao Chlorin 1,5 ppm Tạt khắp ao Vitamin C 1g/2kg thức ăn Trộn vào thức ăn Sorbitol 2g/kg thức ăn 100g/10 cá Trộn vào thức ăn 59 Không hết bệnh Trộn vào thức ăn Không hết bệnh 10 11 Methionine Chlorine ppm Hòa tan tạt mặt ao Sortbitol g/1kg thức ăn Trộn vào thức ăn Chlorine ppm Hòa tan tạt mặt ao Sortbitol g/1kg thức ăn Trộn vào thức ăn CuSO4 0,5 ppm Tạt khắp ao Rifamicine 1g/2kg thức ăn Trộn vào thức ăn Sulfamethoxazole 1g/1kg thức ăn Trộn vào thức ăn 60 Không hết bệnh Không hết bệnh Không hết bệnh Phụ lục 4: Phƣơng pháp phân tích mô học Xử lý mẫu: Mẫu cá sau cố định đƣợc cho vào khuôn đựng mẫu đƣợc xử lý máy tự động Tisue processing (MICROM, STP 120-2) qua 12 bƣớc nhƣ sau: Hóa chất Thời gian (phút) Cồn 70o 15 Cồn 80o 15 o Cồn 95 15 Cồn 95o 15 Cồn 100o 15 o 20 Cồn 100o 15 Xylen 20 Xylen 30 Paraffin:xylen (1:1) 40 Cồn 100 Paraffin : Sáp ong (5:5) 80 Paraffin : Sáp ong (7:3) 20 Quá trình đúc khối Mẫu đƣợc đặt định hƣớng khung cố định inox, cho paraffin nóng chảy 65oC vào (tỉ lệ paraffin : sáp ong 7:3) Để đảm bảo mẫu đƣợc giữ vị trí cho khuôn đúc qua khu vực làm lạnh nhanh để cố định Cho paraffin vào đầy khuôn đặt cassette có kí hiệu mẫu lên khuôn Sau mẫu mô vùi vững vào paraffin làm rắn paraffin lại cách đặt khuôn tủ lạnh, sau tách khối paraffin khỏi khuôn Cắt mẫu Sử dụng máy microtome để cắt mẫu, lát cắt dày 4µm Mẫu đƣợc cắt thành băng dài cho vào chậu nƣớc nóng 45 – 50oC để paraffin căng ra, dùng kim mũi giáo nhẹ nhàng tách riêng đoạn mẫu đạt yêu cầu Dán mẫu lên lame Sử dụng dung dịch keo Mayer’s albumin để dán mẫu Thoa dung dịch keo lên lame, đặt đầu lame vào chậu nƣớc ấm nghiêng gốc 45o nâng từ từ lên, lát cắt đƣợc dán chặt vào phiến kính Sau dán, làm khô phiến cách cách sấy khô nhiệt độ 45 – 50 oC 61 Nhuộm mẫu Qui trình nhuộm mẫu (Harris’s Haematoxylin & Eosin) Hóa chất Thời gian (phút) Xylen Xylen o Cồn 100 o Cồn 95o Cồn 90oC Cồn 65oC Nƣớc máy Haematoxylin Nƣớc máy 1% acid lcohol Nhúng lần Nƣớc máy Potassium Eosine Cồn 100 Nƣớc máy o Cồn 90 o Cồn 95o Cồn 100o Xylen 10 Cồn 65 Dán kính vào lame Nhỏ giọt keo Enterlan phủ lên phiến kính, dán kính lên phiến kính có chứa giọt keo vùng có mẫu mô Kỹ thuật cần làm nhanh để tránh xâm nhập nƣớc không khí vào mẫu mô Đọc kết Tiêu đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi, xem diện tác nhân gây bệnh xác định nhƣ gây ảnh hƣởng mẫu mô đồng thời xác định tỉ lệ cảm nhiễm chúng quan 62 Phụ lục 5: Khóa phân loại Fusarium sp (de Hoog et al., 2000) 1a Khuẩn lạc đạt đƣờng kính 2cm sau 7-10 ngày, đại bào tử có nhiều vách ngăn (1-4 vách ngăn 1b Khuẩn lạc có đƣờng kính vƣợt 2cm, thƣờng 4-8cm 7-10 ngày 2a Đại bào tử có chiều dài đạt 55µm, xuất bào tử vách dày F aquaeductuum 2b Đại bào tử có chiểu dài 25 µm, có bào tử vách dày 3a Đại bào tử cong nhiều nhọn đỉnh, xuất bào tử vách dày dimerum F 3b Đại bào tử cong nhọn đỉnh, bào tử vách dày F tabacinum 4a Tiểu bào tử không có, khuẩn lạc màu vàng nâu đến nâu, cuống sinh bào tử phát triển mạnh F incarnatum 4b Nhiều tiểu bào tử 5a Tiểu bào tử dạng chuỗi 5b Tiểu bào tử không thành chuỗi 6a Tiểu bào tử sinh từ cuống sinh bào tử có hình dạng đơn thể bình 6b Tiểu bào tử sinh từ cuống sinh bào tử có hình dạng đa thể bình đơn 7a Xuất tiểu bào tử tƣơng tự trái cà chua trái chanh F napiforme 7b tiểu bào tử tƣơng tự trái cà chua trái chanh F verticillioides 8a Không có bào tử vách dày F proliferatum 8b Có nhiều bào tử vách dày F nygamai 9a Xuất nhiều cuống sinh đa bào tử 10 9b Không có cuống sinh đa bào tử 13 10a Khuẩn lạc màu đỏ, có nhiều bào tử vách dầy, túi bào tử chiếm ƣu .F chlamydosporum 10b Khuẩn lạc màu hồng màu rƣợu vang đến tím, bào tử vách dày, túi bào tử 11 11a Tiểu bào tử đƣợc sinh từ cuống bào tử sợi nấm bò lan nằm ngang bề mặt môi trƣờng, thƣờng vách ngăn, có hình trứng hình elip hẹp F sacchari 63 11b Các tiểu bào tử sinh từ cuống bào tử thẳng đứng 12 12a Các tiểu bào tử hình lê xuất F anthophilum 12b Không có tiểu bào tử hình lê F subglutinans 13a Các tiểu bào tử thể bình ngắn mọc bên, khối đại bào tử có màu cam, tế bào chân riêng biệt, khuẩn lạc màu trắng tới tía màu vàng nâu tới cam gốc cụm cuống bào tử xuất F oxysporum 13b Các tiểu bào tử thể bình đơn dài, đại bào tử với tế bào chân không riêng biệt, khuẩn lạc trắng kem hoạc xanh dƣơng đến xanh lục gốc cụm cuống bào tử xuất F solani 64 [...]... xác định tác nhân gây bệnh và đặc điểm bệnh học bệnh trƣơng bóng hơi trên cá tra (Pangasinodon hypophthalmus) Từ đó cung cấp dữ liệu cho những nghiên cứu về biện pháp phòng và trị bệnh 1.3 Nội dung đề tài - Thu thập thông tin và thu mẫu bệnh trƣơng bóng hơi trên cá tra - Phân lập và định danh tác nhân gây bệnh trƣơng bóng hơi trên cá tra - Gây cảm nhiễm và đặc điểm mô học cá tra bệnh trƣơng bóng hơi... (Yanong, 2003) Các dấu hỉệu cá bị nhiễm EUS thể hiện trên thân, đầu, vây và nắp mang với các vết bị ăn mòn màu đỏ, sau đó lan thành các vết loét rộng kèm theo rụng vây, xuất huyết và làm chết cá (Lilley et al., 1998) Một số loài cá và trứng đƣợc ghi nhận bị nhiễm Aphanomyces nhƣ: cá chẽm, cá lóc, cá gai, cá vàng, cá mòi dầu, nhóm cá sặc và trứng cá hồi (Royo et al., 2004) Trên GYA, khuẩn lạc nấm Aphanomyces... với 59 mẫu cá bệnh và 14 cá khỏe Các mẫu gan, thận và bóng hơi đƣợc tiến hành phân lập trên GYA Kết quả phân lập nấm trên gan, thận, bóng hơi lần lƣợc là 67; 54,2 và 83,1% Từ các mẫu nấm cấy từ cá tra bệnh trƣơng bóng hơi phân lập đƣợc 49 chủng nấm chiếm 83,1% Các chủng nấm đƣợc kiểm tra hình dạng, kích thƣớc và tốc độ phát triển trên môi trƣờng GYA, PDA Khi kiểm tra đặc điểm khuẩn lạc nấm và tốc độ... liên quan đến dịch bệnh trên cá bống mú và cá chép, tác giả sử dụng phƣơng pháp mô học để xác định những thay đổi vi thể trên các cơ quan khi bị vi khuẩn tấn công Kết quả nghiên cứu cho thấy lớp biểu mô da bị thoái hóa, vẩy bị mất lớp bì và trung tâm các bó cơ bị xuất huyết, hoại tử và các tế bào bị sƣng vi m Trên thận và tỳ tạng xuất hiện các vùng mô tạo máu bị hoại tử rải rác ở các trung tâm hoại... đƣợc tìm thấy trên cá rô đồng bệnh nấm nhớt với tỷ lệ 30% (Trần Ngọc Tuấn, 2010) và trên cá lóc 14,3% (Lƣ Trí Tài, 2010) 2.2 Một số phƣơng pháp nghiên cứu bệnh nấm Hiện nay, ngoài phƣơng pháp nghiên cứu truyền thống dựa vào các dấu hiệu bệnh lí và đặc điểm về hình thái, sinh hóa của nấm phân lập thì phƣơng pháp sinh học phân tử đang có xu hƣớng đƣợc ứng dụng và phát triển mạnh (Atkins và Clark, 2004)... sinh trên cá, các sợi nấm tập trung thành búi nhƣ bông bên ngoài cơ thể ký chủ và phát triển rất nhanh với hình thức sinh sản bằng các túi động bào tử đƣợc hình thành trên đầu mút các sợi nấm hoặc sinh sản hữu tính bằng cách tiếp hợp giữa túi noãn và các túi giao tử đực (Kabata, 1985) Bệnh nấm thủy mi thƣờng đƣợc ghi nhận trên các loài cá chép Cyprinus carpio, trê trắng Clasrias batrachus, trê vàng... Hatai, 1997) 4 Nấm Saprolegnia là tác nhân cơ hội gây bệnh ở cá chép Cyprinus carpio, cá lóc Chanos chanos và cá Odonthetes bonariensis (ở Nhật bản (Kitancharoen et al., 1995) S diclina nhiễm trên trứng cá chép ở Thái Lan (Chukanhom và Hatai, 2004), S salmonis sp nhiễm ở cá hồi O nerka (Hussein và Hatai, 1999) Branchiomyces nhiễm trên cá hồi O mykiss, cá hồi cẩm thạch, cá chó, cá chép, cá chình Nấm Branchiomyces... tụy đều cho thấy sự gia tăng của các đại thực bào sắc tố Supranee và Robert (1999), vi t tài liệu về bệnh cá và mô học ở cá bệnh lở loét (EUS) Tác giả miêu tả dấu hiệu bệnh lý và những thay đổi cấu 12 trúc tế bào của đối tƣợng nhiễm bệnh Do cá bệnh lở loét có nhiều tác nhân sơ cấp và cơ hội xâm nhập gây bệnh (nấm, vi khuẩn) nên tác giả đã chia thành 5 dạng biểu hiện của bệnh tƣơng ứng với từng dạng sẽ... LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài Đề tài đƣợc thực hiện tại các phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản – Khoa thủy sản – Trƣờng Đại học Cần Thơ và phòng xét nghiệm Nam Khoa – Biotek – Thành phố Hồ Chí Minh Thời gian: Từ 15/08/2011 đến 25/05/2012 3.2 Vật liệu nghiên cứu Mẫu cá bệnh: tổng 73 cá tra (200-900g) gồm 14 cá khỏe và 59 cá bệnh thu tại các ao... Tổ ng quan về nghiên cƣ́u bênh ̣ nấ m trên động vật thủy sản 2.1.1 Cách tiếp cận nghiên cứu bệnh nấm Bệnh nấm đƣợc chẩn đoán bằng cách quan sát tiêu bản tƣơi, phân lập và định danh dựa vào đặc điểm hình thái qua quá trình sinh sản vô tính và hữu tính của nấm phân lập đƣợc Phƣơng pháp phân lập và nuôi cấy nấm trên môi trƣờng thạch thƣờng đƣợc ứng dụng nhƣ sau: cắt một phần nhỏ mẫu bệnh phẩm làm tiêu