Nghiên cứu sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn streptomyces orientalisx

san-xuat-khang-sinh-vancomycin-tu-xa-khuan-streptomyces-orientalis

Nghiên cứu sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis Thứ hai, 06/06/2011, 15:49 GMT+7 Vancomycin là chất kháng sinh được sử dụng rộng rãi và có tác dụng tích cực trong chữa bệnh. Các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đang nghiên cứu điều kiện thích hợp sản xuất vancomycin từ biến chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis nhận được từ xử lý N-methyl-N-nitro-N- nitrosoguanidin (MNNG) lên tế bào trần của chủng gốc. Vancomycin là chất kháng sinh thuộc nhóm glycopeptid có tác dụng tích cực trong điều trị bệnh, từng được coi là phương thuốc cuối cùng vì có khả năng điều trị được các bệnh nhiễm trùng nguy hiểm do các chủng vi sinh vật kháng methicillin (chất kháng sinh nhóm β- lactam) gây nên. Vancomycin đã được đưa vào chữa bệnh từ hơn 40 năm qua, nhưng ngày nay vẫn được coi là kháng sinh quan trọng do hiệu quả chữa bệnh cao khi dùng một mình hoặc phối hợp với các kháng sinh khác, chống lại các vi khuẩn đã nhờn với nhiều loại kháng sinh thông dụng. Bởi vậy, việc nghiên cứu sinh tổng hợp vancomycin vẫn được quan tâm, phát triển, để từ đó hình thành nên thế hệ kháng sinh mới có hiệu quả chữa bệnh cao. Hơn nữa, nghiên cứu lên men vancomycin và nắm vững quy trình sản xuất chất kháng sinh này còn tạo tiền đề cho việc xây dựng cơ sở sản xuất các chất kháng sinh ở quy mô công nghiệp trong điều kiện Việt Nam, góp phần thực hiện mục tiêu tới năm 2020 sản xuất được 50% tổng số thuốc, do Bộ Y tế đề ra. Trong bối cảnh như vậy, việc nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vancomycin bằng nguyên liệu trong nước, phù hợp với điều kiện kinh tế và môi trường khí hậu của Việt Nam là cần thiết. Cùng với nó, việc triển khai xây dựng một cơ sở sản xuất kháng sinh này với công suất 500 kg/năm góp phần phục vụ công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Chủng giống vi sinh vật Chủng xạ khuẩn Streptomycws orientalis 4912 và các chủng vi sinh vật kiểm định Bacillus subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC 21778, Staphylococcus aureus 209P, Sarcina lutea và Eschrochia coli PA2 (Bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học); các hóa chất dung để phân tích, định lượng và vancomycin chuẩn (Merck) và các môi trường nghiên cứu là Gause 1, A4, A-4H, TH447, A12, A-9, 48. Lựa chọn môi trường điều kiện lên men sinh kháng sinh của chủng S. orientalis 4912 Thử nghiệm lên men trên một số môi trường thường dùng trong lên men sinh kháng sinh ở xạ khuẩn cho thấy, chủng S. orientalis 4912 có hoạt tính kháng khuẩn mạnh và đã lựa chọn được môi trường MT48 cho hoạt tính kháng sinh cao nhất có thể làm môi trường cơ sở để nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng và điều kiện lên men đến khả năng tạo kháng sinh. Chủng S. orientalis 4912 sử dụng tốt nguồn đường saccharose với hàm lượng thích hợp là 3%, cho hoạt tính kháng sinh cao. Trong số các nguồn nitơ thử nghiệm thì bột đậu tương cho hoạt tính kháng sinh cao nhất, với hàm lượng 0,2% là thích hợp. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và pH cho thấy, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp kháng sinh của chủng S. orientalis 4912 là 280C và pH từ 6 đến 8. Lượng giống được cấy vào môi trường lên men thích hợp 6 - 8 % so với môi trường lên men. Nghiên cứu động thái quá trình lên men chủng S. orientalis 9412 cho thấy, sinh khối và hoạt tính kháng sinh tăng dần và đạt cực đại sau 120 giờ lên men. Như vậy, động thái quá trình lên men chủng này có đặc trưng giống như ở các chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh khác. Nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis 4912 Trước hết, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học áp dụng phương pháp gây chủng đột biến bằng tia UV. Kết quả nghiên cứu khả năng sống sót của tế bào trần và bào tử chủng S. orientalis 4912 sau khi xử lý UV ở độ sống sót từ 1-10%, kiểm tra hoạt tính kháng sinh theo phương pháp cục thạch cho thấy, khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng này tăng lên từ 8-30,3% đối với xử lý bào tử và 66,33% đối với xử lý tế bào trần. Sau đó, các nhà khoa học tiếp tục áp dụng phương pháp thứ hai, đó là gây chủng đột biến bằng MNNG. Trên cơ sở lựa chọn nồng độ MNNG, pH và thời gian xử lý thích hợp để xử lý bào tử và tế bào trần thì tỷ lệ biến chủng có hoạt tính kháng sinh cao hơn chủng gốc là 80,8 và 92,86 %. Kết quả nhận được biến chủng S. orientalis 4912-81-61 (xử lý tế bào trần bằng MNNG) có hoạt tính kháng sinh cao nhất là 1683 mcg/ml, được lựa chọn cho nghiên cứu điều kiện lên men sản xuất vancomycin (hoạt tính kháng sinh chủng gốc là 866 mcg/ml). Lựa chọn môi trường và điều kiện lên men vancomycin của chủng đột biến Dựa trên môi trường lên men thích hợp cho chủng S. orientalis 4912, đã tiến hành lựa chọn môi trường lên men tối ưu theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm của Box- Wilson cho biến chủng S. orientalis 4912-81-61 như sau Saccharose 49,8 g/l; glucose 17 g/l; bột đậu tương 30,6 g/l; NaCl 2,5 g/l; CaCO3 2 g/l; CaCl2 40 mg/l; CuSO4 10 mg/l. Ảnh hưởng của các yếu tố điều kiện lên men cho thấy, tỷ lệ tiếp giống 4%, nhiệt độ lên men tối ưu 28oC và nồng độ pH thích hợp 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng oxy hòa tan (dO2) trong môi trường tới sự sinh trưởng và sinh tổng hợp vancomycin, các thí nghiệm lên men biến chủng S. orientalis 4912-81-61 được thực hiện trong hệ thống Bioflo 110 dung tích 7,5 lit với các điều kiện pH, nhiệt độ và tỉ lệ giống đã xác định ở trên. Kết quả xác định sinh khối khô và hoạt tính kháng sinh sau 120 giờ lên men cho thấy, khi dO2 được duy trì ở mức 20-30% thì lượng vancomycin và sinh khối đạt cao nhất, tương ứng bằng 2983 mcg/ml và 9,8 mg/ml. Như vậy, kết quả của các thí nghiệm này cho thấy việc cung cấp đủ oxy hòa tan và bảo đảm đảo trộn tốt trong bình lên men là điều kiện thiết yếu của sản xuất vancomycin. Để xác định thời điểm thu hồi vancomycin thích hợp nhất, biến chủng S. orientalis 4912-81-61 được nuôi trong thiết bị lên men Bioflo 110 dung tích với thành phân môi trường lên men tối ưu cho thấy, biến chủng này phát triển tốt trong bình lên men, đặc biệt từ giờ thứ 48 sinh khối của chủng tăng nhanh đạt 5,8 mg/ml. Cũng tại thời điểm này chủng bắt đầu sinh vancomycin, tới 120 giờ nồng độ đạt cực đại là 2983 mcg/ml. Tách chiết và tinh chế vancomycin từ dịch lên men Kết quả kiểm tra vancomycin tách chiết từ biến chủng S. orientalis 4912-81-61 bằng sắc ký lớp mỏng trên hệ dung môi Butanol - axit acetic - H2O (4 : 3 : 7) cho giá trị Rf của các mẫu là 0,75; bằng phương pháp phổ khối Agilent 6310 Ion Trap trên máy HPLC-MS, trọng lượng phân tử là 1449,27 và bằng sắc ký lỏng cao áp trên máy HPLC-SPA-10 Shimadzu, thời gian lưu là ở 4,4 phút giống như vancomycin chuẩn (Merck). Sắc ký đồ HPLC cho thấy không có các pic tạp chứng tỏ vancomycin chế phẩm khá tinh sạch, độ tinh khiết đạt 95,4%. Vancomycin là một kháng sinh nhóm glycopeptid được sử dụng để chữa các bệnh nhiễm trùng do các vi khuẩn Gram dương gây ra, đặc biệt là các vi khuẩn kháng lại kháng sinh methicillin và penicillin. Kết quả nghiên cứu đã xây dựng được quy trình thích hợp để sản xuất vancomycin từ biến chủng nhận được cao hơn chủng gốc 344%. Chất kháng sinh thu nhận được từ dịch lên men tương đương với vancomycin chuẩn (Merck) http://www.khoahocphothong.com.vn/news/detail/9496/ng hien-cuu-san-xuat-khang-sinh-vancomycin-tu-xa-khuan- streptomyces-orientalis.html ĐỀ TÀI Nghiên cứu xây dựng quy trình lên men sản xuất kháng sinh vancomycin. Thời gian thực hiện: 2005 - 2006 Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ sinh học Chủ nhiệm: PGS.TS. Lê Gia Hy Cán bộ tham gia Viện Công nghệ sinh học PGS.TS. Lê Gia Hy, TS. Phạm Thị Bích Hợp, TS. Trần Đình Mấn, ThS. Hồ Tuyên, ThS. Lại Thanh Tùng, ThS. Nguyễn Phương Nhuệ, KS. Nguyễn Văn Hiếu, ThS. Phan Hồng Thảo, CN. Phạm Thanh Huyền, ThS. Nguyễn Kim Thoa, CN. Nguyễn Thế Trang. Viện Hóa học TS. Vũ Anh Tuấn Liên hiệp Khoa học - Công nghệ sản xuất mới TS. Phan Quốc Kinh, DS. Nguyễn Thị Tường Vân, PGS.TS. Hà Huy Kế. Tổng kinh phí: 250 triệu đồng Mục tiêu Xây dựng quy trình công nghệ lên men sản xuất kháng sinh vancomycin từ chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912 phù hợp với nguyên liệu và điều kiện môi trường khí hậu Việt Nam. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu đặc điểm hình phái, đặc điểm phân loại và bảo quản chủng Streptomyces orientalis trong điều kiện phòng thí nghiệm. - Nghiên cứu lựa chọn môi trường thích hợp bằng các nguyên liệu trong nước và điều kiện lên men chủng Streptomyces orientalis trong phòng thí nghiệm. - Nghiên cứu tuyển chọn, bảo quản và nâng cao hoạt tính kháng sinh chủng giống. - Nghiên cứu tối ưu môi trường và điều kiện lên men có bổ sung cơ chất. - Nghiên cứu thử nghiệm lên men sản xuất ở trong nồi lên men nhỏ. - Nghiên cứu tách chiết, tinh chế vancomycin từ dịch lên men chủng Streptomyces orientalis 4912. - Nghiên cứu điều chế vancomycin-Na. Kết quả đạt được Đã nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng 4912: Chủng này có đặc điểm giống loại S.orientales như chủng chuẩn ISP 5040 đã mô tả, sử dụng hầu hết các nguồn đường, sinh trưởng phát triển tốt, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu ở 28- 30 0 C, pH thích hợp cho sự phát triển của chủng này từ 6 đến 9, chịu muối đến 6% và không có khả năng tạo xenlulaza. Chủng S. orientalis 4912 có hoạt phổ kháng khuẩn rộng giống loài Streptomyces orientalis Pittenger & Brigham, ức chế được cả vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm. Đã lựa chọn môi trường thích hợp MT 48 làm môi trường cơ sở để nghiên cứu tối ưu thành phần môi trường và điều kiện lên men. Chủng 4912 có đặc điểm sinh học giống loài Streptomyces orientalis và hoạt tính kháng sinh cao. Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cho thấy nguồn dinh dưỡng thích hợp là saccaroza 3%, bột đậu tương 0,2%, pH 7,0 - 7,5 nhiệt độ lên men 30 0 C và tỷ lệ cấy giống 10%. Lượng sinh khối và kháng sinh cao nhất của quá trình lên men ở 120 giờ nuôi cấy. Đã nghiên cứu sự biến động tự nhiên về hoạt tính kháng sinh của chủng S. orientalis 4912 và nhận thấy, chủng này không có biến động lớn về hoạt tính kháng sinh; không có biến chủng âm tính và đã lựa chọn được 1 chủng có hoạt tính kháng sinh cao nhất. Đã lựa chọn được chủng xạ khuẩn S. orientalis 4912-81- 345 có khả năng sinh tổng hợp vancomycin cao và các chủng được đột biến có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao hơn chủng gốc. Đã nghiên cứu và sử dụng kỹ thuật gây đột biến tế bào trần bằng tia UV và nâng cao được hoạt tính của chủng S. orientalis 4912. Đã xác định được hoạt tính kháng sinh của các biến chủng sau khi xử lý UV: Hoạt tính kháng sinh của các chủng dương tính đều cao hơn chủng gốc và biến chủng âm đều thấp hơn chủng gốc. Đã nghiên cứu tối ưu hóa môi trường lên men tổng hợp vancomycin của chủng gốc và các chủng đột biến; Nghiên cứu động thái quá trình lên men trên nồi lên men 5 lít và 80 lít. Đã nghiên cứu tách chiết chất kháng sinh từ dịch nuôi cấy của chủng S. orientalis 4912 bằng dung môi và các chất hấp phụ, sản phẩm nhận được là vancomycin. Đã nghiên cứu tinh chế và điều chế vancomycin.HCl và bào chế 2 dạng thuốc: Thuốc tiêm và viên nang. Kết quả đào tạo Đã đào tạo được 5 sinh viên làm khóa luận tốt nghiệp đại học và 2 thạc sỹ trên cơ sở các số liệu của quá trình thực hiện đề tài. Sản phẩm khoa học - Báo cáo tổng kết đề tài đề cập đầy đủ các nội dung đã nghiên cứu. - Tạo được chủng Streptomyces orientalis sinh vancomycin đạt trên 2000 µg/ml. - Bảng số liệu môi trường lên men thích hợp sinh tổng hợp vancomycin từ nguyên liệu trong nước. - Quy trình công nghệ lên men sinh tổng hợp vancomycin đạt hiệu suất trên 1500 µg/ml. - Quy trình tách chiết và tinh sạch vancomycin. Chất kháng sinh đạt tiêu chuẩn BP 2001. - Quy trình sản xuất thử nghiệm kháng sinh vancomycin ở quy mô nồi lên men 80 lít, tách chiết được 100g kháng sinh thô và điều chế được 2g chế phẩm . Nghiên cứu sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis Thứ hai, 06/06/2011, 15:49 GMT+7 Vancomycin là chất kháng sinh được. nữa, nghiên cứu lên men vancomycin và nắm vững quy trình sản xuất chất kháng sinh này còn tạo tiền đề cho việc xây dựng cơ sở sản xuất các chất kháng sinh