Nghiên cứu sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn streptomyces orientalis

Bộ Coâng Thương Trường Đại Học Coâng Nghiệp Thực Phẩm Khoa Công Nghệ Sinh Học Kỹ Thuật Môi Trường BAØI TIỂU LUẬN NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG SINH VANCOMYCIN TỪ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES ORIENTALIS GVHD: Nguyễn Thị Quỳnh Mai Danh saùch thaønh vieân : Nguyễn Tuấn Ngọc 2013100090 Leâ Hoà Thaûo Nguyeân 2008100132 Huỳnh Ngọc Tuyeàn 2008100168 Leâ Thò Thuùy Haèng 2008100110 MỤC LỤC I. ĐẶT VẤN ĐỀ 2 II. NỘI DUNG 1. Khái quát về Streptomyces orientalis 3 1.1. Streptomyces 3 1.2. Streptomyces orientalis 3 1.3. Ứng dụng trong sản xuất kháng sinh 4 2. Khái quát về Vancomycin 4 2.1. Sinh tổng hợp 5 2.2. Dược và hóa học 6 2.3. Cơ chế tác dụng 7 3. Quy trình công nghệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis 8 3.1. Chủng giống vi sinh vật 7 3.2. Lựa chọn mơi trường điều kiện lên men sinh kháng sinh của chủng S. orientalis 4912 8 3.3. Nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis 4912 9 3.4. Lựa chọn môi trường và điều kiện lên men vancomycin của chủng đột biến 9 3.5. Tách chiết và tinh chế vancomycin từ dịch lên men 11 4. Một số ứng dụng khác của Streptomyces 12 4.1 Các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn trong phòng trừ nấm gây bệnh thực vật 12 4.2 Khuẩn lạc của Streptomyces sp trên môi trường agar 13 4.3 Streptomyces như một vật chủ cho việc tiết ra các protein dị để sản xuất dược sinh học 13 4.4 Vi sinh vật phân giải PhotPho (P) 13 I. KẾT LUẬN 14 TÀI LIỆU THAM KHẢO 15 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, công nghệ sinh học được coi là một trong những ngành công nghệ hàng đầu của thế giới. Và trong đó, công nghệ sinh học vi sinh vật sản xuất kháng sinh, vitamin và các loại hoạt chất ứng dụng trong y học cũng như những lĩnh vực khác phục vụ cho đời sống và nghiên cứu đang có những bước phát triển vượt bậc. Từ những phương pháp sinh tổng hợp và bán tổng hợp thì công nghệ vi sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò quan trọng của mình. Trong số hơn 10.000 chất kháng sinh được tìm ra thì có khoảng 2.000 chất do thực vật tạo ra còn có khoảng 8.000 chất là do kháng sinh vi sinh vật tổng hợp, trong đó xạ khuẩn tổng hợp hơn 60%. Các công trình nghiên cứu đã chứng minh Streptomyces là một chi xạ khuẩn gồm nhiều loài có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh đa dạng về cấu trúc trúc và đặc điểm kháng khuẩn. Đặc biệt trong số đó có chất kháng sinh Vancomycin đóng vai trò rất quan trọng, có nhiều ứng dụng trong thực tiễn đời sống hiện nay. Trong cuộc sống bình thường không chừa một ai, vì thế những nhà khoa học cũng như những y bác sĩ không ngừng học hỏi tìm tòi để có thể tìm được ra những phương thức mới để kháng bệnh, và trong đó có “NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG SINH VANCOMYCIN TỪ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES ORIENTALIS” của các cán bộ thuộc Viện Công nghệ Sinh học thực hiện, được nhóm tâm đắc nhất và nhóm đã quyết định tìm hiểu cũng như học hỏi phương pháp ở đề tài này. + Mục tiêu : Xây dựng quy trình công nghệ lên men sản xuất kháng sinh vancomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912 ph hợp với nguyên liệu và điều kiện môi trường khí hậu Việt Nam. + Nội dung nghiên cứu : Nghiên cứu đặc điểm hình phái, đặc điểm phân loại và bảo quản chủng Streptomyces orientalis trong điều kiện phòng thí nghiệm. Nghiên cứu lựa chọn môi trường thích hợp bằng các nguyên liệu trong nước và điều kiện lên men chủng Streptomyces orientalis trong phòng thí nghiệm. Nghiên cứu tuyển chọn, bảo quản và nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng giống. Nghiên cứu tối ưu môi trường và điều kiện lên men có bổ sung cơ chất. Nghiên cứu thử nghiệm lên men sản xuất ở trong nổi lên men nhỏ. Nghiên cứu tách chiết, tinh chế vancomycin từ dịch lên men chủng Streptomyces orientalis 4912. Nghiên cứu điều chế vancomycinNa. II. NỘI DUNG 1. Khái quát về Streptomyces orientalis 1.1 Streptomyces Streptomyces là lớn nhất chi của Actinobacteria và chi nhập của gia đình streptomycetaceae. Hơn 500 loài Streptomyces vi khuẩn đã được mô tả. Cũng như với các Actinobacteria khác, Streptomyces là Gram dương, và có bộ gen với cao GC . được tìm thấy chủ yếu trong đất và thảm thực vật mục nát, nhất Streptomyces sản xuất bào tử, và được ghi nhận về mùi của họ mà kết quả từ sản xuất của một biến động chất chuyển hóa, geosmin. Streptomyces được nghiên cứu rộng rãi nhất và được biết đến nhiều nhất là chi của họ xạ khuẩn (atinomyces). Streptomyces thường sống ở đất và chúng nhận vai trò là vi sinh vật phân hủy rất quan trọng. Chúng cũng sản xuất hơn một nửa số thuộc kháng sinh của thế giới và đó là sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế. 1.2 Streptomyces orientalis Một loài Streptomyces sản xuất thuốc kháng sinh là Streptomyces orientalis , nay được gọi là orientalis Amycolatopsis, vi khuẩn Streptomyces chủ yếu được tìm thấy trong đất và thảm thực vật mục nát . Streptomyces orientalis ban đầu được tìm thấy trong đất Ấn Độ và Indonesia. Nó được phát triển trên môi trường thạch men một chiết xuất mạch nha và có một nhiệt độ tối ưu là 280C. Streptomyces orientalis sản xuất Vancomycin kháng sinh, được sử dụng để phòng ngừa và điều trị các bệnh nhiễm trùng gây ra bởi vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là khuẩn tụ cầu. Nó hoạt động bằng cách ức chế sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn Gram dương. Trong khi Vancomycin có thể hữu ích để ngăn ngừa viêm nhiễm, nó cũng có thể gây ra vấn đề. Nó đã được báo cáo là gây độc cho thận, và trong vài trường hợp gây độc cho tai, đặc biệt là các dây thần kinh thính giác. Do đó, Vancomycin thường được sử dụng như một loại thuốc cuối cùng, chỉ được sử dụng khi không có gì khác. 1.3. Ứng dụng trong sản xuất kháng sinh Chất kháng sinh là chất có nguồn gốc từ thiên nhiên và các sản phẩm cải biến của chúng bằng con đường hóa học có khả năng tác dụng chọn lọc với sự phát triển của VSV, tế bào ung thư ở ngay nồng độ thấp. Tại Hàn Quốc năm 2007 phân lập được loại xạ khuẩn Streptomyces sp. C684 sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin. Tại Nhật năm 2003, Yatakemycin đã được tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces sp. TP – A0356 bằng phương pháp sắc kí cột. CKS này có khả năng kiềm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus và Candida albicans. Chất này còn có khả năng chống lại các tế bào ung thư có giá trị Mic là 0,01 – 0,3 mgml. Để tránh dịch bệnh trong nông nghiệp, người ta còn có thể sử dụng một số biện pháp kĩ thuật, như thay đổi cơ cấu cây trồng, mùa vụ. Tuy nhiên biện pháp này gây xáo trộn hệ sinh thái đồng ruộng tạo điều kiện phát sinh một số bệnh mà trước đây ít gặp. Việc tuyển chọn các dòng cây kháng bệnh này cũng chỉ được vài năm, sau đó các tác nhân gây bệnh lại kháng lại. 2. Khái quát về Vancomycin Vancomycin là chất kháng sinh thuộc nhóm glycopeptid có tác dụng tích cực trong điều trị bệnh, từng được coi là phương thuốc cuối cùng vì có khả năng điều trị được các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm do các chủng vi sinh vật kháng methicillin (chất kháng sinh nhiễm lactam) gây nên. Vancomycin đã được đưa vào chữa bệnh từ hơn 40 năm qua, nhưng ngày nay vẫn được coi là kháng sinh quan trọng do hiệu quả chữa bệnh cao khi dùng một mình hoặc phối hợp với các kháng sinh khác, chống lại các vi khuẩn đã nhờn với nhiều loại kháng sinh thông dụng. Bởi vậy, việc nghiên cứu sinh tổng hợp vancomycin vẫn được quan tâm, phát triển, để từ đó hình thành nên thế hệ kháng sinh mới có hiệu quả chữa bệnh cao. Hơn nữa nghiên cứu lên men vancomycin và nắm vững quy trình sản xuất chất kháng sinh này còn tạo tiền đề cho việc xây dựng cơ sở sản xuất các chất kháng sinh ở quy mô công nghiệp trong điều kiện Việt Nam, góp phần thực hiện mục tiêu tới năm 2020 sản xuất được 50% tổng số thuộc, do Bộ Y tế đề ra. Trong bối cảnh như vậy, việc nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vancomycin bằng nguyên liệu trong nước, phối hợp với điều kiện kinh tế và môi trường khí hậu của Việt Nam là cần thiết. Cùng với nó, việc triển khai xây dựng một cơ sở sản xuất kháng sinh này với công suất 500 kgnăm góp phần phục vụ công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng. 2.1 Sinh tổng hợp Vancomycin sinh tổng hợp xảy ra thông qua tổng hợp protein khác nhau nonribosomal (NRPSs) . Enzyme xác định trình tự axit amin trong quá trình lắp ráp đến 7 môđun. Trước khi Vancomycin được lắp ráp thông qua NRPS, các axit amin đầu tiên được sửa đổi. Ltyrosine được sửa đổi để trở thành hydroxychlorotyrosine (hTyr) và 4hydroxyphenylglycine (HPG) dư lượng . Mặt khác, acetate được sử dụng để lấy 3,5 dihydroxyphenylglycine vòng (3,5DPG). Tổng hợp peptide Nonribosomal xảy ra thông qua phân biệt các môđun có thể tải và mở rộng các protein axit amin, thông qua việc hình thành liên kết amide tại địa điểm liên kết của các phạm vi hoạt động. Mỗi module thường bao gồm một adenylation (A) tên miền, một chất vận chuyển peptidyl protein (PCP), miền và tên miền ngưng tụ (C) hoặc kéo dài. Trong lĩnh vực A, amino axit cụ thể được kích hoạt bằng cách chuyển đổi thành một phức tạp enzyme aminoacyl adenylate gắn liền với một đồng yếu tố 4phosphopantetheine bởi thioesterification phức tạp sau đó được chuyển vào miền PCP với việc đẩy AMP. Trong sinh tổng hợp các Vancomycin, lĩnh vực sửa đổi bổ sung có mặt, chẳng hạn như các epimerization (E) miền, được sử dụng isomerizes axit amin từ một lập thể khác, và một tên miền thioesterase (TE) được sử dụng như một chất xúc tác cho tạo vòng và vận hành của phân tử thông qua một thioesterase phân cắt. Một tập hợp các multienzymes (CEPA enzym tổng hợp peptide, CepB, và CepC) chịu trách nhiệm lắp ráp các heptapeptide. (Hình 2). Các tổ chức của CEPA, CepB, và CEP C chặt chẽ tương tự như tổng hợp peptide khác như những chất cho surfactin (SrfA1, SrfA2, và SrfA3) và gramicidin (GrsA và GrsB). Mỗi enzym tổng hợp peptide kích hoạt mã hoá cho các axit amin khác nhau để để kích hoạt từng lĩnh vực. CEPA mã hóa cho môđun 1, 2, và 3. CepB mã hóa cho các mơđun 4, 5, và 6. và CepC mã hóa cho mơđun 7. Sau khi phân tử heptapeptide tuyến tính được tổng hợp, Vancomycin đã phải trải qua thay đổi hơn nữa, chẳng hạn như oxy hóa liên kết ngang và glycosyl hóa. Để chuyển đổi heptapeptide tuyến tính, tám enzyme, open reading frames (ORF) 7, 8, 9, 10, 11, 14, 18, 20, và 21 được sử dụng. Enzyme ORF 7, 8, 9, và 20 là những enzym P450 . Và ORF 9 và 14 được xác định là enzym thủy phân giả định. Với sự gíup đỡ của các enzym này, các nhóm hydroxyl được giới thiệu trên tyrosine dư lượng 2 và 6, và khớp nối xảy ra trong vòng 5 và 7, vòng 4 và 6, và vòng 4 và 2. Ngồi ra, haloperoxidase được sử dụng để gắn các nguyên tử clo vào vòng 2 và 6 thông qua một quá trình oxy hóa. 2.2 Dược và hóa học Vancomycin là một nhánh ba vòng peptide nonribosomal glycosyl hóa được sản xuất bởi quá trình lên men của các loài actinobacteria Amycolatopsis orientalis (trước đây là chỉ định Nocardia orientalis ). Vancomycin exhibits atropisomerism – nó có nhiều hóa học khác biệt rotamers do hạn chế luân phiên của một số liên kết. Các hình thái hiện diện trong thuốc là các mặt nhiệt động ổn định hơn conformer và do đó có hoạt động mạnh hơn. 2.3 Cơ chế tác dụng Vancomycin hoạt động bằng cách ức chế tổng hợp thích hợp thành tế bào vi khuẩn Gram dương. Do cơ chế khác nhau mà theo đó các vi khuẩn Gram âm sản xuất thành tế bào của nó và các yêu tố khác nhau liên quan đến việc đi vào màng ngoài của các sinh vật gram âm, vancomycin không phải là hoạt động chống lại các vi khuẩn Gram (ngoại trừ một số loài do lậu cầu của Neisseria) . Các phân tử ưa nước lớn có thể hình thành liên kết hydro tương tác với các thiết bị đầu cuối DalanylDalanine moieties các NAM NAG peptide. Trong những trường hợp bình thường, đây là một sự tương tác năm điểm . Điều này ràng buộc của vancomycin DAlaDAla ngăn chặn tổng hợp thành tế bào trong hai cách: + Ngăn chặn sự tổng hợp của polyme di của Nacetylmuramic acid (NAM) và Nacetylglucosamine (NAG) đã hình thành sợi xương sống của các tế bào vi khuẩn. + Ngăn cản các polyme xương sống để kìm chế sự hình thành, liên kết với nhau. 3. Quy trình công nghệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis 3.1 Chủng giống vi sinh vật Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912 và các chủng vi sinh vật kiểm định Bacillus subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC 21778, Staphylococcus aureus 209P, Sarcina lutea và Eschrochia coli PA2, các hóa chất dung để phân tích, định lượng và vancomycin chuẩn (Merck) và các môi trường nghiên cứu là Gause 1, A4, A4H, TH447, A12, A9, 48. Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912 A. Hình dạng khuẩn lạc, B. Cuống sinh bào tử, C. bào tử. 3.2 Lựa chọn môi trường điều kiện lên men sinh kháng sinh của chủng S. orientalis 4912 Thử nghiệm lên men trên một số môi trường thường dùng trong lên men sinh kháng sinh ở xạ khuẩn cho thấy, chủng S. orientalis 4912 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh và đã lựa chọn được môi trường MT48 cho hoạt tính kháng sinh cao nhất có thể làm môi trường cơ sở để nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng và điều kiện lên men đến khả năng tạo kháng sinh. Hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis 4912 Chủng S. orientalis 4912 sử dụng tốt nguồn đường sacchaose với hàm lượng thích hợp là 3%, cho hoạt tính kháng sinh cao. Trong số các nguồn nitơ thử nghiệm thì bột đậu tương cho hoạt tính kháng sinh cao nhất, với hàm lượng 0,2% là thích hợp. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và pH cho thấy, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. orientalis 4912 là 280C và pH từ 6 đến 8. Lượng giống được cấy vào môi trường lên men thích hợp 6 8% so với môi trường lên men. Nghiên cứu động thái quá trình men chủng S. orientalis 9412 cho thấy, sinh khối và hoạt tính kháng sinh tăng dần và đạt cực đại sau 120 giờ lên men. Như vậy, động thái quá trình lên men chủng này có đặc trưng giống như ở các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh khác. 3.3 Nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis 4912 Trước hết, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phương pháp gay chủng đột biến bằng tia UV. Kết quả nghiên cứu khả năng sống sót của tế bào trần và bào tử chủng S. orientalis 4912 sau khi xử lý UV ở độ sống sót từ 110%, kiểm tra hoạt tính kháng sinh theo phương pháp cục thạch cho thấy, khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng này tăng lên từ 830,3% đối với xử lý bào tử và 66,33% đối với xử lý tế bào trần. Khả năng sống sót của tế bào trần và bào tử chủng S. orientalis 4912 sau khi xử lý UV và MNNG Hoạt tính kháng sinh của các khuẩn lạc chủng S. orientalis 4912 xác định bằng phương pháp cục thạch (A) và đục lỗ (B) Sau đó các nhà khoa học tiếp tục áp dụng phương pháp thứ hai, đó là gây chủng đột biến bằng MNNG. Trên cơ sở lựa chọn nồng độ MNNG, pH và thời gian xử lý thích hợp để xử lý bào tử và tế bào trần thì tỷ lệ biến chủng của hoạt tính kháng sinh cao hơn chủng gốc là 80,8 và 92,86 %. Kết quả nhận được biến chủng S. orientalis 49128161 (xử lý tế bào trần bằng MNNG) của hoạt tính kháng sinh cao nhất là 1683 mcgml, được lựa chọn cho nghiên cứu điều kiện lên men sản xuất vancomycin (hoạt tính kháng sinh chủng gốc là 866 mcgml). 3.4 Lựa chọn môi trường và điều kiện lên men vancomycin của chủng đột biến Dựa trên môi trường lên men thích hợp cho chủng S. orientalis 4912, đã tiến hành lựa chọn môi trường lên men tối ưu theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm của BoxWilson cho biến chủng S. orientalis 49128161 như sau Saccharose 49,8 gl; glucose 17 gl; bột đậu tương 30,6 gl; NaCl 2,5 gl; CaCO3 2 gl; CaCl2 40 mgl; CuSO4 10 mgl. Ảnh hưởng của của các yếu tố điều kiện lên men cho thấy, tỷ lệ tiếp giống 4%, nhiệt độ lên men tối ưu 28oC và nồng độ pH thích hợp 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng oxy hòa tan (dO2) trong môi trường tới sự sinh trưởng và sinh tổng hợp vancomycin, các thí nghiệm lên men biến chủng S. orientalis 49128161 được thực hiện trong hệ thống Bioflo 110 dung tích 7,5 lit với các điều kiện pH, nhiệt độ và tỉ lệ giống được xác định ở trên. Kết quả xác định sinh khối khô và hoạt tính kháng sinh sau 120 giờ lên men cho thấy, khi dO2 được duy trì ở mức 2030% thì lượng vancomycin và sinh khối đạt cao nhất, tương ứng bằng 2983 mcgml và 9,8 mgml. Như vậy, kết quả của các thí nghiệm này cho thấy việc cung cấp đủ oxy hòa tan và bảo đảm đảo trộn tốt trong bình lên men là điều kiện thiết yếu của sản xuất vancomycin. Để xác định thời điểm thu hồi vancomycin thích hợp nhất, biến chủng S. orientalis 49128161 được nuơi trong thiết bị lên men Bioflo 110 dung tích với thành phần môi trường lên men tối ưu cho thấy, biến chủng này phát triển tốt trong bình lên men, đặc biệt từ giờ thứ 48 sinh khối của chủng tăng nhanh đạt 5,8 mgml. Cũng tại thời điểm này chủng bắt đầu sinh vancomycin, tới 120 giờ nồng độ đạt cực đại là 2983 mcgml. Biến động quá trình lên men sinh tổng hợp vancomycin bởi biến chủng S. orientalis 49128161 trên thiết bị Bioflo 5000 3.5 Tách chiết và tinh chế vancomycin từ dịch lên men Quy trình chiết xuất vancomycin Kết quả kiểm tra vancomycin tách chiết từ biến chủng S. orientalis 49128161 bằng sắc ký lớp mỏng trên hệ dung mơi Butanol axit acetic H2O (4 : 3 : 7) cho gía trị Rf của các mẫu là 0,75; bằng phương pháp phổ khối Agilent 6310 Ion Trap trên máy HPLCMS, trọng lượng phân tử là 1449,27 và bằng sắc ký lỏng cao cấp trên máy HPLCSPA10 Shimadzu, thời gian lưu là ở 4,4 phút giống như vancomycin chuẩn (Merck). Sắc ký đồ HPLC cho thấy không có các pic tạp chứng tỏ vancomycin chế phẩm khá tinh sạch, độ tinh khiết đạt 95,4%. Kiểm tra vancomycin bằng sắc ký lớp mỏng 1. Vancomycin từ môi trường nuôi cấy 2. Vancomycin được tách chiết và làm tinh khiết; và 3. Vancomycin chuẩn (Merck) Phỏ UV của vancomycin chuẩn (trên) và vancomycin chủng S. orientalis 4912 (dưới) Phỏ HPLC của vancomycin chuẩn (trên) và vancomycin chủng S. orientalis 4912 (dưới) 4. Một số ứng dụng khác của Streptomyces 4.1 Các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn trong phòng trừ nấm gây bệnh thực vật Để tránh dịch bệnh trong nông nghiệp, người ta có thể sử dụng một số biện pháp kỹ thuật, như thay đổi cơ cấu cây trồng, mùa vụ. Tuy nhiên biện pháp này gây xáo trộn hệ sinh thái đồng ruộng, tạo điều kiện để phát sinh một số bệnh mà trước đây ít gặp. Việc tuyển chọn các dòng cây kháng bệnh cũng chỉ được vài năm, sau đó các tác nhân gây bệnh lại kháng lại. Việc sử dụng CKS trong trồng trọt nhằm các mục đích như chống bệnh do nấm gây ra trên rau quả và cây trồng, chống bệnh do vi khuẩn gây ra, diệt côn trùng và cỏ dại… kiềm chế các bệnh thực vật sinh ra từ đất. So với thuốc hoá học, dùng các chất CKS trong bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân huỷ, các tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp gây ô nhiễm môi trường, còn có khả năng ức chế các VSV đã kháng thuốc hoá học. CKS và dịch lên men các chủng sinh CKS còn dùng để xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt nguồn bệnh ở bên ngoài và trong hạt, diệt bệnh ở cả các bộ phận nằm trên đất của cây và khử trùng đất. Ngày nay, việc sử dụng các CKS trong bảo vệ thực vật được phổ biên rộng rãi trên thế giới nhất là ở các nước Nga, Nhật, Trung Quốc, An Độ… Ở Trung Quốc đã tuyển chọn được nhiều chủng xạ khuẩn từ đất và nghiên cứu sản xuất nhiều CKS phòng chống bệnh cây có hiệu quả cao như policin chống bệnh đạo ôn, jangamicin chống bệnh khô vằn. Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp.201 có khả năng sinh CKS mới là z –methylheptyl iso –nicotinate, chất kháng sinh này có khả năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum, F.solani… Ở Việt Nam cũng đã sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ thực vật từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng xạ khuẩn có khả năng chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn và F.oxysporum gây bệnh thối rễ ở thực vật. 4.2 Khuẩn lạc của Streptomyces sp trên môi trường agar. Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử. Trên thành sợi khí sinh thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh bào tử có nhiều dạng khác nhau tuỳ loài : thẳng, lượn sóng xoắn, có móc, vòng…. Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng 2 phương pháp : phân đoạn và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 µm. Màng tế bào có thể nhẵn, gai khối u, nếp nhăn…. Tuỳ thuộc vào lõi xạ khuẩn với môi trường nuôi cấy. Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucoza thì bào tử thể hiện đặc điểm rất rõ. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sinh khí cũng rất khác nhau tuỳ theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau. Các loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn gram (+), hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường là 25 – 300C, pH tối ưu 6,5 – 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh). Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các CKS ức chế vi khuẩn, nấm sợi và các tế bào ung thư, virus và động vật nguyên sinh. 4.3 Streptomyces như một vật chủ cho việc tiết ra các protein dị để sản xuất dược sinh học Việc sản xuất thương mại protein chữa bệnh hoặc chẩn đoán vi sinh vật lý tổ hợp được quan tâm đáng kể. Một số hệ thống sản xuất protein của vi khuẩn đang được phát triển. Một số chi của các vi khuẩn Gram dương đang được thử nghiệm như là vật chủ lưu trữ để sản xuất protein dị do khả năng tiết ra các protein có hiệu quả trong môi trường nuôi cấy. Trong số đó chi Streptomyces nhiều kể từ khi các loài của nó được biết là tiết ra một lượng protein cao. Vì sự vắng mặt của một hệ thống hạn chế, thay đổi rộng lớn, hoạt động của protease hạn chế về sự sẵn có của hệ thống vector thích hợp, Streptomyces lividans được chọn lựa cho việc tiết của các protein dị. Các kết quả trình bày cho thấy rằng lividans có thể hoạt động như một vật chủ lưu trữ thú vị để sản xuất một số protein hữu ích cho một số bệnh quan trọng trong ngành thương mại dược phẩm trên toàn thế giới như là: ung thư, miễn dịch học, bệnh tim mạch và các bệnh truyền nhiễm. 4.4 Vi sinh vật phân giải PhotPho (P) Trong tự nhiên, P nằm trong nhiều dạng hợp chất khác nhau. Các hợp chất P hữu cơ trong đất có nguồn gốc từ xác động vật, thực vật, phân xanh, phân chuồng… Những hợp chất P hữu cơ này được vi sinh vật phân giải tạo thành những hợp chất P vô cơ khó tan, một số ít được tạo thành ở dạng dễ tan. Hợp chất P hữu cơ quan trọng nhất được phân giải ra từ tế bào vi sinh vật là nucleotide. Nucdeotide có trong thành phần nhân tế bào. Nhờ tác động của các nhóm vi sinh vật hoại sinh trong đất, chất này tách ra từ thành phần tế bào và được phân giải thành 2 phần protein và nuclein. Protein sẽ đi vào vùng chuyển hoá và các hợp chất nitrogen, nuclein sẽ đi vào vòng chuyển hoá các hợp chất P. Sự chuyển hoá các hợp chất P hữu cơ thành muối của H3PO4 được thực hiện bởi nhóm vi sinh vật phân huỷ P hữu cơ theo sơ đồ tổng quát sau : Nucleoprotein  Nuclein  Acid.Nucleic  H2SO4 Vi sinh vật phân hủy P hữu cơ chủ yếu thuộc 2 chi Bacillu và Pseudomonas. Các loài có khả năng phân giải mạnh là : B.megaterium, Serratia, B.subtilis, Serratia, Proteus, Arthrobster, ...  Vi khuẩn: Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Agrobacterium.  Xạ khuẩn: Streptomyces... III. Kết luận Vancomycin là một kháng sinh nhóm glycopeptid được sử dụng để chữa các bệnh nhiễm trùng do các vi khuẩn Gram dương gây ra, đặc biệt là các vi khuẩn kháng lại kháng sinh methicillin và penicillin. Kết quả nghiên cứu được xây dựng được quy trình thích hợp để sản xuất vancomycin từ biến chủng nhận được cao hơn chủng gốc 344%. Chất kháng sinh thu nhận được từ dịch lên men tương đương với vancomycin chuẩn (Merck). Đã nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng 4912: Chủng này có đặc điểm giống loại S.orientales như chủng chuẩn ISP 504 được mô tả, sử dụng hầu hết các nguồn đường, sinh trưởng phát triển tốt, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu ở 28300C, pH thích hợp cho sự phát triển của chủng này từ 6 đến 9, chịu muối đến 6% và không có khả năng tạo xenlulaza. Chủng S. orientalis 4912 cĩ hoạt phổ kháng khuẩn rộng giống lồi Streptomyces orientalis Pittenger Brigham, ức chế được cả vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm. Đã lựa chọn môi trường thích hợp MT 48 làm môi trường cơ sở để nghiên cứu tối ưu thành phần môi trường và điều kiện lên men. Chủng 4912 có đặc điểm sinh học giống lồi Streptomyces orientalis và hoạt tính kháng sinh cao. Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cho thấy nguồn dinh dưỡng thích hợp là saccaroza 3%, bột đậu tương 0,2%, pH 7,0 7,5 nhiệt độ lên men 300C và tỷ lệ cấy giống 10%. Lượng sinh khối và kháng sinh cao nhất của quá trình lên men ở 120 giờ nuôi cấy. Đã nghiên cứu sự biến động tự nhiên về hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis 4912 và nhận thấy, chủng này không có biến động lớn về hoạt tính kháng sinh; không có biến chủng âm tính và được lựa chọn được 1 chủng có hoạt tính kháng sinh cao nhất. Đã lựa chọn được chủng xạ khuẩn S. orientalis 491281345 có khả năng sinh tổng hợp vancomycin cao và các chủng được đột biến có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao hơn chủng gốc. Đã nghiên cứu và sử dụng kỹ thuật gây đột biến tế bào trần bằng tia UV và nâng cao được hoạt tính của chủng S. orientalis 4912. Được xác định được hoạt tính kháng sinh của các biến chủng sau khi xử lý UV: Hoạt tính kháng sinh của các chủng dương tính đều cao hơn chủng gốc và biến chủng âm đều thấp hơn chủng gốc. Đã nghiên cứu tối ưu hóa môi trường lên men tổng hợp vancomycin của chủng gốc và các chủng đột biến; Nghiên cứu động thái quá trình lên men trên nội lên men 5 lít và 80 lít. Đã nghiên cứu tách chiết kháng sinh từ dịch nuôi cấy của chủng S. orientalis 4912 bằng dung môi và các chất hấp phụ, sản phẩm nhận được là vancomycin. Đã nghiên cứu tinh chế và điều chế vancomycin.HC1 và bào chế 2 dạng thuốc : Thuốc tiêm và viên nang. TÀI LIỆU THAM KHẢO (1) http:en.wikipedia.orgwikiStreptomyces (2) http:www.microbiologybytes.comvideoStreptomyces.html (3) http:www.jic.ac.uksciencemolmicrostrept.html (4) http:www.jic.ac.uksciencemolmicrostrept.html (5) http:www.businesschemistry.orgarticle?article=82 (6) www.en.wikipedia.orgwikiVancomycin (7) www.dspace.isivast.org.vndspacebitstream12345678932661dt1.doc (8) www.scribd.comdoc35890819STREPTOMYCES Tạp chí công nghệ sinh học

Bộ Công Thương Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm Khoa Cơng Nghệ Sinh Học - Kỹ Thuật Mơi Trường BÀI TIỂU LUẬN NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG SINH VANCOMYCIN TỪ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES ORIENTALIS GVHD: Nguyễn Thị Quỳnh Mai Danh sách thành viên : Nguyễn Tuấn Ngọc 2013100090 Lê Hồ Thảo Nguyên 2008100132 Huỳnh Ngọc Tuyền 2008100168 Lê Thò Thúy Hằng 2008100110 Tháng 12 -2011 MỤC LỤC I ĐẶT VẤN ĐỀ II NỘI DUNG Khái quát Streptomyces orientalis 1.1 Streptomyces 1.2 Streptomyces orientalis 1.3 Ứng dụng sản xuất kháng sinh Khái quát Vancomycin 2.1 Sinh tổng hợp 2.2 Dược hóa học 2.3 Cơ chế tác dụng Quy trình cơng nghệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis 3.1 Chủng giống vi sinh vật 3.2 Lựa chọn mơi trường điều kiện lên men sinh kháng sinh chủng S orientalis 4912 3.3 Nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng S orientalis 49129 3.4 Lựa chọn mơi trường điều kiện lên men vancomycin chủng đột biến 3.5 Tách chiết tinh chế vancomycin từ dịch lên men 11 Một số ứng dụng khác Streptomyces 12 4.1 Các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn phòng trừ nấm gây bệnh thực vật 12 4.2 Khuẩn lạc Streptomyces sp mơi trường agar 13 4.3 Streptomyces vật chủ cho việc tiết các protein dị để sản xuất dược sinh học 13 4.4 Vi sinh vật phân giải PhotPho (P) 13 I KẾT LUẬN 14 TÀI LIỆU THAM KHẢO 15 I ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, cơng nghệ sinh học coi ngành cơng nghệ hàng đầu của giới Và đó, cơng nghệ sinh học vi sinh vật sản xuất kháng sinh, vitamin loại hoạt chất ứng dụng y học lĩnh vực khác phục vụ cho đời sống nghiên cứu có bước phát triển vượt bậc Từ phương pháp sinh tổng hợp bán tổng hợp cơng nghệ vi sinh tổng hợp kháng sinh tiếp tục khẳng định vai trò quan trọng của Trong số 10.000 chất kháng sinh tìm có khoảng 2.000 chất thực vật tạo có khoảng 8.000 chất kháng sinh vi sinh vật tổng hợp, xạ khuẩn tổng hợp 60% Các cơng trình nghiên cứu đã chứng minh Streptomyces chi xạ khuẩn gồm nhiều lồi có khả sinh tổng hợp kháng sinh đa dạng cấu trúc trúc đặc điểm kháng khuẩn Đặc biệt số có chất kháng sinh Vancomycin đóng vai trò quan trọng, có nhiều ứng dụng thực tiễn đời sống Trong sống bình thường khơng chừa ai, nhà khoa học y bác sĩ khơng ngừng học hỏi tìm tòi để tìm phương thức để kháng bệnh, có “NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG SINH VANCOMYCIN TỪ XẠ KHUẨN STREPTOMYCES ORIENTALIS” của cán thuộc Viện Cơng nghệ Sinh học thực hiện, nhóm tâm đắc nhóm đã định tìm hiểu học hỏi phương pháp đề tài + Mục tiêu : Xây dựng quy trình cơng nghệ lên men sản xuất kháng sinh vancomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912 ph hợp với ngun liệu điều kiện mơi trường khí hậu Việt Nam + Nội dung nghiên cứu : - Nghiên cứu đặc điểm hình phái, đặc điểm phân loại bảo quản chủng Streptomyces orientalis điều kiện phòng thí nghiệm - Nghiên cứu lựa chọn mơi trường thích hợp ngun liệu nước điều kiện lên men chủng Streptomyces orientalis phòng thí nghiệm - Nghiên cứu tuyển chọn, bảo quản nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng giống - Nghiên cứu tối ưu mơi trường điều kiện lên men có bổ sung chất - Nghiên cứu thử nghiệm lên men sản xuất lên men nhỏ - Nghiên cứu tách chiết, tinh chế vancomycin từ dịch lên men chủng Streptomyces orientalis 4912 - Nghiên cứu điều chế vancomycin-Na II NỘI DUNG Khái quát Streptomyces orientalis 1.1 Streptomyces Streptomyces lớn chi của Actinobacteria chi nhập của gia đình streptomycetaceae Hơn 500 lồi Streptomyces vi khuẩn đã mơ tả Cũng với Actinobacteria khác, Streptomyces Gram dương, có gen với cao GC tìm thấy chủ yếu đất thảm thực vật mục HHnh 1.1 nát, Streptomyces sản xuất bào tử, Streptomyces ghi nhận mùi của họ mà kết quả từ sản xuất của biến động chất chuyển hóa, geosmin Streptomyces nghiên cứu rộng rãi biết đến nhiều chi của họ xạ khuẩn (atinomyces) Streptomyces thường sống đất chúng nhận vai trò vi sinh vật phân hủy quan trọng Chúng sản xuất nửa số thuộc kháng sinh của giới sản phẩm có giá trị lớn lĩnh vực y tế 1.2 Streptomyces orientalis Một lồi Streptomyces sản xuất thuốc kháng sinh Streptomyces orientalis , gọi orientalis Amycolatopsis, vi khuẩn Streptomyces chủ yếu tìm thấy đất thảm thực vật mục nát Streptomyces orientalis ban đầu tìm thấy đất Ấn Độ Indonesia Nó phát triển mơi trường thạch men chiết xuất mạch nha có nhiệt độ tối ưu 280C Streptomyces orientalis sản xuất Vancomycin kháng sinh, sử dụng để phòng ngừa điều trị bệnh nhiễm trùng gây vi khuẩn Gram dương, đặc biệt khuẩn tụ cầu Nó hoạt động cách ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn Gram dương Trong Vancomycin hữu ích để ngăn ngừa viêm nhiễm, gây vấn đề Nó đã báo cáo gây độc cho thận, vài trường hợp gây độc cho tai, đặc biệt dây thần kinh thính giác Do đó, Vancomycin thường sử dụng loại thuốc cuối cùng, sử dụng khơng có khác 1.3 Ứng dụng sản xuất kháng sinh Chất kháng sinh chất có nguồn gốc từ thiên nhiên sản phẩm cải biến của chúng đường hóa học có khả tác dụng chọn lọc với phát triển của VSV, tế bào ung thư nồng độ thấp - Tại Hàn Quốc năm 2007 phân lập loại xạ khuẩn Streptomyces sp C684 sinh CKS laidlomycin, chất tiêu diệt cả tụ cầu đã kháng methicillin cầu khuẩn kháng vancomycin - Tại Nhật năm 2003, Yatakemycin đã tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces sp TP – A0356 phương pháp sắc kí cột CKS có khả kiềm hãm phát triển của nấm Aspergillus Candida albicans Chất có khả chống lại tế bào ung thư có giá trị Mic 0,01 – 0,3 mg/ml - Để tránh dịch bệnh nơng nghiệp, người ta sử dụng số biện pháp kĩ thuật, thay đổi cấu trồng, mùa vụ Tuy nhiên biện pháp gây xáo trộn hệ sinh thái đồng ruộng tạo điều kiện phát sinh số bệnh mà trước gặp Việc tuyển chọn dòng kháng bệnh vài năm, sau tác nhân gây bệnh lại kháng lại Một số loại thuốc kháng sinh Khái quát Vancomycin Vancomycin chất kháng sinh thuộc nhóm glycopeptid có tác dụng tích cực điều trị bệnh, coi phương thuốc cuối có khả điều trị bệnh nhiễm H nh 1.2 chủng vi sinh vật kháng trùng nguyHhiểm HHnh 1.3 methicillin (chất kháng sinh nhiễm -lactam) gây nên Vancomycin đã đưa vào chữa bệnh từ 40 năm qua, ngày coi HHnh 2.1 kháng sinh quan trọng hiệu quả chữa bệnh cao dùng phối hợp với kháng sinh khác, chống lại vi khuẩn đã nhờn với nhiều loại kháng sinh thơng dụng Bởi vậy, việc nghiên cứu sinh tổng hợp vancomycin quan tâm, phát triển, để từ hình thành nên hệ kháng sinh có hiệu quả chữa bệnh cao Hơn nghiên cứu lên men vancomycin nắm vững quy trình sản xuất chất kháng sinh tạo tiền đề cho việc xây dựng sở sản xuất chất kháng sinh quy mơ cơng nghiệp điều kiện Việt Nam, góp phần thực mục tiêu tới năm 2020 sản xuất 50% tổng số thuộc, Bộ Y tế đề Trong bối cảnh vậy, việc nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vancomycin ngun liệu nước, phối hợp với điều kiện kinh tế mơi trường khí hậu của Việt Nam cần thiết Cùng với nó, việc triển khai xây dựng sở sản xuất kháng sinh với cơng suất 500 kg/năm góp phần phục vụ cơng tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng 2.1 Sinh tổng hợp Vancomycin sinh tổng hợp xảy thơng qua tổng hợp protein khác nonribosomal (NRPSs) Enzyme xác định trình tự axit amin q trình lắp ráp đến mơ-đun Trước Vancomycin lắp ráp thơng qua NRPS, axit amin sửa đổi Ltyrosine sửa đổi để trở thành hydroxychlorotyrosine (-hTyr) 4-hydroxyphenylglycine (HPG) dư lượng Mặt khác, acetate sử dụng để lấy 3,5 dihydroxyphenylglycine vòng (3,5-DPG) Tổng hợp peptide Nonribosomal xảy thơng qua phân biệt mơ-đun tải mở rộng protein axit amin, thơng qua việc hình thành liên kết amide địa điểm liên kết của phạm vi hoạt động Mỗi module thường bao gồm adenylation (A) tên miền, chất vận chuyển peptidyl protein (PCP), miền tên miền ngưng tụ (C) kéo dài Trong lĩnh vực A, amino axit cụ thể kích hoạt cách chuyển đổi thành phức tạp enzyme aminoacyl adenylate gắn liền với đồng yếu tố 4'-phosphopantetheine thioesterification phức tạp sau chuyển vào miền PCP với việc đẩy AMP Trong sinh tổng hợp Vancomycin, lĩnh vực sửa đổi bổ sung có mặt, chẳng hạn epimerization (E) miền, sử dụng isomerizes axit amin từ lập thể khác, tên miền thioesterase (TE) sử dụng chất xúc tác cho tạo vòng vận hành của phân tử thơng qua thioesterase phân cắt Một tập hợp multienzymes (CEPA enzym tổng hợp peptide, CepB, CepC) chịu trách nhiệm lắp ráp heptapeptide (Hình 2) Các tổ chức của CEPA, CepB, CEP C chặt chẽ tương tự tổng hợp peptide khác chất cho surfactin (SrfA1, SrfA2, SrfA3) gramicidin (GrsA GrsB) Mỗi enzym tổng hợp peptide kích hoạt mã hố cho axit amin khác để để kích hoạt lĩnh vực CEPA mã hóa cho mơ-đun 1, 2, CepB mã hóa cho mơ-đun 4, 5, và CepC mã hóa cho mơ-đun Sau phân tử heptapeptide tuyến tính tổng hợp, Vancomycin đã phải trải qua thay đổi nữa, chẳng hạn oxy hóa liên kết ngang glycosyl hóa Để chuyển đổi heptapeptide tuyến tính, tám enzyme, open reading frames (ORF) 7, 8, 9, 10, 11, 14, 18, 20, 21 sử dụng Enzyme ORF 7, 8, 9, 20 enzym P450 Và ORF 14 xác định enzym thủy phân giả định Với gíup đỡ của enzym này, nhóm -hydroxyl giới thiệu tyrosine dư lượng 6, khớp nối xảy vòng 7, vòng 6, vòng Ngồi ra, haloperoxidase sử dụng để gắn ngun tử clo vào vòng thơng qua q trình oxy hóa HHnh 2.2 2.2 Dược hóa học Vancomycin nhánh ba vòng peptide nonribosomal glycosyl hóa sản xuất q trình lên men của lồi actinobacteria Amycolatopsis orientalis (trước định Nocardia orientalis ) Vancomycin exhibits atropisomerism – có nhiều hóa học khác biệt rotamers hạn chế ln phiên của số liên kết Các hình thái diện thuốc mặt nhiệt động ổn định conformer có hoạt động mạnh 2.3 Cơ chế tác dụng Vancomycin hoạt động cách ức chế tổng hợp thích hợp thành tế bào vi khuẩn Gram dương Do chế khác mà theo vi khuẩn Gram âm sản xuất thành tế bào của u tố khác liên quan đến việc vào màng ngồi của sinh vật gram âm, vancomycin khơng phải hoạt động chống lại vi khuẩn Gram (ngoại trừ số lồi lậu cầu của Neisseria) Các phân tử ưa nước lớn hình thành liên kết hydro tương tác với thiết bị đầu cuối D-alanyl-D-alanine moieties NAM / NAG- peptide Trong trường hợp bình thường, tương tác năm điểm Điều ràng buộc của vancomycin D-Ala-DAla ngăn chặn tổng hợp thành tế bào hai cách: + Ngăn chặn tổng hợp của polyme di của N-acetylmuramic acid (NAM) N-acetylglucosamine (NAG) đã hình thành sợi xương sống của tế bào vi khuẩn + Ngăn cản polyme xương sống để kìm chế hình thành, liên kết với HHnh 2.5 Cơ chế tác dụng của Vancomycin Quy trình cơng nghệ sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis 3.1 Chủng giống vi sinh vật Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912 chủng vi sinh vật kiểm định Bacillus subtilis ATCC 6633, B cereus ATCC 21778, Staphylococcus aureus 209P, Sarcina lutea Eschrochia coli PA2, hóa chất dung để phân tích, định lượng vancomycin chuẩn (Merck) mơi trường nghiên cứu Gause 1, A4, A-4H, TH447, A12, A-9, 48 HHnh 3.1 Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912 A Hình dạng khuẩn lạc, B Cuống sinh bào tử, C bào tử 3.2 Lựa chọn mơi trường điều kiện lên men sinh kháng sinh chủng S orientalis 4912 Thử nghiệm lên men số mơi trường thường dùng lên men sinh kháng sinh xạ khuẩn cho thấy, chủng S orientalis 4912 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh đã lựa chọn mơi trường MT48 cho hoạt tính kháng sinh cao làm mơi trường sở để nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng điều kiện lên men đến khả tạo kháng sinh HHnh 3.2 10 Hoạt tính kháng sinh của chủng S orientalis 4912 Chủng S orientalis 4912 sử dụng tốt nguồn đường sacchaose với hàm lượng thích hợp 3%, cho hoạt tính kháng sinh cao Trong số nguồn nitơ thử nghiệm bột đậu tương cho hoạt tính kháng sinh cao nhất, với hàm lượng 0,2% thích hợp Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ pH cho thấy, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng, phát triển sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S orientalis 4912 280C pH từ đến Lượng giống cấy vào mơi trường lên men thích hợp - 8% so với mơi trường lên men Nghiên cứu động thái q trình men chủng S orientalis 9412 cho thấy, sinh khối hoạt tính kháng sinh tăng dần đạt cực đại sau 120 lên men Như vậy, động thái q trình lên men chủng có đặc trưng giống chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh khác 3.3 Nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng S orientalis 4912 Trước hết, nhà khoa học Viện Cơng nghệ sinh học áp dụng phương pháp gay chủng đột biến tia UV Kết quả nghiên cứu khả sống sót của tế bào trần bào tử chủng S orientalis 4912 sau xử lý UV độ sống sót từ 1-10%, kiểm tra hoạt tính kháng sinh theo phương pháp cục thạch cho thấy, khả sinh tổng hợp kháng sinh của chủng tăng lên từ 8-30,3% xử lý bào tử 66,33% xử lý tế bào trần Khả sống sót của tế bào trần Hoạt tính kháng sinh của khuẩn bào tử chủng S lạc chủng S orientalis 4912 xác định orientalis 4912 sau phương pháp cục thạch (A) đục xử lý UV lỗ (B) MNNG HHnh 3.3 11 Sau nhà khoa học tiếp tục áp dụng phương pháp thứ hai, gây chủng đột biến MNNG Trên sở lựa chọn nồng độ MNNG, pH thời gian xử lý thích hợp để xử lý bào tử tế bào trần tỷ lệ biến chủng của hoạt tính kháng sinh cao chủng gốc 80,8 92,86 % Kết quả nhận biến chủng S orientalis 491281-61 (xử lý tế bào trần MNNG) của hoạt tính kháng sinh cao 1683 mcg/ml, lựa chọn cho nghiên cứu điều kiện lên men sản xuất vancomycin (hoạt tính kháng sinh chủng gốc 866 mcg/ml) 3.4 Lựa chọn mơi trường điều kiện lên men vancomycin chủng đột biến Dựa mơi trường lên men thích hợp cho chủng S orientalis 4912, đã tiến hành lựa chọn mơi trường lên men tối ưu theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm của Box-Wilson cho biến chủng S orientalis 4912-81-61 sau Saccharose 49,8 g/l; glucose 17 g/l; bột đậu tương 30,6 g/l; NaCl 2,5 g/l; CaCO3 g/l; CaCl2 40 mg/l; CuSO4 10 mg/l Ảnh hưởng của của yếu tố điều kiện lên men cho thấy, tỷ lệ tiếp giống 4%, nhiệt độ lên men tối ưu 28oC nồng độ pH thích hợp Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng oxy hòa tan (dO2) mơi trường tới sinh trưởng sinh tổng hợp vancomycin, thí nghiệm lên men biến chủng S orientalis 4912-81-61 thực hệ thống Bioflo 110 dung tích 7,5 lit với điều kiện pH, nhiệt độ tỉ lệ giống xác định Kết quả xác định sinh khối khơ hoạt tính kháng sinh sau 120 lên men cho thấy, dO2 trì mức 20-30% lượng vancomycin sinh khối đạt cao nhất, tương ứng 2983 mcg/ml 9,8 mg/ml Như vậy, kết quả của thí nghiệm cho thấy việc cung cấp đủ oxy hòa tan bảo đảm đảo trộn tốt bình lên men điều kiện thiết yếu của sản xuất vancomycin Để xác định thời điểm thu hồi vancomycin thích hợp nhất, biến chủng S orientalis 491212 81-61 nuơi thiết bị lên men Bioflo 110 dung tích với thành phần mơi trường lên men tối ưu cho thấy, biến chủng phát triển tốt bình lên men, đặc biệt từ thứ 48 sinh khối của chủng tăng nhanh đạt 5,8 mg/ml Cũng thời điểm chủng bắt đầu sinh vancomycin, tới 120 nồng độ đạt cực đại 2983 mcg/ml Biến động q trình lên men sinh tổng hợp vancomycin biến chủng S orientalis 4912-81-61 thiết bị Bioflo 5000 3.5 Tách chiết tinh chế vancomycin từ dịch lên men HHnh 3.4 Quy trình chiết xuất vancomycin Kết quả kiểm tra vancomycin tách chiết từ biến chủng S orientalis 4912-81-61 sắc ký lớp mỏng hệ dung mơi Butanol - axit acetic - H2O (4 : : 7) cho gía trị Rf của mẫu 0,75; phương pháp phổ khối Agilent 6310 Ion Trap máy HPLC-MS, trọng lượng phân tử 1449,27 sắc ký lỏng cao cấp máy HPLC-SPA-10 Shimadzu, thời gian lưu 4,4 phút giống vancomycin chuẩn (Merck) Sắc ký đồ HPLC cho thấy khơng có pic tạp chứng tỏ vancomycin chế phẩm tinh sạch, độ tinh khiết đạt 95,4% 13 Kiểm tra vancomycin Phỏ UV của sắc ký lớp mỏng vancomycin Vancomycin từ Phỏ HPLC của chuẩn (trên) mơi trường ni vancomycin chuẩn (trên) vancomycin cấy Vancomycin vancomycin chủng S chủng S tách chiết orientalis 4912 (dưới) orientalis 4912 làm tinh khiết; (dưới) Vancomycin chuẩn (Merck) Một số ứng dụng khác Streptomyces 4.1 Các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn phòng trừ nấm gây bệnh thực vật Để tránh dịch bệnh nơng nghiệp, người ta sử dụng số biện pháp kỹ thuật, thay đổi cấu trồng, mùa vụ Tuy nhiên biện pháp gây xáo trộn hệ sinh thái đồng ruộng, tạo điều kiện để phát sinh số bệnh mà trước gặp Việc tuyển chọn dòng kháng bệnh vài năm, sau tác nhân gây bệnh lại kháng lại Việc sử dụng CKS trồng trọt nhằm mục đích chống bệnh nấm gây rau quả trồng, chống bệnh vi khuẩn gây ra, diệt trùng cỏ dại… kiềm chế bệnh thực vật sinh từ đất So với thuốc hố học, dùng chất CKS bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân huỷ, tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp gây nhiễm mơi trường, có khả ức chế VSV đã kháng thuốc hố học CKS dịch lên men chủng sinh CKS 14 dùng để xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt nguồn bệnh bên ngồi hạt, diệt bệnh cả phận nằm đất của khử trùng đất Ngày nay, việc sử dụng CKS bảo vệ thực vật phổ biên rộng rãi giới nước Nga, Nhật, Trung Quốc, An Độ… Ở Trung Quốc đã tuyển chọn nhiều chủng xạ khuẩn từ đất nghiên cứu sản xuất nhiều CKS phòng chống bệnh có hiệu quả cao policin chống bệnh đạo ơn, jangamicin chống bệnh khơ vằn Năm 2002, Ấn Độ đã phân lập chủng Streptomyces sp.201 có khả sinh CKS z –methylheptyl iso –nicotinate, chất kháng sinh có khả kháng nhiều loại nấm gây bệnh Fusarium oxysporum, F.solani… Ở Việt Nam đã sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh bảo vệ thực vật từ Trung Quốc hay Nhật Bản đã phân lập số chủng xạ khuẩn có khả chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ơn F.oxysporum gây bệnh thối rễ thực vật 4.2 Khuẩn lạc Streptomyces sp mơi trường agar Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vơ tính bào tử Trên thành sợi khí sinh thành cuống sinh bào tử chuỗi bào tử Cuống sinh bào tử có nhiều dạng khác tuỳ lồi : thẳng, lượn sóng xoắn, có móc, vòng… Bào tử hình thành cuống sinh bào tử phương pháp : phân đoạn cắt khúc Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 µm Màng tế bào nhẵn, gai khối u, nếp nhăn… Tuỳ thuộc vào lõi xạ khuẩn với mơi trường ni cấy Thường mơi trường có nguồn đạm vơ glucoza bào tử thể đặc điểm rõ Màu sắc của khuẩn lạc hệ sinh khí khác tuỳ theo nhóm Streptomyces, màu sắc biến đổi ni cấy mơi trường khác Các loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn gram (+), hiếu khí, dị dưỡng chất hữu Nhiệt độ tối ưu 15 thường 25 – 300C, pH tối ưu 6,5 – 8,0 Một số lồi phát triển nhiệt độ cao thấp (xạ khuẩn ưa nhiệt ưa lạnh) Xạ khuẩn chi có khả tạo thành số lượng lớn CKS ức chế vi khuẩn, nấm sợi tế bào ung thư, virus động vật ngun sinh 4.3 Streptomyces vật chủ cho việc tiết các protein dị để sản xuất dược sinh học Việc sản xuất thương mại protein chữa bệnh chẩn đốn vi sinh vật lý tổ hợp quan tâm đáng kể Một số hệ thống sản xuất protein của vi khuẩn phát triển Một số chi của vi khuẩn Gram dương thử nghiệm vật chủ lưu trữ để sản xuất protein dị khả tiết protein có hiệu quả mơi trường ni cấy Trong số chi Streptomyces nhiều kể từ lồi của biết tiết lượng protein cao Vì vắng mặt của hệ thống hạn chế, thay đổi rộng lớn, hoạt động của protease hạn chế sẵn có của hệ thống vector thích hợp, Streptomyces lividans chọn lựa cho việc tiết của protein dị Các kết quả trình bày cho thấy lividans hoạt động vật chủ lưu trữ thú vị để sản xuất số protein hữu ích cho số bệnh quan trọng ngành thương mại dược phẩm tồn giới là: ung thư, miễn dịch học, bệnh tim mạch bệnh truyền nhiễm 4.4 Vi sinh vật phân giải PhotPho (P) Trong tự nhiên, P nằm nhiều dạng hợp chất khác Các hợp chất P hữu đất có nguồn gốc từ xác động vật, thực vật, phân xanh, phân chuồng… Những hợp chất P hữu vi sinh vật phân giải tạo thành hợp chất P vơ khó tan, số tạo thành dạng dễ tan Hợp chất P hữu quan trọng phân giải từ tế bào vi sinh vật nucleotide Nucdeotide có thành phần nhân tế bào Nhờ tác động của nhóm vi sinh vật hoại sinh đất, chất tách từ thành phần tế bào phân giải thành phần protein nuclein Protein vào vùng chuyển hố hợp chất nitrogen, nuclein vào vòng chuyển hố hợp chất P Sự chuyển hố hợp 16 chất P hữu thành muối của H3PO4 thực nhóm vi sinh vật phân huỷ P hữu theo sơ đồ tổng qt sau : Nucleoprotein  Nuclein  Acid.Nucleic  H2SO4 Vi sinh vật phân hủy P hữu chủ yếu thuộc chi Bacillu Pseudomonas Các lồi có khả phân giải mạnh : B.megaterium, Serratia, B.subtilis, Serratia, Proteus, Arthrobster,  Vi khuẩn: Pseudomonas, Alcaligenes, Achromobacter, Agrobacterium  Xạ khuẩn: Streptomyces III Kết luận Vancomycin kháng sinh nhóm glycopeptid sử dụng để chữa bệnh nhiễm trùng vi khuẩn Gram dương gây ra, đặc biệt vi khuẩn kháng lại kháng sinh methicillin penicillin Kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình thích hợp để sản xuất vancomycin từ biến chủng nhận cao chủng gốc 344% Chất kháng sinh thu nhận từ dịch lên men tương đương với vancomycin chuẩn (Merck) Đã nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng 4912: Chủng có đặc điểm giống loại S.orientales chủng chuẩn ISP 504 mơ tả, sử dụng hầu hết nguồn đường, sinh trưởng phát triển tốt, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu 28-300C, pH thích hợp cho phát triển của chủng từ đến 9, chịu muối đến 6% khơng có khả tạo xenlulaza Chủng S orientalis 4912 cĩ hoạt phổ kháng khuẩn rộng giống lồi Streptomyces orientalis Pittenger & Brigham, ức chế cả vi khuẩn Gram dương vi khuẩn Gram âm Đã lựa chọn mơi trường thích hợp MT 48 làm mơi trường sở để nghiên cứu tối ưu thành phần mơi trường điều kiện lên men Chủng 4912 có đặc điểm sinh học giống lồi Streptomyces orientalis hoạt tính kháng sinh cao Kết quả nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp kháng sinh cho thấy nguồn dinh dưỡng thích hợp saccaroza 3%, bột đậu tương 0,2%, pH 7,0 - 7,5 nhiệt độ 17 lên men 300C tỷ lệ cấy giống 10% Lượng sinh khối kháng sinh cao của q trình lên men 120 ni cấy Đã nghiên cứu biến động tự nhiên hoạt tính kháng sinh của chủng S orientalis 4912 nhận thấy, chủng khơng có biến động lớn hoạt tính kháng sinh; khơng có biến chủng âm tính lựa chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao Đã lựa chọn chủng xạ khuẩn S orientalis 4912-81-345 có khả sinh tổng hợp vancomycin cao chủng đột biến có khả sinh tổng hợp kháng sinh cao chủng gốc Đã nghiên cứu sử dụng kỹ thuật gây đột biến tế bào trần tia UV nâng cao hoạt tính của chủng S orientalis 4912 Được xác định hoạt tính kháng sinh của biến chủng sau xử lý UV: Hoạt tính kháng sinh của chủng dương tính cao chủng gốc biến chủng âm thấp chủng gốc Đã nghiên cứu tối ưu hóa mơi trường lên men tổng hợp vancomycin của chủng gốc chủng đột biến; Nghiên cứu động thái q trình lên men nội lên men lít 80 lít Đã nghiên cứu tách chiết kháng sinh từ dịch ni cấy của chủng S orientalis 4912 dung mơi chất hấp phụ, sản phẩm nhận vancomycin Đã nghiên cứu tinh chế điều chế vancomycin.HC1 bào chế dạng thuốc : Thuốc tiêm viên nang TÀI LIỆU THAM KHẢO (1) http://en.wikipedia.org/wiki/Streptomyces (2) http://www.microbiologybytes.com/video/Streptomyces.html (3) http://www.jic.ac.uk/science/molmicro/strept.html (4) http://www.jic.ac.uk/science/molmicro/strept.html (5) http://www.businesschemistry.org/article/?article=82 (6) www.en.wikipedia.org/wiki/Vancomycin (7) www.dspace.isivast.org.vn/dspace/bitstream/123456789/3266/1/dt1.d oc (8) www.scribd.com/doc/35890819/STREPTOMYCES 18 Tạp chí cơng nghệ sinh học 19 [...]... do các vi khuẩn Gram dương gây ra, đặc biệt là các vi khuẩn kháng lại kháng sinh methicillin và penicillin Kết quả nghiên cứu được xây dựng được quy trình thích hợp để sản xuất vancomycin từ biến chủng nhận được cao hơn chủng gốc 344% Chất kháng sinh thu nhận được từ dịch lên men tương đương với vancomycin chuẩn (Merck) Đã nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng 4912: Chủng này có đặc điểm giống loại... để nghiên cứu tối ưu thành phần môi trường và điều kiện lên men Chủng 4912 có đặc điểm sinh học giống lồi Streptomyces orientalis và hoạt tính kháng sinh cao Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cho thấy nguồn dinh dưỡng thích hợp là saccaroza 3%, bột đậu tương 0,2%, pH 7,0 - 7,5 nhiệt độ 17 lên men 300C và tỷ lệ cấy giống 10% Lượng sinh khối và kháng sinh. .. Đã nghiên cứu sự biến động tự nhiên về hoạt tính kháng sinh của chủng S orientalis 4912 và nhận thấy, chủng này không có biến động lớn về hoạt tính kháng sinh; không có biến chủng âm tính và được lựa chọn được 1 chủng có hoạt tính kháng sinh cao nhất Đã lựa chọn được chủng xạ khuẩn S orientalis 4912-81-345 có khả năng sinh tổng hợp vancomycin cao và các chủng được đột biến có khả năng sinh. .. chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ thực vật từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng xạ khuẩn có khả năng chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn và F.oxysporum gây bệnh thối rễ ở thực vật 4.2 Khuẩn lạc của Streptomyces sp trên môi trường agar Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử Trên thành sợi khí sinh thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử Cuống sinh bào... kháng sinh của chủng S orientalis 4912 là 280C và pH từ 6 đến 8 Lượng giống được cấy vào môi trường lên men thích hợp 6 - 8% so với môi trường lên men Nghiên cứu động thái quá trình men chủng S orientalis 9412 cho thấy, sinh khối và hoạt tính kháng sinh tăng dần và đạt cực đại sau 120 giờ lên men Như vậy, động thái quá trình lên men chủng này có đặc trưng giống như ở các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh. .. tính kháng sinh của chủng S orientalis 4912 Chủng S orientalis 4912 sử dụng tốt nguồn đường sacchaose với hàm lượng thích hợp là 3%, cho hoạt tính kháng sinh cao Trong số các nguồn nitơ thử nghiệm thì bột đậu tương cho hoạt tính kháng sinh cao nhất, với hàm lượng 0,2% là thích hợp Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và pH cho thấy, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp kháng. .. kháng sinh của chủng S orientalis 4912 Trước hết, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phương pháp gay chủng đột biến bằng tia UV Kết quả nghiên cứu khả năng sống sót của tế bào trần và bào tử chủng S orientalis 4912 sau khi xử lý UV ở độ sống sót từ 1-10%, kiểm tra hoạt tính kháng sinh theo phương pháp cục thạch cho thấy, khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng này tăng lên từ. .. nghiên cứu tối ưu hóa môi trường lên men tổng hợp vancomycin của chủng gốc và các chủng đột biến; Nghiên cứu động thái quá trình lên men trên nội lên men 5 lít và 80 lít Đã nghiên cứu tách chiết kháng sinh từ dịch nuôi cấy của chủng S orientalis 4912 bằng dung môi và các chất hấp phụ, sản phẩm nhận được là vancomycin Đã nghiên cứu tinh chế và điều chế vancomycin. HC1 và bào chế 2 dạng thuốc : Thuốc... các pic tạp chứng tỏ vancomycin chế phẩm khá tinh sạch, độ tinh khiết đạt 95,4% 13 Kiểm tra vancomycin bằng Phỏ UV của sắc ký lớp mỏng vancomycin 1 Vancomycin từ Phỏ HPLC của chuẩn (trên) và môi trường nuôi vancomycin chuẩn (trên) vancomycin cấy 2 Vancomycin và vancomycin chủng S chủng S được tách chiết và orientalis 4912 (dưới) orientalis 4912 làm tinh khiết; và (dưới) 3 Vancomycin chuẩn (Merck)... lệ biến chủng của hoạt tính kháng sinh cao hơn chủng gốc là 80,8 và 92,86 % Kết quả nhận được biến chủng S orientalis 491281-61 (xử lý tế bào trần bằng MNNG) của hoạt tính kháng sinh cao nhất là 1683 mcg/ml, được lựa chọn cho nghiên cứu điều kiện lên men sản xuất vancomycin (hoạt tính kháng sinh chủng gốc là 866 mcg/ml) 3.4 Lựa chọn môi trường và điều kiện lên men vancomycin của chủng đột biến