Đề cương nghiên cứu sinh lý động vật

Năm 2001, A.Basu và cộng sự thuộc Viện Sinh hóa Ấn độ đã cập nhật, tổng hợp, đánh giá tác động gây đột biến, ung thư của arsenic (As) và các hợp chất của nó lên người và động vật. 8Năm 2003, V.M. Rodr´ıguez và cộng sự đã tổng hợp các nghiên cứu về ảnh hưởng As lên hệ thống thần kinh, bao gồm thần kinh ngoại biên, thần kinh trung ương, sự dẫn truyền thần kinh và sự phát triển của thần kinh trung ương ở động vật. 19

NỘI DUNG

1 Tổng quan

1.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Năm 2001, A.Basu và cộng sự thuộc Viện Sinh hóa Ấn độ đã cập nhật, tổng hợp, đánh giá tác động gây đột biến, ung thư của arsenic (As) và các hợp chất của nó lên người và động vật [8]

Năm 2003, V.M Rodr´ıguez và cộng sự đã tổng hợp các nghiên cứu về ảnh hưởng As lên hệ thống thần kinh, bao gồm thần kinh ngoại biên, thần kinh trung ương,

sự dẫn truyền thần kinh và sự phát triển của thần kinh trung ương ở động vật [19] Năm 2007, Akshata và cộng sự tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của As với nồng

độ thấp (2 và 10ppb) lên hệ thống miễn dịch của cá Ngựa vằn Đây là nồng độ an toàn trong nước uống Kết quả cho thấy lượng virus tăng khoảng 50 lần, lượng vi khuẩn tăng ít nhất 17 lần trong phôi cá Đối với nhóm nhiễm virus, khi phôi tiếp xúc với As, biểu hiện của interferon và mRNA MX giảm tương ứng 13 và 1,5 lần Đối với nhóm nhiễm khuẩn, phôi nhiễm As có sự biểu hiện hoạt động của interleukin - 1β giảm 2,5 lần, hoạt động của yếu tố gây hoại tử khối u (TNF-α) giảm 4 lần Biểu hiện của các cytokine cần thiết cũng bị hạn chế khi bị nhiễm As Như vậy, dù phôi cá bị nhiễm As ở nồng độ thấp cũng làm ức chế khả năng miễn dịch bẩm sinh Kết quả này minh chứng thêm rằng cá Ngựa vằn được xem là mô hình duy nhất cho các nghiên cứu về độc học miễn dịch [9]

Năm 2009, Micheli Rosa de Castro và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của As đến khả năng học tập (sự hình thành trí nhớ ngắn hạn và trí nhớ dài hạn) trên cá Ngựa vằn Đầu tiên, tập luyện cho cá một phản ứng có điều kiện tránh lại tác động có hại bằng việc bơi từ vùng sáng sang vùng tối; sau đó, cho chúng tiếp xúc với arsenic ở ba nồng độ khác nhau là 1, 10 và 100 µg/l Tiếp theo, nhóm đã sử dụng một thiết bị đặc biệt dùng để đo khả năng phản ứng của cá Đồng thời, tách lấy não của cá nhiễm As ở ba nồng độ thí nghiệm để tiến hành phân tích sinh hóa Kết quả cho thấy khả năng ảnh hưởng của As lên khả năng học tập và trí nhớ của cá Cơ chế gây

hại chung của As là tăng sự oxy hóa protein trong não, đồng thời gây hại đến DNA của

tế bào [16]

Năm 2009, Juliane Ventura-Lima và cộng sự đã gây nhiễm As cho cá Ngựa vằn trưởng thành với ba nồng độ 1, 10, 100µg/l trong 48 giờ Kết quả cho thấy As làm xáo trộn khả năng chống oxy hóa của mang cá bao gồm làm tăng glutathione (GSH), ligase glutamate cysteine (GCL) tại nồng độ 10 và 100 µg/l, tương ứng; khả năng tiêu thụ oxy thấp hơn đáng kể khi cá bị nhiễm As ở nồng độ 100 µg/l [14]

Cùng năm này, Dan Li và cộng sự nghiên cứu sự phát triển ở giai đoạn phôi của

cá Ngừa vằn khi nhiễm As Phôi cá ngựa vằn cho phơi nhiễm trong các nồng độ sodium arsenite (0-10mM) giữa 4 đến 120 giờ sau thụ tinh (hpf) Sự sống và phát triển sớm của phôi bị ảnh hưởng không rõ ràng ở nồng độ arsenite dưới 0,5mM Tuy nhiên, phôi nhiễm ở nồng độ cao biểu hiện rõ sự giảm tỉ lệ sống và phát triển bất thường bao gồm chậm thoát nang, chậm phát triển và thay đổi hình thái Thay đổi trong sự phát triển thần kinh bao gồm phản ứng xúc giác với ánh sáng (2 – 5mM, 30hpf), dị dạng cột sống và rối loạn vận động của sợi trục thần kinh (2mM, 48hpf) Chức năng của tim cũng bất thường như giảm nhịp tim (0,5-2mM, 60hpf) và bất thường hình dạng của tâm thất (2mM, 48hpf) Hơn nữa, bất thường trong sinh sản tế bào và chết theo chương trình (2mM, 24 và 48hpf) cũng như bất thường trong metyl hóa DNA (2mM, 24 và 48hpf) được phát hiện khi phôi bị nhiễm arsenite Tất cả điều này cho thấy As ảnh hưởng rất xấu đến bộ gen của phôi động vật có xương sống [11]

Năm 2012, Celine de Esch và cộng sự đã tóm tắt những tiềm năng của cá Ngựa vằn trong việc dùng làm mô hình để sàng lọc ngộ độc thần kinh và nghiên cứu cơ chế tác động của các chất độc hại nhờ các xét nghiệm sinh hóa và quan sát ở mức độ cấu trúc và chức năng của từng cá thể [10]

Năm 2013, Gabriel O Vachon thuộc đại học Maine phát hiện rằng phơi nhiễm As làm tăng biểu hiện của gen p21 - ảnh hưởng đến quá trình lão hóa của tế bào và hệ thống miễn dịch [12]

Từ một số công trình đã được trình bày ở trên, có thể thấy cá Ngựa vằn đang ngày càng trở thành mô hình động vật cho các nghiên cứu về sinh lí, sinh hóa, tế bào học

Thực tế cũng cho thấy các nghiên cứu liên quan đến đối tượng này liên tục được công

bố trên các trang Web và sách báo, tạp chí uy tín trên thế giới Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có công bố nào nghiên cứu ảnh hưởng của As lên sự phát triển liên tục các giai đoạn của cá Ngựa vằn

1.2 Các nghiên cứu trong nước

Năm 2009, Phan Kim Ngọc và cộng sự, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp

Hồ Chí Minh đã tạo thành công cá phát sáng do cấy ghép gen GFP bằng kĩ thuật bắn gen [6]

Năm 2011, Nguyễn Thị Hạnh Tiên thuộc Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I

và cộng sự thuộc Trường Đại học Ghent - Bỉ, đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình kết nối các đốt sống và tạo dị tật xương sống ở cá Ngựa vằn Các mẫu cá được nhuộm màu cho sụn và xương để xác định dị tật Kết quả theo dõi cho thấy ở nhiệt độ 32oC, cá bị dị tật ở đốt sống phần trước và đầu xương cột sống; ở nhiệt độ 20oC có sự kết nối giữa đốt sống PU2 với PU3, PU3 với đốt sống đuôi 7 cuối cùng Như vậy, nhiệt độ có thể là nguyên nhân ảnh hưởng đến quá trình nối các đốt sống và tạo dị tật trên cá Ngựa vằn [17]

Năm 2012, Nguyễn Thị Thương Huyền và cộng sự đã tiến hành đánh giá tác động của cadmium lên quá trình phát triển thông qua tỉ lệ sống, chết của phôi cá Ngựa vằn ở các giai đoạn phát triển Đồng thời, nhóm đã khảo sát ảnh hưởng của cadmium lên nhịp tim và quẫy mình của phôi ở các nồng độ 0,1; 1; 5; 10; 20, 50 và 100µg/L Kết quả cho thấy đây vẫn chưa là nồng độ gây chết, nhưng chúng làm tăng nhịp tim và giảm số lần quẫy mình của phôi [4]

Năm 2013, Nguyễn Thị Thương Huyền và cộng sự tiến hành khảo sát hàm lượng Cadmium tích tụ trên cơ thể cá Ngựa vằn với các nồng độ: 0µg/l, 1µg/l, 5µg/l, 10µg/l, 20µg/l, 50µg/l trong 3 tháng Kết quả cho thấy hàm lượng Cd tích tụ trên toàn cơ thể và từng phần có xu hướng tỉ lệ thuận theo nồng độ Hàm lượng Cd tích tụ trong các mô giảm theo thứ tự sau: nội quan > xương > cơ, cụ thể hàm lượng này lần lượt là 10,813

± 0,263 mg/kg đạt giá trị cao nhất ở nồng độ 50µg/l; 2,053 ± 0,031 mg/kg và 0,607 ±

0,015 mg/kg đạt giá trị cao nhất khi cá được gây độc ở nồng độ 20µg/l [5]

Năm 2014, Trần Thị Phương Dung và cộng sự đã đánh giá tác động của Chì lên quá trình phát triển phôi cá Ngựa vằn ở các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100 µg/l Kết quả cho thấy tác động của chì làm tăng nhịp tim ở giai đoạn phôi, tăng thời gian thoát nang, giảm tỉ lệ thoát nang, tăng tỉ lệ biến dạng hệ xương Cũng trong năm này, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Thương Huyền và cộng sự đã đánh giá ảnh hưởng của Chì lên sự sống cá Ngựa vằn giai đoạn ấu trùng Kết quả cho thấy trong các nồng độ chì khảo sát, nồng độ 40µg/l là ngưỡng ảnh hưởng đến tỉ lệ sống của ấu trùng; trong cùng một nồng

độ khảo sát, sau ngày nuôi thứ 6 và thứ 7 có ảnh hưởng rõ đến tỉ lệ sống của ấu trùng; đặc biệt nhóm đã lập được phương trình tiên đoán tỉ lệ sống của ấu trùng cá Ngựa vằn theo ảnh hưởng tương tác của nồng độ ion Pb2+ và thời gian nuôi [3]

2 Mục đích nghiên cứu

2.1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong những năm gần đây, sự phát triển các ngành công nghiệp, giao thông vận tải, chăn nuôi cùng với sự gia tăng dân số làm cho môi trường sống ngày càng bị ô nhiễm bởi các chất độc hại đặc biệt là các kim loại nặng Các kim loại nặng rất khó loại

bỏ bằng các biện pháp xử lý nước thải thông thường Nếu nước sinh hoạt bị nhiễm kim loại nặng cao hơn mức cho phép sẽ dẫn đến nguy cơ mắc nhiều loại bệnh hiểm nghèo như ung thư, tim, mạch, gan… Vì thế, vấn đề nghiên cứu và bảo vệ môi trường nói chung và môi trường nước nói riêng đã trở thành mối quan tâm hàng đầu của nhiều quốc gia và tổ chức thế giới

Arsenic là một trong những nguyên tố kim loại nặng nguy hiểm đối với con người

và động vật thủy sinh Khi tích tụ trong cơ thể, arsenic gây tác hại nghiêm trọng đến nhiều hệ cơ quan như thần kinh, tuần hoàn, tiêu hóa, sinh sản … và cả ung thư, hay gặp nhất là ung thư da Theo thống kê của Bộ Y tế, hiện 21% dân số Việt Nam đang dùng nguồn nước nhiễm arsenic vượt quá mức cho phép và tình trạng nhiễm độc arsenic ngày càng rõ rệt và nặng nề trong dân cư [19] Việc nghiên cứu tác động của arsenic lên sự sống sinh vật đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu Ở Việt Nam, việc đánh giá tác động của arsenic chủ yếu bằng các phương pháp hóa lí, chưa có sự

đánh giá một cách chính xác lên sự phát triển của các động vật thủy sinh, nhất là động vật có xương sống

Hiện nay, các nghiên cứu về ảnh hưởng của kim loại nặng lên động vật thủy sinh

đang được quan tâm Trong đó, cá Ngựa vằn - Danio rerio được sử dụng làm đối tượng

thí nghiệm phổ biến vì chúng có nhiều ưu điểm như vòng đời ngắn; dễ nuôi; phôi lớn, trong suốt, phát triển nhanh; kích thước phù hợp cho việc nuôi với số lượng lớn và bộ gen có những tương đồng với con người Đặc biệt, cá Ngựa vằn phù hợp với điều kiện khí hậu ở Việt Nam nên không cần đến các trang thiết bị hỗ trợ trong nuôi dưỡng như máy sưởi, đèn chiếu sáng theo chu kì

Vì những lý do trên, đề tài: “Đánh giá tác động của Arsenic lên sự phát triển

mô hình cá Ngựa vằn - Danio rerio (Hamilton, 1822)” được tiến hành.

2.2 Mục đích nghiên cứu

- Đánh giá những tác động của Arsenic lên quá trình phát triển cá Ngựa vằn

(Danio rerio) ở các giai đoạn phôi, ấu trùng và sau ấu trùng đến 3 tháng tuổi khi nuôi

trong môi trường Hanks;

- Xác định hàm lượng nhiễm Arsenic ở cá trưởng thành tại các nồng độ khảo sát

3 Đối tượng nghiên cứu

Cá Ngựa vằn (Danio rerio) trong độ tuổi sinh sản (từ 4 tháng tuổi), có sức sống

tốt, sạch bệnh để làm nguồn cung cấp đối tượng thí nghiệm:

- Phôi cá Ngựa vằn ở các giai đoạn phân chia khác nhau (1-72 giờ);

- Cá ấu trùng sau 144 giờ;

- Cá trưởng thành sau 3 tháng nuôi

4 Các phương pháp nghiên cứu

4.1 Phương pháp ổn định điều kiện sống của cá

- Cá Ngựa vằn được mua từ cửa hàng bán cá cảnh Thùy Dung, đường Lưu Xuân Tín, phường 10, quận 5, thành phố Hồ Chí Minh

- Cá đực và cá cái được nuôi riêng và ổn định theo chu kỳ sáng – tối: 14h sáng – 10h tối cho tới khi đạt giai đoạn thành thục sinh dục

- Cá Ngựa vằn thích nghi với môi trường nước tương đối sạch, cần dọn bể thường xuyên trước khi cho ăn để tránh nhiễm bệnh cho cá Bể nuôi cần được thay nước thường xuyên (khoảng 2 ngày thay một lần) Khi thay nước chú ý không thay toàn bộ

số nước, chừa lại khoảng 1/3 số nước Cá được cho ăn vừa phải, chia làm nhiều lần trong ngày (2 đến 3 lần), lượng thức ăn đảm bảo cá ăn hết trong 5 phút để tránh nhiễm bẩn môi trường nước do thức ăn thừa

4.2 Phương pháp phối cá và thu phôi

Cá được ghép theo tỉ lệ 1 đực : 2cái , tách riêng bởi vách ngăn trong suốt và được giữ trong tối 10 tiếng Trước khi thu phôi, mở đèn và tháo vách ngăn để cá giao phối với nhau Khi đó con đực đuổi theo con cái trong vài phút Sau khi phối 3 – 5 phút, bắt riêng cá bố mẹ sang bể mới và kiểm tra sơ bộ dưới đáy bể phối để biết chắc chắn có phôi Phôi cá được thu bằng ống siphon Lần lượt loại bỏ các phôi bị hư và rửa phôi cho vào các đĩa petri thủy tinh sạch (ɸ35mm), mật độ 20 phôi/đĩa để ấp phôi Phôi tốt

và ấu trùng mới nở được nuôi trong điều kiện nhiệt độ duy trì là 28 – 29oC, pH duy trì

là 7 – 8 Thao tác rửa và phân loại phôi được tiến hành nhanh chóng

4.3 Phương pháp gây nhiễm phôi với các nồng độ Arsenic khảo sát

- Chuẩn bị các cốc thủy tinh thể tích 300ml chứa môi trường Hanks phôi bổ sung Arsenic tương ứng các nồng độ khảo sát: 0; 20; 50; 80; 110; 140; 170; 200; 230; 260µg/l

- Quan sát dưới kính hiển vi soi nổi, chọn ra các phôi tốt nhất ở cùng giai đoạn (1 đến 128 tế bào) cho vào bể Mỗi nồng độ cho 30 phôi và lặp lại 3 lần

- Quan sát hình thái, sức sống và theo dõi tỉ lệ sống của phôi trong mỗi giai đoạn phân chia

4.4 Phương pháp đánh giá sự phát triển của phôi ở các nồng độ khảo sát

Sự phát triển của phôi, tỉ lệ sống chết, phôi biến dạng được quan sát bằng kính hiển vi soi nổi hoặc kính hiển vi đảo ngược

Phương pháp đếm nhịp tim và số lần quẫy mình

Dùng máy chụp hình (canon) quay phim hoạt động của các phôi, cài đặt trong 1 phút dưới kính hiển vi đảo ngược ở vật kính x10 Nhịp tim và tần số quẫy mình được

đếm trong 1 phút, mỗi nồng độ được thực hiện ngẫu nhiên trên 5-10 phôi Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Phương pháp đánh giá quá trình thoát nang

Đếm số phôi thoát nang trong tổng số phôi sống ở giai đoạn hầu họng (Pharyngeal), quan sát một số biến đổi bất thường của phôi làm cho phôi không thoát nang được và xác định tỉ lệ thoát nang

4.5 Phương pháp gây nhiễm Arsenic cho cá bột và chăm sóc

- Chuẩn bị môi trường Hanks cho các nồng độ khảo sát, bảo quản trong các lọ

thủy tinh để dung dịch không bị biến tính và dễ sử dụng

- Chuẩn bị bể nuôi để chuyển cá bột 7 ngày tuổi sang môi trường Hanks với các

nồng độ khảo sát: bể thủy tinh chuyên dụng kích thước 17cm x 18cm x 29cm, mỗi bể chứa 2 lít môi trường Hanks Trong bể cho thêm rong Đuôi chó (2 nhánh nhỏ, đồng đều giữa các bể) để làm thức ăn cho cá và tạo môi trường nuôi Bố trí bể nuôi ở nơi có ánh sáng vừa phải Trong bể nuôi, có gắn thêm máy sục khí để cung cấp lượng oxy cần thiết Máy hoạt động 24/24 giờ Trên miệng bể nuôi có tấm chắn để tránh các động vật khác rơi vào hoặc vào bể ăn cá và tránh cá nhảy ra ngoài

- Chuyển cá bột sang môi trường mới

Phôi nở sau 3 ngày, trong suốt quá trình này không cần cho cá ăn Sang ngày thứ

4, cho cá ấu trùng ăn phiêu sinh vật (có trong rong) Cá bột giai đoạn ấu trùng có tính nhạy cảm cao nhất trong vòng đời cá (Hwang và cs, 1995) Do đó sức sống của cá bột

từ 1 – 7 ngày tuổi (trước khi chuyển sang bể nuôi lớn) được theo dõi và ghi nhận sau mỗi 24 giờ để đánh giá độ nhạy cảm và mức nồng độ nào Arsenic gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến cá nhất, kết hợp với những quan sát về tỉ lệ sống ở giai đoạn phôi và những dị dạng quan sát được

Cá bột 7 ngày tuổi được nuôi trong bể kính nhằm hạn chế sự chênh lệch nhiệt độ giữa môi trường nước nuôi và môi trường bên ngoài Cá được nuôi theo chu kì sáng tối

là 14 giờ: 10 giờ Đo pH và nhiệt độ nước 2 lần/ngày Thường xuyên theo dõi độ ẩm và nhiệt độ phòng nuôi

Chín ngày sau khi cá nở, cá được cho ăn kết hợp động vật phiêu sinh và ấu trùng

có trong rong Khi ấu trùng lớn, cho cá ăn thức ăn dành cho cá trưởng thành, mỗi bể nuôi ở mật độ thấp (trung bình 20 con/ bể 3lít), cho ăn thường xuyên (2 lần/ngày) và thay thế 1/3 nước trong bể mỗi ngày

Đánh giá ảnh hưởng As 3+ lên sức sống của cá Ngựa vằn ở giai đoạn ấu trùng

Ngày đầu tiên quy ước số cá con ban đầu là 100%; các ngày sau theo dõi số lượng cá con chết sau mỗi ngày, tính tỉ lệ sống của cá ở mỗi ngày dựa trên số cá con còn lại so với ngày hôm trước

Đánh giá ảnh hưởng As 3+ lên sức sống của cá Ngựa vằn sau giai đoạn ấu trùng

Quy ước số cá chuyển vào bể nuôi lớn ban đầu là 100%, coi mốc thời gian này là ngày bắt đầu thí nghiệm Trong hai tuần đầu tiên, kiểm tra số lượng cá còn sống sau mỗi tuần Các lần kiểm tra kế tiếp được thực hiện theo chu kì 15 ngày một lần và ghi nhận lại số cá còn lại trong các bể

4.6 Đánh giá sự tích tụ Arsenic trong cơ thể cá

- Sau 3 tháng nuôi, cá ở mỗi nồng độ khảo sát được vớt ra đĩa petri thủy tinh sạch, dùng giấy thấm để thấm sạch nước, đo chiều dài và trọng lượng trước khi tiến hành các bước tiếp theo

- Phân tích hàm lượng As trong cơ thể: dùng kẹp gắp nhẹ nhàng mỗi con cá riêng

lẻ vào một eppendorf mới, sạch

- Phân tích hàm lượng As trong các cơ quan: mổ cá bằng dao mổ y tế, tách riêng phần nội quan, lọc cơ và xương riêng Mỗi phần được cho vào các eppendorf mới (Kwong và cs, 2011)

- Tất cả mẫu được giữ ở -4oC cho đến lúc gửi đi phân tích Mỗi nồng độ được lặp lại 3 lần

4.7 Phương pháp xử lý thống kê

Các số liệu được xử lí thống kê bằng phần mềm để so sánh sự khác biệt ở tất cả các chỉ tiêu thực hiện trên các nhóm khảo sát Số liệu được trình bày ở dạng x± SE (P < 0,05)

4.8 Dụng cụ, thiết bị

STT Dụng cụ/Thiết bị Hãng sản xuất Nước sản xuất

11 Tủ sấy

18 Kéo mổ, dao mổ, kẹp mổ

19 Đũa thủy tinh

20 Eppendorf

22 Bo bo

23 Rong đuôi chó

- Các dụng cụ thủy tinh được rửa sạch và hấp, sấy khử trùng trước khi sử dụng

- Bo bo (trứng nước, bọ đỏ, hồng trần, rận nước) chứa hàm lượng protein lớn 50% khối lượng khô của cơ thể Ngoài ra, bo bo trưởng thành chứa lượng chất béo chiếm 20-27% khối lượng khô Do đó, chúng là nguồn thức ăn bổ dưỡng cho cá thời kì sinh trưởng và sinh sản

- Rong đuôi chó làm thức ăn cho cá, chúng còn tiết ra các chất độc đối với các loài tảo, giúp ngăn cản một cách có hiệu quả sự phát triển của tảo Chúng còn có khả năng tạo oxy nhờ quang hợp

4.9 Hóa chất

5 KH2PO4 Scharlab S.L Tây Ban Nha

5 Nội dung và phạm vi của vấn đề sẽ đi sâu nghiên cứu

5.1 Nội dung nghiên cứu

- Theo Quy chuẩn kĩ thuật Quốc gia về chất lượng nước mặt bảo vệ đời sống thủy sinh (QCVN 38: 2011/BTNMT) giá trị As giới hạn trong thủy vực là 0,02mg/l [2]

- Theo kết quả điều tra, phân tích mẫu nước ngầm năm 2010 ở các xã thuộc 57 tỉnh/thành trong cả nước của Cục Quản lý tài nguyên nước (Bộ Tài nguyên và Môi trường), tỉ lệ các xã có hàm lượng As trong nước hơn 0,05mg/l cao, nhất là đồng bằng Sông Hồng (43,86%) [23]

Chúng tôi khảo sát 9 nồng độ As: 20; 50; 80; 110; 140; 170; 200; 230; 260 µg/l

Cụ thể gồm các nội dung nghiên cứu sau:

 Ảnh hưởng của Arsenic lên sự phát triển giai đoạn phôi

- Tỷ lệ sống

- Nhịp tim

- Nhịp quẫy mình

- Tỷ lệ thoát nang

- Tỷ lệ dị tật

 Ảnh hưởng Arsenic lên sự phát triển giai đoạn cá bột

- Tỷ lệ sống

- Tỷ lệ dị tật

- Kích thước

 Ảnh hưởng Arsenic lên sự phát triển giai sau cá bột

- Tỷ lệ sống

- Tỷ lệ dị tật

- Kích thước, trọng lượng

 Xác định lượng Arsenic tích tụ trong cơ thể cá trưởng thành

- Ở các cơ quan của cá (cơ, xương, nội tạng)